CN103087943B - 一株空间金黄色葡萄球菌lct-sa67菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株太空环境下金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株的生物学特性、基因组DNA序列、转录组和差异蛋白组学，特别是同地面金黄色葡萄球菌比较分析鉴定出的功能序列和分子在阐明空间环境对微生物的作用及用途，可获得全面、准确的空间诱变金黄色葡萄球菌菌株突变的基因、差异表达基因和蛋白质。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及太空环境下金黄色葡萄球菌的生物学特性、全基因组测序信息、转录组测序以及差异蛋白组学分析。
背景技术
空间环境是指大气层以外的宇宙空间，其显著特点是高真空、极端温度、微磁场、微重力和高能核粒子辐射。在空间环境中很多微生物的致病性会受到影响，同时飞行中航天员的免疫功能下降，如何保障进入太空的生命体预防感染性疾病，如何利用空间环境造福人类都是就是其中要解决的关键问题。
金黄色葡萄球菌是感染机体的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，是一种典型的革兰氏阳性菌，可引起许多严重感染，常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。其在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，很容易污染食品，是常见的引起食物中毒的致病菌，人体中常存在少量金黄色葡萄球菌。因此，在航天活动中，该菌常可随人体或其他航天设备进入太空。
随着人类的生物医学研究进入微观水平，人们认识到，DNA遗传信息决定了生物体的生命特征，而生物体的基因组正是这些遗传信息的携带者。因此阐明生物体基因组携带的遗传信息、以及这些遗传信息是如何转录成RNA和翻译成蛋白质执行功能将有助于揭示生物体的遗传规律。目前，测序技术和质谱继续不断更新，这些技术的成本也不断降低，同时细菌的基因组较小，从细菌基因组、转录组和蛋白质组入手研究其对机体的分子作用机 制是研究细菌致病的很好切入点。通过这些组学的研究分析太空诱变金黄色葡萄球菌的变化特征，有利于保障航天活动的安全，同时研究结果可服务于地面。
发明内容
本发明的一个目的提供空间环境诱变的金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株
本发明提供的该菌株，其保藏号为CGMCC NO.6517。
一株金黄色葡萄球菌，其特征包括：革兰氏染色阳性，呈球状、聚团排列；同地面对照株的抗生素耐受性相比，无差异；无生长速度的差异；不能利用丙酮酸甲酯为碳源，而地面对照能使用该碳源。
所述的金黄色葡萄球菌，利用全基因组测序和比较基因组学分析获得基因突变，见表1，空间环境导致LCT-SA67基因组上SNP的变化，包括SNP在基因组上的位置，突变位点及编码蛋白以及注释出的基因。
表1：空间环境导致LCT-SA67菌株基因组上SNP的变化
其中Staphylococcus_aureusGL002088未在数据中注释出，而Staphylococcus_aureusGL001923和Staphylococcus_aureusGL001697的注释号分别是gil257434926和gil341841705。
所述的金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株，进行转录组测序鉴定差异表达基因(FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1.5)见附表1。
所述的金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株，进行差异蛋白组学分析鉴定的差异表达蛋白(蛋白丰度差异倍数超过2倍以上时；经统计检验其p-value值小于0.05；三次重复中至少两次重复中达到上述要求)见附表2。
附图说明
图1金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株革兰氏染色
图2金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株生理生化鉴定
图3金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株生长曲线
图4金黄色葡萄球菌LCT-SA112菌株生长曲线
图5LCT-SA67菌株的GC含量与Depth关联分析图
图6LCT-SA67菌株和地面对照组LCT-SA112的二维共线性图
图7LCT-SA67菌株的转录组测序基因覆盖度图
图8转录组测序鉴定的差异表达基因
图9差异蛋白组学鉴定的差异表达蛋白质
附件说明
附件1LCT-SA112菌株转录组测序分析的差异表达基因信息
附件2LCT-SA112菌株定量蛋白组学分析的差异表达蛋白信息
具体实施方式
下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施实例一：金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株的革兰氏染色
取50ul样品离心，弃上清，加入无菌水50ul，吸取20ul于载玻片上进行固定；初染，吸取革兰氏染色I(结晶紫)2滴于载玻片样品上进行初染1min，然后用自来水冲洗染液；媒染，吸取革兰氏染色II(碘液)2滴覆盖涂面染约1min，然后用自来水冲洗染液，用吸水纸吸取涂面上的水分；脱色，吸取革兰氏染色III(酒精)2滴滴在涂面上约30s，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；复染，吸取革兰氏染色IV(番红)2滴滴在涂 面上约1min，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；观察，先用显微镜低倍镜找到目标视野，然后再用油镜(100×)进行观察，判定并记录结果、拍照，见图1，从图中可看出LCT-SA67菌株革兰氏染色阳性，呈球状、聚团排列。
实施实例二：金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株的抗生素敏感性检测
配制LB固体培养基25L，灭完菌后倒1500个平板，晾干，备用；菌悬液的制备，取出这些单菌的斜面，并准备盛有1ml无菌生理盐水的1.5ml离心管，用灭菌的竹签从斜面上蘸取适量菌种于1.5ml离心管中，混匀，调菌浓度约107～108；稀释涂布，吸取备好的菌悬液100μl进行涂布，尽可能地涂布均匀，每株单菌涂6个平板，每涂完一株菌，就进行下一步(粘贴药敏片)；粘贴药敏片，选择抗生素进行药敏试验，以筛选出抗药性突变的菌株；贴完药敏片后，将平板放置在37℃下培养18～24h；观察结果，将平板培养18～24h，取出观察平板上药敏片的抑菌情况，并记录抑菌圈的大小(直径cm)，其中药敏片直径约为0.6cm。金黄色葡萄球菌LCT-SA67同地面对照LCT-SA112菌株相比，对抗生素耐受性无差异。
实施实例三：金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株的生理生化鉴定实验
菌悬液制备，取出菌株的斜面，用灭菌竹签蘸取菌种接种在LB液体培养基中(4ml体系)，培养24h。然后取2ml菌液6000r/s离心5min，弃上清培养基，留下离心的菌体，然后用灭菌的生理盐水洗涤菌体，6000r/s离心5min，再次弃去上清，再用Biolog接种液进行悬浮菌体，最后再转至15ml的接种液中。调至浓度约107～108；接种，将以上菌悬液倒至接种皿中，震荡均匀，用12道(或8道)排枪进行加样，每个Biolog板孔加样100ul，共96孔，加完样后，盖上Biolog板盖，放置在37℃下培养，24h和48h进行观察，并记录结果，见图2和表2，LCT-SA67菌株不能利用丙酮酸甲 酯为碳源，而地面对照LCT-SA112能使用该碳源。
表2：LCT-SA67菌株的生理生化鉴定结果
| 编号 | 底物 | LCT-SA67菌株 | 地面对照菌株 |
| B2 | α-D-乳糖 | + | +/- |
| B5 | D-柳醇 | + | +/- |
| D9 | D-丝氨酸 | + | +/- |
| F10 | 万古霉素 | +/- | + |
| G2 | 丙酮酸甲酯 - | + |
实施实例四：金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株的生长曲线
活化菌株，在15ml试管(4ml培养基)中培养1d，然后接种至100孔蜂窝板中，在Bioscreen中进行生长曲线的测定，测定24h，读取数据；将每株菌所得到的OD值进行平均值的计算，然后再做曲线，见图3和图4，LCT-SA67菌株同对照菌株LCT-SA112相比无差异。
实施实例五：LCT-SA67菌株的基因组测序和比较基因组分析
培养金黄色葡萄球菌并提取基因组DNA，首先采用超声法将检测合格的DNA样品随机打断，得到一系列DNA片段，经T4DNA聚合酶、KlenowDNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶等处理后，回收目的片段，得到测序文库，利用Illumina的Genome Analyzer ll测序；测序结束后得到的reads，经过滤处理后进行组装和分析；采用Glimmer3.0软件注释基因并分析SNP、Indel、基因重排和结构变异等。发现的SNP改变基因见表1，Indel分析未发现明显变化。测序的质控即GC含量与Depth关联分析统计图见图5，其中横坐标是GC含量，纵坐标是平均深度。以500bp为窗口无重复的计算其GC含量和平均深度，该散点图近似于泊松分布，即测序过程中GC无明显偏向性。共线性及重排分析见图6的二维共线性图，图中横轴是参考序列基因组，纵轴是所测基因组，颜色较浅的水平或垂直的直线表示各个Scaffold之间的分割，红色线条表示所测基因组的核酸序列在正链，蓝色表 示所测基因组的核酸序列在负链。
实施实例六：金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株的转录组测序分析
提取金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株总RNA后，用试剂盒去除rRNA后。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase l合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM 2000进行测序。将原始序列数据去除杂质数据后统计rRNA统计、评价Reads在基因组上的分布基因覆盖度、统计基因表达量差异、分析差异表达基因等，见表3、表4、图7和图8，差异表达基因详见附表1，满足FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1.5条件的上调基因16个，下调基因7个。图7为基因测序覆盖度指每个基因被reads覆盖的百分比，其值等于基因中unique mapping reads覆盖的碱基数跟基因编码区所有碱基数的比值。
表3：样品LCT-SA67和参考基因组比对的统计结果
表4：样品LCT-SA112和参考基因比对的统计结果
上述表格各列含义如下：
实施实例七：金黄色葡萄球菌LCT-SA67菌株的差异蛋白组学分析
从金黄色葡萄球菌LCT-SA67样品中提取蛋白；对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续充分酶解蛋白；用GE公司的2D quant kit法进行蛋白质的浓度测定；等体积进行SDS(十二烷基磺酸钠)电泳；酶解蛋白；用iTRAQ试剂标记肽段；将标记后的肽段进行等量混合；对混合后的肽段使用强阳离子交换色谱(Strong Cation Exchange Choematography，SCX)进行预分离；进行液相串联质谱(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。对质谱下机的原始文件，进行峰识别，得到峰列表；建立参考数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定；最后比较各蛋白在各样品之间的相对含量的关系，从而获得一些感兴趣的重要蛋白，上调和下调的蛋白分子见下附表2，上调下调蛋白统计见图9，统计的依据为蛋白丰度差异倍数超过2倍以上时；经统计检验其p-value值小于0.05；三次重复中至少两次重复中满足上述要求，结果显示3个蛋白表达增高，7个蛋白表达量下降。
关于保藏的LCT-SA67菌株的说明
A.菌种的保藏单位名称和地址
名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
B.交机构保藏的日期
2012年9月5日
C.保藏机构给予的保藏号
CGMCC No.6517
D.菌株分类命名：金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus
附件1
附件2
Claims (1)
1.一种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）LCT-SA67，其保藏号为：CGMCC NO：6517，其特征在于：革兰氏染色阳性，呈球状、聚团排列；同地面对照株的抗生素耐受性相比，无差异；无生长速度的差异；不能利用丙酮酸甲酯为碳源，而地面对照能使用该碳源。
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