CN103773887A - 一种小鼠肠道菌群失调eric-pcr指纹图谱的制备方法 - Google Patents

一种小鼠肠道菌群失调eric-pcr指纹图谱的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种小鼠肠道菌群失调的ERIC-PCR指纹图谱的制备方法。所述方法包括抗生素相关性腹泻致小鼠肠道菌群失调造模、提取盲肠内容物DNA、清除盲肠内容物DNA中的腐殖酸、清除盲肠内容物DNA中的PCR抑制物、ERIC-PCR扩增及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE），通过与常规菌群分析结果做比较，从而建立小鼠肠道菌群失调的ERIC-PCR指纹图谱的制备方法。本发明是以纯系小鼠为研究对象，解决传统的细菌培养方法应用于微生物群落分析所带来的不足。该方法可用于实验小鼠肠道菌群失调的快速检测，避免传统的细菌分离培养的操作繁琐、耗时长、工作量大等缺点，能够准确、快速有效地检测小鼠肠道菌群分布状况。

Description

一种小鼠肠道菌群失调ERIC-PCR指纹图谱的制备方法
技术领域
本发明属于细菌基因组指纹图谱制备领域，特别涉及一种小鼠肠道菌群失调ERIC-PCR指纹图谱的制备方法。
背景技术
菌群失调（dysbacteriosis）是基础及临床研究经常遇到的问题，它是外源性感染和内源性感染的起始因素，一旦发生很难控制。引起菌群失调的因素有很多，包括饮食因素、菌丛的变化因素、药物的代谢因素、年龄因素及胃肠道免疫功能障碍因素。因此，对于机体肠道菌群结构多样性及种群动态变化进行研究对治疗菌群失调具有至关重要的意义。
最常见的、也是最被人们所熟悉的一种菌群失调，就是“腹泻”症状。腹泻是一种粪便稀薄、排便次数增加的表现，为多种类似症状的统称。在临床上一般将其分为感染性腹泻和非感染腹泻2种，其中感染性腹泻约占80%。对于感染性腹泻，人们习惯于使用抗生素进行治疗，然后由于抗生素的大量盲目使用，使肠道中有益菌被抑制，使其数量急剧减少，肠道微生态平衡被打破，导致菌群失调，此时肠上皮细胞的代谢调节水平和生理功能发生紊乱，使腹泻进一步加重，即抗生素相关性腹泻（Antibiotic Associated Diarrhea，AAD）。其发生率视不同抗生素而异，约为15％～39％。凡能对抗细菌的药物，几乎均可引起AAD，多见于氯林可霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、阿奇霉素、头孢菌素等抗生素。为深入开展菌群失调研究，常需要建立抗生素相关性腹泻动物模型。
检测菌群失调一般采用传统的细菌培养方法，虽然可行，但肠道内微生物多数都是厌氧菌，采用传统的培养方法难以分析，并且传统的细菌分离和培养方法操作繁琐，耗时、费力，重复性差，易受操作方法等因素的影响。随着分子生物学的发展，一些基于微生物遗传物质的分子生物学方法，如PFGE、RAPD-PCR、REA、RFLP、ERIC-PCR等，可以克服传统方法的缺陷，与传统的培养方法相比优势明显，已应用于微生物群落分析研究中。其中，以肠杆菌基因间重复一致序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences，ERIC）为基础的ERIC-PCR指纹图谱鉴定，具有灵敏度高、可重复性和可靠性好、省时省力，是目前应用最广泛的方法之一。ERIC是存在于多种细菌基因组中的串联重复序列，主要存在于肠道细菌基因组间，目前尚未在细菌噬菌体和质粒上发现有ERIC的存在。ERIC具有不完整的反向重复性和高度保守性，二级结构可以形成稳定的茎环结构，该序列长约44bp，在染色体上存在的位置和拷贝数随物种的不同而有差异。由于不同的细菌基因组上的ERIC重复序列的数目和分布不同，可根据这一ERIC核心序列设计反向引物进行PCR扩增，得到一系列有大小不同的片段组成的DNA指纹图谱，即DNA迁移带。在一定范围内，DNA迁移带的大小和多少代表着此重复序列间的距离和重复次数。因此，基因组DNA的差异可清晰显示在指纹图谱上，根据电泳条带来区分菌株（型）。ERIC-PCR指纹图谱具有高度的稳定性和良好的可重复性。
采用ERIC-PCR方法对正常小鼠和抗生素相关性腹泻小鼠进行肠道菌群基因组DNA扩增，快速检测并获得菌群分布状况。与传统方法比较，可以得出较为准确的菌群定性结果。这对于相关基础及临床研究，尤其是流行性肠道疾病快速诊断会有很大的用途。
发明内容
本发明的目的是提供一种以小鼠为研究对象，解决传统的细菌培养方法应用于微生物群落分析所带来的不足，而建立的一种小鼠肠道菌群失调的ERIC-PCR指纹图谱的制备方法。为实现上述目的，本发明的具体步骤为：建立抗生素相关性腹泻致小鼠肠道菌群失调动物模型、提取盲肠内容物DNA、清除盲肠内容物DNA腐殖酸、清除盲肠内容物DNA中的PCR抑制物、ERIC-PCR扩增、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）。
本发明的制备方法如下：
（1）采用粪便DNAout试剂盒，从盲肠内容物标本中提取基因组DNA，方法如下：
a、65℃预热溶液A，待其沉淀溶化后，充分混匀，然后取0.5mL加入到1.5mL塑料离心管中并放置于65℃待用。最好使用螺旋盖离心管；
b、取0.1-0.3g的新鲜或冷冻的盲肠内容物，加入到含预热溶液A的离心管中，振荡器上剧烈振荡使菌体样品裂解，再加B液处理并抽提、乙醇沉淀和洗涤，所得DNA沉淀溶解于TE或无菌水，-20℃保存备用。
（2）所提取的盲肠内容物DNA用柱式腐殖酸清除剂清除腐殖酸得到纯化的DNA溶液，去除DNA溶液中小鼠肠道细菌蛋白质、腐殖酸。
（3）ERIC-PCR扩增：采用合成引物ERIC1R、ERIC2对盲肠内容物DNA进行PCR扩增。取盲肠内容物DNA作为PCR模板，将PCR抑制物清除剂加入到PCR反应体系中，PCR抑制物清除剂加入量与PCR总反应体系总量的体积比1：10，进行PCR扩增，然后取扩增产物，用于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上样，胶浓度为10%，设定电泳条件：室温，150V，90min，电泳缓冲液为1×TBE，电泳结束后凝胶采用Syber-GreenⅠ染色30min，并立即进行紫外拍照，即得小鼠肠道菌群失调的ERIC-PCR指纹图谱。
PCR抑制物清除剂用于去除PCR抑制物。
ERIC-PCR引物，序列如下:
ERIC1R：5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’，
ERIC2：5’-AGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’；
引物粉末短暂离心后，加入灭菌ddH2O配制成100μM储备液，经1：10稀释成10μM工作液。
所述非变性聚丙烯酰胺凝胶以30%聚丙烯酰胺、5×TBE为原料，10%APS作为促凝剂，TEMED作为催化促凝剂。
所述ERIC-PCR扩增，扩增程序：95℃预变性7min，94℃变性1min，52℃退火1min，65℃延伸8min，循环35次，65℃延伸16min。
粪便DNAout试剂盒、柱式腐殖酸清除剂、PCR抑制物清除剂均购于北京天恩泽基因科技有限公司。
本发明将ERIC-PCR技术用于小鼠肠道菌群的快速鉴别，可以避免传统的分离培养方法的耗时长、工作繁重，操作繁琐等缺点，常规菌群分析方法有较大的局限性：一是分离培养细菌操作繁琐，用时至少2～3天，后续的菌落计数工作量也较大；二是检测菌群种类有限，无法获得更多的肠道菌群分布状况。同时由于传统方法无法对所有微生物进行分离培养，可能造成原始菌群缺失，无法获取实时和全面的菌群信息，而采用ERIC-PCR可以检测到相对含量极低的菌群，而且操作简便对于实验室设备条件没有过高要求，用时1天左右，能够准确、快速有效地检测两组小鼠的肠道菌群分布状况。
应使用试剂盒提取小鼠盲肠内容物DNA，并清除腐殖酸和PCR抑制物，使盲肠内容物DNA在成分极其复杂的粪便中被简易有效地提取和纯化，继而方便后续的ERIC-PCR反应，省时省力。
采用ERIC-PCR，样品在设定的电泳条件下，用PAGE胶进行条带分离，基因组DNA差异可清晰显示在图谱上，图谱具有高度稳定性和可重复性，能够得出较为准确的菌群定性结果，从而建立肠道菌群快速检测平台。
附图说明
图1为正常小鼠及肠道菌群失调小鼠盲肠内容物DNA ERIC-PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳结果；
图2为正常小鼠及肠道菌群失调小鼠盲肠内容物DNA ERIC-PCR产物10%Native-PAGE凝胶电泳结果，M：DNA Marker DL2000；S1～S4：正常组小鼠；K2～K5：模型组小鼠。
具体实施方式
以下实施例子进一步解释本发明的内容，但并不用以限制本发明。
实施例1小鼠肠道菌群失调造模
将24只纯系Balb/c小鼠适应性饲养7天后随机分为2组，每组12只，均为雄性，体质量在20±2g，分别为正常（生理盐水，NS）组和模型组。正常组小鼠用NS灌胃0.35mL/只/次，每天灌胃2次，作为对照组。模型组小鼠每天每只给药量分别为硫酸庆大霉素28mg和头孢拉定70mg，按用药量配成混合抗生素溶液后给药0.35mL/只/次，每天灌胃2次，造成小鼠肠道菌群失调。混合抗生素溶液是由硫酸庆大霉素（80mg/2mL/支）40支和头孢拉定（1g/瓶）8瓶混匀而成。正常组和模型组均连续处理7d。
实施例2样品采集与处理
将两组实验小鼠颈椎脱臼处死后，在75%酒精中浸泡片刻，解剖小鼠腹部，用无菌小勺取少量小鼠盲肠内容物，使盲肠内容物重量在0.15g，4℃保存或直接用于后续基因组提取操作，另取少量盲肠内容物（0.01～0.10g）用于常规菌群分析（作为ERIC-PCR鉴定方法的参照）。
实施例3常规菌群分析
用NS将盲肠内容物做连续10倍稀释，即从10-1至10-7，常规方法分离培养细菌，EMB、EC平板于37℃正置培养18h，LBS、BS平板于37℃正置厌氧培养48h，选择菌落生长密度为10-100个的平板进行菌落计数，计算每克盲肠内容物中肠杆菌、肠球菌、乳杆菌和双歧杆菌的菌落数（CFU/g），以Lg10n/g表示，各组数据结果用mean±SE表示，统计学分析采用两样本均数t检验。正常组中，肠杆菌3.68±0.28CFU/g，肠球菌3.65±0.34CFU/g，乳杆菌6.16±0.11CFU/g，双歧杆菌6.58±0.08CFU/g；模型组中，肠杆菌5.29±0.21CFU/g，肠球菌5.14±0.21CFU/g，乳杆菌4.83±0.21CFU/g，双歧杆菌4.89±0.21CFU/g。肠杆菌P=0.001＜0.01，肠球菌P=0.003＜0.01，乳杆菌P=0.000＜0.01，双歧杆菌P=0.000＜0.01，四种菌群两组间比较均有显著的统计学意义。常规菌群分析结果表明四种优势菌群在数量上出现明显的变化，证实造模成功。
实施例4小鼠盲肠内容物基因组DNA的提取
采用粪便DNAout试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司，CAT#:70601）从盲肠内容物标本中提取基因组DNA。
（1）65℃预热溶液A，待其沉淀溶化后，充分混匀，然后取0.5mL加入到1.5mL塑料离心管中并放置于65℃待用。最好使用螺旋盖离心管。
（2）取0.1-0.3g的新鲜或冷冻的盲肠内容物，加入到含预热溶液A的离心管中，振荡器上剧烈振荡5-10min。注意:一定要让管底的样品充分振荡起来。
（3）将离心管置于65℃水浴中保温至少5min。
（4）13000-15000g室温离心3min，将上清转移到一新的1.5mL塑料离心管中。
（5）在上清液中加入等体积的溶液B，上下颠倒30s使之充分混匀，溶液将呈白色或淡黄色混浊状。
（6）将离心管冰浴至少5min。
（7）13000-15000g室温离心3min，转移上清到新的1.5mL塑料离心管中。
（8）加入0.2mL的氯仿（自备），振荡器上充分振荡30s混匀。注意：一定要让管底的溶液振荡起来。
（9）13000-15000g室温离心3min，小心转移上清到新的1.5mL塑料离心管中。
（10）重复第8步和第9步各一次。
（11）将上清转移到新的1.5mL离心管时，不要超过0.5mL，否则没有空间加两倍体积的乙醇。如果有多余的可以弃之不用。
（12）加入2倍体积的乙醇（自备），上下颠倒30s混匀，15000g离心5-10min，弃上清，管底将有微小DNA沉淀。注意：最好不要用异丙醇代替乙醇，否则不容易去除带色素的杂质。
（13）加入1mL75%乙醇（自备），振荡数秒，13000-15000g室温离心3min，弃上清。
（14）重复上步清洗一次。注意：75%乙醇洗两次有助于去除PCR抑制物。短暂离心，吸弃残留的75%乙醇（约50μL），室温晾干。注意：一定要去除残留的75%乙醇，否则会影响后续反应和电泳上样（样品会飘走）。
（15）加入30μL TE缓冲液溶解沉淀。注意：不知道样品DNA产率前最好不要加过多TE。如果DNA浓度偏高，可以再加TE稀释。
实施例5腐殖酸的清除
（1）采用柱式腐殖酸清除剂（北京天恩泽基因科技有限公司，CAT#：60801），将0.3mL专用上柱液与50μL或50μL以下的含腐殖酸的DNA溶液轻柔混匀。如果DNA溶液体积超过50μL,专用上柱液的体积需按1：6（DNA溶液:专用上柱液）的比例相应增加。不要剧烈振荡，否则DNA容易断裂。
（2）将离心管中的溶液转移到离心吸附柱中，套上收集管，放于离心管架上，静置3-5min，12000-15000g离心1min并倒掉收集管中的液体。若一次加不完，可分两次加入并离心。
（3）加入0.5mL通用洗柱液于离心柱中，12000-15000g离心1min，倒弃收集管中的废液。
（4）重复第3步操作1次。
（5）12000-15000g离心1min以去除离心柱中的残留液体。
（6）将离心柱置于一新的干净的离心管（自备）中，加入50μL通用洗脱液，静置3-5min，12000-15000g离心1min。
（7）离心管底部所得溶液即为纯化的DNA溶液。4℃保存或用于后续实验。
实施例6ERIC-PCR
（1）由宝生物工程（大连）有限公司合成ERIC-PCR引物。
ERIC1R：5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’；
ERIC2：5’-AGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。
引物粉末短暂离心后，加入灭菌ddH2O配制成100μM储备液，经1：10稀释成10μM工作液。
（2）ERIC-PCR反应液的配制
取1μL纯化的盲肠内容物DNA作为模板，利用ERIC1R、ERIC2进行ERIC-PCR扩增。ERIC-PCR反应体系（总体积25μL）：Premix Ex Taq12.5μL，盲肠内容物DNA溶液1μL，ERIC1R0.5μL，ERIC20.5μL，ddH2O10.5μL，PCR抑制物清除剂（北京天恩泽基因科技有限公司，CAT#：60804）2.5μL。PCR扩增程序：95℃预变性7min，35个循环（94℃变性1min，52℃退火1min，65℃延伸8min），65℃延伸16min；进行2%琼脂糖凝胶电泳并拍照（图1）。
实施例7非变性聚丙烯酰胺凝胶
取PCR产物10μL上样。配制10%非变性聚丙烯酰胺凝胶：4mL ddH2O、2.6mL5×TBE、100μL10%APS和4μL TEMED加入到3.3mL30%聚丙烯酰胺溶液中，待1h凝胶后即可使用。采用北京市六一仪器厂的水平电泳仪（DYY-6C型）进行电泳，设定电泳条件：室温，150V，90min，电泳缓冲液为1×TBE。电泳结束后，采用凝胶1：10000的Syber-GreenⅠ溶液染色30min，并立即进行紫外拍照（见图2）。
结果表明，8只小鼠肠道菌群基因组DNA经ERIC-PCR扩增及Native-PAGE，得到大小分布于0～2000bp的特异性条带。正常组小鼠ERIC-PCR特异性条带呈现多样性，模型组小鼠ERIC-PCR特异性条带渐成单一化，模型组小鼠较正常组肠道菌群明显减少。
正常组小鼠肠道菌群种类丰富，ERIC-PCR特异性条带呈现多样性；而模型组小鼠由于肠道菌群失调导致以厌氧菌为主的正常优势菌群数量急剧下降，因此ERIC-PCR特异性条带渐成单一化。

Claims (4)

1.一种小鼠肠道菌群失调ERIC-PCR指纹图谱的制备方法，其特征在于：
(1)从盲肠内容物标本中提取基因组DNA；
(2)所提取的盲肠内容物DNA须用柱式腐殖酸清除剂清除腐殖酸，从而得到纯化的DNA溶液；
(3)采用合成引物ERIC1R、ERIC2，取纯化的DNA溶液作为PCR模板，PCR抑制物清除剂加入到PCR反应体系中，进行PCR扩增；取扩增产物用于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上样，电泳结束后凝胶采用Syber-GreenⅠ染色，并立即进行紫外拍照，即得小鼠肠道菌群失调ERIC-PCR指纹图谱；所述ERIC1R引物的序列为5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’，所述ERIC2引物的序列为5’-AGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’；所述PCR抑制物清除剂加入量与PCR总反应体系总量的体积比1：10。
2.如权利要求1所述小鼠肠道菌群失调ERIC-PCR指纹图谱的制备方法，其特征在于：所述非变性聚丙烯酰胺凝胶为以30%聚丙烯酰胺、5×TBE为原料，10%APS作为促凝剂，TEMED作为催化促凝剂。
3.如权利要求1所述小鼠肠道菌群失调ERIC-PCR指纹图谱的制备方法，其特征在于：所述PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性7min，94℃变性1min，52℃退火1min，65℃延伸8min，循环35次，65℃延伸16min。
4.权利要求1所述小鼠肠道菌群失调ERIC-PCR指纹图谱的制备方法在小鼠肠道菌群失调快速鉴别的应用。
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