CN110195096A - 一种用于检测血流感染致病菌的样本处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及临床检测技术领域，公开了一种用于检测血流感染致病菌的样本处理方法。本发明将待测样本进行红细胞裂解，然后将所得沉淀中加入血细胞裂解液以及指示溶剂混匀，蛋白裂解并孵育，离心后获取所述指示溶剂及其下层的沉淀，获得分离样本；将所述分离样本同时进行RNA和DNA提取，即最终获得混合核酸溶液。本发明先红细胞裂解再用血细胞裂解液裂解可最大限度保证致病菌不被裂解，高效保证血液样本中致病菌的分离；利用活菌体中RNA水平远远高于基因组DNA拷贝数的特性，同时提取致病菌的基因组DNA和RNA，相对于常规的致病菌检测方案中的样本预处理，能够保证微量致病菌的阳性检出率。

Description

一种用于检测血流感染致病菌的样本处理方法

技术领域

本发明涉及临床检测技术领域，具体涉及一种用于检测血流感染致病菌的样本处理方法。

背景技术

血流感染(bloodstreaminfection，BSI)，是临床上重症感染性疾病之一，根据症状不同可分为败血症、脓毒症和脓毒性休克，具有较高的发病率和致死率，其常见感染源包括细菌和真菌。现阶段，血流感染诊断的金标准是血培养，通过生化方法或显微镜观察确定病原体，但该方法耗时长，通常需要数天时间才能确定结果，且对于难培养或无法培养的病原体，则难以准确检测。在缺乏准确诊断结果的情况下，临床医师为了缓解病症，可能盲目使用抗生素，导致患者的生存率降低、细菌耐药性的出现以及治疗费用的增加等。

目前，常规的检测方法大致分为两类，一类是根据血培养菌株，或者快速培养的方式，对致病菌进行放大培养，然后通过不同的检测平台进行菌株鉴定和耐药基因位点分析。但这种方式的鉴定周期相对较久(阳性报警需要1到5天，甚至更长)，无法满足临床早期、快速诊断以指导治疗的需要，针对病死率如此高的病例，往往更早确定致病菌，可最大程度保证临床治疗效果，而且血流感染患者通过培养的方式，仅可检测到30％-40％的致病菌，同时也不适合临床实验室对不易培养的微生物的及时检出，如军团菌属、巴尔通氏体属和曲霉属真菌等，血流感染初期的24小时内，若未能及时进行早期诊断以及合理的抗菌药物治疗将会导致患者存活率大大下降。

另外一类是通过血液中的致病菌进行分离，进一步通过菌体核酸获取，对菌体进行鉴定的方法，此类方法中，大都采用PCR或荧光定量PCR方法，而且均是针对致病菌株的基因组DNA进行检测、鉴定实验。其检测灵敏度较低，针对临床血流感染患者，其血液样本中致病菌的含量为不大于10CFU/mL，甚至更低，其检测方法学往往不能达到阳性检测的效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检测血流感染致病菌的样本处理方法，使得所述样本处理方法提高菌体核酸的最大回收率以及低浓度致病菌的阳性检出率。

为了实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：

一种用于检测血流感染致病菌的样本处理方法，包括：

步骤1、待测血液样本加入红细胞裂解液进行裂解，将红细胞裂解后的样本通过离心获得包含菌体及白细胞的沉淀，往所述沉淀中加入血细胞裂解液以及与血液不互溶且密度大于全血密度(1.06g/mL)的介质，孵育，离心后获取所述介质及其下层的沉淀，获得分离样本；

步骤2、将所述分离样本同时进行RNA和DNA的提取，获得混合核酸溶液；

其中，所述血细胞裂解液为盐酸胍、山梨醇或皂素的RNase-free的水溶液；所述与血液不互溶且密度大于全血密度的介质在本发明具体实施过程中为氟化油。

针对现有检测方法中灵敏度较低的问题，本发明从提高致病菌核酸回收率和同时提取致病菌RNA和DNA两个方向入手处理血液样本，以便提高PCR检测低浓度(微量)致病菌的阳性检出率。

本发明在红细胞裂解后再添加本发明所述血细胞裂解液进行裂解，利用致病菌细胞壁和人类细胞细胞膜对所述血细胞裂解液裂解性能存在的差异，最大限度保证致病菌不被裂解，获得菌体的最大效率回收，同时去除人类血细胞，高效保证血液样本中致病菌的分离；作为优选，所述血细胞裂解液选自浓度为4-7M的盐酸胍、质量百分比浓度为1-5％的山梨醇；在本发明具体实施方式中，所述盐酸胍的浓度为4M、5M、6M或7M，所述山梨醇的浓度为1％、2.74％或5％。

在本发明具体实施方式中，所述红细胞裂解液组成为NH₄CL 8.29g/L，KHCO₃1.00g/L，Na₂EDTA37.2mg/L，pH 7.2-7.4。

作为优选，所述血液样本和红细胞裂解液的体积比为1：(1-4)，在本发明具体实施方式中，上述体积比为1:1、1:2、1:3或1:4。

作为优选，所述包含菌体及白细胞的沉淀与血细胞裂解液的体积比为(1-2)：(1-2)，在本发明具体实施方式中，上述体积比为2:1、1:1或1:2。

在本发明具体实施方式中，所述步骤2可优选采用市售试剂盒天根DP316同时进行RNA和DNA的提取，其中同类产品或可获得相同核酸样本的设备耗材、试剂均可被使用，具体过程如下：

步骤2.1、向所述分离样本中按1:1的比例加入裂解液，加8ul蛋白酶K(25mg/ul)，56℃水浴10-30min左右，孵育期间晃动混匀2次；

步骤2.2、在裂解液孵育后的分离样本中加入0.2-1微克的carrier RNA并晃动混匀，将上清液加入吸附柱CB3中，离心30s，弃废液；

步骤2.3、加500ul缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液；

步骤2.4、加600ul缓冲液PW，12000rpm离心30s，弃废液；

步骤2.5、再次离心2min，把吸附柱转移至干净的离心管中，室温放置2min，使乙醇挥发；

步骤2.6、往吸附柱中悬空加入30ul事先预热的DDW；室温放置5min，12000rpm离心2min；弃吸附柱，剩下的为混合核酸溶液。

作为优选，在将所述分离样本同时进行RNA和DNA的提取后，还包括将所述RNA逆转录为cDNA，此时混合核酸溶液为DNA和cDNA的混合溶液。

本发明人为往血液中掺入了5-10CFU的大肠杆菌作为模拟样本，采用本发明所述处理方法进行处理和常规血培方法，然后采用相同的液滴式数字PCR进行检测，结果显示，以本发明处理方法处理的样本经过检测后能够获得较多的阳性点数，而对照的血培方法无法获得阳性点数。

同时，本发明对比不同血细胞裂解液的效果，结果显示，本发明所采用的盐酸胍和山梨醇相比SDS有更好的检测效果。

由以上技术方案可知，本发明先红细胞裂解再用血细胞裂解液裂解可最大限度保证致病菌不被裂解，高效保证血液样本中致病菌的分离；利用活菌体中RNA水平远远高于基因组DNA拷贝数的特性，同时提取致病菌的基因组DNA和RNA，相对于常规的致病菌检测方案中的样本预处理，能够保证微量致病菌的阳性检出率。

附图说明

图1所示为采用山梨醇为血细胞裂解液的模拟样本液滴式数字PCR扩增结果；

图2所示为采用盐酸胍为血细胞裂解液的模拟样本液滴式数字PCR扩增结果；

图3所示为采用SDS为血细胞裂解液的模拟样本液滴式数字PCR扩增结果。

具体实施方式

本发明公开了一种用于检测血流感染致病菌的样本处理方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述样本处理方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述样本处理方法用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，如无特别说明，所涉及的对比试验中，除去各组应有的技术区别外，其他试验所用试剂、样本等材料以及试验环境均一致。

以下就本发明所提供的一种用于检测血流感染致病菌的样本处理方法做进一步说明。

实施例1：本发明样本处理方法

1、菌体分离

按表1中试剂进行菌体分离；

表1

利用红细胞裂解液，将患者血浆样本进行红细胞裂解，血液样本与红细胞裂解液加入比为1：3，4度孵育10分钟左右，将红细胞裂解后的样本通过离心获得包含菌体及白细胞的沉淀；

所述沉淀按照1：1的比例加入血细胞裂解液，加入20-50微升的氟化油，充分震荡混匀。

加入蛋白酶K裂解蛋白，55度孵育5-10分钟，12000rpm离心10分钟，分离菌体。

将离心后的样本，小心去除上清液，获取氟化油及其下层的沉淀，获得分离样本。

2、核酸提取

优选市售天根DP316试剂盒按说明进行DNA和RNA的提取，具体如下：

分离样本按1:1的比例加入裂解液，加8ul蛋白酶K(25mg/ul)，56℃水浴10-30min左右，孵育期间摇晃震荡2次。

在裂解液孵育后的分离样本中加入0.2-1微克的carrier RNA并晃动混匀，将上清液加入吸附柱CB3中，离心30s，弃废液；

备注：由于吸附柱最大承受量为700ul，因此分多次将所有的上清液过柱。

加500ul缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液。

加600ul缓冲液PW，12000rpm离心30s，弃废液。重复一次。

12000rpm空转2min，把吸附柱转移至干净的离心管中，室温放置2min，使乙醇挥发。

往吸附柱中悬空加入30ul事先预热的DDW，室温放置5min，12000rpm离心2min。弃吸附柱，剩下的为混合核酸溶液(DNA+RNA)。

实施例2：本发明样本处理方法和常规血培方法的对比

人为往血液中掺入了5-10CFU的大肠杆菌作为模拟样本，分别按照本发明样本处理方法(实施例1)和常规血培方法进行处理，然后在相同的液滴式数字PCR条件下扩增，结果见表2；

表2

以上实验结果显示，在相同微量菌体浓度条件下，经过本发明样本处理方法获得的样本经过检测能够获得更多的阳性点数，而常规血培方法无法获得阳性点数，表明本发明所述方法能够保证微量致病菌的阳性检出率。

实施例3：不同血细胞裂解液的对比

仍以往血液中掺入的大肠杆菌(9CFU)作为模拟样本，将模拟样本分为三份，参照实施例1的方法处理，区别在于血细胞裂解液不同，然后在相同的液滴式数字PCR条件下扩增，结果见表3和图1-3；

表3

组别	血细胞裂解液	阳性扩增点个数
			1	2.74％山梨醇的RNase-free水溶液	61个
2	5M盐酸胍的RNase-free水溶液	73个
			3	5％SDS的RNase-free水溶液	34个

由图1-3以及表3结果可以看出，相同微量浓度致病菌的前提下，采用盐酸胍和山梨醇能够获得更多的阳性扩增点数，而SDS所获得的阳性扩增点数较少。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于检测血流感染致病菌的样本处理方法，其特征在于，包括：

步骤1、待测血液样本加入红细胞裂解液进行裂解，将红细胞裂解后的样本通过离心获得包含菌体及白细胞的沉淀，往所述沉淀中加入血细胞裂解液以及与血液不互溶且密度大于全血密度的介质混匀，蛋白裂解并孵育，离心后获取所述介质及其下层的沉淀，获得分离样本；

步骤2、将所述分离样本同时进行RNA和DNA的提取，获得混合核酸溶液；

其中，所述血细胞裂解液为盐酸胍或山梨醇的RNase-free水溶液。

2.根据权利要求1所述样本处理方法，其特征在于，所述血细胞裂解液为浓度为4-7M的盐酸胍的RNase-free水溶液或质量百分比浓度为1-5％的山梨醇的RNase-free水溶液。

3.根据权利要去1所述样本处理方法，其特征在于，所述红细胞裂解液组成为NH₄CL8.29g/L，KHCO₃ 1.00g/L，Na₂EDTA 37.2mg/L，pH 7.2-7.4。

4.根据权利要求1所述样本处理方法，其特征在于，所述血液样本和红细胞裂解液的体积比为1：(1-4)。

5.根据权利要求1所述样本处理方法，其特征在于，所述包含菌体及白细胞的沉淀与血细胞裂解液的体积比为(1-2)：(1-2)。

6.根据权利要求2所述样本处理方法，其特征在于，所述步骤具体如下：

步骤2.1、向所述分离样本中按1:1的比例加入裂解液，加8ul蛋白酶K(25mg/ul)，56℃水浴10-30min左右，孵育期间晃动混匀2次；

步骤2.2、在裂解液孵育后的分离样本中加入0.2-1微克的carrier RNA并晃动混匀，将上清液加入吸附柱CB3中，离心30s，弃废液；

步骤2.3、加500ul缓冲液GD，12000rpm离心1分钟，弃废液；

步骤2.4、加600ul缓冲液PW，12000rpm离心1分钟，弃废液；

步骤2.5、再次离心2min，把吸附柱转移至干净的离心管中，室温放置2min，使乙醇挥发；

步骤2.6、往吸附柱中悬空加入30ul事先预热的DDW；室温放置5min，12000rpm离心2min；弃吸附柱，剩下的为混合核酸溶液。

7.根据权利要求1所述样本处理方法，其特征在于，在将所述分离样本同时进行RNA和DNA的提取后，还包括将所述RNA逆转录为cDNA。