CN105132410B - 一种微生物基因组dna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种微生物基因组DNA的提取方法，步骤如下：(1)收集样本菌体，加入STES缓冲液重悬，加入玻璃珠，以TE缓冲液溶解；(2)加入等体积酚/氯仿溶液，震荡混合后第一次离心；(3)向第一次离心后的上层水相中加入等体积氯仿/异戊醇溶液，混合后第二次离心；(4)向第二次离心后的上层水相中加入等体积异丙醇或两倍体积无水乙醇，室温下沉淀，第三次离心，收集沉淀；(5)对沉淀使用乙醇洗涤，再次离心得到DNA沉淀，使用无菌水溶解DNA沉淀，进行磁珠纯化，得到所提取的微生物基因组DNA。使用本方法提取得到的基因组DNA具有浓度高、条带单一、无污染的优点，满足三代测序的要求。

Description

一种微生物基因组DNA的提取方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种应用于分子测序技术中的对微生物基因组的提取方法。

背景技术

近年来，病原微生物的基因组研究取得了飞速的进展。通过基因组研究，可以从根本上揭示微生物的全部基因，不仅可发现新的基因，还可发现新的基因间相互作用、新的调控因子等。这一研究将使人类可从更高层次上掌握病原微生物的致病机制及其规律，从而得以发展新的诊断、预防及治疗微生物感染的制剂、疫苗及药品。

随着测序技术的不断发展，第二代高通量测序技术已经广泛的应用于各项研究领域中，但其不足之处也日益凸显。比如，二代测序读长短，对后续的序列拼接、组装以及注释等生物信息学分析带来困难；且该技术建立在PCR的基础上，扩增后得到的片段数目和扩增前比例有相对偏差，对基因表达分析有很大的影响。这些缺点在一定程度上制约了二代测序的发展，因此三代测序应运而生。

第三代测序技术是指单分子测序技术，DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。由于具有读长长的特点，三代测序平台在基因组测序中能降低测序后的Contig数量，明显减少后续的基因组拼接和注释的工作量，节省大量的时间。但同时第三代测序技术对基因组的质量要求更高，基因组DNA必须条带单一，无降解，无蛋白和盐离子以及糖类等物质污染。

细菌一般分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌和真菌的基因组提取一直困扰着科研人员。目前提取微生物基因组的方法主要有酶解法、化学或者热裂解法、磁珠或超声波机械破壁，又或者是上述几种方法的结合。但这些方法提取出的基因组浓度很低，且大多污染严重，不能满足三代测序的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种将酚氯仿裂解法和磁珠纯化法相结合来提取微生物基因组DNA的方法，以满足三代测序技术对于基因组DNA的高质量要求。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，包含下述步骤：(1)收集样本菌体，加入STES缓冲液重悬，得到菌悬液；向菌悬液中加入玻璃珠，然后以TE缓冲液溶解，得到待提取菌液；(2)向待提取菌液中加入等体积的酚/氯仿溶液，震荡混合后进行第一次离心，转移第一次离心后的上层水相；(3)向第一次离心后的上层水相中加入等体积的氯仿/异戊醇溶液，混合后进行第二次离心，转移第二次离心后的上层水相；(4)向第二次离心后的上层水相中加入等体积的异丙醇或两倍体积的无水乙醇，在室温下沉淀，然后进行第三次离心，并收集沉淀；(5)对收集到的沉淀使用乙醇溶液洗涤，再次离心得到DNA沉淀，使用无菌水溶解所述DNA沉淀，然后进行磁珠纯化，得到所提取的微生物基因组DNA。

本发明的实施方式所提供的上述方法，将酚氯仿裂解法和磁珠纯化进行了结合，用于对微生物基因组DNA的提取，具体来说，本方法首先使用苯酚来裂解微生物细胞壁，由于苯酚是强氧化剂，其能直接破坏细胞壁释放出DNA，且对菌种没有选择性，广泛适用于对各类菌种的基因组DNA提取过程中；其次，提取后采用磁珠纯化的方法进行再一次纯化，此过程对DNA的损耗和破坏较小，且大大地提高了DNA的纯度，避免了常规过柱纯化方法对基因组的破坏和降解，又或者是无水乙醇沉淀法纯化造成的DNA总量的大部分流失。本发明的实施方式所提供的微生物基因组DNA的提取方法，对微生物细胞壁的裂解完全、对菌种类型没有特异性要求，结合磁珠纯化的方法，耗时少，步骤简捷，使用本方法提取得到的基因组DNA具有浓度高、条带单一、无污染的优点，完全能满足三代测序的要求。值得补充说明的是，本发明在将酚氯仿提取法和磁珠纯化法结合的过程中，最大程度地裂解微生物细胞，释放核酸并且最低程度地减少对基因组DNA的降解和破坏，避免DNA总量的损耗。

优选地，本发明的实施方式所提供的微生物基因组DNA的提取方法中，步骤(1)中的样本菌体为处于指数生长期的菌体。培养至处于指数生长期的菌体，其细胞数以几何级数增长，细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较为一致，较为适宜进行基因组DNA提取和分析。一般来说，对处于指数生长期的菌体进行收集的方法可以为：取达到指数期的菌液，最大转速离心，收集菌体；吸弃培养液，加入PBS缓冲液重悬菌体，最大转速离心，收集菌体。

具体地，本发明的实施方式所提供的微生物基因组DNA的提取方法中，步骤(1)中的STES缓冲液包含下列组份：0.2M Tris-Hcl、0.5M Nacl、0.01M的乙二胺四乙酸和质量浓度为0.1％的十二烷基硫酸钠；步骤(1)中的TE缓冲液包含下列组份：10mM Tris-Hcl和1mM乙二胺四乙酸。

优选地，本发明的实施方式所提供的微生物基因组DNA的提取方法中，步骤(2)中所述的酚/氯仿溶液中，酚和氯仿的体积比为25:24；步骤(3)中的氯仿/异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1。上述提取试剂中，酚使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用；氯仿可加速有机相与液相的分层。在抽提DNA的过程中，为了混合均匀，通常进行剧烈震荡，此时会在混合液内产生大量气泡，而异戊醇的作用是降低分子表面张力，因而能在提取过程中减少气泡的产生。为使酚、氯仿和异戊醇在DNA提取过程中更好地发挥上述作用，步骤(2)中所使用的酚和氯仿的最佳体积比为25:24；步骤(3)中使用的氯仿和异戊醇的最佳体积比为24：1。

优选地，本发明的实施方式所提供的微生物基因组DNA的提取方法中，步骤(5)中所述的磁珠纯化的步骤为：(a)待离心管内的DNA沉淀完全溶解于无菌水中后，向离心管中加入磁珠，混匀后室温静置；(b)将离心管放置在磁力架上，待溶液澄清后，吸弃上清；从磁力架上取出离心管，加入乙醇溶液，震荡混匀；然后将离心管再次放置在磁力架上，待溶液澄清后再次吸弃上清，重复清洗；(c)吸净上清，室温晾干后，加入无菌水溶解，将离心管重新放置在磁力架上，待溶液澄清后，上清液即为所提取的微生物基因组DNA。进一步地，在上述磁珠纯化的步骤(a)中，所使用的磁珠可以为0.6x Axy Prep Mag PCR Clean-UP磁珠，以完成上述的磁珠纯化步骤。

此外，本发明的实施方式所提供的微生物基因组DNA的提取方法中，样本菌体可以为所有微生物种类，尤其是较难破壁的革兰氏阳性菌或真菌。一般来说，革兰氏阴性菌的细胞壁厚约2～3nm，而革兰氏阳性菌细胞壁厚约20～80nm，真菌的细胞壁厚度高达100～250nm。因而，革兰氏阳性菌和真菌的基因组提取在困难程度上较高，而本发明的实施方式所提供的基因组DNA的提取方法，由于结合了酚氯仿法和磁珠纯化法的优点，增大了提取过程中对细菌细胞壁的裂解能力和裂解程度，可成功地对革兰氏阳性菌或真菌完成基因组DNA提取，并获得高浓度、高质量的基因组。

附图说明

图1为实施例1中对9个样本菌体提取到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中，泳道号为样本序号；

图2为对比试验例一中对9个样本菌体提取到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中，泳道号为样本序号，图2-1是序号为1～3的样本的电泳结果图，图2-2是序号为4～6的样本的电泳结果图，图2-3是序号为7～9的样本的电泳结果图；

图3为对比试验例二中对9个样本菌体提取到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中，泳道号为样本序号。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。

实施例1

以下采用本发明所提供的方法分别对下述9个样本菌体进行基因组DNA的提取：

实验操作：

1.STES缓冲液、TE缓冲液的制备：

STES缓冲液：0.2M Tris-Hcl(pH＝8.0)、0.5M Nacl、0.01M EDTA(pH＝8.0)、0.1％SDS，配制100ml，高压灭菌。

TE缓冲液：10mM Tris-Hcl和1mM EDTA。

2.提取步骤：

1)取2ml达到指数期的菌液，最大转速离心，收集菌体；

2)吸弃培养液，加入1ml 1xPBS重悬菌体，最大转速离心，收集菌体；

3)吸净培养介质加入200ul STES缓冲液重悬；

4)向菌悬液中加入200mg玻璃珠，每管加入80ul TE缓冲液；

5)加入等体积的酚/氯仿溶液，(其中按体积比，酚：氯仿＝25：24)，盖上管盖，涡旋器上剧烈震荡1min；

6)最大转速下离心；

7)转移上层水相到新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇溶液，(其中，按体积比，氯仿：异戊醇＝24:1)；

8)最大转速下离心；

9)转移上层水相，加入等体积的异丙醇，室温沉淀10min；

10)4℃下，最大转速离心10min，收集沉淀；

11)倒掉上清，使用70％乙醇洗涤沉淀，最大转速下离心1min；

12)倒掉上清，短暂离心后吸净溶液，加入50ul无菌水溶解DNA沉淀；

13)待DNA沉淀溶解完全后，加入0.6xAxy Prep Mag PCR Clean-UP磁珠，混匀后室温静置10min；

14)将离心管放置在磁力架上，待溶液澄清后，吸弃上清；

15)从磁力架上取出离心管，加入80％乙醇，震荡混匀；

16)将离心管重新放置在磁力架上，待溶液澄清后吸弃上清；

17)重复清洗一次；

18)尽量吸净上清，室温晾干，加入50ul无菌水溶解；

19)将离心管放置在磁力架上，待溶液澄清后，转移上清至新的离心管中，即可得到所提取的基因组DNA。

3.对提取得到的各样本基因组DNA进行质检：

对上述提取到的9个样本菌体的基因组DNA在0.8％的琼脂糖凝胶电泳下检测其完整度，琼脂糖凝胶电泳结果如附图1所示(样本上样量均为100～200ng，M(DL15,000)上样量为3μl)。

对上述提取到的9个样本菌体的基因组DNA在TBS380荧光定量及紫外分光光度计上进行检测，结果如下表1所示：

表1本发明方法提取结果

对比试验例一

使用天根细菌基因组提取试剂盒的提取结果如下表2所示：

表2天根细菌基因组提取试剂盒提取结果

对比试验例一提取到的9个样本菌体的基因组DNA在0.8％的琼脂糖凝胶电泳下检测其完整度，琼脂糖凝胶电泳结果如附图2所示(样本上样量均为100～200ng，M(DL15,000)上样量为3μl)。

对比试验例二

使用CTAB法提取微生物基因组DNA结果如下表2所示：

表2 CTAB法提取结果

对比试验例二提取到的9个样本菌体的基因组DNA在0.8％的琼脂糖凝胶电泳下检测其完整度，琼脂糖凝胶电泳结果如附图3所示(样本上样量均为100～200ng，M(DL15,000)上样量为3μl)。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (7)

1.一种微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，包含下述步骤：

(1)收集样本菌体，加入STES缓冲液重悬，得到菌悬液；向所述菌悬液中加入玻璃珠，然后以TE缓冲液溶解，得到待提取菌液；

(2)向所述待提取菌液中加入等体积的酚/氯仿溶液，震荡混合后进行第一次离心，转移第一次离心后的上层水相；

(3)向所述第一次离心后的上层水相中加入等体积的氯仿/异戊醇溶液，混合后进行第二次离心，转移第二次离心后的上层水相；

(4)向所述第二次离心后的上层水相中加入等体积的异丙醇或两倍体积的无水乙醇，在室温下沉淀，然后进行第三次离心，并收集沉淀；

(5)对收集到的沉淀使用乙醇溶液洗涤，再次离心得到DNA沉淀，使用无菌水溶解所述DNA沉淀，然后进行磁珠纯化，得到所提取的微生物基因组DNA；

步骤(1)中所述的STES缓冲液包含下列组份：0.2M Tris-Hcl、0.5M Nacl、0.01M的乙二胺四乙酸和质量浓度为0.1％的十二烷基硫酸钠；

步骤(5)中所述的磁珠纯化的步骤为：

(a)待离心管内的DNA沉淀完全溶解于无菌水中后，向离心管中加入磁珠，混匀后室温静置；

(b)将离心管放置在磁力架上，待溶液澄清后，吸弃上清；从磁力架上取出离心管，加入乙醇溶液，震荡混匀；然后将离心管再次放置在磁力架上，待溶液澄清后再次吸弃上清，重复清洗；

(c)吸净上清，室温晾干后，加入无菌水溶解，将离心管重新放置在磁力架上，待溶液澄清后，上清液即为所提取的微生物基因组DNA；

所使用的磁珠为0.6x Axy Prep Mag PCR Clean-UP磁珠。

2.根据权利要求1所述的微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述的样本菌体为处于指数生长期的菌体。

3.根据权利要求1所述的微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述的TE缓冲液包含下列组份：10mM Tris-Hcl和1mM乙二胺四乙酸。

4.根据权利要求1所述的微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的酚/氯仿溶液中，酚和氯仿的体积比为25:24。

5.根据权利要求1所述的微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的氯仿/异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1。

6.根据权利要求1所述的微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤(4)中所述的第三次离心在4℃下进行，离心时间为10～15min。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述样本菌体为革兰氏阳性菌或真菌。