ES2266374T3 - Procedimiento para la deteccion de adn procariotico. - Google Patents
Procedimiento para la deteccion de adn procariotico. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2266374T3 ES2266374T3 ES02020904T ES02020904T ES2266374T3 ES 2266374 T3 ES2266374 T3 ES 2266374T3 ES 02020904 T ES02020904 T ES 02020904T ES 02020904 T ES02020904 T ES 02020904T ES 2266374 T3 ES2266374 T3 ES 2266374T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dna
- protein
- polypeptide
- baselineskip
- prokaryotic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Procedimiento para la detección de ADN procariótico a partir de fluidos corporales in vitro, con las etapas: a. contacto de al menos un ADN procariótico que se encuentra en disolución con al menos una proteína o un polipéptido capaces de unirse específicamente a motivos CpG sin metilar, b. separación del complejo proteína/polipéptido-ADN de la disolución, c. detección del ADN procariótico mediante procedimientos de biología molecular.
Description
Procedimiento para la detección de ADN
procariótico.
La invención se refiere a un procedimiento in
vitro para la detección de ADN procariótico a partir de fluidos
corporales, un procedimiento para la purificación de los fluidos
corporales de ADN procariótico in vitro, así como un kit
para la realización de estos procedimientos.
Las infecciones causadas por bacterias son una
de las causas más frecuentes de las enfermedades inflamatorias. La
detección temprana del agente patógeno bacteriano es de importancia
decisiva para el pronóstico del curso de la enfermedad, así como en
especial para la elección puntual de las medidas terapéuticas
adecuadas.
Para la detección de agentes patógenos
bacterianos se aplican sobre todo distintos procedimientos de
cultivo de células. Sin embargo, en los últimos tiempos ha
aumentado también la importancia de los procedimientos de biología
molecular, que se basan en la detección de un ácido nucleico
específico del agente patógeno. Además de la elevada especificidad
de estos procedimientos, es de mencionar como ventaja fundamental el
poco tiempo requerido frente a los procedimientos convencionales.
No obstante, la sensibilidad de la detección de ADN procariótico
directamente a partir de fluidos corporales y de material
experimental sin tratamiento previo es hasta ahora demasiado baja,
en comparación con el cultivo de microorganismos. Una cantidad
suficiente de ácidos nucleicos bacterianos para la detección
directa del agente patógeno a partir del material experimental sin
tratamiento previo se alcanza, en todo caso, para el intervalo de
las moléculas de ARNm de 16S. Esto presupone, sin embargo, que las
bacterias que se han de detectar se encuentran en la fase metabólica
y expresan suficiente ARNm de 16S.
Generalmente no puede partirse de esta base, en
especial en el caso de pacientes que se encuentran bajo una terapia
de antibióticos. Además, determinados factores de patogenicidad de
las bacterias no se expresan en todo momento, aunque los genes
correspondientes se encuentren presentes en el genoma bacteriano.
Por tanto, la detección de los factores de patogenicidad y las
resistencias de las bacterias a nivel cromosómico es indispensable
para el diagnóstico de las enfermedades sépticas.
Y esto tanto más cuanto que a este nivel también
puede diferenciarse entre bacterias patógenas y comensales.
Muy frecuentemente, la detección de los ácidos
nucleicos específicos del agente patógeno tiene lugar a través de
una multiplicación del ADN procariótico por medio de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y/o de la reacción en cadena de la
ligasa (LCR). La alta especificidad y la rápida disponibilidad de
los resultados se contraponen a la propensión al fallo por
contaminaciones o por factores fuertemente inhibidores en las
muestras clínicas.
En un procedimiento de detección por PCR
convencional, para una detección satisfactoria de los agentes
patógenos en la sangre, debe aislarse el ADN total a partir de al
menos 1 a 5 ml de sangre. Sin embargo, la concentración de ADN
total es entonces demasiado elevada para poder emplear dicho ADN
directamente en una reacción de PCR.
Es diferente con el cultivo sanguíneo para la
detección de los agentes patógenos de una sepsis. Aquí el límite
inferior de detección es de menos de 10 bacterias por mililitro.
Este límite de detección sólo se alcanza actualmente con protocolos
de PCR cuya secuencia diana se encuentra en el intervalo de los ARN
de 16S, y que con ello dependen de la expresión de esta secuencia
diana. Es de esperar una mayor seguridad de diagnóstico de los
protocolos de PCR cuyas secuencias diana se encuentran en el
cromosoma de los microorganismos. Justamente bajo la influencia de
una terapia de antibióticos en curso, el comportamiento de expresión
de distintos genes puede modificarse o limitarse considerablemente,
aún cuando el antibiótico empleado después de todo no sea efectivo.
Esta situación se presenta frecuentemente en las estaciones de
terapia intensiva, en las que la mayoría de los pacientes se
encuentra bajo terapia de antibióticos, de los que, por esta razón,
no puede cultivarse ninguna bacteria relevante a partir de los
cultivos sanguíneos o de otras muestras.
Debido a su insuficiente sensibilidad, la
detección de ácidos nucleicos específicos del agente patógeno sin
una etapa de amplificación, mediante la detección directa del ADN
procariótico (técnica de sondas, técnica FISH), sólo tiene
importancia de diagnóstico en caso de un número de gérmenes
suficientemente alto en el material experi-
mental.
mental.
La problemática fundamental de la detección de
ADN procariótico para la identificación de agentes patógenos
bacterianos en los fluidos corporales consiste, además de en los
componentes inhibidores de la reacción de PCR en el material
experimental, sobre todo en el exceso del ADN eucariótico frente al
procariótico. Aquí han de considerarse en especial los procesos
competitivos durante el análisis de ADN, así como la baja cantidad
de ADN procariótico, como obstáculos para una detección cualitativa
y cuantitativa del agente patógeno.
Los procedimientos convencionales para el
aislamiento de ADN concentran el ADN total de un fluido corporal de
modo que la relación entre el ADN del huésped y el ADN microbiano
puede estar entre 1:10^{-6} y 1:10^{-8}. A partir de esta
diferencia puede comprenderse bien la dificultad de la detección del
ADN microbiano en los fluidos corporales.
Por consiguiente, la presente invención se basa
en el objetivo de proporcionar un procedimiento para la detección
y/o la concentración del ADN microbiano en muestras experimentales
con una elevada proporción de ADN eucariótico de pacientes con
infecciones, para una rápida y sencilla detección del agente
patógeno, que permita un diagnóstico temprano de las infecciones
causadas por agentes patógenos bacterianos.
Este objetivo se consigue según la invención
mediante un procedimiento para la detecciónde ADN procariótico a
partir de fluidos corporales in vitro, con las etapas:
a. contacto de al menos un ADN procariótico que
se encuentra en disolución con al menos una proteína o un
polipéptido capaces de unirse específicamente a motivos CpG sin
metilar,
b. separación del complejo
proteína/polipéptido-ADN de la disolución,
c. detección del ADN procariótico mediante
procedimientos de biología molecular.
En ello la denominación ADN procariótico se
refiere tanto a ADN vírico como bacteriano. Dicho ADN puede haberse
purificado y vuelto a disolver o estar presente directamente en la
fuente original (por ejemplo, un fluido corporal como sangre,
suero, etc.).
La separación puede tener lugar por medio de los
distintos procedimientos para el aislamiento o la concentración de
complejos ADN-proteína que el experto conoce
suficientemente. En ello, para concentrar el ADN a partir de la
disolución de muestra, se prefiere la aplicación de procedimientos
en los que la proteína que se une al ADN se encuentra inmovilizada
sobre una matriz vehículo.
Según una forma de realización preferida, a la
separación sigue una etapa para separar entre sí el ADN y la
proteína/polipéptido. Esto puede tener lugar, por ejemplo, por los
procedimientos convencionales para la purificación de ADN conocidos
por el experto. En el caso más sencillo, la separación se basa en la
modificación del valor del pH o de la concentración salina (por
ejemplo hasta NaCl 1M) del medio/tampón o en la adición de reactivos
caotrópicos, etc.; es decir, los parámetros adecuados que conducen
a la disociación del complejo proteína-ADN. Estos
procedimientos son conocidos por el experto.
Según otra forma de realización preferida, la
proteína o el polipéptido se encuentran acoplados a un vehículo.
Esta forma de realización proporciona una posibilidad de
concentración del ADN procariótico especialmente sencilla, ya que
su separación a partir de la disolución tiene lugar de forma
especialmente sencilla, por ejemplo por retirada física de la
disolución (por ejemplo, por centrifugación) del, o de los vehículos
cargados.
Como disolución del ADN procariótico se
considera, en principio, cualquier disolvente adecuado. Sin embargo,
el procedimiento es especialmente recomendable para la
concentración de ADN procariótico a partir de disoluciones que
contienen distintas especies biomoleculares, en especial distintos
tipos de ADN. La invención se refiere preferentemente a un
procedimiento para la detección y para la concentración de ADN
procariótico o vírico y ADN eucariótico a partir de una mezcla de
ADN procariótico o vírico. En ello, por ejemplo, el ADN procariótico
que se encuentra en los fluidos corporales se separa del ADN
eucariótico y se concentra mediante su unión específica a la
proteína o al polipéptido. El ADN procariótico así concentrado
facilita la detección de agentes patógenos microbianos por medio de
procedimientos de biología molecular y puede contribuir al
diagnóstico de enfermedades causadas por agentes patógenos.
En especial, la forma de realización en la que
la proteína o el polipéptido que se unen al ADN se encuentran
inmovilizados sobre la superficie de un vehículo, es adecuada para
una adsorción del ADN procariótico de los fluidos corporales y/o de
la sangre. Este planteamiento ofrece además la posibilidad de
retirar de la sangre o de otro fluido corporal el ADN microbiano
que se encuentre en éstos. El fluido corporal (por ejemplo, sangre
completa, suero o fluido cerebroespinal), así purificado del ADN
microbiano, el cual por sí solo también puede desencadenar graves
reacciones inflamatorias en los pacientes, puede después
reintroducirse en el cuerpo.
Como fluidos corporales en el sentido de la
invención se entienden todos los fluidos procedentes del cuerpo de
un mamífero, incluido el hombre, en los que pueden existir agentes
patógenos, como por ejemplo, sangre, orina, fluido cerebroespinal,
líquido pleural, pericardial, peritoneal, así como sinovial. La
descripción de la invención referida a sangre humana no representa
ninguna limitación, sino sólo una aplicación a modo de ejemplo.
Como proteínas o polipéptidos en el sentido de
la invención se entienden todas las proteínas eucarióticas y
procarióticas que son capaces de unirse específicamente a ADN
procariótico. Para esto son adecuadas, en especial, proteínas o
polipéptidos que son capaces de unirse específicamente a motivos CpG
sin metilar.
Como agentes patógenos bacterianos se entienden
preferentemente los agentes causantes de una sepsis, pero también
cualquier otro agente bacteriano causante de infecciones. En ello
pueden distinguirse de los agentes comensales, que también se
encuentran ocasionalmente en las muestras experimentales de
pacientes, pero que carecen de importancia patógena.
En el aislamiento del ADN total a partir de los
fluidos corporales, la relación del ADN del huésped al ADN del
agente patógeno puede ser frecuentemente de 1:10^{-6} a
1:10^{-8} e inferior. El procedimiento según la invención permite
una concentración de tres unidades de potencia a través de la unión
específica del ADN procariótico a la proteína o al polipéptido con
tales propiedades selectivas.
En ello, la proteína o el polipéptido pueden
estar directa o indirectamente acoplados al vehículo. El tipo de
acoplamiento depende del vehículo y del material del vehículo. Como
vehículo se consideran aquí en especial, membranas, micropartículas
y resinas o materiales similares para matrices de afinidad. Los
materiales adecuados para la unión de la proteína o el polipéptido,
así como -dependiendo del tipo de material- la realización de la
unión, son suficientemente conocidos por el experto. Para el
acoplamiento indirecto son adecuados, por ejemplo, anticuerpos
específicos contra la proteína o el polipéptido que, por su parte,
están unidos al vehículo por procedimientos conocidos.
Una aplicación del procedimiento según la
invención consiste en la detección de ADN procariótico. Otra
aplicación adicional consiste en la separación del ADN procariótico
a partir de una mezcla de ADN eucariótico y ADN procariótico
mediante la unión del ADN procariótico a una proteína o polipéptido
específicos, inmovilizados sobre una matriz. La mezcla del ADN
propio del cuerpo y del ADN procariótico se pone en contacto con la
matriz de afinidad por medio de procedimientos adecuados y, en
ello, el ADN procariótico se une a la proteína inmovilizada; el ADN
eucariótico recorre, por ejemplo, una columna de separación y puede
recogerse por separado.
Las matrices de afinidad pueden ser, por
ejemplo, polisacáridos poliméricos como agarosas, otros
biopolímeros, polímeros sintéticos o vehículos con un armazón
básico de silicato, como vidrios porosos u otros vehículos sólidos
o flexibles, sobre los que se inmovilizan la proteína o el
polipéptido que se unen al ADN. Después de la separación
satisfactoria del ADN procariótico del eucariótico, la matriz de
afinidad se lava con un reactivo adecuado, de modo que la proteína
de unión con el ADN procariótico acoplado se separa de la matriz
y/o el ADN procariótico se separa de la proteína de unión y queda
disponible en cantidad suficiente para etapas de trabajo
posteriores.
Otra aplicación del procedimiento según la
invención consiste en la separación y concentración de ADN
procariótico de ADN eucariótico, mediante la unión del ADN
procariótico a una proteína específica inmovilizada sobre
micropartículas. Para esto se consideran todas las micropartículas
que permiten una inmovilización de la proteína o el polipéptido que
se unen a ADN. Estas micropartículas pueden ser de látex, plástico
(por ejemplo poliestireno expandido, polímero), metal o sustancias
ferromagnéticas. Además pueden usarse también micropartículas
fluorescentes, como ofrece, por ejemplo, la empresa Luminex. Una
vez que el ADN procariótico se ha unido a las proteínas
inmovilizadas sobre las micropartículas, dichas micropartículas se
separan de la mezcla de sustancias por procedimientos adecuados,
como por ejemplo, filtración, centrifugación, precipitación,
clasificación por medida de la intensidad de fluorescencia o por
procedimientos magnéticos. Después de su separación de las
micropartículas, el ADN procariótico se encuentra disponible para
su procesado posterior.
Otra aplicación del procedimiento según la
invención consiste en la separación y concentración de ADN
procariótico de ADN eucariótico, mediante la unión del ADN
procariótico a una proteína o un polipéptido específicos, que a
continuación pueden separarse de los demás componentes de la mezcla
por electroforesis.
Otra aplicación del procedimiento según la
invención consiste en la separación y concentración de ADN
procariótico de ADN eucariótico, mediante la unión del ADN
procariótico a la proteína o el polipéptido. Esta proteína se une a
continuación a los correspondientes anticuerpos. Los anticuerpos
pueden estar unidos a sustratos sólidos o flexibles, por ejemplo
cristal, plásticos, silicio, micropartículas, membranas, o
encontrarse en disolución. Después de la unión del ADN procariótico
a la proteína o el polipéptido y de la unión de éstos a los
anticuerpos específicos, tiene lugar su separación de la mezcla de
sustancias por los procedimientos conocidos por el experto.
Como proteína o polipéptido son adecuados, en
especial cualquier proteína o polipéptido que se unan a ADN
procariótico, por ejemplo, con motivos CpG sin metilar. Para ello
son adecuados, por ejemplo anticuerpos o antisueros específicos
contra ADN procariótico. Su preparación y obtención son conocidas
por el experto.
El ADN procariótico se diferencia del
eucariótico, por ejemplo, por la existencia de motivos CpG sin
metilar. Por consiguiente, recomendablemente la
proteína/polipéptido es una proteína que reconoce y se une
específicamente a motivos CpG sin metilar. Esta proteína es
recomendablemente también un anticuerpo específico o un antisuero
correspondiente. Según otra forma de realización preferida, la
proteína o el polipéptido son una proteína o un polipéptido
codificados por el gen TLR9 o por el gen CGBP.
Esta forma de realización de la invención se
basa en el conocimiento de que el ADN eucariótico y el ADN
procariótico se diferencian en la proporción de motivos CpG. En el
ADN procariótico los dinucleótidos
citosina-guanosina (motivos CpG) se encuentran en
un exceso de 20 veces frente al ADN eucariótico. En el ADN
procariótico estos motivos no están metilados, mientras que en el
ADN eucariótico están en gran parte metilados, lo que hace la
diferencia aún mayor. Los motivos CpG sin metilar son dinucleótidos
desoxicitidilato-desoxiguanilato sin metilar en el
genoma procariótico o en fragmentos del mismo.
En segundo lugar, esta forma de realización
preferida de la invención se basa en el conocimiento de que hay
proteínas o polipéptidos que se unen específicamente a motivos CpG
sin metilar. La propiedad de unión de estas proteínas/polipéptidos
se utiliza según la invención para, por una parte, unirse al ADN
procariótico y con ello, por otra parte, concentrar dicho ADN
procariótico a partir de una muestra con una proporción mayoritaria
de ADN eucariótico.
Una aplicación para el aislamiento de ADNc, que
utiliza la existencia de motivos CpG metilados en el ADN
eucariótico, ha sido descrita por Cross y col., Nature Genetics 6
(1994) 236-244. La aplicación inmunoestimuladora de
oligodesoxirribonucleótidos (ODN) monocatenarios con los
correspondientes motivos CpG ha podido demostrarse repetidamente
(Häcker y col., Immunology 105 (2002) 245-251,
documento US 6,239.116). Como moléculas de reconocimiento de los
motivos CpG procarióticos se han identificado hasta ahora dos
proteínas receptoras. Del documento WO 02/06482 se conoce el
receptor de tipo Toll 9 como molécula receptora de motivos CpG sin
metilar. Voo y col., Molecular and Cellular Biology (2000)
2108-2121, describen otra proteína receptora, la
proteína humana que se une a CpG (hCGBP) que se usa, en un
planteamiento analítico, como molécula de reconocimiento para la
detección de motivos CpG sin metilar en ADN procariótico. En
ninguna de las dos publicaciones se utilizan las proteínas que se
unen CpG para el aislamiento o concentración de ADN
procariótico.
Son especialmente adecuados una proteína o un
polipéptido codificados por un ADNc de una secuencia con al menos
el 80%, preferentemente al menos el 90% y con especial preferencia
al menos el 95% de homología con la secuencia según el número de
acceso de la base de datos GenBank: NM-014593
(versión NM-014593.1, GI: 7656974; banco de datos
NCBI). Aquí se trata de proteínas o polipéptidos que se corresponden
con la CGBP o que derivan de ésta y que reconocen y se unen
específicamente a motivos CpG.
Según otra forma de realización preferida, la
proteína o el polipéptido están codificados por un ADNc de una
secuencia con al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de
homología con la secuencia según el número de acceso de GenBank
AB045180 (secuencia codificante del gen TLR9; banco de datos NCBI,
versión AB045180.1; GI: 11761320) o un fragmento de la misma,
preferentemente un ADNc con al menos el 80%, con especial
preferencia el 90% de homología con la variante A del transcrito
(número de acceso de GenBank NM-017442; versión
NM-017442.2; GI: 20302169; banco de datos NCBI) o
la variante B del transcrito (número de acceso de GenBank
NM-138688; versión NM-138688.1; GI:
20302170; banco de datos NCBI).
La invención se refiere además a un
procedimiento para la purificación de fluidos corporales de ADN
procariótico in vitro. Este procedimiento comprende las
etapas:
a. contacto de al menos un ADN procariótico que
se encuentra en un fluido corporal con una proteína o un polipéptido
capaces de unirse a motivos CpG sin metilar.
b. separación del complejo
proteína/polipéptido-ADN del fluido corporal.
Aquí es recomendable que la separación tenga
lugar de forma extracorporal y en condiciones estériles, para poder
volver a introducir los fluidos corporales en el cuerpo, de modo
que, al retirar el ADN procariótico que se encuentra en los fluidos
corporales, se apoye al propio sistema inmunitario del cuerpo en la
eliminación de infecciones.
Para la retirada extracorporal del ADN
procariótico de los fluidos corporales se consideran todos los
procedimientos químicos, mecánicos o electroquímicos adecuados.
Además, la combinación con otros procedimientos terapéuticos
extracorporales, como hemoperfusión, máquina cardiopulmonar o
sistema de adsorción de endotoxinas, representan otra aplicación
recomendable. Esta enumeración no representa ninguna limitación del
procedimiento.
Según una forma de realización especialmente
preferida, la invención se refiere a un procedimiento para la
detección de ADN procariótico. En ello, a la concentración del ADN
procariótico sigue una etapa de amplificación del ADN procariótico,
para la que son adecuados todos los procedimientos de amplificación
de uso corriente (PCR, LCR, LM-PCR, etc.).
La invención se refiere además al uso de un kit
para la concentración de ADN procariótico por medio de uno de los
procedimientos descritos anteriormente, que contiene al menos la
proteína/polipéptido, preferentemente otros reactivos adecuados
para la realización del procedimiento.
Según una forma de realización preferida, el kit
contiene además de la proteína/polipéptido al menos un conjunto de
cebadores, adecuados para la amplificación del ADN genómico de
determinados procariotas en condiciones estándar.
La invención tiene la ventaja de que, a través
de la unión específica de ADN procariótico rico en motivos CpG sin
metilar a proteínas con una afinidad específica para tales
estructuras, se consigue una concentración del ADN procariótico a
partir del ADN total de un huésped infectado y, por consiguiente, se
aumenta fuertemente la sensibilidad de detección del ADN de agentes
patógenos en los fluidos corporales.
Las posibilidades de separación de ADN
procariótico de ADN eucariótico con una proteína de unión específica
no requieren más tiempo que los procedimientos conocidos para el
aislamiento de ADN total. Sin embargo, la detección posterior sólo
puede tener lugar a través de una reacción de PCR. En la mayoría de
los casos no será necesaria una reacción de PCR anidada, con lo que
es posible un considerable ahorro de tiempo en el diagnóstico.
La invención se ilustrará con más detalle a
continuación mediante ejemplos sin, por ello, limitarla.
La figura 1 muestra la reacción de PCR de ADN
de estreptococos en sangre humana, y
la figura 2 muestra la reacción de PCR anidada
con los productos de la reacción de PCR según la figura 1.
Ejemplo
1
Para la detección del agente patógeno se usa
sangre humana fresca heparinizada que contiene Streptococcus
pyogenes con 103 unidades formadoras de colonias/ml como agente
patógeno. El ADN se aísla por absorción a una matriz de unión a
ADN, con kits comerciales para el aislamiento del ADN total a partir
de fluidos corporales, según una modificación de las instrucciones
del fabricante. Para ello se introducen 100 \mul de sangre
infectada en tubos Eppendorf con 200 \mul del tampón de lisis
completo, que contiene proteinasa K y SDS. La mezcla se incuba
durante 30 minutos a 37ºC y se calienta después durante 20 minutos a
95ºC. Una vez enfriada la muestra se añaden 20 \mug de
mutanolisina y se vuelve a incubar durante 60 minutos a 37ºC.
Después de una centrifugación, el sobrenadante se carga en las
columnas de centrifugación con la matriz de unión a ADN y el ADN se
purifica según las instrucciones del fabricante. El ADN purificado
se disuelve en un volumen final de 100 \mul de tampón de Tris
0,01 M a pH 7,5, o en la misma cantidad del tampón de elución del
fabricante. Para la detección del agente patógeno se eligen
cebadores para la identificación del gen de la estreptolisina O
(slo).
1ª reacción de PCR: amplificación de un
fragmento de 465 pb
Cebador directo
1:5’-AGCATACAAGCAAATTTTTTACACCG
Cebador inverso 2:
5’-GTTCTGTTATTGACACCCGCAATT
Concentración de cebadores 1 mg/ml
Reacción: 5 \mul de ADN aislado
- 0,5 \mul cebador directo 1
- 0,5 \mul cebador inverso 2
- 14 \mul agua destilada
- total 25 \mul en el kit "Ready to go" (Amersham-Biosciences)
PCR:
- 1 x 5 minutos a 95ºC
- 40 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 51ºC, 3 minutos a 72ºC
- 1 x 7 minutos a 72ºC
Los resultados de la reacción de PCR del ADN de
estreptococos en sangre humana se representan en la figura 1. Se
separaron 10 \mul de los 25 \mul de reacción: 1) reacción de PCR
con 5 \mul de ADN molde; 2) reacción con 5 \mul de molde
diluido 1:10; 3) control positivo: 0,2 \mul de ADN de
estreptococos como molde sin la presencia de ADN eucariótico de la
sangre; ST) estándar de peso molecular.
Resultado: La reacción de PCR primaria no
resulta en un producto de PCR visible. Por lo tanto se realizó a
continuación una segunda reacción de PCR (PCR anidada).
2ª reacción de PCR (anidada): amplificación de
un fragmento de 348 pb interno al anterior fragmento slo
Cebador directo
3:5’-CCTTCCTAATAATCCTGCGGATGT-3’
Cebador inverso 4: CTGAAGGTAGCATTAG
TCTTTGATAACG-3’
Concentración de cebadores 1 mg/ml
Reacción: 5 \mul de PCR 1, muestra 1, figura
1
- 0,5 \mul cebador directo 1
- 0,5 \mul cebador inverso 2
- 14 \mul agua destilada
- total 25 \mul en el kit "Ready to go" (Amersham-Biosciences)
PCR:
- 1 x 5 minutos a 95ºC
- 50 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 54ºC, 3 minutos a 72ºC
- 1 x 7 minutos a 72ºC
La figura 2 muestra la reacción de PCR anidada
con los productos de PCR de la primera reacción de PCR según la
figura 1 como molde. Las muestras se corresponden con las de la
figura 1.
Resultado: en la reacción de PCR anidada se
amplifica el fragmento slo deseado para un número de agentes
patógenos de 100 células de estreptococos por 100 \mul de sangre
(muestra 1). Esto corresponde a aproximadamente 5 a 10 moléculas de
molde para 5 \mul de ADN molde en la primera reacción de PCR
(figura 1). La sensibilidad se agota para una dilución 1:10
(muestra 2) (0,5 a 1 moléculas de molde).
Ejemplo
2
El ADN de un lisado celular se disuelve como se
ha descrito anteriormente para el procedimiento de PCR anterior. La
diferencia es que se emplean entre 1 ml y 5 ml de material
experimental.
Para la detección del agente patógeno se usan 3
ml de sangre humana fresca heparinizada o con citrato, que contiene
Streptococcus pyogenes con 102 unidades formadoras de
colonias/ml. El ADN se aísla con tampones de lisis que contienen
SDS y proteinasa K de kits comerciales para el aislamiento de ADN
total a partir de fluidos corporales, según una modificación de las
instrucciones del fabricante. Para ello se añaden a 3 ml de sangre
infectada, 6 ml del tampón de lisis completo que contiene proteinasa
K y SDS. La mezcla se incuba durante 30 minutos a 37ºC y se
calienta después durante 20 minutos a 95ºC. Una vez enfriada la
muestra se añaden 200 \mug de mutanolisina y se vuelve a incubar
durante 60 minutos a 37ºC. Después de una centrifugación la mezcla
se precipita con etanol a una concentración final del 70% y después
de una centrifugación el sedimento se lava con 2 ml de etanol al
70%. El resto de etanol se retira en una centrífuga de vacío y el
ADN precipitado se disuelve en 500 \mul de tampón TE. El ADN se
carga después en una columna que contiene 0,5 ml de sefarosa y en
la que se encuentra inmovilizado 1 mg de TLR9. La columna se lava
con 5 volúmenes de tampón TE. La elución tiene lugar con iones
caotrópicos en alta concentración, por ejemplo con 0,7 ml de una
disolución de NaI o KSCN 6M. Este eluido puede cargarse después
directamente en una columna comercial de centrifugación para
aislamiento de ADN, y el ADN con CpG concentrado puede aislarse
según las instrucciones, como en el ejemplo inicial, en un pequeño
volumen entre 20 \mul y 100 \mul y emplearse para análisis
posteriores como reacciones de PCR de agentes patógenos.
<110> SIRS-Lab GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la detección de
ADN procariótico
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Pat3696/25-EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 02020904.5
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
18-09-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Versión 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcatacaag caaatttttt acaccg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttctgttat tgacacccgc aatt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttcctaat aatcctgcgg atgt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgaaggtag cattagtctt tgataacg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2452
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína que se une a CpG (CGBP)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Variante A del transcrito del gen
TLR9
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3868
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Variante A del transcrito del gen
TLR9
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Variante B del transcrito del gen
TLR9
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
Claims (18)
1. Procedimiento para la detección de ADN
procariótico a partir de fluidos corporales in vitro, con las
etapas:
a. contacto de al menos un ADN procariótico que
se encuentra en disolución con al menos una proteína o un
polipéptido capaces de unirse específicamente a motivos CpG sin
metilar,
b. separación del complejo
proteína/polipéptido-ADN de la disolución,
c. detección del ADN procariótico mediante
procedimientos de biología molecular.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque a la separación sigue una etapa para
separar entre sí el ADN y la proteína/polipéptido.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el ADN
procariótico se detecta mediante amplificación.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el ADN
procariótico se detecta mediante técnica de sondas.
5. Procedimiento para la purificación de
fluidos corporales de ADN procariótico in vitro, con las
etapas:
a. contacto de al menos un ADN procariótico que
se encuentra en un fluido corporal con una proteína o un polipéptido
capaces de unirse a motivos CpG sin metilar.
b. separación del complejo
proteína/polipéptido-ADN del fluido corporal.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
proteína/polipéptido está acoplada a un vehículo.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque la proteína/polipéptido está
directamente acoplada al vehículo.
8. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque la proteína/polipéptido está acoplada al
vehículo a través de un anticuerpo.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque el vehículo está
formado como matriz, micropartículas o una membrana.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la separación
tiene lugar por medio de un anticuerpo o antisuero dirigido contra
la proteína/polipéptido.
11. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la separación tiene lugar por medio de
electroforesis.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
proteína/polipéptido es un anticuerpo dirigido contra motivos CpG
sin metilar o un correspondiente antisuero.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la
proteína/polipéptido está codificada por el gen TLR9 o por el gen
CGBP.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque la proteína/polipéptido está codificada
por un ADNc de una secuencia con al menos 80%, preferentemente al
menos 90% de homología con la secuencia siguiente
\vskip1.000000\baselineskip
y que es capaz de unirse específicamente a
motivos CpG sin metilar.
15. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque la proteína/polipéptido está codificada
por un ADNc de una secuencia con al menos 80%, preferentemente al
menos 90% de homología con la secuencia según la secuencia
siguiente
\newpage
\newpage
o un fragmento de la misma, preferentemente un
ADNc con al menos 80%, con preferencia especial al menos 90% de
homología con la variante A del transcrito de la secuencia
siguiente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o la variante B del transcrito de la secuencia
siguiente
\vskip1.000000\baselineskip
y que es capaz de unirse
específicamente a motivos CpG sin
metilar.
16. Procedimiento para la purificación de los
fluidos corporales de ADN procariótico según la reivindicación 5,
caracterizado porque la separación extracorporal tiene lugar
en condiciones estériles.
17. Uso de un kit, que contiene al menos una
proteína o un polipéptido capaces de unirse específicamente a
motivos CpG sin metilar, para la concentración de ADN procariótico
por medio de un procedimiento según una de las reivindicaciones 1,
2 ó 4 a 15.
18. Uso de un kit de ensayo, que contiene al
menos una proteína o un polipéptido capaces de unirse
específicamente a motivos CpG sin metilar y uno o varios
conjunto(s) de cebadores específicos, para la detección de
ADN procariótico por medio de un procedimiento según la
reivindicación 15.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02020904A EP1400589B1 (de) | 2002-09-18 | 2002-09-18 | Verfahren zum Nachweis prokaryontischer DNA |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2266374T3 true ES2266374T3 (es) | 2007-03-01 |
Family
ID=31896878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02020904T Expired - Lifetime ES2266374T3 (es) | 2002-09-18 | 2002-09-18 | Procedimiento para la deteccion de adn procariotico. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8062854B2 (es) |
| EP (1) | EP1400589B1 (es) |
| JP (1) | JP4447459B2 (es) |
| KR (1) | KR20050057152A (es) |
| CN (1) | CN1681925A (es) |
| AT (1) | ATE335816T1 (es) |
| AU (1) | AU2003260392A1 (es) |
| CA (1) | CA2498951C (es) |
| DE (1) | DE50207801D1 (es) |
| DK (1) | DK1400589T3 (es) |
| ES (1) | ES2266374T3 (es) |
| WO (1) | WO2004033683A1 (es) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE335816T1 (de) | 2002-09-18 | 2006-09-15 | Sirs Lab Gmbh | Verfahren zum nachweis prokaryontischer dna |
| WO2005085440A1 (de) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Sirs-Lab Gmbh | VERFAHREN ZUR ANREICHERUNG UND/ODER ABTRENNUNG VON PROKARYONTER DNA MITTELS EINES PROTEINS, DAS NICHT-METHYLIERTE CpG-MOTIVE ENTHALTENDE DNA SPEZIFISCH BINDET |
| DE102005001889B4 (de) * | 2005-01-14 | 2012-03-29 | Sirs-Lab Gmbh | Verfahren zur Steigerung der Bindungskapazität und -effizienz eines Proteins, das nicht methylierte CPG-Motive enthaltende DNA spezifisch bindet |
| GB0413688D0 (en) * | 2004-06-18 | 2004-07-21 | Novartis Forschungsstiftung | Analysis of methylated nucleic acid |
| DE202005009490U1 (de) * | 2005-06-16 | 2006-10-19 | Sirs-Lab Gmbh | Vorrichtung zur Anreicherung/Abtrennung von nicht-methylierte CpG-Motive enthaltender DNA |
| DE102005034628B4 (de) * | 2005-07-19 | 2007-08-23 | Epigenomics Ag | Verfahren zur Untersuchung von Cytosin-Methylierungen in DNA |
| DE102007041864B4 (de) | 2007-09-04 | 2012-05-03 | Sirs-Lab Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Bakterien und Pilzen |
| CA2811493C (en) | 2010-09-15 | 2020-06-16 | Spinomix S.A. | Method for separating target molecules or particles from fibrinogen-containing samples including blood components |
| US8980553B2 (en) * | 2011-04-02 | 2015-03-17 | New England Biolabs, Inc. | Methods and compositions for enriching either target polynucleotides or non-target polynucleotides from a mixture of target and non-target polynucleotides |
| US9145580B2 (en) * | 2011-04-02 | 2015-09-29 | New England Biolabs, Inc. | Methods and compositions for enriching either target polynucleotides or non-target polynucleotides from a mixture of target and non-target polynucleotides |
| DE102012219142B4 (de) | 2012-10-19 | 2016-02-25 | Analytik Jena Ag | Verfahren zum Trennen, Erfassen oder Anreichern von unterschiedlichen DNA-Spezies |
| US20220307009A1 (en) * | 2019-04-26 | 2022-09-29 | Thermo Fisher Scientific Baltics, UAB | Isolated nucleic acid binding domains |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6239116B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-05-29 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| JPH11510692A (ja) * | 1995-07-28 | 1999-09-21 | ベス イスラエル ディーコネス メディカル センター，インク． | 突然変異誘発を検査するための方法及び検査器具 |
| WO2001012659A2 (en) | 1999-08-18 | 2001-02-22 | Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. | Human dna sequences |
| JP2002034565A (ja) | 2000-07-19 | 2002-02-05 | Japan Science & Technology Corp | 細菌ｄｎａを特異的に認識する受容体タンパク質 |
| ATE335816T1 (de) | 2002-09-18 | 2006-09-15 | Sirs Lab Gmbh | Verfahren zum nachweis prokaryontischer dna |
| WO2005085440A1 (de) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Sirs-Lab Gmbh | VERFAHREN ZUR ANREICHERUNG UND/ODER ABTRENNUNG VON PROKARYONTER DNA MITTELS EINES PROTEINS, DAS NICHT-METHYLIERTE CpG-MOTIVE ENTHALTENDE DNA SPEZIFISCH BINDET |
| GB0423991D0 (en) * | 2004-10-29 | 2004-12-01 | Univ Edinburgh | Applications of nucleic acid fragments |
-
2002
- 2002-09-18 AT AT02020904T patent/ATE335816T1/de active
- 2002-09-18 DE DE50207801T patent/DE50207801D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-18 EP EP02020904A patent/EP1400589B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-18 DK DK02020904T patent/DK1400589T3/da active
- 2002-09-18 ES ES02020904T patent/ES2266374T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-08-08 WO PCT/EP2003/008825 patent/WO2004033683A1/de active Application Filing
- 2003-08-08 AU AU2003260392A patent/AU2003260392A1/en not_active Abandoned
- 2003-08-08 US US10/528,235 patent/US8062854B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-08 CN CNA038222337A patent/CN1681925A/zh active Pending
- 2003-08-08 CA CA2498951A patent/CA2498951C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-08 KR KR1020057003719A patent/KR20050057152A/ko not_active Application Discontinuation
- 2003-08-08 JP JP2004542300A patent/JP4447459B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-10-05 US US13/253,661 patent/US8288115B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2498951A1 (en) | 2004-04-22 |
| EP1400589A1 (de) | 2004-03-24 |
| US8062854B2 (en) | 2011-11-22 |
| EP1400589B1 (de) | 2006-08-09 |
| CN1681925A (zh) | 2005-10-12 |
| US8288115B2 (en) | 2012-10-16 |
| AU2003260392A1 (en) | 2004-05-04 |
| CA2498951C (en) | 2013-04-23 |
| US20120040363A1 (en) | 2012-02-16 |
| DK1400589T3 (da) | 2006-11-27 |
| KR20050057152A (ko) | 2005-06-16 |
| WO2004033683A1 (de) | 2004-04-22 |
| DE50207801D1 (de) | 2006-09-21 |
| JP2005538737A (ja) | 2005-12-22 |
| JP4447459B2 (ja) | 2010-04-07 |
| US20100316993A1 (en) | 2010-12-16 |
| ATE335816T1 (de) | 2006-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8288115B2 (en) | Method for enriching a prokaryotic DNA | |
| ES2384571T3 (es) | Procedimiento para el enriquecimiento y/o la separación de ADN procariota mediante una proteína que se une específicamente a ADN que contiene motivos CpG no metilados | |
| ES2163865T5 (es) | Aislamiento en fase solida de acidos nucleicos. | |
| EP0389063B1 (en) | Process for isolating nucleic acid | |
| JP6533468B2 (ja) | 目的の核酸の特異的な単離方法 | |
| JP2008510456A (ja) | 多官能基コート化固相担体を用いる核酸の単離方法 | |
| US7923551B2 (en) | Method of purifying RNA using kosmotropic salt | |
| US20120252009A1 (en) | Methods and Compositions for Enriching Either Target Polynucleotides or Non-Target Polynucleotides from a Mixture of Target and Non-Target Polynucleotides | |
| CN105132410B (zh) | 一种微生物基因组dna的提取方法 | |
| US10907146B2 (en) | Nucleic acid extraction method using solid subject | |
| CN113151282A (zh) | 结合新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核衣壳蛋白的核酸适配体及其用途 | |
| WO1995004140A1 (en) | Process for isolating nucleic acid from gram positive microorganisms | |
| US20130189674A1 (en) | Methods and Compositions for Enriching Either Target Polynucleotides or Non-Target Polynucleotides from a Mixture of Target and Non-Target Polynucleotides | |
| EP3194626A1 (en) | Methods and devices for detecting and identifying microorganisms | |
| US20220025354A1 (en) | Nucleic acid synthesis and purification device, use thereof, and nucleic acid synthesis and purification method | |
| US20240025929A1 (en) | Methods and devices for ultrasensitive direct detection of microorganisms | |
| CN110923338A (zh) | 一种能检测多种细菌基因组dna的微阵列芯片及其制备方法 | |
| KR20090036121A (ko) | 시료로부터 사전 추출 없이 거대분자를 변형시키는 방법 | |
| JP2022533269A (ja) | 糞便試料中の希少なｄｎａ配列の検出方法 | |
| DE102004010928B4 (de) | Protein zur Bindung prokaryonter DNA sowie Verfahren zur Trennung und Anreicherung prokaryonter DNA | |
| JP4519247B2 (ja) | 核酸の抽出精製用試薬 | |
| JP2016171795A (ja) | アプタマーの選抜方法 | |
| RU2513700C1 (ru) | Способ специфического отбора высокоаффинных молекул днк (днк-аптамеров) к рекомбинантному белку-мишени | |
| CN117947037A (zh) | Map2蛋白核酸适配体wqy022及其应用 | |
| CN117551717A (zh) | 基因文库的构建方法及在检测病原微生物中的应用 |