KR20050057152A - 원핵 ｄｎａ의 농축 방법 - Google Patents

원핵 ｄｎａ의 농축 방법 Download PDF

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Abstract

원핵 DNA를 농축시키기 위한 방법을 개시하며, 상기 방법은 하나 이상의 원핵 DNA를 비-메틸화된 CpG 동기와 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계 및 상기 단백질/폴리펩티드-DNA 복합체를 분리시키는 단계를 포함한다. 더욱이, 본 원은 상기 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

원핵 ＤＮＡ의 농축 방법{METHOD OF ENRICHING PROCARYOTIC DNA}
본 발명은 원핵 DNA의 농축 방법뿐만 아니라 상기 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
세균에 의해 야기된 감염은 염증 질환의 가장 흔한 원인들 중 하나이다. 임상 과정의 예후에 대해서뿐만 아니라 특히 적합한 치료 조치의 시기 적절한 선택을 위해서 세균성 병원균의 조기 검출이 결정적으로 중요하다.
세균성 병원균의 검출에서, 무엇보다도, 다양한 세포 배양 방법들이 사용된다. 그러나, 최근에 병원균-특이성 핵산의 검출을 기본으로 하는 분자 생물학의 방법이 또한 보다 중요해지고 있다. 상기 방법은 고도의 특이성 이외에, 통상적인 방법들에 대한 필수적인 이점으로서, 요구되는 시간이 적다는 것을 언급해야 한다. 그러나, 체액 및 전-처리되지 않은 시험 물질로부터 원핵 DNA를 직접 검출하는 방법에 대한 감도는 지금까지는 미생물의 배양에 비해 너무나 낮았다. 상기 전-처리되지 않은 시험 물질로부터 병원균을 직접 검출하는데 충분한 세균의 핵산 량은 16S-mRNA 분자의 영역에서 얻어진다. 그러나, 이는 검출하려는 세균이 대사 단계 중에 존재해야 하고 충분한 16S-mRNA를 발현할 것을 필요로 한다.
이는 대개, 특히 항체 요법이 가해진 환자의 경우에 그렇지 않다. 더욱이, 세균의 특정한 병원성 인자들은, 상응하는 유전자가 세균 게놈 중에 존재하기는 하지만 언제나 발현되는 것은 아니다. 따라서, 상기 병원성 인자의 검출 및 염색체 수준에서의 세균의 내성은 패혈성 질병 상태의 진단에 필요 불가결하다.
이 수준에서 병원성 세균과 공생 세균간에 차별이 이루어질 수 있기 때문에 상기가 더욱 더 적용된다.
가장 흔히는, 병원균-특이성 핵산의 검출을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 리가제 연쇄 반응(LCR) 각각에 의한 원핵 DNA의 증폭에 의해 수행한다. 상기 결과의 높은 특이성과 빠른 입수성은 임상 샘플의 방해 민감성 또는 강한 억제 인자와 대비된다.
통상적인 PCR 검출 방법에서, 혈액에서의 병원균의 성공적인 검출은 적어도 1 내지 5 ㎖의 혈액으로부터 전체 DNA를 단리할 것을 요한다. 그러나, 전체 DNA 농도는 PCR 반응에 직접 사용되기에는 너무 높다.
패혈증 병원균의 검출을 위한 혈액 배양물들에 관한 상황들이 다양하다. 이 경우에, 검출 하한은 ㎖ 당 10 미만의 세균이다. 상기 검출 한계는 현재 오직, 표적 서열이 16S-RNA 영역에 있고 따라서 상기 표적 서열의 발현에 의존하는 PCR 프로토콜에 의해서만 얻어진다. 미생물의 염색체 중에 표적 서열을 갖는 PCR 프로토콜에 대해서 보다 큰 진단 신뢰성을 기대할 수 있다. 상이한 유전자들의 발현 양상은, 사용되는 항생제가 궁극적으로 효과가 없다 하더라도, 특히 진행중인 항생제 요법의 영향 하에서 상당히 변하거나 제한될 수 있다. 이러한 상황은 종종, 특히 대부분의 환자들이 항생제 치료를 받는 집중적인 치료 병동에서 발견되며, 따라서 이러한 이유로 인해 혈액 배양액 또는 다른 샘플로부터 임의의 관련 세균의 증식이 허용되지 않는다.
불충분한 감도로 인해, 병원균-특이성 핵산의 검출은, 원핵 DNA의 직접적인 검출에 의한 증폭 단계(탐침 기법, FISH 기법) 없이, 시험 물질 중의 오직 충분하게 높은 세균수만이 진단 상 중요하다.
체액 중의 세균성 병원균을 동정하기 위한 원핵 DNA의 검출에 본질적인 문제는, 시험 물질 중의 PCR-억제 성분 이외에, 주로 원핵 DNA에 대한 과잉의 진핵 DNA이다. 이와 관련하여, DNA 분석에서 경쟁 과정뿐만 아니라 원핵 DNA의 낮은 양이 병원균의 정성 및 정량적 검출에 장애로서 간주될 수 있다.
통상적인 DNA 단리 방법들은 숙주 DNA 대 미생물 DNA의 비가 1:10-6 내지 1:10-8일 수 있도록 체액의 전체 DNA를 농축시킨다. 이러한 차이는 체액 중의 미생물 DNA의 검출을 매우 어렵게 만든다.
따라서, 본 발명의 목적은 미생물 DNA를 단리 및/또는 농축시키는 방법을 제공하는 것이다. 감염 환자로부터의 원핵 DNA를 높은 함량으로 갖는 시험 샘플에서, 신속하고 용이한 병원균의 검출을 위해서 상기 검출은 세균성 병원균에 의해 야기된 감염을 조기 진단할 수 있게 한다.
발명의 요약
본 발명에 따라, 상기 목적은
a) 용액 중의 하나 이상의 원핵 DNA를 상기 원핵 DNA에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드와 접촉시켜 단백질 또는 폴리펩티드 DNA 복합체를 형성시키는 단계, 및
b) 상기 복합체를 분리시키는 단계
를 포함하는, 원핵 DNA의 농축 방법에 의해 성취된다.
도 1은 인간 혈액 중의 스트렙토코커스-DNA의 PCR을 나타낸다.
도 2는 도 1에 따른 PCR 산물을 갖는 네스티드 PCR을 나타낸다.
상기 경우에, 원핵 DNA란 용어는 바이러스성 및 세균성 DNA 모두에 관한 것이다. 상기 DNA를 정제하고 다시 용해시키거나, 또는 상기 DNA가 원래의 출처(예를 들어 체액, 예를 들어 혈액, 혈청 등)에 직접적으로 존재할 수도 있다.
분리를 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 DNA 단백질 복합체 또는 DNA 폴리펩티드 복합체의 다양한 단리 또는 농축 방법들에 의해 수행할 수 있다. 상기와 같이 수행함에 있어서, 바람직하게는 DNA를 샘플 용액으로부터 농축시키기 위해서 DNA 결합 단백질을 담체 기질에 고정화시키는 방법을 사용할 것이다.
바람직한 실시태양에 따라, 분리에 이어서 상기 DNA와 단백질/폴리펩티드를 분리시키는 단계를 수행한다. 이를 예를 들어 당해 분야의 숙련가에게 공지된 통상적인 DNA 정제 방법에 의해 수행할 수 있다. 가장 간단한 경우에, 상기 분리는 배지/완충액의 pH 값 또는 염 농도(예를 들어 1 M NaCl)의 변화 또는 카오트로픽 시약(chaotropic reagent)의 첨가 등, 즉 상기 단백질-DNA-복합체의 분리를 유도하는 적합한 변수들을 근거로 한다. 상기와 같은 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
추가의 바람직한 실시태양에 따라서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 담체에 커플링시킨다. 상기 실시태양은 특히 간단한 원핵 DNA의 농축 방법을 나타내는데, 그 이유는 상기 용액으로부터의 분리가 예를 들어 상기 용액으로부터 하전된 담체(들)의 물리적인 제거에 의해(예를 들어 원심 분리에 의해) 특히 용이하기 때문이다.
원핵 DNA의 용액으로서, 임의의 적합한 용매가 기본적으로 적합하다. 그러나, 상기 방법은 다양한 생물 분자 종들을 함유하는 용액으로부터 원핵 DNA, 특히 다양한 유형의 DNA를 농축시키는데 특히 유용하다. 본 발명은 바람직하게는 원핵 또는 바이러스 DNA의 혼합물로부터 원핵 또는 바이러스 DNA와 진핵 DNA를 분리 및 농축시키는 방법에 관한 것이다. 상기와 같이 함에 있어서, 예를 들어 체액 중에 존재하는 원핵 DNA를 상기 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 특이적 결합에 의해 진핵 DNA로부터 분리시키고 농축시킨다. 이와 같은 식으로 농축된 원핵 DNA는 분자 생물학 방법의 도움으로 원핵 생물 병원균의 검출을 촉진시키며 병원성 병원균에 의해 야기된 질병의 진단에 기여할 수 있다.
특히, DNA-결합 단백질 또는 폴리펩티드를 담체의 표면에 고정화시키는 것에 따른 실시태양은 체액, 바람직하게는 혈액으로부터 원핵 DNA를 흡착시키기에 적합하다. 더욱이, 상기 접근법은 혈액이나 다른 체액 중에 존재하는 미생물 DNA를 상기 체액으로부터 제거할 수 있게 한다. 이어서 이러한 방식으로 상기 미생물 DNA(이는 또한 본질적으로 환자에서 심각한 염증 반응을 개시시킬 수 있다)로부터 정제된 체액(예를 들어 전혈, 혈청 또는 분비액)을 체내로 다시 보낼 수 있다.
본 발명에서 체액의 의미는 병원균이 나타날 수 있는, 인간을 포함한 포유동물의 신체로부터 기원하는 모든 유체, 예를 들어 혈액, 뇨, 분비액, 늑막, 심장막, 복막뿐만 아니라 윤활막액인 것으로 이해된다. 인간 혈액에 대한 본 발명의 설명은 제한적인 뜻으로 파악되지 않으며, 단지 예시적인 용도로서 파악된다.
본 발명에서 단백질 또는 폴리펩티드의 의미는 원핵 DNA에 특이적으로 결합할 수 있는 모든 진핵 및 원핵 단백질인 것으로 이해된다. 메틸화되지 않은 CpG-동기에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드가 상기 목적에 특히 적합하다.
세균성 병원균은 바람직하게는 패혈증의 병원균으로서 이해되지만, 또한 감염에 대한 임의의 다른 세균성 병원균으로서도 이해된다. 상기는, 때때로 환자의 시험 샘플에서 발견되기도 하지만 어떠한 병원성의 의미도 갖지 않는 공생 병원균과 상이할 수 있다.
감염된 체액에서 전체 DNA를 단리함에 있어서, 숙주-DNA 대 병원균-DNA의 비는 많은 경우에 1:10-6 내지 1:10-8 이하일 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 상기와 같은 선택적인 성질을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 원핵 DNA의 특이적인 결합을 통해 3 지수 단위 이상까지 농축시킬 수 있다.
상기 단백질 또는 폴리펩티드는 담체에 직접 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 커플링의 유형은 담체 및 담체 물질에 따라 다르다. 적합한 담체에는 특히 멤브레인, 미세입자 및 수지, 또는 유사한 친화성 기질용의 물질이 있다. 단백질 또는 폴리펩티드의 결합에 적합할 뿐만 아니라, 물질의 유형에 따라, 상기와 같은 결합을 수행하기에 적합한 물질은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 간접적인 커플링을 위해서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 상기와 같은 특이적인 항체들, 예를 들어 차례로 공지된 방법에 의해 담체에 결합하는 것들이 적합하다.
본 발명에 따른 방법의 한 가지 용도는 원핵생물 DNA의 농축이다. 추가의 용도는 원핵 DNA를 기질에 고정화시킨 특정한 단백질 또는 폴리펩티드에 결합시킴으로써 원핵 DNA를 진핵 DNA와 원핵 DNA의 혼합물로부터 분리시키는 것이다. 자기 신체 자신의 DNA와 원핵 DNA의 혼합물을 적합한 방법에 의해 친화성 기질과 접촉시키며, 그렇게 함에 있어서 상기 원핵 DNA를 고정화된 단백질에 결합시키고; 상기 진핵 DNA를 예를 들어 분리 컬럼에 통과시켜 별도로 수거할 수 있다. 친화성 기질은 예를 들어 중합체성 폴리사카라이드, 예를 들어 아가로스, 다른 생물중합체, 합성 중합체, 또는 실리케이트 주쇄를 갖는 담체, 예를 들어 다공성 유리, 또는 표면상에 DNA-결합 단백질 또는 폴리펩티드가 고정화되어 있는 다른 고체 또는 가요성 담체일 수 있다. 진핵 DNA로부터 원핵 DNA를 분리시킨 후에, 상기 친화성 기질을 적합한 시약으로 세정하며, 따라서 커플링된 원핵 DNA를 갖는 결합 단백질이 상기 기질로부터 분리되고/되거나 상기 원핵 DNA가 상기 결합 단백질로부터 분리되어 추가의 공정 단계에 충분한 양으로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 추가적인 적용은 원핵 DNA를 미세입자 상에 고정화되어 있는 특정 단백질에 결합시킴으로써 상기 원핵 DNA를 진핵 DNA로부터 분리시키고 농축시키는 것이다. 이와 관련하여, DNA-결합 단백질 또는 폴리펩티드의 고정화를 허용하는 모든 미세입자들이 적합하다. 상기와 같은 미세입자들은 라텍스, 플라스틱(예를 들어 스티로폼, 중합체), 금속 또는 강자성 물질로 이루어질 수 있다. 더욱 또한, 형광성 미세입자, 예를 들어 루미넥스 캄파니(Luminex company)로부터 입수할 수 있는 것들을 또한 사용할 수 있다. 원핵 DNA를 미세입자상에 고정화된 단백질에 결합시킨 후에, 상기 미세입자들을 적합한 방법, 예를 들어 여과, 원심분리, 침전, 형광 강도의 측정에 의한 분류 또는 자기적 방법에 의해 상기 물질들의 혼합물로부터 분리시킨다. 상기 미세입자들로부터 분리시킨 후에 원핵 DNA를 추가의 공정에 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 용도는 원핵 DNA를 특정한 단백질 또는 폴리펩티드에 결합시키고 이어서 이를 전기 영동에 의해 상기 혼합물의 다른 성분들로부터 분리시킴으로써 상기 원핵 DNA를 진핵 DNA로부터 분리 및 농축시키는 것이다.
본 발명에 따른 방법의 추가의 용도는 원핵 DNA를 단백질 또는 폴리펩티드에 결합시킴으로써 상기 원핵 DNA를 진핵 DNA로부터 분리 및 농축시키는 것이다. 상기 단백질을 후속적으로 상응하는 항체에 결합시킨다. 상기 항체를 고체 또는 가요성 물질, 예를 들어 유리, 플라스틱, 실리콘, 미세입자, 멤브레인에 결합시키거나 또는 상기 항체가 용액 중에 존재할 수도 있다. 원핵 DNA를 단백질 또는 폴리펩티드에 결합시키고 이를 특이적인 항체에 결합시킨 후에, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 상기 물질 혼합물로부터 분리시킨다.
단백질 또는 폴리펩티드로서, 원핵 DNA를 예를 들어 비-메틸화된 CpG 동기와 결합시키는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드가 특히 적합하다. 이를 위해서, 예를 들어 원핵 DNA에 대해 특이적인 항체 또는 항혈청이 적합하다. 이들의 제조 및 단리는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
원핵 DNA는 예를 들어 비-메틸화된 CpG 동기의 존재에 의해 진핵 DNA와 상이하다. 따라서, 상기 단백질/폴리펩티드는 편의상 비-메틸화된 CpG 동기를 특이적으로 인식하고 상기 동기와 결합하는 단백질이다. 편의상, 상기는 또한 특이적인 항체 또는 상응하는 항혈청을 포함한다. 추가의 바람직한 실시태양에 따라, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 TLR9 유전자 또는 CGBP 유전자에 의해 암호화된 단백질 또는 폴리펩티드이다.
본 발명의 상기 실시태양은 진핵 DNA와 원핵 DNA가 그들의 CpG 동기의 함량이 상이하다는 발견을 기본으로 한다. 원핵 DNA에서, 시토신-구아노신-디뉴클레오티드(CpG 동기)는 진핵 DNA에서보다 20 배 과잉으로 존재한다. 원핵 DNA에서, 이들 동기는 비-메틸화된 반면, 진핵 DNA에서는 대부분 메틸화되어 있으며, 이는 상기 차이를 더욱 크게 한다. 비-메틸화된 CpG 동기는 원핵생물 게놈 또는 그의 단편 내의 비-메틸화된 데옥시시티딜레이트-데옥시구아닐레이트-디뉴클레오티드이다.
두 번째로, 본 발명의 상기 바람직한 실시태양은 상기 DNA의 비-메틸화된 CpG 동기에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드가 존재한다는 발견을 기본으로 한다. 상기 단백질/폴리펩티드의 결합 성질을 본 발명에 따라, 한편으로는 원핵 DNA의 결합을 위해, 따라서 다른 한편으로는 상기를 주로 진핵 DNA를 함유하는 샘플로부터 농축시키기 위해 이용한다.
진핵 DNA 중의 메틸화된 CpG 동기의 존재를 이용하는 cDNA의 단리를 위한 용도가 문헌[Cross et al. Nature Genetics 6(1994) 236-244]에 개시되어 있다. 상응하는 CpG 동기를 갖는 단일-가닥 올리고데옥시리보뉴클레오티드(ODN)의 면역자극 용도가 여러 번 제시되었다(Hacker et al., Immunology 105(2002)245-251, US 6,239,116). 원핵 CpG 동기의 인식 분자로서, 지금까지 2 개의 수용체 단백질이 동정되었다. 톨형 수용체 g는 비-메틸화된 CpG 동기를 인식하는 분자로서 WO 02/06482로부터 공지되었다. 문헌[Voo et al., Molecular and Cellular Biology(2000) 2108-2121]에는 추가적인 수용체 단백질, 즉 원핵 DNA에서 비-메틸화된 CpG 동기를 검출하기 위한 인식 분자로서 분석학적 접근법에 사용되는 인간 CpG-결합 단백질(hCGBP)이 개시되어 있다. 상기 두 공보 모두에서, CpG-결합 단백질은 원핵 DNA의 단리 또는 농축에 사용되지 않는다.
유전자 은행 입수 번호: NM-014593(버전 NM-014593 1, GI: 7656974; NCBI 데이터베이스)에 따른 서열에 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상 상동성인 서열을 갖는 cDNA에 의해 암호화되는 단백질 또는 폴리펩티드가 특히 적합하다. 상기는 CGBP에 상응하거나 또는 이로부터 유도되고 CpG 동기를 특이적으로 인식하여 상기 동기와 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드이다.
추가의 바람직한 실시태양에 따라, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 유전자 은행 입수 번호: AB045180에 따른 서열(TLR9 유전자의 암호화 서열; NCBI 데이터베이스, 버전 AB045180.1; GI: 11761320)에 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상 상동성인 서열을 갖는 cDNA 또는 그의 단편, 바람직하게는 전사 변체 A(유전자 은행 입수 번호 NM-138688; 버전 NM-107442.1; GI: 20302169; NCBI 데이터베이스) 또는 전사 변체 B(유전자 은행 입수 번호 NM-017442; 버전 NM-138688.1; GI: 20302170; NCBI 데이터베이스)에 대해 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 상동성인 cDNA에 의해 암호화된다.
더욱이, 본 발명은 원핵 DNA를 제거하기 위해 체액을 정제시키는 방법에 관한 것이다. 이와 관련하여, 상기 분리를 멸균 조건 하에 체외에서 수행하여 상기 체액을 다시 몸 안으로 보내며, 따라서 상기 체액 중에 함유된 원핵 DNA를 제거함으로써 상기 자기 몸 자신의 면역계가 감염의 제거를 도울 수 있게 하는 것이 편리하다.
원핵 DNA를 체액으로부터 체외에서 제거하기 위해 임의의 적합한 화학적, 기계적 또는 전기화학적 방법을 고려할 수 있다. 더욱이, 다른 체외 치료 방법들, 예를 들어 혈액관류, 심폐기 또는 내독소 흡수제가 더욱 편리하게 적용된다. 이러한 나열이 상기 방법들의 제한을 나타내는 것은 아니다.
특히 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명은 원핵 DNA의 검출 방법에 관한 것이다. 이 경우에, 상기 원핵 DNA의 농축에 이어서 상기 원핵 DNA의 증폭 단계를 수행하며, 이를 위해서 모든 통상적인 증폭 방법들이 적합하다(PCR, LCR; LM-PCR 등).
더욱이, 본 발명은 상술한 방법들 중 하나를 사용하여 원핵 DNA를 농축시키기 위한 키트에 관한 것이며, 상기 키트는 하나 이상의 상기 단백질/폴리펩티드, 바람직하게는 상기 방법을 수행하는데 적합한 추가의 시약들을 함유한다.
바람직한 실시태양에 따라, 상기 키트는 상기 단백질/폴리펩티드 이외에, 표준 조건 하에서 특정한 원핵들의 게놈 DNA를 증폭시키는데 적합한 하나 이상의 프라이머 세트를 함유한다.
본 발명은 CpG 동기가 풍부한 비-메틸화된 원핵 DNA를 상기와 같은 구조물에 대해 특이적인 친화성을 갖는 단백질에 특이적으로 결합시킴으로써, 감염된 숙주의 전체 DNA로부터 원핵 DNA를 성공적으로 농축시키고 따라서 체액 중의 병원성 DNA의 검출 감도를 강하게 증대시키는 이점을 갖는다.
특이적으로 결합하는 단백질을 사용하여 진핵 DNA로부터 원핵 DNA를 분리시키는 가능성은 공지된 전체 DNA의 단리방법보다 더 이상 시간 소모적이지 않다. 그러나, 하기의 검출은 오직 PCR 반응을 통해서만 수행될 수 있다. 대부분의 경우에, 진단학에서 상당량의 시간 절감을 가능하게 하는 네스티드(nested) PCR은 필요하지 않을 것이다.
본 발명을 하기 실시예들에 의해 보다 상세히 설명할 것이며, 본 발명은 이들로 제한되지 않는다.
실시예 1: 선행 기술의 검출 방법
병원균으로서 스트렙토코커스 피오게네스를 103/㎖의 콜로니 형성 단위로 함유하는 신선한, 헤파린 첨가된 인간 혈액을 병원균의 검출에 사용한다. DNA를 제조사의 변경된 지시에 따라 체액으로부터 전체 DNA의 단리를 위한 상업용 키트를 사용하여 DNA-결합 기질에 대한 흡착에 의해 단리시킨다. 이를 위해서, 프로테이나제 K 및 SDS를 함유하는 전체 용해 완충액 200 ㎕를 에펜도르프 튜브 중의 감염된 혈액 100 ㎕에 가한다. 상기 혼합물을 37 ℃에서 30 분간 배양하고 이어서 20 분간 95 ℃로 가열한다. 냉각시킨 후에, 뮤타놀리신 20 ㎍을 가하고 37 ℃에서 추가로 60 분간 배양한다. 원심분리시킨 후에, 상등액을 DNA-결합 기질을 사용하여 원심분리 컬럼에 적용시키고 제조사의 지시에 따라 DNA를 정제한다. 상기 정제된 DNA를 최종 부피 100 ㎕의 0.01 몰 트리스 완충액(pH 7.5) 또는 동량의 상기 제조사의 용출 완충액에 넣는다. 병원균의 검출을 위해서, 프라이머들을 선택하여 스트렙토라이신 O 유전자(slo)를 동정한다.
1. 465 bp 단편의 PCR 증폭
순 방향 프라이머 1: 5'-AGCATACAAGCAAATTTTTTACACCG
역 방향 프라이머 2: 5'-GTTCTGTTATTGACACCCGCAATT
프라이머 농도 1 ㎎/㎖
출발 물질: 단리된 DNA 5 ㎕
순 방향 프라이머 1 0.5 ㎕
역 방향 프라이머 2 0.5 ㎕
수성 데스트(aqua dest) 14 ㎕
바로 키트(Amersham-Biosciences)에 넣을 수 있는 총 25 ㎕
반응:
1 x 5 분 95 ℃
각각 95 ℃ 30 초, 51 ℃ 30 초, 72 ℃ 3 분에서 40 주기
1 x 7 분 72 ℃
인간 혈액 중의 스트렙토코커스-DNA의 PCR 결과를 도 1에 나타낸다. 25 ㎕의 출발 물질 중 10 ㎕를 분리시켰다. 1) 주형 DNA 5 ㎕를 함유하는 PCR 출발 물질; 2) 1:10의 희석비로 주형 5 ㎕를 함유하는 출발 물질; 3) 양성 대조군: 혈액으로부터 진핵 DNA 부재 하의 주형으로서 스트렙토코커스-DNA 0.2 ㎕. ST) 분자량 표준.
결과:
1 차 PCR은 가시적인 PCR 산물을 생성시키지 않는다. 따라서, 2. PCR(네스티드 PCR)을 하기와 같이 수행하였다.
2. PCR(네스티드): 상기 slo-단편을 함유하는 348 bp 단편의 증폭
순 방향 프라이머 3: 5'-CCTTCCTAATAATCCTGCGGATGT-3'
역 방향 프라이머 4: 5'-CTGAAGGTAGCATTAG TCTTTGATAACG-3'
프라이머 농도 1 ㎎/㎖
출발 물질: PCR1, 샘플 1, 도 1로부터 5 ㎕
순 방향 프라이머 1 0.5 ㎕
역 방향 프라이머 2 0.5 ㎕
수성 데스트 14 ㎕
바로 키트(Amersham-Biosciences)에 넣을 수 있는 총 25 ㎕
반응:
1 x 5 분 95 ℃
각각 95 ℃ 30 초, 54 ℃ 30 초, 72 ℃ 3 분에서 50 주기
1 x 7 분 72 ℃
도 2는 주형으로서 도 1에 따른 PCR 산물을 갖는 네스티드 PCR을 나타낸다. 상기 샘플은 도 1의 샘플에 상응한다.
결과:
네스티드 PCR에서, 목적하는 slo-DNA 단편을 혈액 100 ㎕ 당 100 개의 스트렙토코커스 세포의 병원균 수로 증폭시킨다(샘플 1). 1 차 PCR에서 주형 DNA 5 ㎕에서(도 1), 상기는 약 5 내지 10 주형 분자에 상응한다. 1:10의 희석비에서(샘플 2), 감도가 고갈된다(0.5 내지 1 주형 분자).
실시예 2: 본 발명에 따른 방법의 수행
DNA를 선행의 PCR 방법에 대해 상술한 바와 같이 세포 용해물로부터 용해시킨다. 차이는 1 ㎖ 내지 5 ㎖의 시험 물질을 사용한다는 것이다.
병원균으로서 스트렙토코커스 피오게네스를 102/㎖의 콜로니 형성 단위로 함유하는 신선한, 헤파린 첨가되거나 시트레이트 첨가된 인간 혈액 3 ㎖을 병원균의 검출에 사용한다. DNA를 제조사의 변경된 지시에 따라 체액으로부터 전체 DNA의 단리를 위한 상업용 키트를 사용하여, SDS 및 프로테이나제 K를 함유하는 용해 완충액에 의해 단리시킨다. 이를 위해서, 프로테이나제 K 및 SDS를 함유하는 전체 용해 완충액 6 ㎖을 감염된 혈액 6 ㎖에 가한다. 상기 혼합물을 37 ℃에서 30 분간 배양하고 이어서 20 분간 95 ℃로 가열한다. 냉각시킨 후에, 뮤타놀리신 200 ㎍을 가하고 37 ℃에서 추가로 60 분간 배양한다. 원심분리시킨 후에, 상기 혼합물을 최종 농도 70%의 에탄올로 침전시키고, 원심분리 시 펠릿을 70% 에탄올 2 ㎖로 세척한다. 에탄올 잔사를 진공 원심분리에서 제거하고 침전된 DNA를 500 ㎕ TE 완충액 중에 수거한다. 이어서 상기 DNA를 세파로즈 0.5 ㎖을 함유하는 컬럼에 적용시키고 이를 TLR9 1 ㎎상에 고정화시킨다. 상기 컬럼을 5 부피의 TE 완충액으로 세척한다. 고농도의 카오트로픽 이온, 예를 들어 0.7 ㎖의 6 몰 NaJ 또는 KSCN 용액을 사용하여 용출을 수행한다. 이어서 상기 용출물을 상업적인 DNA-단리 원심분리 컬럼에 직접 적용시키고, CpG-풍부한 DNA를 초기 실시예에서와 같이 지시에 따라 20 ㎕ 내지 100 ㎕의 작은 부피로 단리시키고 이를 병원균 PCR과 같은 추가의 분석에 사용한다.

Claims (18)

  1. a) 용액 중의 하나 이상의 원핵 DNA를 상기 원핵 DNA에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드와 접촉시켜 단백질 또는 폴리펩티드 DNA 복합체를 형성시키는 단계, 및
    b) 상기 복합체를 분리시키는 단계
    를 포함하는, 원핵 DNA의 농축 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    분리에 이어서 DNA와 단백질 또는 폴리펩티드를 분리시키는 단계를 수행하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    단백질 또는 폴리펩티드를 담체에 커플링시키는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    단백질 또는 폴리펩티드를 담체에 직접 커플링시키는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    단백질 또는 폴리펩티드를 그에 대한 항체를 통해 담체에 커플링시키는 방법.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    담체를 기질로서, 미세입자로서 또는 멤브레인으로서 제공하는 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    분리를 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 항체 또는 항혈청을 사용하여 수행하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    분리를 전기영동을 사용하여 수행하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단백질 또는 폴리펩티드가 비-메틸화된 CpG 동기에 대한 항체이거나 또는 상응하는 항혈청인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단백질 또는 폴리펩티드를 TLR9 유전자 또는 CGBP 유전자에 의해 암호화하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    단백질 또는 폴리펩티드를 유전자 은행 입수 번호 XM-165661에 따른 서열에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상 상동성인 서열을 갖는 cDNA에 의해 암호화하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    단백질 또는 폴리펩티드를 유전자 은행 입수 번호: AB045180에 따른 서열에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상 상동성인 서열을 갖는 cDNA 또는 그의 단편, 바람직하게는 전사 변체 A(유전자 은행 입수 번호 NM-138688) 또는 전사 변체 B(유전자 은행 입수 번호 NM-017442)에 대해 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상 상동성인 cDNA에 의해 암호화하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    용액이 원핵 DNA와 진핵 DNA의 혼합물을 함유하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    용액이 체액인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    체액을 원핵 DNA로부터 정제시키는 방법에서 분리를 멸균 조건 하에 체외에서 수행하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    원핵 DNA를 검출하는 방법에서 상기 원핵 DNA의 증폭 단계를 후속 수행하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 원핵 DNA를 농축시키기 위한 키트.
  18. 하나 이상의 특이적인 프라이머 세트를 포함하는, 제 16 항의 방법을 사용하여 원핵 DNA를 검출하기 위한 시험 키트.
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