CN115210386A - 用于检测体液中tb的基于crispr的测试法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种用于检测体液样品中结核分枝杆菌存在的方法。该方法利用CRISPR效应蛋白以及引导RNA和报道分子，使得当引导RNA与靶核苷酸片段杂交时，CRISPR效应蛋白切割报道分子，产生可检测的信号。

Description

用于检测体液中TB的基于CRISPR的测试法
先前的相关申请
本申请要求于2020年2月6日提交的美国系列号62/971,210的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文以用于所有目的。
联邦资助的研究声明
不适用。
发明领域
本发明总体上涉及一种检测循环体液例如血清、血浆、尿液和脑脊液(CSF)中的结核病(tuberculosis，TB)的方法，并且更具体地涉及一种使用基于CRISPR的报道分子系统来检测血清中的结核病的方法。
发明背景
结核病(TB)是每年影响数百万人的一种严重疾病，并且是全球十大死因之一。延误诊断可能导致死亡。虽然痰样品主要用于诊断肺结核病，但有些患者无法咳出痰液，例如病重或非常年轻的患者。
目前，TB诊断依赖于Xpert
Figure BDA0003783680130000011
这需要痰样品。尽管痰液中的细菌含量很高，但它很难作为样品收集。此外，不可能从每个结核病患者采集痰液，尤其是肺外结核病患者，而肺外结核病(EPTB)是常见的，尤其是在HIV患者中。
血液是TB检测的备选候选物，尤其是在HIV感染的患者中，因为血液比痰液更容易和更可靠地收集。然而，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)很少通过验血检测出来。TB血液培养可能需要数周时间才能变为阳性，并且需要配备某些设备。用血液进行核酸扩增测试由于敏感性低(20-55％)，因此较不理想，这可能是由于细菌载量低、PCR抑制物的存在或通常用于这些测试的样品体积小。
因此，需要对结核病具有高特异性的高灵敏度血清测试。
发明概述
本发明描述了一种用于检测血清样品中的结核分枝杆菌(“MTB”)的方法。请参考图1，它阐述了本发明的方法。在第一步中，从样品例如血清样品中提取核酸。然后靶向MTB特异的序列(如果存在的话)扩增核酸。然后，将扩增产物与gRNA-CRISPR系统和报道分子反应。如果存在MTB特异的序列，gRNA将与其杂交以激活CRISPR效应蛋白，其然后切割报道分子，并且可以基于测量报道分子产生的信号来确定MTB的存在。
CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复)是在原核生物如细菌和古细菌的基因组中发现的DNA序列家族。这些序列衍生自先前感染原核生物的噬菌体的DNA片段，并用于在随后的感染期间检测和破坏来自类似噬菌体的DNA，因此它们是原核生物免疫系统的重要部分。
CRISPR相关蛋白9(“Cas9”)是一种使用CRISPR序列作为引导来识别和切割与CRISPR序列互补的特定DNA链的酶。Cas9核酸内切酶是一个四组分系统，包括两个小crRNA分子和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。这两个RNA序列融合成一条单一引导RNA(gRNA)，引导Cas9找到并切割由该引导RNA指向的DNA靶。Cas9酶与CRISPR序列一起构成了一种称为CRISPR-Cas9的技术的基础，该技术可用于编辑生物体内的基因。通过操纵引导RNA的核苷酸序列，可以将人工Cas9系统编程，以靶向任何用于切割的DNA序列。
核酸酶Cas12a(以前称为Cpf1)是Cas家族的另一个成员，显示出与Cas9的几个关键差异，包括：导致双链DNA的“交错(staggered)”切割，而不是Cas9产生的“平直(blunt)”切割，依赖于“富含T”的原型间隔子相邻基序(protospacer adjacent motifs)，从而提供Cas9备选的靶向位点，并且只需要一个CRISPR RNA来成功靶向。
Cas13(包括四个亚型：Cas13a-d)的功能与Cas9相似，使用～64-nt引导RNA来编码靶特异性。Cas13蛋白通过识别crRNA中的短发夹与引导RNA复合，并且靶特异性由与靶区域互补的28至30-nt间隔子(spacer)编码。除了可编程的RNase活性外，所有Cas13在识别和切割靶转录物后都表现出附带活性，导致任何附近转录物的非特异性降解，无论与间隔子的互补性如何。
在一个实施方案中，CRISPR效应蛋白是Cas12a(以前称为Cpf1)、Cas9或Cas13。然而，可以使用其他的CRISPR效应蛋白，只要能够实现高特异性的有效检测即可。
通过改变gRNA的长度和其在特定基因中的位置来合适地设计gRNA，因此gRNA可以以期望的特异性和敏感性靶向DNA片段。因此，利用本发明的CRISPR-Cas-gRNA方法，可以在数小时内实现对血清中MTB的高灵敏度和特异性检测。预计能够在5μl血清样品中检测到MTB DNA的单拷贝。
该方法还可用于区分MTB和非结核分枝杆菌(NTM)，并通过靶向物种特异性DNA片段来鉴定分枝杆菌(Mycobacterium)物种。NTM感染与MTB产生的症状相似，虽然已经描述了150多种不同种类的NTM，但在肺部标本中鉴定出这些生物并不总是等同于活动性感染。需要支持性的影像学和临床发现来建立诊断，治疗或根除NTM感染一直具有挑战性。
可以实施进一步的变化以增强MTB检测。在一个实施方案中，从血清样品中提取的DNA可以通过首先用抗DNA抗体处理来进一步富集。在另一个实施方案中，可以用抗人DNA抗体进一步处理从血清样品中提取的DNA，以从样品中消耗人DNA。
在一个实施方案中，抗人DNA抗体是抗5-甲基胞苷(5mC)抗体。但是，可以使用其他抗体或蛋白质，只要它可以与甲基化DNA结合，例如抗CpGDNA甲基化，包括5-甲基胞苷(5-mC)、5-羟甲基-(5-hmC)、5-甲酰基-(5-fC)和5-羧基-(5-caC)胞嘧啶抗体；CpGDNA甲基化结合蛋白、甲基-CpG结合域(MBD)蛋白：MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3、MBD4、MBD5、MBD6、TET1、TET2、TET3、Kaiso和它们的抗体；以及甲基化RNA，如抗N7-甲基鸟苷(m7G)、5-甲基胞苷(5mC)及其氧化形式5-羟甲基胞苷(5hmC)、N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、假尿苷(Ψ)和肌苷(I)RNA抗体；和甲基-RNA结合蛋白METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1、ZNF217和它们的抗体。
可以通过在扩增之前分离胞外囊泡(EV)来实现进一步的富集。EV是小的膜囊泡(membranous vesicle)，其源自多泡体与质膜融合时的内体细胞室。分泌的EV相对稳定，可作为来自亲本细胞/细菌的蛋白质、多肽、基因、可溶性因子和膜结合受体/配体的有效载体，因此通过超速离心从人血清或血浆中分离的EV可以增加MTB DNA或RNA产量。
为了分离EV，通常实施大于100,000g(42,000rpm)的超速离心。然而，本领域技术人员将理解分离EV的其他方法，例如密度梯度分离、基于聚合物的沉淀、免疫学选择、微流体分离、尺寸排阻色谱、膜过滤、膜亲和分离。
密度梯度分离是指将样品加载到不同密度分布的蔗糖溶液上，然后进行超速离心的方法，从而可以将EV与蛋白质聚集体和其他杂质分离。例如，密度梯度超速离心可以通过将血浆样品加载到50、30和10％碘克沙醇(iodixanol)层上，然后以120,000×g离心24小时来进行。从顶部到底部收集十个级分(F1-10)，其中可以进一步纯化EVs含量最高的级分。
基于聚合物的沉淀包括将生物样品与含聚合物的沉淀溶液混合，然后进行温育和低速离心。最常用的聚合物之一是聚乙二醇。
免疫选择技术使用基于抗体的分离方法，所述抗体靶向胞外囊泡上已知的表面标志物。这些标志物中的一些包括囊泡表面上的充分表征的四跨膜蛋白(tetraspanins)(CD9、CD63、CD81)或免疫调节分子(MHC I&II)。
微流体分离基于将EV捕获在微通道中，并且可以是生物流体的低体积输入的一种选择。
尺寸排阻色谱法用于基于尺寸而非分子量来分离大分子。该技术应用了一种填充有多孔聚合物珠子的柱子，其含有多种孔和通道。分子根据它们的直径穿过珠子。小半径分子通过色谱柱的孔的迁移需要更长的时间，而大分子从色谱柱中洗脱得更早。尺寸排阻色谱可以精确分离大分子和小分子。此外，该方法可以应用不同的洗脱溶液。
膜过滤也可用于分离外泌体(exosome)。根据微囊泡的大小，这种方法允许将EV与蛋白质和其他大分子分离。EV也可以通过多孔结构捕获它们来分离。特别地，微柱多孔硅纤毛结构被设计用于分离40-100nm EV。除了标准过滤技术外，切向流过滤也可用于EV的有效分离。该方法用于通过去除游离肽和其他小化合物来分离具有很好确定了尺寸的EV。
可以使用各种DNA扩增技术，因为每种技术都有其优点和缺点。本发明的方法可以采用常见的DNA扩增技术，例如PCR、RPA、RCA、LAMP等，以及任何新开发的扩增方法。
所述方法结合了扩增和CRISPR检测。在扩增步骤中，反应缓冲液中的杂交增强剂成分可用于在DNA扩增的每个循环期间增强特异性引物-模板杂交，防止错误引发并提高DNA扩增特异性和产量。我们预期能够从5μl血清样品中的单个拷贝中扩增MTBDNA，用于CRISPR检测。
杂交增强剂可进一步用于CRISPR检测步骤，因为它们可进一步改善引导RNA与靶序列之间的杂交并减少错配。预计此类增强剂能够稳定和增强CRISPR蛋白的活性并放大信号。
在一个实施方案中，杂交增强剂是热稳定的AccuPrime辅助蛋白。这些增强了每个PCR循环期间的特异性引物-模板杂交，防止错误引发并提高PCR特异性和产量。也可以使用其他杂交增强剂，只要它们可以增强杂交的特异性。杂交增强剂的非限制性实例包括阴离子聚合物、原位杂交缓冲液和类似的缓冲液组分、AccuPrime辅助蛋白、ULTRAhybTM超灵敏杂交缓冲液等。
如本文所用，“CRISPR蛋白”或“CRISPR效应蛋白”或“CRISPR酶”是指2类CRISPR效应蛋白，包括但不限于Cas9、Cas12a(以前称为Cpf1)、Csn2、Cas4、C2c1、Cc3、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d。在一个实施方案中，本文所述的CRISPR效应蛋白优选为Cpf1效应蛋白。
如本文所用，“引导RNA”或“gRNA”是指与互补的靶DNA序列结合以引导CRISPR-Cas系统与该靶DNA链紧密接触的非编码RNA序列。
如本文所用，“报道分子”是指用荧光和猝灭剂、金纳米颗粒或生物素-FAM标记的单链DNA或单链RNA，并且可以在例如纸侧流测试法(paper lateral flow assay)或光谱仪等中通过荧光读数器或比色变化来检测报道分子的解离。
如本文所用，“靶DNA片段”是MTB特异性DNA序列的一部分。例如，IS6110是一种MTB复合物特异性插入序列，其在每个MTB基因组存在多个拷贝。据报道，gryB在495、516和533位的突变发生在耐氟喹诺酮的MTB中，并且esxB是MTB分泌的有助于其毒力的一种CFT-10蛋白。因此，靶向这些DNA片段将有助于检测MTB。额外的靶DNA片段也可以选自以下MTB基因：rpoB,katG,inhA,rpsL,rrs,gyrA,gyrB,embB,eis和pncA。
如本文所用，“DNA扩增”或“核酸扩增”是指一个基因或一个DNA片段的拷贝数增加而其他基因不成比例增加的自然和人工过程。
如本文所用，“聚合酶链反应”或“PCR”是指通过使用DNA聚合酶和与DNA链的特定靶区域的每一端互补的两个引物(正向和反向引物)以及dNTP来扩增该靶区域的方法。
如本文所用，“重组酶聚合酶扩增”或RPA是指使用重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换聚合酶扩增特定靶区域的方法。重组酶将寡核苷酸引物与双链DNA中的同源序列配对，且单链DNA结合蛋白与置换的DNA链结合以防止引物被置换。最佳温度为37-42℃，反应迅速进行并导致特异性DNA扩增，无需PCR所需的热或化学熔解。
如本文所用，“基于核酸序列的扩增”或NASBA是指用于在一个温度下连续扩增单一混合物中的核酸(特别是RNA序列)的引物依赖性方法。使用了三种酶：逆转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶。使用了两个引物：第一个引物包括与靶序列互补的3'端序列和被T7RNA聚合酶识别的启动子的5'端有义序列；第二个引物包括与P1引发的DNA链互补的序列。首先，将RNA模板提供给反应混合物，由此第一个引物结合到模板3'端的其互补位点。逆转录酶合成相反的互补DNA链，延伸引物的3'端，沿RNA模板向上游移动。此时，RNAse H破坏DNA-RNA复合物中的RNA模板(RNAseH仅破坏RNA-DNA杂合体中的RNA，但不破坏单链RNA)。然后第二个引物结合至(反义)DNA链的5'端。之后，当T7RNA聚合酶与双链上的启动子区域结合时，该逆转录酶再次从结合的引物合成另一条DNA链，从而产生双链DNA。由于T7 RNA聚合酶只能在3'到5'方向转录，因此有义DNA被转录并产生反义RNA。重复此过程，且聚合酶不断产生模板的互补RNA链，从而导致扩增。
现在，循环阶段可以类似于之前的步骤开始。然而，在这里，第二个引物首先与(-)RNA结合，且逆转录酶现在产生(+)cDNA/(-)RNA双链体。RNAse H再次降解RNA，且第一个引物与现在的单链+(cDNA)结合，随后逆转录酶产生互补(-)DNA并产生dsDNA双链体。最后，T7聚合酶与启动子区域结合，产生(-)RNA，循环完成。
如本文所用，“滚环扩增”或RCA指等温酶促过程，其中使用环状DNA模板和特定DNA或RNA聚合酶扩增短DNA或RNA引物以形成长单链DNA或RNA。RCA产物是包含数十到数百个与环状模板互补的串联重复序列的多联体(concatemer)。
如本文所用，“环介导的等温扩增”或LAMP是指单管DNA扩增方法，其中靶序列在60-65℃的恒定温度下使用两组或三组引物和除复制活性外还具有高链置换活性的聚合酶。通常，使用4种不同的引物来扩增靶基因上的6个不同区域，这提高了特异性。额外的一对“环引物”可以进一步加速反应。
如本文所用，“报道分子”是指具有与可检测报道基团连接的核苷酸的分子，使得当核苷酸与匹配的序列杂交时，报道基团产生可检测信号。非限制性报道分子包括用荧光和猝灭剂、金纳米颗粒、生物素-FAM标记的单链DNA或RNA。
如本文所用，“抗人DNA抗体”是指靶向双链人DNA作为抗原的抗核抗体。
如本文所用，“抗MTB抗体”是指由于其特定的甲基化模式而靶向结核分枝杆菌DNA的抗体。
当与权利要求书或说明书中的术语“包含”结合使用时，使用词语“一个”或“一种”是指一个或多于一个，除非上下文另有说明。
术语“约”是指所述值加上或减去测量误差范围，或者如果没有指明测量方法，则为加或减10％。
权利要求书中使用的术语“或”用于指“和/或”，除非明确指出仅指代备选物或如果备选物是相互排斥的。
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短语“由...组成”是封闭式表述，并且排除了所有额外的元件。
短语“基本上由...组成”排除了额外的材料元件，但允许含有基本上不改变本发明的性质的非材料元件。
本文使用以下缩写：
缩写 术语
CRISPR 成簇的规则间隔的短回文重复
gRNA 引导RNA
LAMP 环介导的等温扩增
MTB 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
NASBA 基于核酸序列的扩增
PAM 原型间隔子相邻基序
PCR 聚合酶链反应
RCA 滚环扩增
EV 胞外囊泡(Extracellular vesicle)
NTM 非结核分枝杆菌
附图简述
图1阐示了本发明的方法。
图2显示了血清样品的荧光结果。
详细描述
本发明提供了检测血清样品中的MTB DNA的新方法。该方法包括以下步骤：a)从血清样品中提取核酸；b)扩增靶核酸序列，和c)使用CRISPR介导的系统检测靶核酸序列的存在，其中CRISPR介导的系统包含CRISPR效应蛋白、与该靶核酸序列杂交的引导RNA、以及报道分子。
设计在DNA扩增步骤中使用的引物为仅扩增在分枝杆菌物种中保守或已被报道具有某些耐药性的MTB基因序列。例如，IS6110是MTB特异的插入序列。也可以扩增其他MTB特异的基因，例如esxB,rpoB,katG,inhA,rpsL,rrs,gyrA,gyrB,embB,eis和pncA。
可以在登录号X17348.1中发现结核分枝杆菌IS6110的DNA序列。来自菌株H37Rv的结核分枝杆菌esxB的DNA序列可在AL123456.3(4352274-4352576)中找到。来自菌株H37Rv的结核分枝杆菌gryB的DNA序列可在AL123456.3(5240-7267)中找到。在设计引物时，重点是扩增CRISPR效应蛋白可识别的PAM。
gRNA序列是根据DNA扩增步骤中使用的靶片段和引物设计的。换言之，gRNA序列是IS6110,IS986,esxB,gryB,rpoB,katG,inhA,rpsL,rrs,gyrA,gyrB,embB,eis或pncA的部分。这些基因列于表1。
Figure BDA0003783680130000081
Figure BDA0003783680130000091
本发明以IS6110,esxB,gryB作为靶片段为例进行说明。然而，这些靶标仅是示例性的，本发明可广泛应用于分枝杆菌物种中的其他保守区域。以下实施例仅用于阐述，而不是过度限制所附权利要求的范围。
实施例1
如下收集/制备四个样品。对所有四个样品实施本发明的方法。
Figure BDA0003783680130000092
Figure BDA0003783680130000101
1.提取DNA
为了从血清样品中提取DNA，使用了以下材料：Quick-cfDNATM血清&血浆试剂盒(D4076)，其含有S&P 5X消化缓冲液、蛋白酶K、S&P DNA结合缓冲液、Zymo-SpinTM III-S柱组件、S&P DNA Prep洗涤缓冲液、S&P DNA洗涤缓冲液、DNA洗脱缓冲液(10nM Tris-HCL,pH8.5,0.1mM EDTA)和1.5mL管。
如果血清样品储存在-80℃，首先将样品置于室温解冻30分钟。在DNA低结合管中将100μl解冻的血清与25μl S&P 5X消化缓冲液和10μl蛋白酶K混合。
随后，将混合物在55℃孵育30分钟以进行消化，然后向消化的样品中加入两体积的S&P DNA结合缓冲液并彻底混合。
然后将全部混合物转移到1.5ml管中的Zymo-SpinTM III-S柱组件中，并以1000g离心2分钟。弃去流出液。
将400μl S&P DNA Prep缓冲液添加到柱中并以≥10000g离心30秒，并弃去流出液。用400μl S&P洗涤缓冲液洗涤该柱两次，每次以≥10000g离心1分钟。
然后将柱转移到1.5ml无DNase管中。将40μl DNA洗脱缓冲液直接添加到柱基质中并在室温孵育3分钟，然后以最大速度离心30秒。然后将收集的DNA储存在-20℃直至进一步使用。
2.扩增DNA
作为DNA扩增的一个例子进行PCR，并且如上所述，可以使用其他DNA扩增技术。为了进行PCR，使用了以下材料：DEPC处理水(1907041)、引物F和引物R(下表列出)、10X DNA聚合酶PCR缓冲液、AccuPrimeTMTaq DNA聚合酶系统。
设计三对引物以扩增MTB基因组的IS6110,esxB和gryB。如上所述，选择IS6110的原因是因为MTB基因组有多个其拷贝，这可以提高灵敏度。设计针对esxB的引物是因为esxB在不同的分枝杆菌物种中是保守的。针对gryB的引物专门设计用于检测MTB是否耐氟喹诺酮。下面列出了此步骤中使用的设计引物：
Figure BDA0003783680130000111
在室温将以下组分添加到无菌薄壁0.2ml PCR管中。
Figure BDA0003783680130000112
充分混合管中的内容物，并短暂离心以收集内容物。将管在热循环仪中95℃孵育2分钟，以使DNA模板完全变性并激活酶。
然后进行35个循环的PCR扩增，如下所示：变性：95℃ 30秒；退火：60℃ 30秒；延伸：72℃ 30秒。在完成35个循环后，反应混合物的温度保持在4℃。然后将得到的PCR产物储存在-20℃直到下一步。
3.CRISPR检测
在扩增步骤之后，使用CRISPR-Cas系统进行MTB检测，使用以下材料：DEPC处理水(1907041)、
Figure BDA0003783680130000113
Lba Cas12a(Cpf1)、10X NEBufferTM 2.1、gRNA(在下表中列出)、荧光报道分子(5′-6-FAM-TTTTTTTTTTTT-BHQ1)、以及
Figure BDA0003783680130000114
96Well Half-Area微孔板。
如上所讨论的那样，gRNA序列是根据靶片段和PCR引物设计的，如下所列：
Figure BDA0003783680130000121
为了实施CRISPR检测步骤，将以下组分添加到Half-area微孔板的孔中，充分混合并在室温孵育10分钟
Figure BDA0003783680130000122
应注意，将具有缓冲溶液混合物的PCR产物添加到CRISPR检测混合物中，而不是从缓冲溶液中分离PCR产物。这也增加了检测灵敏度。
该系统在黑暗中在37℃振动孵育20分钟。用读板器测量荧光信号。结果示于图2。当样品产生的信号强度比阴性对照高两倍时，定义为阳性。如图2所示，阳性样品1、2和4显示出与阳性对照相当的荧光强度，而阴性样品3显示出与阴性对照相当的荧光强度。
预言性实施例1
为了获得最佳结果，改变CRISPR检测步骤中的比例(Cas12a:gRNA:报道分子)，否则DNA提取、DNA扩增和CRISPR检测步骤与实施例1相同。这个优化的比例将进一步提高该方法的特异性和灵敏度。
预言性实施例2
为了进一步提高该方法的灵敏度，将在DNA扩增步骤之前从血清样品中富集MTB-DNA和/或去除人DNA。人DNA具有特定的甲基化模式，其作为抗人DNA抗体的表位。通过用抗人DNA抗体处理提取的DNA以消耗血清样品中的人DNA，预期进一步提高本发明方法的灵敏度。
类似地，MTB DNA具有其自身的特定甲基化模式，其是种系或物种特异性的，并且可以用作抗MTB抗体的表位。因此，通过用抗MTB抗体处理血清样品以仅捕获MTB DNA片段，可以进一步提高该方法的灵敏度。
出于所有目的，以下参考文献通过引用整体并入本文作为参考。
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
ggtcggaagc tcctatgaca atgcactagc c 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
ttgagcgtag taggcagcct cgagttcgac 30
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
taaagagaga aagtagtcca gcatggcaga g 31
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
tctcgtcgag ttcctgcttc tgcttattgg 30
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
ctgttgttga cgttgttgtt ccggttcatg c 31
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
ctgaatgccg tcttccttgt tgatcttctt c 31
<210> 7
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 7
uaauuucuac ucuuguagau aucagcucgg ucuugaauag 40
<210> 8
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 8
uaauuucuac ucuuguagau gagcggaucu ccggcgaccu 40
<210> 9
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 9
uaauuucuac ucuuguagau gcacaaccgc cgcuguacaa 40

Claims (22)

1.一种检测体液样品中结核分枝杆菌(MTB)的方法，包括以下步骤：
a)从体液样品中扩增MTB靶核酸序列；和
b)使用CRISPR介导的系统检测MTB靶核酸序列的存在；
其中所述CRISPR介导的系统包含CRISPR效应蛋白、与所述MTB靶核酸片段杂交的引导RNA(gRNA)和报道分子，所述报道分子被所述CRISPR效应蛋白切割时是可检测的。
2.根据权利要求1所述的方法，在步骤a)之前还包括以下步骤：
a-1)从体液样品中提取核酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸片段是DNA。
4.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤a-1)中，所述提取步骤还包括：
a-2)使用抗人DNA抗体消耗人DNA。
5.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤a-1)中，所述提取步骤还包括：
a-3)使用抗MTB抗体富集MTB细菌DNA。
6.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤a-1)中，所述提取步骤还包括：
a-4)通过超速离心、尺寸排阻色谱、聚合物沉淀、膜过滤或膜亲和分离中的至少一种分离胞外囊泡。
7.根据权利要求3的所述方法，其中使用聚合酶链反应(PCR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)或环介导的等温扩增(LAMP)实施步骤a)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中使用PCR实施步骤a)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在PCR中使用杂交增强剂，并且将杂交增强剂转移到检测步骤b)中。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b)中，所述CRISPR效应蛋白选自Cas12a、Cas9和Cas13。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述报道分子是用荧光和猝灭剂、金纳米颗粒或生物素-FAM标记的单链DNA或单链RNA。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述报道分子是5′-6-FAM-TTTTTTTTTTTT-BHQ1。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述体液样品获自血清、血浆或尿。
14.根据权利要求2所述的方法，其中在室温实施步骤a)。
15.根据权利要求2所述的方法，其中所述靶DNA序列是IS6110,IS986,esxB,gryB,rpoB,katG,inhA,rpsL,rrs,gyrA,gyrB,embB,eis和pncA的一部分。
16.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤b)中使用一对引物用于DNA扩增，其中所述引物是SEQ ID NO.1和2。
17.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤b)中使用一对引物用于DNA扩增，其中所述引物是SEQ ID NO.3和4。
18.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤b)中使用一对引物用于DNA扩增，其中所述引物是SEQ ID NO.5和6。
19.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤c)中，所述gRNA具有以下序列中的至少一种：SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸片段。
21.一种检测血清样品中结核分枝杆菌(MTB)的方法，包括以下步骤：
a)从血清样品提取DNA以产生DNA样品；
b)使用PCR或RPA从所述DNA样品扩增MTB靶DNA序列以产生扩增的DNA，其中使用一对引物，并且其中所述引物是SEQ ID NO.1&2,3&4或5&6；和
c)使用CRISPR介导的系统检测所述扩增的DNA中MTB靶DNA片段的存在；
其中所述CRISPR介导的系统包含Cas12a、引导RNA(gRNA)和报道分子，所述报道分子被Cas12a切割时是可检测的，
其中所述gRNA是SEQ ID NO.7、8或9。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在步骤a)中，所述提取步骤还包括以下至少之一：
a-1)使用抗人DNA抗体从所述血清样品或所述DNA样品中去除人DNA，
a-2)通过使用抗MTB抗体从所述血清样品或所述DNA样品中富集MTB细菌DNA，或
a-3)通过超速离心、尺寸排阻色谱、聚合物沉淀、膜过滤或膜亲和分离中的至少一种分离胞外囊泡。
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