KR100434244B1 - 미코박테리움아비움복합체종의증폭및검출방법 - Google Patents

미코박테리움아비움복합체종의증폭및검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미코박테리움 아비움 복합체 종 (Mycobacterium avium complex species) 의 dnaJ 유전자내 타겟 서열을 복합체 - 특이적으로 증폭시키는 방법에 관한다. 또한 증폭 생성물의 검출 및/또는 존재하는 MAC 종의 동정을 위한 검정 탐침을 제공한다.

Description

미코박테리움 아비움 복합체 종 (Mycobacterium avium complex species) 의 증폭 및 검출 방법
[발명의 분야]
본 발명은 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 미코박테리아 (Mycobacteria) 의 타겟 핵산 서열의 증폭 및 검출 방법에 관한 것이다.
[발명의 배경]
본 미코박테리아는 항산성, 비운동성, 그람 양성 간균속이다. 상기 속에는 몇몇종을 포함하는데, 예를 들어 미코박테리움 아프리카늄 (Mycobacterium africanium), 엠 아비움 (M. avium), 엠. 보비스 (M. bovis), 엠. 보비스-BCG (M. bovis-BCG), 엠. 켈로내 (M. chelonae), 엠. 포튜이튬 (M. fortuitum), 엠. 고도내 (M, gordonae), 엠. 인트라셀룰래어 (M. intrecellulare), 엠. 캔사시 (M. kansasii), 엠. 마이크로티 (M. microti), 엠. 스크로풀라세움 (M. scrofulaceum), 엠. 파라튜베큘로시스 (M. paratubeculosis) 및 엠. 튜베큘로시스 (M. tuberculosis) 을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 상기 유기체들중 흑종의 것은 질병 원인 인자이다. 1953 년 이래 처음으로, 미국에서는 미코박테리아에 감염되는 경우가 증가되고 있다. 튜베큘로시스에 특히 관심이 집중되었지만, 면역 약화 환자 (immune compromised patients) 의 수가 증가함에 따라 기타 미코박테리아감염에 대한 관심도 또한 증가되었다. 상기 새로운 경우중 다수가 유행성 AIDS 인데, 면역 약화 집단 (immune compromised population) 은 미코박테리아에 특히 민감하다. 미코박테리움 아비움, 미코박테리움 캔사시 및 기타 비-결핵성 (non-tuberculosis) 미코박테리아가 HIV 에 감염된 환자 및 면역 약화 환자에서 기회성 병원체인 것으로 밝혀졌다.
엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어는 미코박테리움 아비움 복합체 (MAC) 의 구성원들이다. 최근들어 AIDS 환자들에 전이성 (disseminated) MAC 감염이 매우 성행하고 있으므로 상기 종들이 매우 중요성을 띄게 되었다. 상기 미코박테리움 아비움 복합체는 이들의 생화학적 및 혈청 응집성 (seroagglutination characteristic)을 기초로 하여 구별되어 지는 28 개의 혈청형 (serovar) 으로 구성된다. [Inderlied 와 그의 동료에 의하여 1993 년 Clin. Microbiol. Rev. 6, 266 - 310 참조] 분류 방법에 따라, 28 혈청형중 10 - 12 는 미코박테리움 아비움종에 속하고, 10 - 12 는 미코박테리움 인트라셀룰래어에 속한다. MAC 혈청형중 6 개는 아직 정확히 분류되지 않았다. MAC 감염은 미코박테리아 연구 실험실에서 동정된 병원성 분리체의 약 50%를 차지하고, AIDS 환자 및 기타 면역 약화 환자에서 가장 흔하게 발생한다. MAC 감염의 조기 진단 및 치료가 감염된 사람들의 삶을 향상 및 연장시킬 수 있었다.
현재 미코박테리움 감염의 진단은 이들 유기체를 항산성 염색 및 배양시킨후 생화학적 검정법을 수행함으로써 행해진다. 상기 과정들을 수행하는 데에는 시간이 소모되며 종래의 배양 방법을 사용하는 진단법은 통상적으로 6 주 정도 걸린다.BACTECTM시스템과 같은 자동화 배양 시스템 (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks. MD) 은 진단에 필요한 시간을 1 - 2 주 정도로 감소시킬 수 있을 것이다. 그러나, 미코박테리아 감염의 진단에 필요한 시간을 1 주일 미만, 바람직하게는 하루 정도로 단축시킬 필요성은 있다. 핵산 증폭 방법은 특이 타겟 서열을 신속하게 검출시키는 유력한 기술이다. 따라서 이는 미코박테리아를 신속하게 검출시키고 동정하는 전도 유망한 기술이라 할 수 있다. 업계에 공지된 핵산 증폭 기술의 예로서는 중합 효소 사슬 반응 (PCR ; U.S. 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호, 제 4,800,159 호, 제 4,965,188 호), 사슬 치환 증폭법 (SDA ; G. Walker 외 다수, 1992, PROC. Nat. Acad. Sci. USA 89, 392-396 ; G. Walker 외 다수, 1992. Nucleic Acids Res. 20, 1691 - 1696 및 본원에 참고 문헌으로 포함되어 있는 U.S. 특허 제 5,270,184 호), 핵산 서열 기초 증폭법 (NASBA ; U.S. 특허 제 5,130,238 호), 전사 - 기초 증폭 기술 (D. Kwoh 외 다수. 1989, Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173 - 1177), 자활 서열 복제 반응 (Sele-sustained sequence replication ; 3 SR ; J. C. Guatelli 외 다수, 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874- 1878) 및 Qβ 복제효소계 (P. Lizardi 외 다수, 1988. BioTechnology 6, 1197 - 1202) 가 있다.
SDA 및 3 SR 과 같은 등온성 증폭 방법은 진단에 특히 유리한데, 이들은 PCR 과 같이 고온/저온의 온도 순환을 필요로하지 않기때문이다. 따라서 이들은 더욱 간단한 방법이며 수행하는데에 있어서는 특별한 장치는 별로 필요하지 않다. 그러나, 임의의 핵산 증폭방법에 있어서, 그 방법을 적용하기 전에 소망의 형태와 특이성의 정도로 증폭될 수 있는 타겟 서열이 확인되어져야 한다. 선택된 타겟의 서열로부터 반드시 상기 선택된 증폭 방법에 적절한 증폭 프라이머를 디자인할 있는 것은 아니며, 상기 타겟이 반드시 진단에 적합한 정도의 민감도 및 특이도로 증폭되어 검출될 필요는 없다. 유럽 특허 출원 제 0 528 306 호에서는 유전자의 보존 지역 (conserved region) 에 대한 증폭 프라이머를 사용하여 미코박테리아의 16 S 리보좀 RNA 유전자내의 타겟 서열을 PCR 증폭시키는 방법에 대하여 기술하고 있다. 길이가 약 583 염기쌍인 증폭 생성물은 속-특이적 (genus-specific) 탐침이 혼성화되는 보존 지역 (conserved region) 및 종-특이적 (species-specific) 탐침을 사용하여 종을 동정하는데에 사용될 수 있는 다양화 지역 (variable region) 을 함유한다. EPO 제 0 528 306 호에 기술된 검정 시스템은 종 비특이적 증폭을 수행한 다음, 증폭산물을 종-특이적으로 검출하는 것을 기초로 하며, 생성된 증폭 생성물이 매우 크다는 사실이 중요하다. 증폭된 타겟 서열이 클수록, 증폭 생성물은 증폭물을 검출하기 위하여 비-교차-혼성화 (non-cross-hybridizing) 탐침, 종-특이 탐침을 디자인하기에 충분할 정도로 변이가 일어난 지역을 함유할 가능성이 크다. 본 발명에서 사용된 SDA 와 같은 증폭 방법은 PCR 에 의하여 증폭될 수 있는 정도의 큰 타겟을 증폭시킬 수 없다. 작은 타겟 서열은 증폭 생성물내 검정 탐침을 디자인할 수 있는 서열이 적으므로, 주어진 타겟 검출용 비-교차-혼성화(non-cross hybridizing) 탐침, 종-특이 탐침을 디자인 할 수 있는 가능성이 엄격히 제한된다. 명확하게는, 원하는 특이성 (specificity) 를 갖는 검정 탐침 및 증폭 프라이머가타겟 서열이 큰 경우에도 디자인될 수 있는지 여부는 확실하지 않다. 그러나, 작은 타겟 서열이 증폭되어 검출되는 경우 특이 프라이머 및 탐침을 개발하는 문제는 특히 민감한 문제이다. 타겟 선택이 변이성 분석 영역(bariable assay region)에 인접하는 서열을 요구하는 것에 의하여 더욱 한정되는 경우 상기 문제는 더욱 복잡해진다. 상기 변이성 분석 영역은 함께 증폭될 만큼 근접하여 있을 뿐만 아니라 관심있는 종들 중에서 고도로 보존되어 있어, 종-, 복합체- 또는 그룹 - 특이적으로 검출을 하기 이전에 상기 분석 영역의 종 비특이 증폭이 가능하도록 한다.
열 쇼크 단백질 (heat shock protein) 은 온도가 증가함에 따라 유기체내에서의 발현량이 증가하는 단백질 과 (family) 이다. 상기 열 쇼크 단백질은 고도로 보존되어 있다. [R. J. Garcia 와 그의 동료, 1989, Infection and Immunity 57, 204 - 212, R. S. Gupta 와 그의 동료, 1992, J. Bacteriology 174, 4594 - 4605] 42 kDa의 열 - 쇼크 단백질을 암호화하는 dnaJ 유전자는 세포 스트레스 감응 (cellular stress response) 에 관여한다고 사료된다. 엠. 튜베큘로시스 는 dnaJ 유전자의 누클레오티드 서열이 밝혀진 최초의 미코박테리아이다. [R. B. Lathigra 와 그의 동료, 1988. Nucl. Acids Res. 16, 1636] 엠. 레프래 (M. leprae) 의 dnaJ 유전자 단편 누클레오티드 서열이 뒤이어 밝혀졌다. [S. S, Harvey 와 그의 동료, 1993, J. Gen. Microbiol. 139, 2003 - 2008] 이후에, R.B.Lathigra 와 그의 동료, S. I. Takewaki 와 그의 동료에 의하여 기술된 [1993, J. Clin. Microbiol. 31, 446-450] 엠. 튜베큘로시스 서열을 사용하여 엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어 를 포함하는 광범위의 미코박테리아 종에서 dnaJ 유전자 (bp 1394-1629) 236-bp 단편을 증폭시키는 1 세트의 속 - 특이 PCR 프라이머를 개발하였다. 또한, PCR 에 의하여 속 - 특이 증폭된 다음, 엠. 튜베큘로시스, 엠. 아비움, 엠. 인트라셀룰래어, 및 엠. 캔사시를 동정할 수 있도록 하는 종 - 특이 올리고누클레오티드 탐침이 보고되었다. 이후 19 종의 미코박테리아 dnaJ 유전자가 서열분석되었고, 이를 계통 발생 관계를 조사하는데에 사용하여 유전자내의 종 - 특이 제한 위치를 기초로 종을 분류하였다. [S. I. Takewaki 와 그의 동료, 1994, 1994 년 5 월 17 일, Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 159 - 166] 일본 공개 특허 제 6-133775 호 (Takewaki 와 그의 동료에 의하여 출원된) 에 PCR 용 속 - 특이 증폭 프라이머 쌍 및 미코박테리아의 dnaJ 유전자에서 유도된 수개의 종 - 특이적 탐침에 관하여 기술하고 있다.
본원에 사용된 흑종의 용어들은 하기와 같이 정의된다 ;
증폭 프라이머란 타겟 서열에 혼성화된후 프라이머를 연장(extension) 시켜 타겟 서열을 증폭시키는 프라이머를 의미한다. SDA 에 의하여 증폭되는 경우, 2 차 구조 형성을 최소화시키기 위하여 상기 증폭 프라이머는 GC 함량이 낮은, 바람직하게는 탐침의 총 누클레오티드 조성의 70 % 미만인 것을 선택하는 것이 바람직하다. SDA 증폭 프라이머의 3 ' 말단(타겟 결합 서열)은 타겟 서열의 3 ' 말단에 혼성화한다. 상기 타겟 결합 서열은 증폭 프라이머에 타겟 특이성 (target specificity) 을 부여한다. 상기 SDA 증폭 프라이머는 추가로 이의 5 ' 말단에 근접한 제한 엔도누클레아제 인지 부위를 추가로 포함한다. G. Walker 와 그의 동료에 의하여 기술된 바[1992, PNAS, 상동]와 같이, 제한 엔도누클레아제에 대한 인지 부위는 상기 인지 부위가 절반이 개질된 (hemimodified) 경우, DNA 이중체 중 하나의 사슬에 닉이 형성되는 부위이다. 대부분의 SDA 반응에서, 증폭 프라이머는 타겟 서열을 기하급수적으로 증폭시킨다. 한 쌍의 증폭 프라이머가 2 본쇄 서열을 증폭시키는데에 사용되는 경우, SDA 증폭 프라이머는 "S" 프라이머 (예를 들어 S1, 및 S2) 라고 나타내기도 한다. 타겟 말단의 특이화된 서열을 필요로 하지 않는 기타의 증폭 방법에서, 상기 증폭 프라이머는 일반적으로 필수적으로 타겟 결합 서열만으로 구성된다. 예를 들어, 본 발명에 의한 타겟 서열의 PCR 증폭에서는 표 1 의 증폭 프라이머의 타겟 결합 서열로 구성된 증폭 프라이머를 사용할 것이다.
범퍼 프라이머 (bumper primer) 또는 외부 프라이머 (external primer) 란, SDA 에 의하여 증폭될 수 있는 타겟을 생성시키는데에 사용되는 프라이머이다. 상기 범퍼 프라이머는 증폭 프라이머의 타겟 서열의 업스트림에 어닐링되어 범퍼 프라이머가 연장 (extension) 됨에 따라 증폭 프라이머 다운 스트림 및 이의 연장 생성물을 치환시킨다. 한쌍의 범퍼 프라이머가 한쌍의 증폭 프라이머 연장 생성물을 치환시키는 경우 범퍼 프라이머는 또한 "B" 프라이머 (예를 들어 B1및 B2) 라고도 나타낼 수 있다. 범퍼 프라이머를 연장시키는 것은 증폭 프라이머의 연장 생성물을 치환시키는 하나의 방법이지만, 가열시키는 것도 또한 흑종의 증폭 반응에 적당하다.
타겟 (target) 또는 타겟 서열 (target sequence) 이란, 증폭될 핵산 서열이다. 이러한 것들에는 증폭될 핵산 서열 원본, 이것에 상보적인 제 2 서열, 및 증폭 반응에 의하여 생성된 서열 원본의 복사체 중 하나의 사슬을 포함한다. 복사체들은프라이머가 혼성화될 타겟 서열 원본에 충실한 (faithful) 복사체들을 포함하므로 상기 복사체들은 또한 증폭 가능한 타겟 서열로 사용된다.
증폭 반응시 생성되는 타겟 서열 복사체 (copies of target sequence) 란, 증폭 생성물, 앰플리머 (amplimer) 또는 앰플리콘 (amplicon) 을 의미한다.
연장 생성물 (extension product) 이란, 증폭 프라이머가 혼성화된 후 타겟 서열을 주형으로 사용하여 중합 효소로 연장되어 생성된 타겟 서열의 1 본쇄 복사본을 의미한다.
검정 탐침 (assay probe) 이란, 검정법에서 검출 또는 동정에 사용되는 흑종의 올리고누클레오티드 부분을 의미한다. 본 발명에서, 상기 검정 탐침은 미코박테리아의 복합체-, 그룹- 또는 종 - 특이적 검출 또는 동정에 사용되는 탐침이며, 검출 탐침 및 포획 탐침 (capture probe) 이 상기 검정 탐침의 예이다.
검정 부위 (assay region) 또는 검정 부위 서열 (assay region sequence)이란, 검정 탐침이 혼성화되는 타겟 서열 부분, 또는 다른 핵산을 의미한다.
종 - 특이적 (species - specific) 이란, 동일 속 (genus) 의 다른 종 (species) 또는 상이한 속 (genus) 의 종들에서는 실질적으로 검출되거나 또는 증폭되지 않고, 임의의 유기체의 종에서 검출되거나 또는 증폭되는 것을 의미한다. 속 - 특이적 (genus - specific) 이란, 상이한 속에 속하는 종들에서는 실질적으로 검출 또는 증폭되지 않고, 동일한 속에 속하는 대다수의 종에서 검출되거나 또는 증폭되는 것을 의미한다.
그룹 - 또는 복합체 - 특이 검출 (group - or complex - specificdetection) 이란, 동일한 속에 속하는 다른 종 또는 상이한 속에 속하는 종들에서는 실질적으로 검출 또는 증폭되지 않고, 선택된 그룹 (예를 들어, MAC) 내 관련된 대다수의 종에서 검출되거나 또는 증폭되는 것을 의미한다.
[발명의 요약]
본 발명은 MAC 를 포함하는 28 개의 혈청형중 26 개에서 관찰되는 타겟 서열의 복합체 - 특이 증폭에 사용될 수 있는 올리고누클레오티드 프라이머의를 제공한다. 상기 타겟 서열은 dnaJ 유전자의 단편이다. 그러므로, 한쌍의 증폭 프라이머는 엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어 의 dnaJ 유전자에서 얻어지는 48 bp 타겟 서열을 증폭시킬 수 있다. 증폭된 타겟의 검정 부위에 혼성화되는 올리고누클레오티드 검정 탐침은 증폭 생성물을 검출하는데에 사용되며, 임의로는 MAC 종들을 구별시킨다. 본 발명의 방법은 미코박테리움 파라투베큘로시스 (Mycobacterium paratuberculosis), 인간의 Crohn 병 및 가축의 Johne 병과 관련된 엠. 아비움 의 아종 (subspecies) 에서 dnaJ 타겟 서열을 검출시킨다.
MAC 종의 danJ 유전자 (1548 - 1595 bp) 의 48 bp 타겟 단편을 복합체 - 특이 증폭시키는 증폭 프라이머가 제공된다. 엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어 의 서열이 증폭 프라이머가 혼성화되는 부위의 단일 누클레오티드가 상이하므로 S. I. Takewaki 와 그의 동료 (1994, 상동)에 의하여 제공된 서열 데이터를 기초로하여 엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어 모두에서의 타겟을 매우 효율적으로 증폭시키는 것은 예견될 수 없다. 프라이머의 타겟 결합 서열 및 이것이 혼성화될 타겟 서열사이의 매치 오류 (mismatch) 는 일반적으로 타겟 증폭을 억제시키거나 그렇지 않으면 타겟 증폭을 방해하는 것으로 공지되어 있다. 특히, 본 발명은 dnaJ 유전자내 MAC-특이 타겟이 사슬 치환 증포법 (Strand Displacement Amplification ; SDA)에 의하여 증폭되고, MAC 종의 존재를 검출하거나 존재하는 경우 특정 MAC 종을 동정할 수 있도록 하는 올리고누클레오티드 탐침 및 프라이머를 제공한다. 본 발명의 프라이머는 상기 종들 사이의 타겟내 증폭 프라이머 혼성화가 발생되는 누클레오티드 서열이 상이함에도 불구하고 엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어 타겟을 107배 증폭킨다는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 증폭후, 증폭된 엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어 타겟 서열은 본 발명의 검정 탐침과 혼성화되는 지의 여부로 각각 구별될 수 있다.
SDA 및 MAC 타겟을 검출시키기 위하여 개발한 여러 가지 탐침 및 프라이머를 표 1 에 나타내었다. 상기 제한 엔도누클레아제 인지 부위 (HincII) 는 굵은 글자체로 나타내었으며 타겟 결합 서열은 이탤릭체로 나타내었다. 각각의 SDA 프라이머의 3 ' 말단에 있는 타겟 결합 서열은 이의 타겟 특이성을 결정해준다. 엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어 내 증폭 프라이머가 혼성화될 dnaJ 서열은 타겟의 각 말단 누클레오티드 하나가 상이함에 의하여 구별된다. 따라서 증폭 프라이머는 디자인되어 프라이머중 하나의 타겟 결합 서열 (엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어) 은 Watson - Crick 상보성을 완벽히 고수하면서 2 개의 타겟중 하나에 혼성화되지만, 다른 종들의 타겟에 혼성화될 경우에는 하나의 누클레오티드에 매치 오류(mismatch) 가 발생한다. 예를 들어, 상기 타겟 결합 서열인 서열 1 은 엠. 아비움 타겟에는 완벽하게 상보성 (perfect complmentary) 을 이루면서 혼성화되지만, 엠. 인트라셀룰래어 타겟에는 하나의 누클레오티드에 매치 오류 (mismatch) 가 발생한 상태로 혼성화된다. 이와 유사하게, 타겟 결합 서열인 서열 2 는 엠. 인트라셀룰래어 타겟에 완벽하게 상보성을 이루면서 혼성화되지만 엠. 아비움 타겟에는 하나의 누클레오티드에 매치 오류가 발생한 상태로 혼성화된다.
[표 1]
MAC 에서 얻은 dnaJ 유전자의 검출용 프라이머 및 탐침
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
단일 누클레오티드상에 매치 오류가 발생하는 경우는 완벽하게 상보적인 복합체에 비하여 프라이머 - 타겟 복합체를 불안정화시키지만, 의외로, SDA 반응 조건하에서의 증폭 효율은 감소되지는 않는다. SDA 반응물내 타겟 서열에 증폭 및 범퍼 프라이머의 초기 혼성화는 G. Walker 와 그의 동료에 의하여 기술된 바와 같이 (1992, Nucl. Acids Res. 상동 및 U.S. 특허 제 5,270,184 호) 증폭 가능한 타겟을 생성한다. 타겟 생성 캐스캐이드 (target - generation cascade) 에 의하여 닉 형성가능한 제한 엔도누클레아제 인지 부위가 인접되어 있는 원하는 타겟 서열 복사체를 생성한다. 따라서, 타겟 - 생성시 원래 존재하였던 타겟 및 프라이머 사이에서의 단일 누클레오티드 매치 오류는 증폭 프라이머에 의하여 완벽하게 상보적인 서열로 치환된다. 상기 말단-개질된 타겟 (terminally - modified target) 은 증폭 반응이 시작되고 SDA 를 수행한다. 따라서, 엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어 모두에서의 개질된 타겟 말단 서열은 동일할 것이지만, 증폭 프라이머가 결합하는 서열들 사이의 검정 부위 (assay region) 는 변하지 않을것이므로, 엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어 의 증폭 생성물이 구별되도록 할 것이다. 본 출원인은 타겟에상기 불일치 프라이머(mismatched primer)를 충분히 혼성화하여 증폭에 적합한 단일 변형된 타겟을 생성할 수 있는 한, SDA 와 연계된 이 독특한 타겟 생성의 기술적 특징에 의하여 증폭 반응이 프라이머 / 타겟 미스매치의 해로운 영향을 극복할 수 있도록 한다고 가정하고자 한다. 이러한 사실이 본 시스템에서 매치 오류가 발생함에도 불구하고, 증폭이 높은 효율로 수행될 수 있는 이유를 설명해주는 것이다. 표1에 기술된 증폭 프라이머 및 범퍼 프라이머를 사용하면, 엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어의 dnaJ 타겟은 SDA 에 의하여 107배 이상 증폭될 수 있으며, 엠. 아비움 에서는 최소 5 개의 복사체 및 엠. 인트라셀룰래어 에서는 최소 50 개의 복사체의 타겟을 검출할 수 있다.
표 1 에서, 서열 10 은 검출 탐침이며 서열 8 은 포획 탐침이다. 출원인은 상기 2 개의 올리고누클레오티드의 기능이 뒤바뀔 경우, 즉 검정법에서 서열 10 이 포획 탐침으로 사용되고 서열 8 이 검출 탐침으로 사용될 경우, 교차 - 반응성 (cross - reactivity) 이 검출된다는 것을 알아내었다. 그러나, 교차-반응성은 표 1 의 탐침 형태에 의하여 제거되는데, 정확히 말하면, 교차 - 반응 증폭 생성물이 포획되지 않기 때문이다. 서열 2 의 밑줄쳐진 A 잔기를 결실시키면 증폭 효율이 엠. 인트라셀룰래어에서 100 배 및 엠. 아비움 에서 10 배 감소되는 바와 같이, 본 발명의 프라이머를 개발함에 있어서 SDA 증폭 프라이머의 사소한 변형이라도 종종 예상하지 못한 효과를 초래한다는 밝혀졌다. 밑줄쳐진 A 잔기가 타겟 결합 서열의 일부가 아니라는 관점에서 이러한 사실은 예상외의 결과이지만, 상기 A 잔기는 타겟 결합 서열로부터 제한 엔도누클레아제 인지 부위와의 거리를 주기 위하여 포함되는 필수적으로 무작위 - 선택된 서열 (randomnly-selected sequence) 의 일부이다.
본 발명의 증폭 프라이머는 또한 PCR, 호열성 SDA (근본적으로 종래의 저온 SDA 와 동일한 반응 기작에서 열 - 안정화 효소를 사용하는) 및 3SR 과 같은 기타 핵산 증폭 반응에 역시 유용하다. 구체적으로, 타겟 서열에 대한 프라이머의 순환적, 특이적 혼성화, 타겟 서열을 주형으로 이용한 프라이머 연장 및 타겟 서열로부터 연장 생성물을 치환하는 것을 이용하는 흑종의 증폭 방법은 본 발명의 증폭 프라이머를 사용할 수 있다. 특이화된, 비-타겟 결합 서열을 필요로하지 않는 증폭 방법 (예를 들어, PCR)에서, 상기 증폭 프라이머는 표 1 에 기술된 증폭 프라이머의 타겟 결합 서열만을 포함할 수 있다. 표 1 에 기술된 증폭 프라이머와 다른 특이화된, 비-타겟 결합 서열을 필요로 하는 증폭 방법(예, 3SR) 에서는 선택된 증폭 방법에 필요한 서열 또는 구조를 HincII 부위와 치환시킨 타겟 결합 서열을 포함하는 증폭 프라이머를 증폭 방법에 사용할 수 있다. 저온 SDA (low - temperature SDA) 에 적당한 제한 엔도누클레아제 인지 부위는 업계에 공지된 바와 같이 HincII 부위를 대신할 수 있고, 또는 타겟이 호열성 SDA 에 의하여 증폭될 경우 호열성 SDA (thermophilic SDA) 에 적당한 제한 엔도누클레아제 인지 부위로 치환될 수 있다.
검정 방법의 검출 단계에서 검정 탐침에 혼성화시켜 증폭 생성물이 생성되는 MAC 종들을 동정 또는 구별할 수 있다. 혼성화에 의하여 검출시키는 경우, 통상적으로 상기 검출 탐침에는 검출 가능한 표지가 부착될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 타겟 핵산에 탐침이 혼성화되었음을 나타내어 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 부분을 말한다. 표지를 직접적으로 검출하는 경우, 업계에 공지된 바와 같이 탐침은 방사성 동위원소로 표지되어 방사성 사진으로 검출될 수 있거나 또는 형광 부분으로 표지되어 형광계로 검출될 수 있다. 이와는 달리, 상기 탐침은 검출 가능하도록 하는 추가의 시약을 필요로 하는 표지를 부착시켜 간접적으로 검출될 수있다. 간접적으로 검출 가능한 표지에는 예를 들어, 화학 발광 시약, 시각으로 관찰 가능한 생성물을 생성하는 효소 및 표지된 특이 결합 파트너 (예를 들어, 항체 또는 항원/햅텐) 와 결합될 경우 검출될 수 있는 리간드 (예를 들어, 바이오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 햅텐, 항체 또는 항원) 를 포함한다. 특히 유용한 표지에는 바이오틴 (표지된 아비딘 또는 스트렘트아비딘에 결합하여 검출가능한) 및 예를 들어 호오스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 또는 알카리성 포스파타제 (효소 기질을 가하여 채색된 반응 생성물이 생성될 경우 검출 가능한) 와 같은 효소를 포함한다. 바이오틴 및 기타 리간드는 또한 포획 탐침을 부착시켜 포획 탐침 및 적당한 특이 결합 파트너와 결합하여 고체상 (solid phase) 에 혼성화되는 상기 복합체를 고정시키는 데에 또한 유용하다. 이러한 표지, 또는 이러한 표지를 포함하는 것을 올리고누클레오티드 에 가하는 방법은 업계에 널리 공지되어 있으며 이러한 방법들중 흑종의 것은 본 발명에 사용하기 적당하다.
증폭 생성물을 검출하는 한가지 방법은 중합 효소를 사용하여 검정 부위에 특이적으로 혼성화된 프라이머를 연장시키는 것이다. 상기 프라이머는 상기된 바와같이 예를 들어, 방사성 동위원소를 사용하여 표지되는데, 그 결과 상기 표지는 프라이머와 함께 앰플리콘 - 특이 연장 생성물에 결합된다. 프라이머를 연장시켜 검출하는 방법에 관하여서는 G. Walker 와 그의 동료에 의화여 기술되었다. [1992, Nuc. Acids Res. 및 PNAS, 상동] 증폭 생성물을 검출하는 두번째 방법은 C. A. Spargo 와 그의 동료에 의하여 기술된 바와 같이 (1993, Molec. Cell. Probes 7, 395 - 404) 바이오틴화된 올리고누클레오티드 포획 탐침 및 효소 - 컨쥬게이트된 올리고누클레오티드 검출 탐침을 사용하여 증폭된 생성물을 검출하는 화학 발광 검정법이다. 상기 2 개의 탐침을 검정 부위내 상이한 위치에 혼성화시킨후, 상기 복합체는 스트렙트 아비딘 - 피복된 마이크로웰 플레이트 (microwell plate) 상에서 포획되며, 화학 발광 시그널이 나타나면 발광계 (luminometer) 로 측정한다. 상기 화학 발광 검정법 (chemiluminescent assay) 은 2 시간 미만에 수행될 수 있으며 하나의 전 - 증폭 (pre-amplification) 타겟 서열이라도 검출하기에 충분히 민감하다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 표 1 에 나타낸 포획 및 검출 탐침은 엠. 아비움 및/또는 엠. 인트라셀룰래어 증폭 생성물의 존부를 검출하는데에 사용될 수 있다. 엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어내 증폭 생성물의 검정 부위의 몇 개의 누클레오티드 위치상에 차이가 있기 때문에, 상기 종들은 원하는 타겟의 검정 부위에 특이적인 포획 및/또는 검출 탐침만을 사용하여 구별될 수 있다. 이들 동일한 검출 탐침들은 엠. 파라튜베큘로시스도 검출할 수 있다. 또한, 상기 여러 가지 검정 탐침은 MAC 종의 모든 증폭 생성물을 검출하기 위하여 (이들을 구별하지 않고) 단일혼합물에 조합되어질 수 있다.
[실시예 1]
본 발명의 프라이머를 사용하여 미코박테리움 아비움 및 미코박테리움 인트라셀룰래어의 SDA 에 대한 감도를 측정하기 위하여, 타겟 DNA 를 적정시키고 증폭시켰다. 50 ng 의 인간 태반 DNA와 함께 상기 2종에서 분리된 게놈형 DNA (genomic DNA)가 농도 10,000, 1000, 100, 10 및 0 의 게놈으로 제조하였다. SDA 는 근본적으로 G. Walker 와 그의 동료에 의하여 기술된 바 (1992, Nucl. Acids Res. 상동) 와 같이 하기의 조성을 갖는 반응 완충액내에서 수행되었다 ;
45 mM 포타슘 포스페이트 pH 7.6, 100 μg/ml 아실화된 소 혈청 알부민, 5 mM dUTP, 각각 2 mM dGTP, dCTP 및 알파 티오-dATP (dATP αS), 6 mM 마그네슘 아세테이트, 7.5 % 디메틸 설폭시드 및 5 % 글리세롤.
상기 dUTP 는 우라실-N-글리코실라제 (UNG) 로 오염된 흑종의 앰플리콘 분해 (오염제거 ; decontamination) 를 촉진시키기 위하여 포함되었다. 증폭 프라이머인 서열 1 및 서열 2 은 반응물내 최종 농도 5 μM 로 존재하였으며 범퍼 프라이머인 서열 5 및 서열 6 은 최종 농도 0.5 μM 로 존재하였다. 타겟 DNA 를 가하여 초기 변성시킨후 (95 ℃, 2 분), 39 ℃ 로 냉각시켰으며 이후 UNG (5 units/reaction, 30 분 인큐베이팅) 를 가하여 오염제거시켰다. 증폭 반응을 모니터하기 위하여 각각의 샘플에 내부 대조구 서열 (internal control sequence) 을 포함시켰다.
오염제거 시킨후, 상기 UNG 억제자인 Ugi (우라실 N-글리코실라제 억제자 ;uracil N-glycosylase inhibitor) 를 가하여 오염제거 (decontamination) 반응을 정지시켰다. 상기 효소, 마그네슘 아세테이트 및 글리세롤도 가하였다. 상기 제한 엔도누클레아제 HincII 를 반응물당 150 유니트의 농도로 사용하였으며 exo-Klenow 중합 효소를 반응물당 3.6 유니트의 최종 농도로 사용하였다. SDA 를 2 시간동안 39 ℃ 에서 수행하였으며, 95 ℃ 에서 3 분 동안 가열시켜 증폭 반응을 정지시켰다.
C. A. Spargo 와 그의 동료, (상동) 에 의한 화학 발광 검정법에서 상기 증폭 생성물을 검출하였다. 알카리성 포스파타제 표지된 검출 탐침, 서열 9 및 서열 10 을 마이크로타이터 웰 (microtiter well) 에 포획 탐침과 함께 가하였다. 상기 혼합물을 37 ℃ 에서 45 분동안 인큐베이팅시켰다. 인큐베이팅 시킨후, 상기 마이크로타이터 웰을 세척 완충액 (일회세척당 300 μl) 으로 완전히 세척시켰다. 이후 LUMIPHOS 530 (Lumigen Inc.) 을 상기 웰에 가한후 37 ℃ 에서 30 분동안 인큐베이팅시켰다. 발광계 (LUMISCAN, Labsystems) 를 사용하여 발광도를 측정하여 상대적 광 단위 (relative light units ; RLU) 로 기록하였다. 결과를 표 2 에 나타내었다.
Figure pct00004
상기 결과는 엠. 아비움의 10 개의 게놈 및 엠. 인트라셀룰래어의 100 개의 게놈에 관한 감도를 나타낸다.
[실시예 2]
엠.아비움 및 엠. 인트라셀룰래어에 대한 프라이머 특이성을 측정하기 위하여, 여러 가지의 미코박테리아 및 비-미코박테리아 종 (표 3 에 기술된) 에서 얻은 게놈형 DNA 를 SDA 에서 주형으로서 사용하였다. 내부 대조구 서열을 반응물에 포함시키지 않았으며 상기 반응물을 오염제거 시키지 않았다는 점을 제외하고 증폭 반응을 실시예 1 에 기술된 바와 같이 수행하였다. 결과를 표 3 에 나타내었다.
Figure pct00005
Figure pct00006
상기 결과는 MAC 이외의 종에서 그다지 증폭되지 않았음을 나타낸다. 엠. 파라튜베큘로시스 (M. paratuberculosis) 에서의 증폭도 마찬가지인데, 왜냐하면 상기 유기체는 엠. 아비움의 아종이기 때문이라고 사료된다. 대부분의 경우에서, 엠. 인트라셀룰래어 및 엠. 아비움 시그널은 농도가 유사하다. 그러나, 본 실시예에서,상기 엠. 인트라셀룰래어 타겟은 낮은 농도로 얻어졌으나 포지티브 시그널 (positive signal) 로서 용이하게 검출 가능하였다. 본 실험에서 검출된 엠. 말모엔스(M. malmoense) 시그널은 타겟의 고 카피수 (high copy number) 로 인한 인위적 결과(artifact)이며, MAC 종 샘플에 상응하는 카피수에서는 네가티브적(negative) 이었다.
[실시예 3]
엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어의 28 개 혈청형에서 얻은 세포용균액을 사용하여 증폭 특이도 (amplification specificity) 를 측정하였다. 오염 제거 단계 및 내부 대조구 서열을 생략하였다는 것을 제외하고 실시예 1 에 기술된 바와 같이 SDA 를 수행하였다. 혈청형 2 및 혈청형 16 (100 게놈이 테스트됨) 을 제외하고, 각각의 혈청형에 대한 게놈형 타겟 약 20,000 에 대하여 증폭 테스트를 수행하였다. 상기 결과를 표 4 에 나타내었다.
Figure pct00007
[표 3]
Figure pct00008
28 개의 혈청형중 26 개는 본 발명의 프라이머 및 탐침을 사용하여 성공적으로 증폭되었다. 혈청형 7A, 19 및 28 은 약 포지티브였으나, 용이하게 검출할 수 있었다. 혈청형 18 및 22 는 증폭되지 않았으나, 임상 샘플에서는 약간의 퍼센트로 발견되었다. 포지티브 임상 샘플의 약 90 % 를 나타내는 8 개의 혈청형은 용이하게 검출되었다.
[실시예 4]
서열 1 및 서열 3 을 증폭 프라이머로 사용하여 엠. 아비움 및 엠. 인트라셀룰래어 내에서 dnaJ 타겟 서열을 증폭시켰다. SDA 반응을 엠. 아비움 또는 엠. 인트라셀룰래어 게놈형 DNA 의 0 또는 20,000 복사체를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 비교하기 위하여, 몇몇 반응에서 서열 3 을 서열 2 와 치환시켰다. 프라이머 연장 검정법 (primer extension assays) 에서 엠. 아비움에 대한 검출 탐침인 서열 11 및 엠. 인트라셀룰래어에 대한 검출 탐침인 서열 12 를 사용하여 상기 2 종중 하나에서 얻은 타겟 단편에 특이적인 증폭 생성물의 존부를 확인하기 위하여 반응 종결 혼합물을 검정하였다. 상기 검정법을 수행하기 위하여, 반응 종결 혼합물 10 μL의 분취량을 35 mM TRIS-HCl (pH 8.0), 7mM MgCl2, dCTP, dGTP, dTTP 및 dATPαS 각각 350 μM, 및 5 '-32P 표지된 검출 탐침 1.65 pmole을 함유하는 24 μL 의 혼합물과 혼합시켰다. 상기 혼합물을 95 ℃ 에서 2 분 동안 가열한후, 37 ℃ 의 수조에 방치시켰다. 3 - 5 분후, 3 μL H2O 내 exo-Klenow 1 unit 를 각각의 샘플에 가하고 이 혼합물들을 37 ℃ 에서 20 분 동안 인큐베이팅시켰다. 40 μL 의 50 % 우레아 및 0.5 X TBE 를 가하여 상기 연장 반응을 종결시켰다. 95 ℃ 에서 2 분 동안 가열시킨후, 10 μL 의 분취량을 10 % 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동시킨 후 겔을 변성시킨후 방사성 사진으로 분석하였다.
그 결과 서열 1 및 서열 3 이 상기 2 개의 종 내에서 타겟을 증폭시켰다는 것을 알 수 있었다. 그러나, 상기 증폭 프라이머쌍에 의하여 엠. 아비움 타겟은 엠. 인트라셀룰래어 타겟보다 50 배 이상 더욱 효과적으로 증폭되었다. 엠. 아비움 타겟에 혼성화될 경우 서열 1 및 서열 3 의 타겟 결합 서열은 완전한 이중체를 형성하였으나 상기 2 개 중 하나의 프라이머가 엠. 인트라셀룰래어 타겟에 혼성화될 경우에는 단일 누클레오티드 매치 오류 (mismatch) 를 함유하였다. 이는 엠. 인트라셀룰래어 타겟의 증폭 효율이 떨어진다는 것을 설명해 준다. 서열 3 이 서열 2 에 의하여 치환될 경우, 증폭 효율은 약 10 배 정도 증가한다. 아마도 이는 서열 2 의 타겟 결합 서열이 엠. 인트라셀룰래어 타겟에 완전히 상보적으로 혼성화되기 때문일 것이다. 그러나, 예상외로, 상기 프라이머가 엠. 아비움 타겟에 혼성화될 경우 단일 누클레오티드에서 매치 오류가 발생됨에도 불구하고, 서열 2 의 치환(substitution) 은 엠. 아비움의 타겟 증폭 효율을 감소시키지 않는다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017

Claims (17)

  1. 서열 1, 서열 2 및 서열 3 의 타겟 결합 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 타겟 결합 서열 및 선택적으로, 선택된 증폭 방법에 의하여 필요로 하는 비타겟 결합 서열로 이루어지는 증폭 프라이머.
  2. 서열 1, 서열 2 및 서열 3 으로 이루어진 그룹에서 선택된 제 1 항의 증폭 프라이머.
  3. 서열 4, 서열 5 또는 서열 6 으로 이루어진 올리고누클레오티드.
  4. 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 또는 서열 12 로 이루어진 올리고누클레오티드.
  5. 검출 가능한 표지로 표지된 제 4 항의 올리고누클레오티드.
  6. a) 서열 1 의 타겟 결합 서열 및 선택적으로, 선택된 증폭 방법에 의하여 필요로 하는 비타겟 결합 서열로 이루어지는 제 1 증폭 프라이머 및 서열 2 의 타겟 결합 서열 또는 서열 3 의 타겟 결합 서열 및 선택적으로, 선택된 증폭 방법에 의하여 필요로 하는 비타겟 결합 서열로 이루어지는 제 2 증폭 프라이머를 타겟 핵산에 혼성화시키는 단계 ;
    b) 혼성화된 제 1 및 제 2 증폭 프라이머가 타겟 핵산상에서 연장된 증폭 반응물내에서 타겟 핵산을 증폭시키는 단계 ;
    를 포함하는 미코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium) 복합체의 타겟 핵산을 복합체 - 특이 증폭 (complex - specific amplification) 시키는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 검출 가능한 표지가 부착된 서열 9, 서열 10, 서열 11 또는 서열 12 로 이루어진 검출 탐침에 혼성화시켜 증폭된 타겟 핵산을 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 증폭된 타겟 핵산을 검출하기 위하여 리간드로 표지된 서열 7 또는 서열 8 로 이루어진 포획 탐침 (capture probe) 에 혼성화시켜 포획하는 방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 증폭 프라이머가 인지 부위의 절반이 개질된 (hemimodified) 경우 인지부위에 닉 (nick) 을 형성시키는 제한 엔도누클레아제의 인지 부위를 추가로 포함하고, 상기 타겟 핵산은 사슬치환증폭법에 의하여 증폭되는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 제 2 증폭 프라이머가 서열 2 의 타겟 결합 서열로 이루어지고, 상기 혼성화된 제 1 및 제 2 증폭 프라이머가 서열 5 로 이루어진 제 1 범퍼 프라이머 (bumper primer) 및 서열 6 으로 이루어진 제 2 범퍼 프라이머가 연장 (extension) 됨에 따라 타겟 핵산으로부터 치환되는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 제 2 증폭 프라이머가 서열 3 의 타겟 결합 서열로 이루어지고 혼성화된 제 1 및 제 2 증폭 프라이머가 서열 4로 이루어진 제 1 범퍼 프라이머 및 서열 5 로 이루어진 제 2 범퍼 프라이머가 연장됨에 따라 타겟 핵산으로부터 치환되는 방법.
  12. 제 6 항에 있어서, 제 1 증폭 프라이머는 서열 1 의 타겟 결합 서열로 이루어지고, 제 2 증폭 프라이머는 서열 2 의 타겟 결합 서열 또는 서열 3 의 타겟 결합 서열로 이루어지고, 타겟 핵산이 중합 효소 사슬 반응 (Polymerase Chain Reaction) 으로 증폭되는 방법.
  13. a) 서열 1 로 이루어진 제 1 증폭 프라이머 및 서열 2 또는 서열 3 으로 이루어진 제 2 증폭 프라이머를 타겟 핵산에 혼성화시키는 단계 ; 및
    b) 상기 타겟 핵산을 사슬 치환 증폭 (Strand Displacement Amplification) 방법에 의하여 증폭시키는 단계
    를 포함하는 미코박테리움 아비움 복합체의 타겟 핵산을 복합체 - 특이 증폭시키는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 검출 가능한 표지가 부착된 서열 9, 서열 10, 서열 11 또는 서열 12 로 이루어진 검출 탐침 (detector probe) 에 혼성화시켜 상기 증폭된 타겟 핵산을 검출시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 증폭된 타겟 핵산을 검출하기 위하여 리간드로 표지된 서열 7 또는 서열 8 로 이루어진 포획 탐침에 혼성화시켜 증폭된 타겟 핵산을 포획하는 방법.
  16. 제 13 항에 있어서, 제 2 증폭 프라이머가 서열 2 로 이루어지고, 혼성화된 제 1 및 제 2 증폭 프라이머는 서열 5 로 이루어진 제 1 범퍼 프라이머 및 서열 6 으로 이루어진 제 2 범퍼 프라이머를 연장시켜 타겟 핵산으로부터 치환시키는 방법.
  17. 제 13 항에 있어서, 제 2 증폭 프라이머는 서열 3 으로 이루어지고, 혼성화된 제 1 및 제 2 증폭 프라이머는 서열 4 로 이루어진 제 1 범퍼 프라이머 및 서열 5 로 이루어진 제 2 범퍼 프라이머를 연장시켜 타겟 핵산으로부터 치환시키는 방법.
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