JPH09511658A - 鳥型結核菌複合種の増幅および検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 鳥型結核菌（Mycobacterium avium）複合体（ＭＡＣ）種のｄｎａＪ遺伝子中の標的配列の複合体特異的増幅のための増幅プライマーおよび方法を開示する。更に、増幅生成物の検出および／または存在するＭＡＣ種の同定のための検定プローブを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 鳥型結核菌複合種の増幅および検出 発明の分野 本発明は、標的核酸配列の増幅および検出に関する。特に、本発明は、ミコバ クテリアの標的核酸配列の増幅および検出に関する。 発明の背景 ミコバクテリアは、抗酸性、非自動性、グラム陽性の桿状体である細菌の属で ある。該属は、限定されるものではないが、ミコバクテリウム・アフリカヌム(M ycobacterium africanum)、鳥型結核菌(M.avium)、ウシ型結核菌(M.bovis)、ウ シ型結核菌−ＢＣＧ、Ｍ．ケロネエ（chelonae）、Ｍ．フォルツイツム(fortuit um)、Ｍ．ゴルドネエ（gordonae）、Ｍ．イントラセルレア(intracellulare)、 Ｍ．カンサシイ(Kansasii)、Ｍ．ミクロティ(Microti)、Ｍ．スクロフラセウム （scrofulaceum）、パラ結核菌（M.paratuberculosis）およびヒト型結核菌（M. tuberculosis）を含むいくつかの種を含む。これらの微生物のいくつかは、疾患 の原因物質である。最初の１９５３年以来、ミコバクテリア感染の症例は米国に おいて増加している。結核が特に問題であるが、他のミコバクテリア感染もまた 、免疫無防備状態の患者数の増加の結果として増加している。多数のこれら新規 の症例はエイズ流行に関係しており、それは、ミコバクテリアによる感染に対し て特に感受性である免疫無防備状態の集団を与える。鳥型結核菌、ミコバクテリ ウム・カンサシイおよび他の非結核ミコバクテリアは、ＨＩＶ感染および他の免 疫無防備状態の患者において日和見病原体として見出される。 鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアは、鳥型結核菌複合体（ＭＡＣ）のメ ンバーである。これらの種は、エイズ患者での播種性ＭＡＣ感染の高い罹患率の ために、近年重要になっている。鳥型結核菌複合体は、それらの生化学的および 血清凝集特性に基いて区別しうる２８種類の血液型亜型から成る（インダーリー ド（Inderlied）ら、1993年、Clin Microbiol.Rev.6,266-310 による論評を参照 されたい）。分類の方法に応じて、２８種類の血液型亜型の内１０〜１２種類は 鳥型結核菌種に属し、そして１０〜１２種類はミコバクテリウム・イントラセル レア種に属すると分類される。ＭＡＣ血液型亜型の６種類はまだ明確に分類され ていない。ＭＡＣ感染は、現在、ミコバクテリア学研究室で同定された病原性単 離物の約５０％を占め且つエイズおよび他の免疫無防備状態の患者の中で最も一 般的である。ＭＡＣ感染の初期診断および治療は、感染した個体の生存状態を改 善し且つ延長することができる。 現在、ミコバクテリア感染の診断は、抗酸性染色および微生物の培養に続く生 化学的検定にたよっている。これらの手順は時間がかかり、しかも慣用的な培養 法を用いる典型的な診断は６週間程度かかることがある。BACTEC^TM システム（ ベクトン・ディキンソン・ミクロバイオロジー・システムズ(Becton Dickinson Microbiology Systems)，スパークス，ＭＤ）のような自動培養システムは、診 断のための時間を１〜２週間まで減らすことができる。しかしながら、ミコバク テリア感染を診断するのに必要な時間を１週間未満に、好ましくは、ほぼ１日に 短縮する必要がなおある。核酸増幅は、特定の標的配列の速やかな検出を可能に する有力な技術である。したがって、それは、ミコバクテリアの速やかな検出お よび同定に対して有望な技術である。当該技術分野において知られている核酸増 幅技術の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：米国特許第4,683,195号；第4,6 83,202号；第4,800,159号；第4,965,188号明細書）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｇ ．ウォーカー（Walker）ら、1992年，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89,392-396；Ｇ． ウォーカーら、1992年，Nucl.Acids Res.20,1691-1696；本明細書に援用される 米国特許第5,270,184号明細書）、核酸配列に基く増幅（ＮＡＳＢＡ：カンジー ン（Cangene）による米国特許第5,130,238号明細書）、転写に基く増幅（Ｄ．ク ウォー（Kwoh）ら、1989年，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86,1173-1177）、自己持続 配列複製（３ＳＲ：Ｊ．グァテリ（Guatelli）ら、1990年，Proc.Nat.Acad.Sci. USA 87,1874-1878）およびＱβレプリカーゼシステム（Ｐ．リザルディ（Lizard i）ら、1988年，BioTechnology 6,1197-1202）である。 ＳＤＡおよび３ＳＲのような等温増幅法は、それらが、ＰＣＲのような方法に 特有の高／低温循環を必要としないので、診断において特に有益である。したが って、それらは、より簡単なプロトコルであり且つ実施のための特別な装置をあ まり必要としない。しかしながら、いずれの核酸増幅法に対しても、所望の特異 性種類および程度によって増幅されうる標的配列は、該技法を適用しうる前に識 別されるべきである。選択された標的の配列は、選択された増幅法に適した増幅 プライマーの設計を必ずしも可能にしなくてよいし、そして標的は、診断に適し た感受性および特異性の程度によって必ずしも増幅され且つ検出されなくてよい 。欧州特許出願第0528306号明細書は、遺伝子の保存部分に向けられた増幅プラ イマーを用いるミコバクテリアの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中の標的配列の ＰＣＲ増幅を記載している。その増幅生成物は長さ約５８３塩基対であり、属特 異的プローブに対してハイブリッド形成する保存配列部分および種特異的プロー ブを用いて種を同定するのに用いることができる可変部を含有する。EPO 052830 6号明細書で記載された検定システムは、種非特異的増幅に続く増幅生成物の種 特異的検出に基くが、生成された増幅生成物が極めて大きいことは重要である。 増幅される標的配列が大きいほど、その増幅生成物は、増幅の検出用の種々の非 クロスハイブリッド形成性種特異的プローブの設計を可能にするのに十分な配列 変異を伴う部分を含有する見込みがある。この時点でのＳＤＡのような増幅法は 、ＰＣＲによって増幅可能なものほど大きい標的を増幅することができない。増 幅生成物中には検定プローブ設計に利用可能な配列がほとんどないので、小さい 標的配列は、ある与えられた標的の検出のための非クロスハイブリッド形成性種 特異的プローブを設計する能力を厳しく制限する。明らかに、標的配列が大きい 場合でも、所望の特異性を有する増幅プライマーおよび検定プローブを設計する ことができるかどうかは確実ではない。しかしながら、特異的プライマーおよび プローブを開発する問題は、小さい標的配列が増幅され且つ検出されている場合 に特に深刻である。増幅のために互いに十分に接近しているのみならず、目的の 種の中で高度に保存され、それによって、種−、複合体−または群特異的検出の 前に検定範囲の種非特異的増幅を可能にする可変検定範囲に隣接する配列に対す る必要条件によって標的の選択が更に制限されている場合、問題は複雑である。 熱ショックタンパク質は、温度の増加によって微生物が刺激される場合に高量 で発現される一群のタンパク質である。熱ショックタンパク質は高度に保存され ている（Ｒ．Ｊ．ガルシア（Garcia）ら、1989年，Infection and Immunity 57, 204-212；Ｒ．Ｓ．グプタ（Gupta）ら、1992年，J.Bacteriology 174,4594-4605 ）。ｄｎａＪ遺伝子は、細胞のストレス応答に関与していると考えられる４２ｋ ｄ熱ショックタンパク質をコードする。ヒト型結核菌は、ｄｎａＪ遺伝子のヌク レオチド配列が決定された最初のミコバクテリアであった（Ｒ．Ｂ．ラシグラ（ Lathigra）ら、1988年，Nucl.Acids Res.16,1636）。らい菌（M.leprae）のｄｎ ａＪ遺伝子のセグメントのヌクレオチド配列が、引き続き決定された（Ｓ．Ｓ． ハービー（Harvey）ら、1993年，J.Gen.Microbiol.139,2003-2008）。後に、Ｒ ．Ｂ．ラシグラら、上記によって公表されたヒト型結核菌配列を用いて、Ｓ．Ｉ ．タケワキ（Takewaki）ら（1993年，J.Clin.Microbiol.31,446-450）は、鳥型 結核菌およびＭ．イントラセルレアを含めた広範囲のミコバクテリア種からのｄ ｎａＪ遺伝子（ｂｐ１３９４〜１６２９）の２３６−ｂｐフラグメントを増幅す る一組の属特異的ＰＣＲプライマーを開発した。ＰＣＲによる属特異的増幅後の ヒト型結核菌、鳥型結核菌、Ｍ．イントラセルレアおよびＭ．カンサシイの同定 を可能にした種特異的オリゴヌクレオチドプローブもまた報告された。次に、１ ９種のミコバクテリアのｄｎａＪ遺伝子を配列決定し且つ用いて、遺伝子中の種 特異的制限部位に基いて系統発生関係を決定し且つ種を区別した（Ｓ．Ｉ．タケ ワキら、1994年，Int.J.Syst.Bacteriol.44,159-166）。公開特許第6-133775号 公報（タケワキら、1994年５月17日に公開された）は、ＰＣＲのための属特異的 増幅プライマー対およびミコバクテリアのｄｎａＪ遺伝子に由来するいくつかの 種特異的プローブを開示している。 本明細書中で用いられる若干の用語を以下のように定義する。 増幅プライマーは、標的配列に対するハイブリダイゼーション後のプライマー の伸長による標的配列の増幅のためのプライマーである。ＳＤＡによる増幅に対 して、増幅プライマーは、好ましくは、二次構造を最小限にするためにＧＣ含量 が低い、好ましくは、プローブの全ヌクレオチド組成の７０％未満であるように 選択される。ＳＤＡ増幅プライマーの３′末端（標的結合配列）は、標的配列の ３′末端でハイブリッド形成する。標的結合配列は、増幅プライマーに対して標 的特異性を与える。ＳＤＡ増幅プライマーは、その５′末端付近に制限エンドヌ クレアーゼの認識部位を更に含む。その認識部位は、Ｇ．ウォーカーら（1992年 ，PNAS ，上記）によって記載されたように、認識部位が半修飾された場合にＤＮＡ 二重らせんの一方の鎖にニックを入れるであろう制限エンドヌクレアーゼに対す る。ＳＤＡ反応の大部分に対して、増幅プライマーは、標的配列の指数的増幅の 原因である。ＳＤＡ増幅プライマーは、１対の増幅プライマーを二本鎖配列の増 幅に用いる場合、「Ｓ」プライマー（例えば、Ｓ₁およびＳ₂）と称することもで きる。標的の末端に特別な配列を必要としない他の増幅法に対して、増幅プライ マーは、概して、本質的に標的結合配列だけから成る。例えば、ＰＣＲを用いる 本発明による標的配列の増幅は、表１の増幅プライマーの標的結合配列から成る 増幅プライマーを用いるであろう。 バンパープライマーすなわち外部プライマーは、ＳＤＡによって増幅されうる 標的を生じるのに用いられるプライマーである。バンパープライマーは、バンパ ープライマーの伸長が下流の増幅プライマーおよびその伸長生成物を置換するよ うに、増幅プライマーの上流の標的配列に対してアニーリングする。バンパープ ライマーは、１対の増幅プライマーの伸長生成物を置換するのに１対のバンパー プライマーを用いる場合、「Ｂ」プライマー（例えば、Ｂ₁およびＢ₂）と称する こともできる。バンパープライマーの伸長は、増幅プライマーの伸長生成物を置 換する一つの方法であるが、加熱もまた、ある種の増幅反応に適している。 標的または標的配列という用語は、増幅される核酸配列を意味する。これらに は、増幅される元の核酸配列、増幅される元の核酸配列の相補的第二鎖、および 増幅反応によって生成される元の配列のコピーのどちらかの鎖がある。これらの コピーは、増幅プライマーがハイブリッド形成する元の標的配列の忠実なコピー をそれらが含むという事実により、増幅可能な標的配列としても役立つ。 増幅反応中に生じる標的配列のコピーは、増幅生成物、アンプリマーまたはア ンプリコンと称される。 伸長生成物という用語は、増幅プライマーのハイブリダイゼーションおよび標 的配列を鋳型として用いるポリメラーゼによる増幅プライマーの伸長によって生 成された標的配列の一本鎖コピーを意味する。 検定プローブという用語は、検定の検出または同定部分で用いられるいずれの オリゴヌクレオチドも意味する。本発明において、検定プローブは、ミコバクテ リアの複合体−、群−または種特異的検出または同定に用いられるプローブであ る。検出用プローブおよび捕捉プローブは、検定プローブの例である。 検定範囲または検定範囲配列は、検定プローブがハイブリッド形成する標的配 列の部分または他の核酸である。 種特異的という用語は、同属の他の種または異なる属の種における実質的な検 出または増幅を伴わない微生物の種の検出または増幅を意味する。属特異的とは 、異なる属の種における実質的な検出または増幅を伴わない、ある属の種の大部 分の検出または増幅を意味する。群−または複合体特異的検出とは、同属の他の 種または異なる属の種における実質的な検出または増幅を伴わない、ある選択さ れた群（例えば、ＭＡＣ）の同類種の大部分の検出または増幅を意味する。 発明の概要 本発明は、ＭＡＣを含む全２８種類の血液型亜型の内の２６種類で見出された 標的配列の複合体特異的増幅に用いることができるオリゴヌクレオチドプライマ ーを提供する。該標的配列はｄｎａＪ遺伝子のセグメントである。したがって、 一つの対の増幅プライマーは、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方のｄ ｎａＪ遺伝子からの４８ｂｐ標的配列の増幅を可能にする。増幅された標的の検 定範囲に対してハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド検定プローブを用いて 、増幅生成物を検出し、場合により、ＭＡＣ種間を区別する。本発明の方法はま た、ヒトのクローン病および家畜のヨーネ病に関係した鳥型結核菌の亜種である パラ結核菌のｄｎａＪ標的配列の検出を可能にする。 発明の詳細な説明 ＭＡＣ種のｄｎａＪ遺伝子（ｂｐ１５４８−１５９５）の４８ｂｐ標的フラグ メントの複合体特異的増幅を可能にする増幅プライマーを提供する。鳥型結核菌 およびＭ．イントラセルレアの配列は、増幅プライマーがハイブリッド形成する 範囲において１個のヌクレオチドだけ異なるので、鳥型結核菌およびＭ．イント ラセルレア両方における標的の極めて有効な増幅は、Ｓ．Ｉ．タケワキら（1994 年、上記）の配列データに基いて予測されなかった。プライマーの標的結合配列 と、それらが標的においてハイブリッド形成する配列との誤対合は、概して、標 的増幅を阻止するかまたはさもなければ妨げることが知られている。特に、本発 明は、引き続きのＭＡＣ種の存在の検出または存在する特定のＭＡＣ種の同定を 伴って、ｄｎａＪ遺伝子中のＭＡＣ特異的標的を鎖置換増幅（ＳＤＡ）によって 増幅させるオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを提供する。本発明の プライマーは、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方の標的を、標的中の 増幅プライマーハイブリダイゼーション部位のヌクレオチド配列がこれらの種間 で異なるにもかかわらず、１０⁷倍増幅させることが発見された。更に、増幅後 、増幅された鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア標的配列は、本発明の検定 プローブに対するハイブリダイゼーションによって互いに区別されうる。 ＭＡＣ標的のＳＤＡおよび検出のために開発された種々のプローブおよびプラ イマーを表１で示す。制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＨｉｎｃＩＩ）を太字 で示し且つ標的結合配列をイタリック体で示す。それぞれのＳＤＡプライマーの ３′末端の標的結合配列は、その標的特異性を決定している。鳥型結核菌および Ｍ．イントラセルレアにおいて増幅プライマーがハイブリッド形成するｄｎａＪ 配列は、標的の両末端の１個のヌクレオチドだけ異なる。したがって、増幅プラ イマーは、プライマーの内の一つの標的結合配列が、完全なワトソン・クリック 相補性によって二つの標的の一方（鳥型結核菌かまたはＭ．イントラセルレア） に対してハイブリッド形成するが、もう一方の種の標的に対してハイブリッド形 成させた場合に１個のヌクレオチド誤対合を示すように設計された。例えば、配 列番号：１の標的結合配列は、完全な相補性によって鳥型結核菌標的に対してハ イブリッド形成するが、Ｍ．イントラセルレア標的に対しては、一つのヌクレオ チド誤対合を含んでハイブリッド形成する。同様に、配列番号：２の標的結合配 列は、完全な相補性によってＭ．イントラセルレア標的に対してハイブリッド形 成するが、鳥型結核菌標的に対しては、一つのヌクレオチド誤対合を含んでハイ ブリッド形成する。 ただ一つのヌクレオチド誤対合の存在は、完全に相補的な複合体と比較したと ころ、プライマー−標的複合体を不安定にさせるが、意外にも、ＳＤＡの反応条 件下において増幅効率を有意に減少させるようには見えない。ＳＤＡ反応におけ る標的配列に対する増幅およびバンパープライマーの初期ハイブリダイゼーショ ンは、Ｇ．ウォーカーら（1992年，Nucl.Acids Res. 上記および米国特許第5,27 0,184号明細書）によって記載されたように、増幅可能な標的の生成を引き起こ す。標的生成カスケードは、ニックを入れることができる制限エンドヌクレアー ゼ認識部位に隣接した所望の標的配列のコピーを生じる。したがって、標的生成 中に、初めから存在していた標的およびプライマー間のいずれか一つのヌクレオ チド誤対合は、増幅プライマーによって与えられた完全に相補的な配列によって 置換される。これら末端に修飾された標的は、増幅反応に入り且つＳＤＡを行う 。したがって、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方の修飾された標的の 末端配列は同一になるであろうが、増幅プライマーを結合する配列間の検定範囲 は未変化のままであり、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアの増幅生成物を 区別させるであろう。出願人は、ＳＤＡに対して共役したこの独特の標的生成現 象は、増幅に適した１個の修飾された標的を生じるのに十分な、標的に対する誤 対合プライマーのハイブリダイゼーションが存在する限りにおいて、増幅反応が プライマー／標的誤対合の有害な作用を克服することを可能にすると仮定した。 これは、誤対合にもかかわらずこのシステムで観察された増幅の高効率を説明し うる。表１で挙げた増幅プライマーおよびバンパープライマーを用いると、鳥型 結核菌およびＭ．イントラセルレアのｄｎａＪ標的を、ＳＤＡによって＞１０⁷ 倍に増幅させることができ、鳥型結核菌において標的の５コピーおよびＭ．イン トラセルレアにおいて標的の５０コピー程度の僅かな検出を可能にする。 表１において、配列番号：１０は検出用プローブであり且つ配列番号：８は捕 捉プローブである。出願人は、これら二つのオリゴヌクレオチドの機能が逆であ る場合、すなわち、検定において配列番号：１０を捕捉プローブとして用い且つ 配列番号：８を検出用プローブとして用いる場合、交差反応性が検出されること を発見した。しかしながら、明らかに、交差反応性増幅生成物は捕捉されないの で、交差反応性は表１のプローブ立体配置によって除去される。本発明のプライ マーの開発はまた、配列番号：２で下線を施された残基Ａの欠失がＭ．イントラ セルレアの増幅効率を１００倍までおよび鳥型結核菌では１０倍まで低下させる ように、ＳＤＡ用の増幅プライマーの一見僅かな修飾が、しばしば予測できない 効果を有することを例証する。この結果は、下線を施された残基Ａは標的結合配 列の一部分ではないが、その標的結合配列から制限エンドヌクレアーゼ認識部位 の間に間隔を置くように包含された本質的に無作為に選択された配列の一部分で あることを考えると予想外であった。 本発明の増幅プライマーは、ＰＣＲ、好熱性ＳＤＡ（慣用的な低温ＳＤＡの場 合と本質的に同様である反応スキームにおいて熱安定酵素を用いる）および３Ｓ Ｒなどの他の核酸増幅プロトコルにおいても有用である。具体的に、標的配列に 対するプライマーの循環的特異的ハイブリダイゼーション、標的配列を鋳型とし て用いるプライマーの伸長、および標的配列からのその伸長生成物の置換を用い るいずれの増幅プロトコルも、本発明の増幅プライマーを用いることができる。 特殊な非標的結合配列を必要としない増幅法（例えば、ＰＣＲ）に対して、増幅 プライマーは、表１で挙げた増幅プライマーの標的結合配列だけから成りうる。 表１の増幅プライマーのものとは異なる特殊な非標的結合配列を必要とする増幅 法（例えば、３ＳＲ）は、ＨｉｎｃＩＩ部位のための選択された増幅法によって 必要とされる配列または構造の置換と共に、標的結合配列を含む増幅プライマー を用いることができる。低温ＳＤＡに適当な別の制限エンドヌクレアーゼ認識部 位もまた、当該技術分野において知られているようにＨｉｎｃＩＩ部位の代わり に置き換えることができるし、または標的が好熱性ＳＤＡによって増幅される場 合、好熱性ＳＤＡに適当な別の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を置き換えるこ とができる。 増幅生成物を生じるＭＡＣ種は、検定の検出部分において検定用プローブに対 するハイブリダイゼーションによって同定されうるしまたは区別されうる。ハイ ブリダイゼーションによる検出に対して、検出用プローブは、典型的に、検出可 能な標識によって標識される。検出可能な標識は、標的核酸に対するプローブの ハイブリダイゼーションを示すものとして直接的にかまたは間接的に検出されう る残基である。標識の直接的検出に対して、プローブは、放射性同位体によって 標識され且つオートラジオグラフィーによって検出されうるし、または蛍光残基 によって標識され且つ当該技術分野において知られているように蛍光によって検 出されうる。或いは、プローブは、それを検出可能にさせるのに更に別の試薬を 必要とする標識によって標識することによって間接的に検出されうる。間接的に 検出可能な標識としては、例えば、化学発光物質、目に見える反応生成物を生じ る酵素、および標識された特異的結合パートナー（例えば、抗体または抗原／ハ プテン）に対して結合することによって検出されうるリガンド（例えば、ビオチ ン、アビジン、ストレプトアビジン、ハプテン、抗体または抗原）がある。特に 有用な標識としては、（標識されたアビジンまたはストレプトアビジンに対して 結合することによって検出可能な）ビオチン、および（着色反応生成物を生じる 酵素基質の添加によって検出可能な）西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカ リ性ホスファターゼなどの酵素がある。ビオチンおよび他のリガンドはまた、捕 捉プローブを標識して、該捕捉プローブおよびそれがハイブリッド形成する複合 体を、適当な特異的結合パートナーに対して結合することによって固相上に固定 させるのに有用である。このような標識をオリゴヌクレオチドに対して加える、 またはこのような標識をオリゴヌクレオチド中に包含させる方法は、当該技術分 野において周知であり、そしてこれらの方法はいずれも、本発明において用いる のに適している。 増幅生成物を検出する一つの方法は、検定範囲に対して特異的にハイブリッド 形成したプライマーのポリメラーゼ伸長を用いる。そのプライマーを上記のよう に、例えば、放射性同位体によって標識し、その結果、標識はアンプリコン特異 的伸長生成物中にプライマーと一緒に包含される。プライマー伸長による検出は 、Ｇ．ウォーカーら（1992年，Nucl.Acids Res.およびPNAS、上記）によって記 載されている。増幅生成物を検出する第二の方法は、Ｃ．Ａ．スパーゴ（Spargo ）ら（1993年，Molec.Cell.Probes 7,395-404）によって記載のビオチニル化オ リゴヌクレオチド捕捉プローブおよび酵素結合オリゴヌクレオチド検出用プロー ブを用いて増幅生成物を検出する化学発光検定である。検定範囲中の異なる部位 に対するこれら二つのプローブのハイブリダイゼーション後、複合体をストレプ トアビジン被覆マイクロウェルプレート上で捕捉し、そして化学発光シグナルを 生じさせ且つルミノメーターで読み取る。化学発光検定は２時間未満で行うこと ができ、しかも１個程度の僅かな前増幅標的配列を検出するほど十分に敏感であ る。 本発明の一つの実施態様において、表１で示された捕捉および検出用プローブ は、鳥型結核菌および／またはＭ．イントラセルレア増幅生成物の存在を検出す るのに用いることができる。鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアの増幅生成 物の検定範囲はいくつかのヌクレオチド位置で互いに異なるので、所望の標的の 検定範囲に特異的な捕捉および／または検出用プローブだけを用いて種を区別す ることができる。これらの同様の検定プローブもまた、パラ結核菌を検出する。 或いは、種々の検定プローブは、全ＭＡＣ種の増幅生成物を検出するために、そ れらの間で区別することなく単一混合物中で混合することができる。 実施例１ 本発明のプライマーを用いて鳥型結核菌およびミコバクテリウム・イントラセ ルレアに対するＳＤＡの感度を決定するために、標的ＤＮＡを滴定し且つ増幅さ せた。これら二つの種から単離されたゲノムＤＮＡを、ヒト胎盤ＤＮＡ ５０ｎ ｇを用いて１０，０００、１０００、１００、１０およびゼロゲノムの濃度で調 製した。ＳＤＡは、本質的にはＧ．ウォーカーら（1992年，Nucl.Acids Res.、 上記）によって記載のように、以下の組成、すなわち、４５ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．６、アセチル化ウシ血清アルブミン１００μｇ／ｍＬ、０．５ｍＭ ｄ ＵＴＰ、各０．２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびαチオｄＡＴＰ（ｄＡＴＰα Ｓ）、６ｍＭ酢酸マグネシウム、７．５％ジメチルスルホキシド並びに５％グリ セロールを有する反応緩衝液中で行われた。ｄＵＴＰは、ウラシル−Ｎ−グルコ シラーゼ（ＵＮＧ）によっていずれの汚染アンプリコンの分解（汚染除去）も促 進するように包含された。増幅プライマー配列番号：１および配列番号：２は、 反応中に０．５μＭの最終濃度で存在し、そしてバンパープライマー配列番号： ５および配列番号：６は０．０５μＭの最終濃度で存在した。標的ＤＮＡを加え 、そして最初に変性させ（９５℃、２分間）、次に３９℃まで冷却し、そしてＵ ＮＧの添加（０．５単位／反応、３０分間インキュベートする）によって汚染除 去した。内部対照配列もまた、増幅反応を監視するために各試料中に包含された 。汚染除去後、ＵＮＧ阻害剤Ｕｇｉ（ウラシルＮ−グリコシラーゼ阻害剤）を加 えて、汚染除去反応を停止させた。酵素、酢酸マグネシウムおよびグリセロール も加えた。制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩＩは、反応当たり１５０単位の濃 度 で用いられ、そしてｅｘｏ￣クレノウポリメラーゼは、反応当たり３．６単位の 最終濃度で用いられた。ＳＤＡは３９℃で２時間行われ、そして増幅反応は、９ ５℃で３分間加熱することによって停止された。 増幅生成物は、Ｃ．Ａ．スパーゴら、上記の化学発光検定で検出された。アル カリ性ホスファターゼで標識された検出用プローブ配列番号：９および配列番号 ：１０を、微量滴定ウェルに対して、捕捉プローブ配列番号：７および配列番号 ：８と一緒に加えた。この混合物を３７℃で４５分間インキュベートした。イン キュベーション後、微量滴定ウェルを、緊縮洗浄緩衝液（１回の洗浄につき３０ ０μｌ）によって３回洗浄した。次に、LUMIPHOS 530（ルミジェン・インコーポ レーテッド（Lumigen,Inc.）をウェルに対して加え且つ３７℃で３０分間インキ ュベートした。ルミネセンスをルミノメーター（LUMISCAN、ラブシステム（Labs ystems））を用いて検出し、そして相対光単位（ＲＬＵ）を記録した。結果を表 ２で示す。 結果は、鳥型結核菌に対して１０ゲノムの感度およびＭ．イントラセルレアに 対して１００ゲノムの感度を実証する。 実施例２ 鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアに対するプライマーの特異性を確認す るために、種々のミコバクテリアおよび非ミコバクテリア種（表３に挙げられた ）からのゲノムＤＮＡを、ＳＤＡにおいて標的として用いた。増幅反応は、内部 対照配列が含まれなかったことおよび反応が汚染除去されなかったこと以外は実 施例１で記載のように行われた。結果を表３で示す。 結果は、ＭＡＣ以外の種において有意の増幅を示さない。パラ結核菌での増幅 は、この微生物は鳥型結核菌の亜種と考えられるので一致している。ほとんどの 場合、Ｍ．イントラセルレアおよび鳥型結核菌シグナルの強さは同様である。し かしながら、この実施例において、Ｍ．イントラセルレア標的は、低いが容易に 検出可能な正のシグナルを与えた。この実験で検出されたＭ．マルモエンスシグ ナルは、標的の高コピー数の人工物であると考えられ、そしてＭＡＣ種試料に匹 敵する同様のコピー数で負であると考えられる。 実施例３ 増幅の特異性を、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアの２８種類の血液型 亜型からの細胞溶解産物を用いて確認した。ＳＤＡは、汚染除去および内部対照 配列の省略以外は実施例１で記載のように行われた。それぞれの血液型亜型の約 ２０，０００ゲノム標的の増幅について、血液型亜型２および１６（１００ゲノ ムが試験された）を除いて試験した。結果を表４で示す。 ２８種類の血液型亜型の内２６種類は首尾よく増殖し、そして本発明のプライ マーおよびプローブを用いて検出された。血液型亜型７Ａ、１９および１８は弱 陽性であったが、容易に検出できた。血液型亜型１８および２２は増幅しなかっ たが、臨床試料で見出された血液型亜型の僅か数％であるにすぎない。陽性臨床 試料の約９０％である８種類の血液型亜型は容易に検出された。 実施例４ ｄｎａＪ標的配列を、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアにおいて増幅プ ライマーとして配列番号：１および配列番号：３を用いて増幅させた。配列番号 ：４および配列番号：５はバンパープライマーであった。ＳＤＡ反応は、本質的 には実施例１で記載のように、鳥型結核菌かまたはＭ．イントラセルレアゲノム ＤＮＡの０かまたは２０，０００コピーを用いて行われた。比較のために、若干 の反応において配列番号：３を配列番号：２によって置き換えた。終結した反応 混合物は、両方の種のｄｎａＪ標的フラグメントに特異的な増幅生成物の存在に ついて、プライマー伸長検定において鳥型結核菌に対する検出プローブ配列番号 ：１１およびＭ．イントラセルレアに対する検出プローブ配列番号：１２を用い て検定された。検定を行うために、終結した反応混合物の１０μＬアリコートを 、３５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂、各３５０μＭ のｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰαＳ並びに１．６５ピコモルの ５ ′−³²Ｐ標識検出プローブを含有する混合物２４μＭと混合した。３〜５分後、 Ｈ₂Ｏ ３μＬ中１単位のｅｘｏ^-クレノウを各試料に対して加え、そして混合物 を３７℃で２０分間インキュベートした。伸長反応は、５０％尿素および０．５ Ｘ ＴＢＥ ４０μＬの添加によって終結した。９５℃で２分間加熱した後、１ ０μＬアリコートを、１０％ポリアクリルアミドゲル上の変性ゲル電気泳動およ びオートラジオグラフィーによって分析した。 結果は、配列番号：１および配列番号：３が両方の種において標的を増幅した ことを示した。しかしながら、鳥型結核菌標的は、この増幅プライマー対によっ て、Ｍ．イントラセルレア標的が増幅したよりも少なくとも５０倍効率よく増幅 した。配列番号：１および配列番号：３の標的結合配列は、鳥型結核菌標的に対 してハイブリッド形成した場合に完全な二重らせんを形成するが、どちらかのプ ライマーがＭ．イントラセルレア標的に対してハイブリッド形成する場合、一つ のヌクレオチド誤対合を含む。これは、Ｍ．イントラセルレア標的のあまり有効 でない増幅を説明しうる。配列番号：３を配列番号：２で置き換える場合、増幅 効率は約１０倍増加する。これは、配列番号：２の標的結合配列がＭ．イントラ セルレア標的に対して完全な相補性によってハイブリッド形成することによりう る。しかしながら、意外にも、配列番号：２の置換は、このプライマーを鳥型結 核菌標的に対してハイブリッド形成させる場合に一つのヌクレオチド誤対合が導 入されるにもかかわらず、鳥型結核菌における標的増幅効率を低下させない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ナデュー，ジェームズ・ジー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，コーカー・レイ ン 710 (72)発明者 ディーン，チェリル・エイチ アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27614，ローリー，トレイルス・エンド・ コート 205

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３の標的結合配列から成 る群より選択される標的結合配列を含む増幅プライマー。 ２． 配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３から成る群より選択さ れる請求項１に記載の増幅プライマー。 ３． 配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６から成るオリゴヌクレ オチド。 ４． 配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番 号：１１または配列番号：１２から成るオリゴヌクレオチド。 ５． 検出可能な標識によって標識されている請求項４に記載のオリゴヌクレ オチド。 ６． 鳥型結核菌複合体の標的核酸の複合体特異的増幅方法であって、 （ａ）該標的核酸に対して、配列番号：１の標的結合配列を含む第一増幅プラ イマーおよび配列番号：２の標的結合配列または配列番号：３の標的結合配列を 含む第二増幅プライマーをハイブリッド形成させ、そして （ｂ）ハイブリッド形成した第一および第二増幅プライマーが標的核酸上で伸 長される増幅反応において該標的核酸を増幅させること を含む上記方法。 ７． 増幅した標的核酸を、検出可能な標識によって標識された配列番号：９ 、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２から成る検出用プロー ブに対するハイブリダイゼーションによって検出することを更に含む請求項６に 記載の方法。 ８． 増幅した標的核酸を、リガンドによって標識された配列番号：７または 配列番号：８から成る捕捉プローブに対するハイブリダイゼーションによる検出 のために捕捉する請求項７に記載の方法。 ９． 第一および第二増幅プライマーが、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が 半修飾されていて且つ標的核酸が鎖置換増幅によって増幅される場合に該認識部 位にニックを入れる制限エンドヌクレアーゼの認識部位を更に含む請求項６に記 載の方法。 １０．第二増幅プライマーが配列番号：２の標的結合配列を含み、そしてハイ ブリッド形成した第一および第二増幅プライマーを、配列番号：５から成る第一 バンパープライマーおよび配列番号：６から成る第二バンパープライマーの伸長 によって標的核酸から置換させる請求項９に記載の方法。 １１．第二増幅プライマーが配列番号：３の標的結合配列を含み、そしてハイ ブリッド形成した第一および第二増幅プライマーを、配列番号：４から成る第一 バンパープライマーおよび配列番号：５から成る第二バンパープライマーの伸長 によって標的核酸から置換させる請求項９に記載の方法。 １２．第一増幅プライマーが配列番号：１の標的結合配列から成り且つ第二増 幅プライマーが、配列番号：２の標的結合配列または配列番号：３の標的結合配 列から成り、そして標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させる請求項 ６に記載の方法。 １３．鳥型結核菌複合体の標的核酸の複合体特異的増幅方法であって、 （ａ）該標的核酸に対して、配列番号：１から成る第一増幅プライマーおよび 配列番号：２または配列番号：３から成る第二増幅プライマーをハイブリッド形 成させ、そして （ｂ）該標的核酸を鎖置換増幅によって増幅させること を含む上記方法。 １４．増幅した標的核酸を、検出可能な標識によって標識された配列番号：９ 、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２から成る検出用プロー ブに対するハイブリダイゼーションによって検出することを更に含む請求項１３ に記載の方法。 １５．増幅した標的核酸を、リガンドによって標識された配列番号：７または 配列番号：８から成る捕捉プローブに対するハイブリダイゼーションによる検出 のために捕捉する請求項１４に記載の方法。 １６．第二増幅プライマーが配列番号：２から成り、そしてハイブリッド形成 した第一および第二増幅プライマーを、配列番号：５から成る第一バンパープラ イマーおよび配列番号：６から成る第二バンパープライマーの伸長によって標的 核酸から置換させる請求項１３に記載の方法。 １７．第二増幅プライマーが配列番号：３から成り、そしてハイブリッド形成 した第一および第二増幅プライマーを、配列番号：４から成る第一バンパープラ イマーおよび配列番号：５から成る第二バンパープライマーの伸長によって標的 核酸から置換させる請求項１３に記載の方法。