JP5286998B2 - 抗酸菌属細菌の菌種同定用オリゴヌクレオチドおよびその用途 - Google Patents
抗酸菌属細菌の菌種同定用オリゴヌクレオチドおよびその用途 Download PDFInfo
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Description
配列番号1〜6のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した10塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
[項2]
少なくとも以下の(1)〜(3)の工程を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
(1)少なくとも1種類のオリゴヌクレオチドプライマー(A)と、該プライマー(A)の伸長産物の一部と相補的な少なくとも1種類のオリゴヌクレオチドプライマー(B)と、を用いて配列番号1〜6のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と90%以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅する第一工程、
(2)第一工程で得られうるプライマー(A)または(B)の伸長産物と、配列番号1または2に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した10塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも1種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ct)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pt)を形成せしめ、
該プライマー(A)または(B)の伸長産物と、配列番号3または4に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した10塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも1種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Cm)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pm)を形成せしめ、
該プライマー(A)または(B)の伸長産物と、配列番号5または6に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した10塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも1種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ck)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pk)を形成せしめる第二工程、
(3)第二工程で得られうる該複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。
[項2−1]
少なくとも以下の(1)〜(3)の工程を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
(1)少なくとも1種類のオリゴヌクレオチドプライマー(A)と、該プライマー(A)の伸長産物の一部と相補的な少なくとも1種類のオリゴヌクレオチドプライマー(B)と、を用いて配列番号1〜6のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と90%以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅する第一工程、
(2)第一工程で得られうるプライマー(B)の伸長産物と、配列番号1または2に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した10塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも1種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ct)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pt)を形成せしめ、
該プライマー(B)の伸長産物と、配列番号3または4に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した10塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも1種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Cm)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pm)を形成せしめ、
該プライマー(B)の伸長産物と、配列番号5または6に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した10塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも1種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ck)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pk)を形成せしめる第二工程、
(3)第二工程で得られうる該複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。
[項3]
プローブ(Ct)、(Cm)、および(Ck)のTm値が、互いに3℃以上異なることを特徴とする項2に記載の菌種同定方法。
[項4]
プローブ(Ct)、(Cm)、および(Ck)の長さが、互いに1塩基以上異なることを特徴とする項2または3に記載の菌種同定方法。
[項5]
(1)〜(3)の工程を密封状態のままで行うことを特徴とする項2〜4のいずれかに記載の菌種同定方法。
[項6]
検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ct)、(Cm)、および(Ck)が蛍光色素で標識されていることを特徴とする項2〜5のいずれかに記載の菌種同定方法。
[項7]
複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)から発せられる蛍光を測定しながら、連続的な温度上昇または下降を伴う融解曲線解析を行い、該複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)のうち、どの複合体が形成したかを判別することを特徴とする項2〜6のいずれかに記載の菌種同定方法。
[項8]
融解曲線解析を行う際の複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)の検出にIFP法を用いることを特徴とする項7に記載の菌種同定方法。
[項9]
融解曲線解析を行う際の複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)の検出にQ−Probe法を用いることを特徴とする項7に記載の菌種同定方法。
[項10]
少なくとも以下の(1)〜(4)を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
(1)配列番号1または2に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した10塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも1種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ct)、
(2)配列番号3または4に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した10塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも1種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Cm)、
(3)配列番号5または6に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した10塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも1種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ck)、
(4)プローブ(Ct)、(Cm)、および(Ck)の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と90%以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅することが可能なオリゴヌクレオチドプライマー(A)およびオリゴヌクレオチドプライマー(B)。
5’−CTACAAGGAGCTGGGCGTCTCCTCTG−3’(配列番号3)
および
5’−CCCGAGGGAGCGCCGCGCAACCCGGCCTCGCCCTG−3’(配列番号4)
をプライマーとして使用した際に、増幅される抗酸菌属細菌の遺伝子領域に含まれる。当該増幅領域について、トリ型結核菌(Mycobacterium avium)は配列番号18に、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)は配列番号19に、マイコバクテリウム・カンサシイ(Mycobacterium kansasii)は配列番号20に、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)は配列番号21に、それぞれ具体的な核酸配列を記載する。
また、上記の「抗酸菌属細菌のdnaJ1遺伝子において菌種特異性が高い領域」は、「領域Aおよび領域B」として後述するが、従来公知であるdnaJ遺伝子の部分配列(特許第2966478号、特許第3134940号、L Clin. Microbio1.第31巻446頁参照)より当該遺伝子の下流に位置し、従来技術において抗酸菌属細菌の検出および/または同定には使用されなかった領域である。
例えば、
プライマー(A)としては、
5’−ACGGCGCTGAGTTCAACCTCAACG−3’(配列番号9)
5’−CCAAGCGCAAGGAGTACGACGAA−3’(配列番号10)
プライマー(B)としては、
5’−GAACAAGCCACCGAACAAGTCACCGAT−3’(配列番号11)
5’−CGTCGAACATTTCGTTGAGGTTGAACT−3’(配列番号12)
5’−CAAGCCACCGAACAGGTCGCCGAT−3’(配列番号13)
のような配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。
(1)試料の調製
4種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したDNAを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号14〜17に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、オリゴ14〜17と示す)を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社((株)日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン(株)、オペロンバイオテクノロジー(株)など)に依頼した。オリゴ14がプライマー(A)であり、オリゴ15がプライマー(B)であり、オリゴ16がプローブ(Ct)であり、オリゴ17がプローブ(Cm)である。オリゴ16は3’末端がBODIPY−FLにより標識され、オリゴ17は5’末端がBODIPY−FLにより標識され、かつ3’末端がリン酸化されている。
4種類の抗酸菌属細菌DNAおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー(登録商標)を使用した。測定モードは530nmを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ14 250nM、
オリゴ15 1500nM、
オリゴ16(3’末端をBODIPY−FL標識) 200nM、
オリゴ17(5’末端をBODIPY−FL標識、3’末端をリン酸化)200nM、
×10緩衝液 1μl、
dNTP 0.2mM、
MgSO4 4mM、
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.2U、
抽出DNA溶液 20ng
94℃・2分
98℃・0秒、
65℃・5秒、(50サイクル)
94℃・1分、
40℃・1分、
40℃〜75℃(0.5℃/秒で温度上昇)。
図4は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図4より明らかなように、ヒト型結核菌(MT)試料とした場合に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌(MA)およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ(MI)、すなわちMACのDNAを試料とした場合にヒト型結核菌(MT)とは異なる位置に明瞭なピークが観察され、マイコバクテリウム・カンサシイ(MK)のDNAを試料とした場合には陰性コントロール(NC)と同様にピークが得られなかった。これは、プローブ(Ct)およびプローブ(Cm)の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ(Ct)およびプローブ(Cm)を組み合わせて用いることで、一度の測定でヒト型結核菌およびMACを同定できることを示している。
(1)試料の調製
4種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したDNAを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
実施例1と同様の方法にて、配列番号29、30に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、オリゴ29、30と示す)を合成した。オリゴ29はプローブ(Ck)オリゴ30はプローブ(Ct)である。オリゴ29は5’末端がBODIPY−FLにより標識され、かつ3’末端がリン酸化されている。オリゴ30は3’末端がBODIPY−FLにより標識されている。
4種類の抗酸菌属細菌DNAおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー(登録商標)を使用した。測定モードは530nmを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
以下の試薬を含む10μL溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ14 250nM、
オリゴ15 1500nM、
オリゴ30(3’末端をBODIPY−FL標識) 100nM、
オリゴ17(5’末端をBODIPY−FL標識、3’末端をリン酸化)80nM、
オリゴ29(5’末端をBODIPY−FL標識、3’末端をリン酸化)300nM、
×10緩衝液 1μL、
dNTP 0.2mM、
MgSO4 4mM、
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.2U、
抽出DNA溶液 20ng
94℃・2分
98℃・0秒、
65℃・5秒、(50サイクル)
94℃・1分、
40℃・1分、
40℃〜75℃(0.5℃/秒で温度上昇)。
図6は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。プライマー(B)として用いたオリゴ15の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ30、17、29はハイブリダイズする。つまり検出に用いる3種類の標識プローブは全て同じプライマーを用いて伸長させた伸長産物とハイブリダイズすることになる。図6より明らかなように、ヒト型結核菌(MT)試料とした場合に68℃に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌(MA)およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ(MI)、すなわちMACのDNAを試料とした場合に63℃に明瞭なピークが観察され、さらにマイコバクテリウム・カンサシイ(MK)のDNAを試料とした場合には59℃にピークが観察された。MT、MAC、MKのそれぞれに特異的な検出ピークが観察された。陰性コントロール(NC)はピークが得られなかった。これは、プローブ(Ct)、プローブ(Cm)およびプローブ(Ck)の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ(Ct)、プローブ(Cm)およびプローブ(Ck)の三種類のプローブを組み合わせて用いることで、一度の測定で抗酸菌の中で臨床診断上特に重要となるヒト型結核菌、MACおよびマイコバクテリウム・カンサシイを一度に同定できることを示している。
(1)試料の調製
4種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したDNAを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
実施例1と同様の方法にて、配列番号31に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、オリゴ31と示す)を合成した。オリゴ31はプローブ(Ct)である。オリゴ31は3’末端がBODIPY−FLにより標識されている。
4種類の抗酸菌属細菌DNAおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー(登録商標)を使用した。測定モードは530nmを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
以下の試薬を含む10μL溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ14 500nM、
オリゴ15 500nM、
オリゴ31(3’末端をBODIPY−FL標識)100nM、
オリゴ17(5’末端をBODIPY−FL標識、3’末端をリン酸化)80nM、
オリゴ29(5’末端をBODIPY−FL標識、3’末端をリン酸化)300nM、
×10緩衝液 1μL、
dNTP 0.2mM、
MgSO4 4mM、
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.2U、
抽出DNA溶液 20ng
94℃・2分
98℃・0秒、
65℃・5秒、(50サイクル)
94℃・1分、
40℃・1分、
40℃〜75℃(0.5℃/秒で温度上昇)。
図7は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。プライマー(A)として用いたオリゴ14の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ31はハイブリダイズし、プライマー(B)として用いたオリゴ15の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ17、29はハイブリダイズする。つまり検出に用いる3種類の標識プローブのうち、プローブ(Ct)は、プローブ(Cm)および(Ck)とは「異なるプライマーを用いて伸長させた伸長産物」とハイブリダイズすることになる。図7より明らかなように、ヒト型結核菌(MT)試料とした場合に66℃に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌(MA)およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ(MI)、すなわちMACのDNAを試料とした場合に63℃に明瞭なピークが観察され、さらにマイコバクテリウム・カンサシイ(MK)のDNAを試料とした場合には59℃にピークが観察された。MT、MAC、MKのそれぞれに特異的な検出ピークが観察された。陰性コントロール(NC)はピークが得られなかった。これは、プローブ(Ct)、プローブ(Cm)およびプローブ(Ck)の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ(Ct)、プローブ(Cm)およびプローブ(Ck)の三種類のプローブを組み合わせて用いることで、一度の測定で抗酸菌の中で臨床診断上特に重要となるヒト型結核菌、MACおよびマイコバクテリウム・カンサシイを一度に同定できることを示している。
(1)試料の調製
4種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したDNAを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
実施例1と同様の方法にて、配列番号32、33に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、オリゴ32、33と示す)を合成した。オリゴ32はプローブ(Cm)であり、オリゴ33はプローブ(Ck)である。オリゴ32は3’末端がBODIPY−FLにより標識されている。オリゴ33は5’末端がBODIPY−FLにより標識され3’末端がリン酸化されている。
4種類の抗酸菌属細菌DNAおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー(登録商標)を使用した。測定モードは530nmを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
以下の試薬を含む10μL溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ14 500nM、
オリゴ15 500nM、
オリゴ30(3’末端をBODIPY−FL標識)100nM、
オリゴ32(3’末端をBODIPY−FL標識)160nM、
オリゴ33(5’末端をBODIPY−FL標識、3’末端をリン酸化)300nM、
×10緩衝液 1μL、
dNTP 0.2mM、
MgSO4 4mM、
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.2U、
抽出DNA溶液 20ng
94℃・2分
98℃・0秒、
65℃・5秒、(50サイクル)
94℃・1分、
40℃・1分、
40℃〜75℃(0.5℃/秒で温度上昇)。
図8は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。プライマー(A)として用いたオリゴ14の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ32はハイブリダイズし、プライマー(B)として用いたオリゴ15の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ30、33はハイブリダイズする。つまり検出に用いる3種類の標識プローブのうち、プローブ(Cm)は、プローブ(Ct)および(Ck)とは「異なるプライマーを用いて伸長させた伸長産物」とハイブリダイズすることになる。図8より明らかなように、ヒト型結核菌(MT)試料とした場合に68℃に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌(MA)およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ(MI)、すなわちMACのDNAを試料とした場合に60℃に明瞭なピークが観察され、さらにマイコバクテリウム・カンサシイ(MK)のDNAを試料とした場合には63℃にピークが観察された。MT、MAC、MKのそれぞれに特異的な検出ピークが観察された。陰性コントロール(NC)はピークが得られなかった。これは、プローブ(Ct)、プローブ(Cm)およびプローブ(Ck)の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ(Ct)、プローブ(Cm)およびプローブ(Ck)の三種類のプローブを組み合わせて用いることで、一度の測定で抗酸菌の中で臨床診断上特に重要となるヒト型結核菌、MACおよびマイコバクテリウム・カンサシイを一度に同定できることを示している。
(1)試料の調製
4種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したDNAを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
4種類の抗酸菌属細菌DNAおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー(登録商標)を使用した。測定モードは530nmを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
以下の試薬を含む10μL溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ14 500nM、
オリゴ15 500nM、
オリゴ31(3’末端をBODIPY−FL標識)100nM、
オリゴ32(3’末端をBODIPY−FL標識)160nM、
オリゴ33(5’末端をBODIPY−FL標識、3’末端をリン酸化)300nM、
×10緩衝液 1μL、
dNTP 0.2mM、
MgSO4 4mM、
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.2U、
抽出DNA溶液 20ng
94℃・2分
98℃・0秒、
65℃・5秒、(50サイクル)
94℃・1分、
40℃・1分、
40℃〜75℃(0.5℃/秒で温度上昇)。
図9は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。プライマー(A)として用いたオリゴ14の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ31、32はハイブリダイズし、プライマー(B)として用いたオリゴ15の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ33はハイブリダイズする。つまり検出に用いる3種類の標識プローブのうち、プローブ(Ck)は、プローブ(Ct)および(Cm)とは「異なるプライマーを用いて伸長させた伸長産物」とハイブリダイズすることになる。図9より明らかなように、ヒト型結核菌(MT)試料とした場合に66℃に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌(MA)およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ(MI)、すなわちMACのDNAを試料とした場合に60℃に明瞭なピークが観察され、さらにマイコバクテリウム・カンサシイ(MK)のDNAを試料とした場合には63℃にピークが観察された。MT、MAC、MKのそれぞれに特異的な検出ピークが観察された。陰性コントロール(NC)はピークが得られなかった。これは、プローブ(Ct)、プローブ(Cm)およびプローブ(Ck)の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ(Ct)、プローブ(Cm)およびプローブ(Ck)の三種類のプローブを組み合わせて用いることで、一度の測定で抗酸菌の中で臨床診断上特に重要となるヒト型結核菌、MACおよびマイコバクテリウム・カンサシイを一度に同定できることを示している。
(1)試料の調製
36種類の抗酸菌属細菌をそれぞれマクファランドNo.1の濃度となるようにTEバッファーに懸濁し、AMR社製MORA−EXTRACT用ビーズ充填チューブに入れた。チューブを95℃10分間加熱し、ボルテックスにより5分間菌体破砕処理を行った。その後破砕処理後の液を100倍希釈して菌体破砕液とし、これを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
36種類の抗酸菌属細菌菌体破砕液および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー(登録商標)を使用した。測定モードは530nmを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
以下の試薬を含む10μL溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ14 250nM、
オリゴ15 1500nM、
オリゴ30(3’末端をBODIPY−FL標識) 100nM、
オリゴ17(5’末端をBODIPY−FL標識、3’末端をリン酸化) 80nM、
オリゴ29(5’末端をBODIPY−FL標識、3’末端をリン酸化) 300nM、
×10緩衝液 1μL、
dNTP 0.2mM、
MgSO4 4mM、
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.2U、
抽出DNA溶液 20ng
94℃・2分
98℃・0秒、
62℃・5秒、(50サイクル)
94℃・1分、
40℃・1分、
40℃〜75℃(0.5℃/秒で温度上昇)。
表2に36種類の抗酸菌属細菌の検出結果を示す。検出欄への数値の記載は検出可能な菌種であることを示す。例えば「68」は68℃に検出ピークが見られることを示している。55℃以上においてピークが検出できない菌種は「−」と記載する。オリゴ30(Ct)、オリゴ17(Cm)およびオリゴ29(Ck)の組み合わせで検出可能な菌種は、図6で特異的な検出ピークが得られているMT、MAC、MKである。実施例2の結果と同様にMTの菌体破砕液を試料とした場合には68℃、MACの菌体破砕液を試料とした場合には63℃、MKの菌体破砕液を試料とした場合には59℃の検出ピークが観察された。しかし、MT、MAC、MK以外の抗酸菌種32種類の菌体破砕液を試料とした場合では陰性コントロール(NC)と同様にピークが得られなかった。これは、オリゴ30(Ct)、オリゴ17(Cm)およびオリゴ29(Ck)を組み合わせることによって、臨床上重要であるMT、MAC、MKの三種を特異的に検出でき、かつ三種を1つの試薬により明確に同定できることを示している。
Claims (7)
- 以下の(A)から(E)のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドのセット。
(A)配列番号14および配列番号15に示される2つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号16および配列番号17に示される2つのオリゴヌクレオチドからなるプローブセットの組合せ。
(B)配列番号14および配列番号15に示される2つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号30、配列番号17および配列番号29に示される3つのオリゴヌクレオチドからなるプローブセットの組合せ。
(C)配列番号14および配列番号15に示される2つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号31、配列番号17および配列番号29に示される3つのオリゴヌクレオチドからなるプローブセットの組合せ。
(D)配列番号14および配列番号15に示される2つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号30、配列番号32および配列番号33に示される3つのオリゴヌクレオチドからなるプローブセットの組合せ。
(E)配列番号14および配列番号15に示される2つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号31、配列番号32および配列番号33に示される3つのオリゴヌクレオチドからなるプローブセットの組合せ。 - 以下の(A)から(E)のいずれかで示される抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
(A)少なくとも以下の(1)〜(3)の工程を含む方法。
(1)配列番号14に示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号15に示されるオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマー対として用いて、核酸増幅を行う第一工程、
(2)第一工程で得られうる増幅産物と、配列番号16に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ct)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pt)を形成せしめ、
該増幅産物と、配列番号17に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Cm)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pm)を形成せしめる第二工程、
(3)第二工程で得られうる該複合体(Pt)または(Pm)のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。
(B)少なくとも以下の(1)〜(3)の工程を含む方法。
(1)配列番号14に示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号15に示されるオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマー対として用いて、核酸増幅を行う第一工程、
(2)第一工程で得られうる増幅産物と、配列番号30に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ct)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pt)を形成せしめ、
該増幅産物と、配列番号17に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Cm)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pm)を形成せしめ、
該増幅産物と、配列番号29に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ck)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pk)を形成せしめる第二工程、
(3)第二工程で得られうる該複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。
(C)少なくとも以下の(1)〜(3)の工程を含む方法。
(1)配列番号14に示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号15に示されるオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマー対として用いて、核酸増幅を行う第一工程、
(2)第一工程で得られうる増幅産物と、配列番号31に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ct)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pt)を形成せしめ、
該増幅産物と、配列番号17に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Cm)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pm)を形成せしめ、
該増幅産物と、配列番号29に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ck)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pk)を形成せしめる第二工程、
(3)第二工程で得られうる該複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。
(D)少なくとも以下の(1)〜(3)の工程を含む方法。
(1)配列番号14に示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号15に示されるオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマー対として用いて、核酸増幅を行う第一工程、
(2)第一工程で得られうる増幅産物と、配列番号30に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ct)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pt)を形成せしめ、
該増幅産物と、配列番号32に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Cm)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pm)を形成せしめ、
該増幅産物と、配列番号33に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ck)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pk)を形成せしめる第二工程、
(3)第二工程で得られうる該複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。
(E)少なくとも以下の(1)〜(3)の工程を含む方法。
(1)配列番号14に示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号15に示されるオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマー対として用いて、核酸増幅を行う第一工程、
(2)第一工程で得られうる増幅産物と、配列番号31に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ct)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pt)を形成せしめ、
該増幅産物と、配列番号32に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Cm)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pm)を形成せしめ、
該増幅産物と、配列番号33に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ck)と、をハイブリダイズさせ複合体(Pk)を形成せしめる第二工程、
(3)第二工程で得られうる該複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。 - (1)〜(3)の工程を密封状態のままで行うことを特徴とする請求項2に記載の菌種同定方法。
- 検出用オリゴヌクレオチドプローブ(Ct)、(Cm)、および(Ck)が蛍光色素で標識されていることを特徴とする請求項2または3に記載の菌種同定方法。
- 複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)から発せられる蛍光を測定しながら、連続的な温度上昇または下降を伴う融解曲線解析を行い、該複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)のうち、どの複合体が形成したかを判別することを特徴とする請求項2〜4のいずれかに記載の菌種同定方法。
- 融解曲線解析を行う際の複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)の検出にIFP法を用いることを特徴とする請求項5に記載の菌種同定方法。
- 融解曲線解析を行う際の複合体(Pt)、(Pm)、または(Pk)の検出にQ−Probe法を用いることを特徴とする請求項5に記載の菌種同定方法。
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