JP6867369B2 - 結核菌検出のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本開示は、例えば、esxJ核酸配列の一部を増幅することによって結核菌を検出する方法を提供する。esxJの核酸配列が利用可能である(例えば、GenBank受託番号NC_009565)。具体的には、esxJ核酸分子標的を増幅し検出するプライマーおよびプローブは、本開示の実施態様により提供される。結核菌の検出のために、esxJを増幅するプライマーおよびプローブが提供される。本明細書内に例示されるもの以外のEsxJ核酸もまた、試料中の結核菌を検出するために使用できる。例えば、機能的変異体は、日常的な方法を用いて、当業者により特異性および/または感受性について評価され得る。代表的な機能的変異体は、例えば、本明細書内に開示されるesxJ核酸における1つ以上の欠失、挿入および/または置換を含み得る。より詳細には、オリゴヌクレオチドの各実施態様には、配列番号1〜40から選択される配列を有する核酸、配列番号1〜40のうちの一つに対し、少なくとも例えば80%、90%または95%の配列同一性を有する実質的に同一のそれらの変異体、または配列番号1〜40の相補体およびそれらの変異体を含む。
米国特許第4,683,202号、第4,683,195号、第4,800,159号および第4,965,188号は、従来のPCR技術を開示している。PCRは、典型的には、選択された核酸鋳型(例えば、DNAまたはRNA)に結合する2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施態様において有用なプライマーは、前記のesxJ核酸配列(例えば、配列番号1〜21)内の核酸合成の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、従来の方法により制限消化物から精製することができ、またはそのプライマーは合成的に生成することができる。プライマーは、増幅における最大効率のためには好ましくは一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーを、まず変性、すなわち、処理して鎖を分離する。二本鎖核酸を変性させる一つの方法は加熱することである。
FRET技術(例えば、米国特許第4,996,143号、第5,565,322号、第5,849,489号および第6,162,603号を参照)は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いの特定の距離内に位置するときに、可視化されるか、他の方法で検出および/または定量化される2つの蛍光部分の間で、エネルギー移動が起きる。ドナーは、典型的には、ドナーが適切な波長を備える光放射によって励起されるときに、アクセプターにエネルギーを移動させる。アクセプターは、典型的には、異なる波長を備える光放射の形態で移動エネルギーを再放出する。特定のシステムにおいて、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光ドナー部分を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動させることができる(例えば、米国特許第7,741,467号を参照)。
本開示は、生体試料または非生体試料中の結核菌の有無を検出する方法を提供する。提供される方法は、試料汚染、偽陰性、および偽陽性の問題を回避する。これらの方法は、1対以上のesxJプライマーを使用して試料からのesxJ標的核酸分子の一部を増幅することと、FRET検出工程とを含む少なくとも1回のサイクリング工程を実施することを含む。好ましくはサーモサイクラー中で、複数のサイクリング工程を実施する。これらの方法は、esxJプライマーとプローブを使用して結核菌の存在を検出することができ、esxJの検出は試料中の結核菌の存在を示す。
本開示の実施態様はさらに、結核菌を検出するための製品またはキットを提供する。この製品は、適切な包装材料と共にesxJ遺伝子標的を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含むことができる。結核菌を検出するための代表的なプライマーおよびプローブは、esxJ標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。さらに、このキットはまた、DNA固定化、ハイブリダイズ、および検出に必要な適切に包装された試薬および材料、例えば固体支持体、緩衝液、酵素およびDNA標準を含んでもよい。プライマーおよびプローブを設計する方法が本明細書内に開示され、esxJ標的核酸分子を増幅して、それにハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
esxJ遺伝子を標的とするオリゴの特異性は、公に入手可能な28個の結核菌全ゲノムならびに26個の非結核性マイコバクテリアの全ゲノムのブラスト分析によって確立された。標的遺伝子領域は、28個の結核菌全ゲノム中に5個の別個のコピーを有して存在し、ならびに他の結核菌複合体メンバー(M.bovis、M.africanum、およびM.canettii)中に3〜5個の別個のコピーを有して存在し、非常に乏しい相同性を有する他のマイコバクテリア種中に見出されるのみである。多数の非結核マイコバクテリア種から抽出されたゲノムDNAを試験することによって、排他性を確認した。
Claims (12)
- 試料中の結核菌および他の結核菌複合体メンバーを検出する方法であって、
試料を1組のesxJプライマーと接触させることを含む増幅工程を実施して、esxJ核酸が試料中に存在する場合に増幅産物を生成し、
前記増幅産物を1つ以上の検出可能なesxJプローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施し、そして
前記増幅産物の存在または不在を検出すること、ここで前記増幅産物の存在が試料中の結核菌の存在の指標となり、前記増幅産物の不在が試料中の結核菌の不在の指標となる、
を含み、
前記1組のesxJプライマーは、配列番号1、7、及び9からなる群から選択される第1のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む第1のプライマーと、配列番号15〜17からなる群から選択される第2のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む第2のプライマーとを含み、および
前記検出可能なesxJプローブは、配列番号30の第3のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、方法。 - 前記ハイブリダイズ工程は、前記増幅産物を、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識化された前記検出可能なesxJプローブと接触させることを含み、かつ
前記検出工程は、前記プローブの前記ドナー蛍光部分と前記アクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の有無を検出することを含み、前記蛍光の有無が試料中の結核菌の有無を示す、請求項1に記載の方法。 - 前記増幅工程は、5’→3’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する、請求項2に記載の方法。
- 前記ドナー蛍光部分および前記対応するアクセプター部分は、前記プローブ上で互いに8〜20ヌクレオチド以内に存在する、請求項2または3に記載の方法。
- 前記アクセプター部分はクエンチャーである、請求項2〜4のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のプライマー、第2のプライマーおよび検出可能なesxJプローブの少なくとも1つは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜5のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 結核菌および他の結核菌複合体メンバーの核酸を検出するためのキットであって、
配列番号1、7、及び9からなる群から選択される第1のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、
配列番号15〜17からなる群から選択される第2のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、および
配列番号30のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含み、かつ第1のプライマーおよび第2のプライマーによって生成されたアンプリコンにハイブリダイズするように構成された第3の蛍光的に検出可能に標識化されたプローブ
を含む、キット。 - 前記第3の検出可能に標識化されたオリゴヌクレオチド配列は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分を含む、請求項7に記載のキット。
- 前記アクセプター部分はクエンチャーである、請求項8に記載のキット。
- ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液をさらに含む、請求項7〜9のうちのいずれか1項に記載のキット。
- 第1、第2および第3のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項7〜10のうちのいずれか1項に記載のキット。
- 第1、第2および第3のオリゴヌクレオチドは、40個以下のヌクレオチドを有する、請求項7〜11のうちのいずれか1項に記載のキット。
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