JP2024503343A - 細菌性及びカンジダ膣炎に関連する細菌及び真菌の検出のための組成物及び方法 - Google Patents

細菌性及びカンジダ膣炎に関連する細菌及び真菌の検出のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

生物学的又は非生物学的試料中の複数の細菌性膣炎関連（ＢＶ関連）細菌及び／又は外陰膣カンジダ症（ＶＶＣ）関連カンジダの存在又は非存在の迅速な検出のための方法を記載する。本方法は、増幅工程、ハイブリダイズ工程、及び検出工程を行うことを含むことができる。さらに、ＢＶ関連細菌及びＶＶＣ関連カンジダの検出のために設計された、特異的遺伝子を標的とするプライマー及びプローブ並びにキットが提供される。

Description

発明の分野
本開示は、分子診断の分野に関し、より詳細には、細菌性及びカンジダ膣炎に関連する様々な細菌及び真菌株の検出に関する。
発明の背景
膣炎は、米国における全ての婦人科訪問の５０％もの原因であり、医療費の主な原因である。細菌性膣炎（ＢＶ）、外陰膣カンジダ症（ＶＶＣ）、及びトリコモナス症による感染性膣炎は、これらの症例の最大９０％を占める。トリコモナス症とは異なり、ＢＶとＶＶＣの両方がいくつかの病原体に起因する。ＶＶＣの場合、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の過剰増殖が優勢であるが、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）を含む他のカンジダ種も同様に寄与し得る。病因は、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）ｓｐｐ．、及びアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）などのＢＶ関連細菌の濃度の増加と同時にラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌のレベルの減少を伴うため、ＢＶは診断が困難である。
膣炎の根本原因を特定するために、様々な診断方法が利用可能である。臨床医のオフィスでは、比較的性能が低いにもかかわらず、ｐＨ、水酸化カリウム（ＫＯＨ）試験、及び膣分泌物の新鮮な試料の顕微鏡検査の組み合わせが日常的に使用されている。ＢＶの場合、診断はしばしば、臨床的Ａｍｓｅｌ基準又はグラム染色及びＮｕｇｅｎｔスコア（ＢＶの診断のためのゴールドスタンダード検査法と考えられる）のいずれかの使用に依存する。カンジダについてのＫＯＨ調製物及び／又は膣培養物を用いた湿式マウントの検査は、ＶＶＣの最も一般的な診断ツールである。トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の検出には、高感度で特異的な核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）が推奨されているが、臨床現場では、湿式マウント調製物の検査が依然として一般的に使用されている。しかしながら、非分子的方法の使用には、診療所の設備の欠如、使用される臨床エンドポイントの主観、及び医師間の一貫性のない使用、顕微鏡検査における適切な訓練の欠如、及び試験の全体的な感度の低さを含むいくつかの障壁が伴う。膣炎の根底にある原因の診断は、ＢＶ、ＶＶＣ、及びトリコモナス症について報告された一般的な症候学、混合感染又は同時感染の発生率；及び膣症候の再発によってさらに複雑化される。
したがって、外陰膣カンジダ症及び細菌性膣炎を検出するためのより効率的で迅速な方法、例えば、患者に適切な処置を効果的に送達するために、単一のアッセイで両方の膣障害を検出することを可能にする方法を開発する必要がある。
一態様では、生物学的試料中の複数のＢＶ関連細菌を検出する方法が開示され、複数のＢＶ関連細菌は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、並びに、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型、エガセラ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）ｓｐｐ．、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）ｓｐｐ．及び細菌性膣炎関連細菌ＢＶＡＢ－２からの少なくとも１つを含む。本明細書において、本方法は、試料をプライマーセットと接触させて、ＢＶ関連細菌由来の核酸が試料中に存在する場合に増幅産物を産生することを含む増幅工程を実施すること；各増幅産物を１つ又は複数の検出可能なプローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること；及び各増幅産物の存在を検出することを含み、増幅産物の存在は、試料中のＢＶ関連細菌の存在を示し；ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号３８、４１又は４４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号３９、４２又は４５、４７又は７３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号４０、４３、４６及び７４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号１、４、５、８又は１１から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号２、６、９又は１２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号３、７、１０及び１３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号１４、１７、２０、６７又は７０から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号１５、１８、２１、６８又は７１から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号１６、１９、２２、６６、６９及び７２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型由来の増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号２３、２６又は２７から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号２４又は２８から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号２５及び２９から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；エガセラ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）ｓｐｐ．から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号８４又は８７から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号８５又は８８から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号８６及び８９から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）ｓｐｐ．から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号９０、９５、９６又は９７から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９２、９３、９８、９９又は１００から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号９４、１０１及び１０２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；ＢＶＡＢ－２から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号３０又は３３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号３１、３４又は３６から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号３２、３５及び３７から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、複数のＢＶ関連細菌は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、及びアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）であり、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号３８、４１又は４４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号３９、４２又は４５、４７又は７３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号４０、４３、４６及び７４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号１、４、５、８又は１１から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号２、６、９又は１２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号３、７、１０及び１３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号１４、１７、２０、６７又は７０から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号１５、１８、２１、６８又は７１から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号１６、１９、２２、６６、６９及び７２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号４４のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号４５のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号４６のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号１１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号１２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号１３のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号２０のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号２１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号７２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。他の実施形態では、本方法のハイブリダイズ工程は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識された検出可能なプローブと増幅産物とを接触させることを含み、検出工程は、プローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、蛍光の存在又は非存在は、試料中のＢＶ関連細菌の存在又は非存在を示す。さらなる実施形態では、本方法の増幅工程は、５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる。いくつかの実施形態では、「接触させる」工程は、前記生物学的試料及び前記プライマーをＤＮＡポリメラーゼ、アデニン、チミン、シトシン及びグアニンを含む複数の遊離ヌクレオチド、及び／又は緩衝液と接触させて反応混合物を生成することをさらに含む。生物学的試料から抽出された核酸は、二本鎖ＤＮＡを含んでもよく、又は二本鎖ＤＮＡからなってもよい。反応混合物は、二価カチオン、一価カチオンカリウムイオン、１つ又は複数の検出可能に標識されたプローブ、及び／又はそれらの任意の組み合わせを任意にさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、「アンプリコンを生成する」工程は、（ａ）生物学的試料又は核酸中に存在する二本鎖ＤＮＡの鎖を分離するために、反応混合物を第１の所定時間、第１の所定温度に加熱することと、（ｂ）プライマーがそれらの相補配列とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長させる条件下で、反応混合物を第２の所定時間、第２の所定温度に冷却することと、（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）を少なくとも１０～１２回繰り返すことと、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）は、少なくとも１５、２０、２２又は２５回繰り返される。いくつかの実施形態では、試料は、生物学的試料である。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、尿道、陰茎、肛門、喉、子宮頸部又は膣から収集される。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、臨床検体から抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡ又は全核酸である。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズ工程は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識された検出可能な遺伝子プローブと増幅産物とを接触させることを含み、検出工程は、プローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、蛍光の存在又は非存在は、試料中のＢＶ関連細菌の存在又は非存在を示す。いくつかの実施形態では、増幅工程及びハイブリダイズ工程が繰り返される。ここで、繰り返し回数は、例えば、試料の性質に依存する。試料が核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くの増幅及びハイブリダイズ工程が必要となる。いくつかの実施形態では、増幅及びハイブリダイズ工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、少なくとも２５回、３０回、４０回、５０回、６０回又は更には１００回繰り返されてもよい。更に、増幅産物の存在又は非存在の検出は、各増幅及びハイブリダイズ工程の間若しくは後に、１つおきの増幅及びハイブリダイズ工程の間若しくは後に、特定の増幅及びハイブリダイズ工程の間若しくは後に、又は特定の増幅及びハイブリダイズ工程の間若しくは後に行うことができ、存在する場合、検出に十分な増幅産物が期待される。いくつかの実施形態では、増幅ステップは、５’～３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる。いくつかの実施形態では、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分は、プローブ上で互いに８～２０ヌクレオチド以内にある。いくつかの実施形態では、アクセプター部分はクエンチャーである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～４７、６６～７４、及び８４～１０２から選択されるヌクレオチドの配列、又はそれらの相補体を含むか又はそれらからなり、１００個以下のヌクレオチド、５０個以下のヌクレオチド、４０個以下のヌクレオチド又は３０個以下のヌクレオチドを有する。
本開示はまた、配列番号１、４、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２７、３０、３３、３８、４１、４４、６７、７０、８４、８７、９０、９５、９６、及び９７からなる群より選択される第１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２８、３１、３４、３６、３９、４２、４５、４７、６８、７１、７３、８５、８８、９１、９２、９３、９８、９９、及び１００からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなるリバースプライマーと、配列番号３、７、１０、１３、１６、６６、６９、１９、２２、７２、２５、２９、３２、３５、３７、４０、４３、４６、７４、８６、８９、９４、１０１、及び１０２からなる群から選択される第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか又はそれらからなるプローブとを含み、第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド配列が、フォワードプライマー及びリバースプライマーによって生成されるアンプリコンにハイブリダイズするように構成されている、試料中の細菌性膣炎関連（ＢＶ関連）細菌を検出するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、検出可能に標識された第３のオリゴヌクレオチド配列は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び前記核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液をさらに含む。さらに他の実施形態では、第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、ＢＶ関連細菌は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型、エガセラ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）ｓｐｐ．、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）ｓｐｐ．、及びＢＶＡＢ－２を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号３８～４７及び７３～７４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．の２３ｓ ｒＲＮＡ又はＤ－ＬＤＨ遺伝子にハイブリダイズすることができるプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号１～１３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）のｔｕｆ遺伝子又は２３ｓ ｒＲＮＡ遺伝子若しくは１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズすることができるプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号１４～２２及び６６～７２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）の２３ｓ ｒＲＮＡ遺伝子又はｔｕｆＡ遺伝子にハイブリダイズすることができるプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号２３～２９から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズすることができるプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８４～８９から選択されるオリゴヌクレオチドを含むか又はそれからなる、エガセラ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）ｓｐｐ．の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズすることができるプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号９０～１０２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）ｓｐｐ．の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズすることができるプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号３０～３７から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、ＢＶＡＢ－２の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズすることができるプライマー及びプローブを含む。
別の態様では、本開示は、生物学的試料中の外陰膣カンジダ症（ＶＶＣ）関連カンジダ種を検出する方法を提供し、ＶＶＣ関連カンジダ種は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、及びカンジダ・パラプローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（総称してカンジダｓｐｐ．と呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＶＣ関連種は、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）及び／又はカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）をさらに含む。本明細書において、本方法は、試料をプライマーセットと接触させて、ＶＶＣ関連カンジダ由来の核酸が試料中に存在する場合に増幅産物を産生することを含む増幅工程を実施すること；各増幅産物を１つ又は複数の検出可能なプローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること；及び、及び各増幅産物の存在を検出することを含み、増幅産物の存在は、試料中のＶＶＣ関連カンジダの存在を示し；カンジダｓｐｐ．から増幅産物を産生するためのプライマーのセットは、配列番号４８、５１、５４、５７又は７６から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号４９、５２、５５、５８又は７７から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号５０、５３、５６、５９、７５及び７８から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号６０、７９又は８２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号６１、８０又は８３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号６２及び８１から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号６３のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号６４のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号６５を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、カンジダｓｐｐ．から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号７６のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号７７のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号７８のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号７９のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号８０のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号８１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。他の実施形態では、ハイブリダイズ工程は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識された検出可能なプローブと増幅産物とを接触させることを含み、検出工程は、プローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、蛍光の存在又は非存在は、試料中のＶＶＣ関連カンジダの存在又は非存在を示す。さらなる実施形態では、増幅工程は、５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる。いくつかの実施形態では、「接触させる」工程は、前記生物学的試料及び前記プライマーをＤＮＡポリメラーゼ、アデニン、チミン、シトシン及びグアニンを含む複数の遊離ヌクレオチド、及び／又は緩衝液と接触させて反応混合物を生成することをさらに含む。生物学的試料から抽出された核酸は、二本鎖ＤＮＡを含んでもよく、又は二本鎖ＤＮＡからなってもよい。反応混合物は、二価カチオン、一価カチオンカリウムイオン、１つ又は複数の検出可能に標識されたプローブ、及び／又はそれらの任意の組み合わせを任意にさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、「アンプリコンを生成する」工程は、（ａ）生物学的試料又は核酸中に存在する二本鎖ＤＮＡの鎖を分離するために、反応混合物を第１の所定時間、第１の所定温度に加熱することと、（ｂ）プライマーがそれらの相補配列とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長させる条件下で、反応混合物を第２の所定時間、第２の所定温度に冷却することと、（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）を少なくとも１０～１２回繰り返すことと、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）は、少なくとも１５、２０、２２又は２５回繰り返される。
本開示はまた、試料中の外陰膣カンジダ症（ＶＶＣ）関連カンジダ種を検出するためのキットを提供し、配列番号４８、５１、５４、５７、７６、６０、７９、８２及び６３からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号４９、５２、５５、５８、７７、６１、８０、８３、及び６４からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーと、配列番号５０、５３、７５、５６、５９、７８、６２、８１、及び６５からなる群から選択される第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか又はそれからなるプローブとを含み、プローブは、フォワードプライマー及びリバースプライマーによって生成されるアンプリコンにハイブリダイズするように構成されている。いくつかの実施形態では、検出可能に標識された第３のオリゴヌクレオチド配列は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び前記核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液をさらに含む。さらに他の実施形態では、第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＶＣ関連カンジダｓｐｐ．は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、及び カンジダ・パラプローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（総称してカンジダｓｐｐ．と呼ばれる）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号４８～５９及び７５～７８から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、カンジダｓｐｐ．のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子又は２５ｓ ｒＲＮＡにハイブリダイズすることができるプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号６０～６２及び７９～８３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）のｒＲＮＡ遺伝子の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）にハイブリダイズすることができるプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号６３～６５から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）のｒＲＮＡ遺伝子の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）にハイブリダイズすることができるプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施形態では、試料は、生物学的試料である。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、尿道、陰茎、肛門、喉、子宮頸部又は膣から収集される。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、臨床検体から抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡ又は全核酸である。
さらに、本開示は、配列番号１～１０２のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％など）を有する核酸又はその相補体を含むオリゴヌクレオチドであって、１００以下のヌクレオチド、５０以下のヌクレオチド、４０以下のヌクレオチド又は３０以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを提供する。一般に、これらのオリゴヌクレオチドは、プライマー核酸、プローブ核酸等であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、非修飾ヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーション安定性を変化させるために、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、Ｎ６－ベンジル－ｄＡ、Ｎ４－ベンジル－ｄＣ、Ｎ６－パラ－ｔｅｒｔ－ブチル－ベンジル－ｄＡ、及びＮ４－パラ－ｔｅｒｔ－ブチル－ベンジル－ｄＣからなる群から選択される。任意に、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識及び／又は少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの保存的に改変された変異を含む。特定の核酸配列の「保存的に改変された変異」若しくは単に「保存的変異」とは、同一若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、若しくは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。当業者であれば、コードされた配列中の単一のアミノ酸又は少量のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には４％、２％又は１％未満）を変更、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加は、修飾がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的修飾変異」であることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、第１及び第２の標的遺伝子プライマー、並びに検出可能な標的遺伝子プローブの少なくとも１つは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
別の態様では、本開示は、試料中のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、並びに、カンジダｓｐｐ．、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）から選択される群のうちの少なくとも１つを同時に検出する方法であって、試料をプライマーセットと接触させて、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、並びに、カンジダｓｐｐ．、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）から選択される群のうちの少なくとも１つから選択される核酸が試料中に存在する場合に増幅産物を産生することを含む増幅工程を実施すること；各増幅産物を１つ又は複数の検出可能なプローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること；及び各増幅産物の存在を検出することを含み、増幅産物の存在は、試料中のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、並びにカンジダｓｐｐ．、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）から選択される群の少なくとも１つの存在を示す。本明細書では、上記のプライマーセット及び対応するプローブを使用してもよい。一実施形態では、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号４４のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号４５のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号４６のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号１１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号１２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号１３のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号２０のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号２１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号７２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；及び／又は、カンジダｓｐｐ．から増幅産物を産生するためのプライマーのセットは、配列番号７６のオリゴヌクレオチド配列を含むか若しくはそれからなるフォワードプライマーと、配列番号７７のオリゴヌクレオチド配列を含むか若しくはそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号７８のオリゴヌクレオチド配列を含むか若しくはそれからなり；カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号７９のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号８０のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号８１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり；カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）から増幅産物を産生するためのプライマーセットは、配列番号６３のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号６４のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、１つ又は複数の検出可能なプローブは、配列番号６５のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料が本主題の実施又は試験で使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、図面及び発明を実施するための形態、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
実施例２に記載されるようにアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）を増幅及び検出するためのＰＣＲ実験の増殖曲線を示す。 同じ実験の計算されたＣｔ値を示す。 実施例３に記載されているようにガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）を増幅及び検出するためのＰＣＲ実験の計算されたＣｔ値を示す。 実施例４に記載のようにＢＶＡＢ－２を増幅及び検出するためのＰＣＲ実験の計算されたＣｔ値を示す。 実施例５に記載のようにメガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型を増幅及び検出するためのＰＣＲ実験の計算されたＣｔ値を示す。 実施例６に記載のようにラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種を増幅及び検出するためのＰＣＲ実験の計算されたＣｔ値を示す。 実施例９に記載されるように、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｓｐｐ．を増幅及び検出するためのＣＡＰＴ＿ｒＲＮＡ＿１アッセイにおけるＰＣＲ実験の計算されたＣｔ値を示す。 実施例９に記載されるように、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｓｐｐ．及びカンジダ・グラブラタを増幅及び検出するためのＣＶＳ＿ｒＲＮＡ＿１アッセイにおけるＰＣＲ実験の計算されたＣｔ値を示す。 実施例１０に記載されるように、マルチプレックスＰＣＲアッセイにおけるガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の１６ｓ ｒＲＮＡの検出についてのチャネル１での増殖曲線を示す。Ｔ１－４Ａｂ：ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）１６ｓ、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＤＨ、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）ｔｕｆＡ、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）２５ｓ ｒＲＮＡ配列、及びヒトゲノムＤＮＡを有するプラスミドのプール。Ｔ１－４Ｇｂ：ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）１６ｓ、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＤＨ、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）ｔｕｆＡ、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）ＩＴＳ配列、及びヒトゲノムＤＮＡを有するプラスミドのプール。ＨＩＶＤ：試料希釈剤。 実施例１０に記載されるように、マルチプレックスＰＣＲアッセイにおけるラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種のＤ－ＬＤＨ遺伝子の検出についてのチャネル２での増殖曲線を示す。Ｔ１－４Ａｂ：ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）１６ｓ、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＤＨ、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）ｔｕｆＡ、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）２５ｓ ｒＲＮＡ配列、及びヒトゲノムＤＮＡを有するプラスミドのプール。Ｔ１－４Ｇｂ：ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）１６ｓ、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＤＨ、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）ｔｕｆＡ、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）ＩＴＳ配列、及びヒトゲノムＤＮＡを有するプラスミドのプール。ＨＩＶＤ：試料希釈剤。 実施例１０に記載されるように、マルチプレックスＰＣＲアッセイにおけるアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）のｔｕｆＡ遺伝子の検出についてのチャネル３での増殖曲線を示す。Ｔ１－４Ａｂ：ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）１６ｓ、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＤＨ、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）ｔｕｆＡ、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）２５ｓ ｒＲＮＡ配列、及びヒトゲノムＤＮＡを有するプラスミドのプール。Ｔ１－４Ｇｂ：ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）１６ｓ、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＤＨ、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）ｔｕｆＡ、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）ＩＴＳ配列、及びヒトゲノムＤＮＡを有するプラスミドのプール。ＨＩＶＤ：試料希釈剤。 実施例１０に記載されるように、マルチプレックスＰＣＲアッセイにおけるカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｓｐｐ．の２５ｓ ｒＲＮＡの検出についてのチャネル４での増殖曲線を示す。Ｔ１－４Ａｂ：ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）１６ｓ、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＤＨ、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）ｔｕｆＡ、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）２５ｓ ｒＲＮＡ配列、及びヒトゲノムＤＮＡを有するプラスミドのプール。Ｔ１－４Ｇｂ：ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）１６ｓ、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＤＨ、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）ｔｕｆＡ、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）ＩＴＳ配列、及びヒトゲノムＤＮＡを有するプラスミドのプール。ＨＩＶＤ：試料希釈剤。
発明の詳細な説明
外陰膣カンジダ症（ＶＶＣ）及び細菌性膣炎（ＢＶ）を検出するための方法及び組成物が本明細書で提供される。例えば、ＶＶＣ及びＢＶ関連細菌に関連するカンジダ種の特定の遺伝子に結合することができるプライマー及びプローブを提供して、生物学的試料などの試料中のＶＶＣ関連カンジダ種及びＢＶ関連細菌の存在又は非存在を判定する。いくつかの実施形態では、マルチプレックス核酸増幅を実施して、単一のアッセイでＶＶＣ関連カンジダ種及びＢＶ関連細菌の検出を可能にすることができる。
開示される方法は、１つ又は複数のプライマー対を使用して試料からの核酸分子遺伝子標的の１つ以上の部分を増幅することを含む、少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含み得る。本明細書で使用される「プライマー（複数可）」は、細菌種又はカンジダ種中の標的遺伝子に特異的にアニーリングし、それぞれの増幅産物を産生する適切な条件下でそこからＤＮＡ合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。検討されるプライマーは各々、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように、それぞれの標的核酸分子内又はそれに隣接する標的にアニーリングする。標的遺伝子核酸の１つ以上が試料中に存在すれば、１つ以上の増幅産物が生成され、したがって１つ以上の標的遺伝子増幅産物の存在が試料中の細菌又はカンジダ種の存在を示す。増幅産物は、標的遺伝子の１つ以上の検出可能なプローブに相補的な核酸配列を含まなければならない。本明細書で使用される「プローブ（複数可）」は、標的遺伝子をコードする核酸配列に特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプローブを指す。各サイクリングステップは、増幅ステップ、ハイブリダイゼーションステップ及び検出ステップを含み、試料中の細菌種又はカンジダ種の存在又は非存在を検出するために、試料を１つ以上の検出可能なプローブと接触させる。
本明細書で使用される「増幅する」という用語は、鋳型核酸分子の一方又は両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、鋳型核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーを鋳型核酸にアニーリングすること、及び増幅産物を生成するためにプライマーから酵素的に伸長することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）並びにポリメラーゼ酵素（例えば、ＭｇＣｌ２及び／又はＫＣｌ）の最適な活性のための適切な緩衝液及び／又は補因子の存在が必要である。
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に知られており、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドだけでなく、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライミング」することができる修飾オリゴヌクレオチド、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’－ＯＨ基を提供し、そこに、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される３’～５’ホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによって更に「ヌクレオチド」が結合され得ることを指す。したがって、おそらく意図された機能を除いて、「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」、又は「プローブ」の間に基本的な違いはない。
「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への１つ以上のプローブのアニーリングを指す。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
「５’から３’へのヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、該酵素は、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、サーマス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、Ｔ．ルーバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ．ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及びメタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離されている。それにもかかわらず、酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをＰＣＲアッセイに使用することもできる。
「その相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであり、正確に相補的である核酸を指す。
核酸に関して使用される場合の「伸長」又は「延長」という用語は、追加のヌクレオチド（又は他の類似の分子）が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、核酸は、生体触媒を取り込むヌクレオチドによって、例えば、典型的には核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼによって、任意に伸長される。
２つ以上の核酸配列の状況における「同一」又はパーセント「同一性」という用語は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用して、又は目視検査によって測定された最大の一致について、比較又はアラインした場合、同一であるか、又は同一のヌクレオチド特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に適した例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）「Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｇｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６に記載されている。
オリゴヌクレオチドの文脈における「修飾ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置き換えられる変化を指す。本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて置換され得る例示的な修飾ヌクレオチドとしては、例えば、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類縁体、シュード擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－０－メチルリボーＵ、２’－０－メチルリボーＣ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、Ｎ６－メチル－ｄＡ、Ｎ６－ベンジル－ｄＡ、Ｎ４－ベンジル－ｄＣ、Ｎ６－パラ－ｔｅｒｔ－ブチルベンジル－ｄＡ、Ｎ４－パラ－ｔｅｒｔ－ブチル－ベンジル－ｄＣなどが挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の改変ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、又は当技術分野で知られている。特定の実施形態では、改変ヌクレオチド置換は、対応する改変されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、該オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を改変する。更に説明すると、特定の修飾ヌクレオチド置換は、いくつかの実施形態では、非特異的核酸増幅（例えば、プライマーダイマー形成などを最小限に抑える）を減少させ、意図する標的アンプリコンの収率を増加させることなどができる。これらのタイプの核酸修飾の例は、例えば、米国特許第６，００１，６１１号明細書に開示されている。
細菌及び真菌の検出
本明細書に記載されるように、核酸増幅を実施して、試料中のカンジダ種及び／又はＢＶ関連細菌の存在、非存在及び／又はレベルを決定することができる。限定するものではないがＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａを含むいくつかのカンジダ種は、ＶＶＣに関連することが知られている。ラクトバチルス属（例えば、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・イエンセン（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、及びラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ））、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）（Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型（メガスフェラ－１）、及びＢＶＡＢ－２を含むがこれらに限定されない多くの細菌もＢＶに関連することが知られている。いくつかの実施形態では、ＶＶＣ関連カンジダ種及びＢＶ関連細菌の存在、非存在及び／又はレベルは、ＤＮＡ増幅などの当技術分野で公知の方法を使用して、各標的生物の１つ又は複数の標的遺伝子を検出することによって決定される。いくつかの実施形態では、マルチプレックスＰＣＲを実施して、標的カンジダ種及び／又はＢＶ関連細菌のそれぞれの存在、非存在又はレベルを検出することができる。いくつかの実施形態では、マルチプレックスＰＣＲを実施して、標的ＶＶＣ関連カンジダ種、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型、及びＢＶＡＢ－２のそれぞれについての存在、非存在及び／又はレベルを検出する。いくつかの実施形態では、ＶＶＣ関連カンジダ種は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａである。
別の実施形態では、核酸増幅を同じ試料で実施して、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）（ＴＶ）の存在、非存在及び／又はレベルを決定することができる。生物学的又は非生物学的試料中のトリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の存在又は非存在の迅速な検出のための組成物及び方法は、米国特許出願公開第２０１７／０３４２５０８号に記載されている。
標的ＶＶＣ関連カンジダ種及びＢＶ関連細菌のそれぞれは、ＤＮＡ増幅において別々のチャネルを使用して検出することができる。場合によっては、ＶＶＣ関連カンジダ種及びＢＶ関連細菌の２つ以上の存在、非存在及び／又はレベルを検出するために単一の蛍光チャネルを使用することが望ましい場合がある。例えば、単一の蛍光チャネルを使用して、２つのＢＶ関連細菌（例えば、ＢＶＡＢ－２及びメガスフェラ－１）の存在、非存在、及び／又はレベルを検出することができる。そのような組み合わせは、いくつかの実施形態では、実験を行うのに必要な試薬の量を減少させ、ＢＶ決定を評価することができる正確な定性的メトリックを提供することができる。特定の理論に束縛されるものではないが、組み合わされたマーカーの使用は、アッセイの感度及び特異性を増加させ得ると考えられる。いくつかの実施形態では、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．（例えば、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ、及びアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）のそれぞれの存在、非存在及び／又はレベルを検出するために別個の蛍光チャネルが使用され、ＢＶＡＢ－２、メガスフェラ－１、エガセラ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）ｓｐｐ．及びプレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）ｓｐｐ．の存在、非存在及び／又はレベルを検出するために単一の蛍光チャネルが使用される。
ＶＶＣ関連カンジダ種、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型（メガスフェラ－１）、及びＢＶＡＢ－２において、標的遺伝子領域又はその相補体に特異的にハイブリダイズ（例えば、標準的な核酸増幅条件下、例えば、標準的なＰＣＲ条件下及び／又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）することができるオリゴヌクレオチド（例えば増幅プライマー及びプローブ）が提供される。試料中の生物の標的遺伝子領域の増幅（例えば、膣スワブ試料）は、いくつかの実施形態では、試料中の生物の存在、非存在、及び／又はレベルを示すことができる。
標的遺伝子領域は様々であり得る。いくつかの実施形態では、生物における１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）をコードする遺伝子領域に特異的にハイブリダイズする（例えば、標準的な核酸増幅条件下、例えば、標準的なＰＣＲ条件下及び／又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）ことができるオリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマー及びプローブ）が提供される。いくつかの実施形態では、生物はガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）である。いくつかの実施形態では、生物はＢＶＡＢ－２である。いくつかの実施形態では、生物はメガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型である。Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ、メガスフェラ－１及びＢＶＡＢ－２の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの例としては、限定されないが、それぞれ表Ｉに提供される配列番号１１～１３、表ＩＩＩに提供される配列番号２３～２９及び表ＩＶに提供される３０～３７が挙げられる。
いくつかの実施形態では、２３ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、試料中のガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．の存在、非存在及び／又はレベルを検出するためのＤＮＡ増幅のための標的遺伝子として使用される。Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ａ．ｖａｇｉｎａｅ及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．の２３ｓ ＲＮＡ遺伝子領域に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの例としては、限定されないが、それぞれ表Ｉに提供される配列番号５～１０、表ＩＩに提供される配列番号１４～１６、及び表Ｖに提供される配列番号３８～４３が挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの伸長因子Ｔｕタンパク質（ｔｕｆ遺伝子）及びＡ．ｖａｇｉｎａｅのｔｕｆＡ遺伝子をコードする遺伝子領域に特異的にハイブリダイズする（例えば、標準的な核酸増幅条件下、例えば、標準的なＰＣＲ条件下及び／又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）ことができるオリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマー及びプローブ）が提供される。いくつかの実施形態では、ｔｕｆ（又はｔｕｆＡ）遺伝子は、試料中のＧ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ及びＡ．ｖａｇｉｎａｅの存在、非存在及び／又はレベルを検出するためのＤＮＡ増幅の標的遺伝子として使用される。いくつかの実施形態では、Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓのｔｕｆ遺伝子領域及びＡ．ｖａｇｉｎａｅのｔｕｆＡ遺伝子領域に特異的に結合することができるプライマー及びプローブは、生物学的試料中のＧ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ及びＡ．ｖａｇｉｎａｅの存在、非存在及び／又はレベルの検出に使用される。Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓのｔｕｆ遺伝子領域に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの例としては、表Ｉに提供される配列番号１～４が挙げられるが、これらに限定されず、Ａ．ｖａｇｉｎａｅのｔｕｆＡ遺伝子領域に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの例としては、表ＩＩに提供される配列番号１７～２２が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子は、試料中のＶＶＣ関連カンジダ種の存在、非存在及び／又はレベルを検出するためのＤＮＡ増幅の標的遺伝子として使用される。いくつかの実施形態では、ＶＶＣ関連カンジダｓｐｐ．は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、カンジダ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）及びＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（総称してカンジダｓｐｐ．）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＶＣ関連カンジダ種はカンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）である。いくつかの実施形態では、ＶＶＣ関連カンジダ種はカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）である。いくつかの実施形態では、ＶＶＣ関連カンジダ種は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、又はそれらの組み合わせである。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａのｒＲＮＡ遺伝子領域に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの例としては、限定されないが、表ＶＩＩに提供される配列番号６３～６５が挙げられる。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ及びＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（総称してカンジダｓｐｐ．）におけるｒＲＮＡ遺伝子領域に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの例としては、限定されないが、表ＶＩに提供される配列番号４８～５９が挙げられる。Ｃ．ｋｒｕｓｅｉのｒＲＮＡ遺伝子領域に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの例としては、限定されないが、表ＶＩＩに提供される配列番号６０～６２が挙げられる。
Figure 2024503343000002
Figure 2024503343000003
Figure 2024503343000004
Figure 2024503343000005
Figure 2024503343000006
Figure 2024503343000007
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Figure 2024503343000012
一実施形態では、上述のプライマーセット及びプローブは、そのような細菌及びカンジダ種を含むと疑われる生物学的試料中の膣炎に関連する細菌及びカンジダ種の検出を提供するために使用される。一連のプライマー及びプローブは、配列番号１～１０２の核酸配列を含むか、又はそれからなる、それぞれの細菌及びカンジダ標的遺伝子の核酸配列に特異的なプライマー及びプローブを含むか、又はそれからなり得る。別の実施形態では、標的遺伝子のためのプライマー及びプローブは、配列番号１～１０２のプライマー及びプローブのいずれかの機能的に活性なバリアントを含むか、若しくはそれからなる。
配列番号１～１０２のプライマー及び／又はプローブのいずれかの機能的に活性な変異体は、開示される方法においてプライマー及び／又はプローブを使用することによって同定され得る。配列番号１～１０２のいずれかのプライマー及び／又はプローブの機能的に活性な変異体は、配列番号１～１０２のそれぞれの配列と比較して、記載の方法又はキットにおいて、類似する又はより高い特異性及び感度を提供するプライマー及び／又はプローブに関する。
変異体は、例えば、配列番号１～１０２のそれぞれの配列の５’末端及び／又は３’末端における１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失又は置換などの１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失又は置換によって、配列番号１～１０２の配列から変化し得る。上に詳述したように、プライマー（及び／又はプローブ）は化学的に修飾されていてもよく、すなわち、プライマー及び／又はプローブは修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。したがって、プローブ（又はプライマー）は改変オリゴヌクレオチドである。「改変ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類縁体」）は、いくつかの改変によって天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、依然として、塩基若しくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖若しくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分若しくはリン酸様部分、又はそれらの組み合わせからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を結合させて、「改変ヌクレオチド」を得ることができる。「ヌクレオチド」中の天然塩基は、例えば７－デアザプリンで置き換えられてもよく、そのようにしても「修飾ヌクレオチド」が得られる。用語「改変ヌクレオチド」又は「ヌクレオチド類似体」は、本出願において互換的に使用される。「改変ヌクレオシド」（又は「ヌクレオシド類縁体」）は、「改変ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類縁体」）について上に概説したように、何らかの改変によって天然のヌクレオシドとは異なる。
標的遺伝子をコードする核酸分子を増幅する修飾オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、例えば、ＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．Ｃａｓｃａｄｅ、コロラド州）のようなコンピュータプログラムを使用して設計され得る。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出（例えば、電気泳動によって）を容易にするための適切なサイズの増幅産物、一対のプライマーのメンバーに対する同様の融解温度、及び各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性でアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に忠実度が低下するほど長くはない）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは８～５０ヌクレオチド長（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８又は５０ヌクレオチド長）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、４０ヌクレオチド長以下である。
プライマーのセットに加えて、本方法は、標的細菌及びカンジダ種の存在又は非存在を検出するために１つ以上のプローブを使用し得る。「プローブ」という用語は、合成的又は生物学的に産生された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指し、これは、設計又は選択により、定義された所定のストリンジェンシーの下で特異的に（すなわち、優先的に）「標的核酸」に、この場合は標的遺伝子核酸にハイブリダイズすることを可能にする特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と称され得る。
いくつかの実施形態では、開示される標的遺伝子プローブは、少なくとも１つの蛍光標識で標識され得る。一実施形態では、標的遺伝子プローブは、ドナー蛍光部分、例えば蛍光色素、及び対応するアクセプター部分、例えばクエンチャーで標識し得る。一実施形態では、プローブは蛍光部分を含むか、又はそれからなり、核酸配列は配列番号３、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２９、３２、３５、３７、４０、４３、４６、５０、５３、５６、５９、６２又は６５を含むか、又はそれからなる。
プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の方法で行うことができる。実施形態は、増幅産物の検出のために単一のプローブ又は一対のプローブを使用することができる。実施形態に応じて、使用するプローブ（単数又は複数）は、少なくとも１つの標識及び／又は少なくとも１つのクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常、同様の融解温度を有し、各プローブの長さは、配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に忠実度が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に１５～４０（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）ヌクレオチド長である。
構築物は、それぞれが標的遺伝子プライマー及びプローブ核酸分子のうちの１つを含有するベクターを含み得る。構築物は、例えば、対照鋳型核酸分子として使用することができる。使用に適したベクターは、市販されている、及び／又は当技術分野で日常的な組換え核酸技術法によって製造される。標的遺伝子核酸分子は、例えば、化学合成、ＣＡからの直接クローニング、又はＰＣＲ増幅によって得ることができる。
本方法での使用に適した構築物は、典型的には、標的遺伝子核酸分子（例えば、配列番号１～３の１つ以上の配列を含む核酸分子）に加えて、所望の構築物及び／又は形質転換体を選択するための選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列、並びに複製起点を含む。ベクター系の選択は、通常、宿主細胞の選択、複製効率、選択性、誘導性及び回収の容易さを含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存する。
標的遺伝子核酸分子を含有する構築物を、宿主細胞内で増殖させ得る。本明細書で使用される宿主細胞という用語は、原核生物及び真核生物、例えば酵母、植物及び動物細胞を含むことを意味する。原核生物宿主としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。真核生物宿主としては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、ＣＯＳ細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、並びにアラビドプシス タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）及びニコチアナ タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）などの植物細胞が挙げられる。構築物を、当業者に一般的に知られている技術のいずれかを使用して宿主細胞に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション及びウイルス媒介核酸移入は、核酸を宿主細胞に導入するための一般的な方法である。更に、ネイキッドＤＮＡを細胞に直接送達することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号）。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号及び同第４，９６５，１８８号には、従来のＰＣＲ技術が開示されている。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態で有用なプライマーは、記載される標的ＮＧ遺伝子核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、又は合成的に生成することができる。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性される、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲで鋳型として使用することができるようにする前に、二本の鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、又は酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性する（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を超える変性）まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、並びに変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度及び核酸長などの反応の特徴に応じて、約９０℃～約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒間～４分間（例えば、１分～２分３０秒、又は１．５分）行われる。
二本鎖の鋳型核酸が熱により変性された場合、反応混合物を、記載される標的ＮＧ遺伝子核酸分子上のその標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却させる。アニーリングの温度は、通常、約３５℃～約６５℃、（例えば、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒～約１分（例えば、約２０秒～約５０秒、約３０秒～約４０秒）であり得る。次いで、ポリメラーゼの活性が促進又は最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こって、鋳型核酸に相補的な生成物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸鋳型にアニーリングされた各プライマーから伸長生成物を合成するのに充分でなくてはならないが、その相補的な鋳型から伸長生成物を変性させるほど高くすべきではない（例えば、伸長のための温度は、概して、約４０℃～約８０℃（例えば、約５０℃～約７０℃、約６０℃）の範囲である）。伸長時間は、約１０秒～約５分（例えば、約３０秒～約４分、約１分～約３分、約１分３０秒～約２分）であり得る。
ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡ又はＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などの核酸を用いることができる。鋳型核酸は精製される必要はなく、ヒト細胞に含まれる核酸などの複合混合物の微量画分であり得る。核酸分子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）に記載されているような日常的な技術によって生物学的試料から抽出され得る。核酸は、プラスミドなどの任意の数の供給源、又は細菌、酵母、原虫ウイルス、細胞小器官、又は植物若しくは動物などの高等生物を含む天然供給源から得ることができる。
オリゴヌクレオチドプライマーを、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と組み合わせる。例えば、鎖伸長反応には、一般に、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５～１．０μｇのプロト変性された鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ及び１０％ＤＭＳＯ）が含まれる。反応物は、通常、それぞれ１５０～３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、又はそれらの１つ以上の類似体を含有する。
新規に合成された鎖は、反応の後続工程で使用できる二本鎖分子を形成する。標的核酸分子に対応する所望の量の増幅産物を生成するために、鎖分離、アニーリング、及び伸長の工程を必要に応じて何度でも繰り返すことができる。反応の制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、及びヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリング工程（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長）は、好ましくは少なくとも１回繰り返される。検出での使用では、サイクリング工程の数は、例えば、試料の性質に応じる。試料が核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリングステップが必要となる。一般に、サイクリングステップは少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、又は１００回繰り返してもよい。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同大５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号）は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、可視化できるか又は他の方法で検出及び／又は定量することができる、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が起こるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分と、蛍光性であってもなくてもよく、光以外の形態で移動されたエネルギーを散逸させる対応するクエンチャーとを含有することができる。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光がアクセプター部分によってクエンチされるように、ドナー部分とアクセプター部分との間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，９９４，０５６号、及び同第６，１７１，７８５号に記載されている。一般的に使用されるドナー－アクセプター対は、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ対を包含する。一般的に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーククエンチャーは、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ノヴァト）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビル）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ－６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ、ミシガン州デクスタ）を包含する。
別の例では、それぞれが蛍光部分を含有する２つのオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物核酸にハイブリダイゼーションすると、ＦＲＥＴシグナルが生成される。ハイブリダイゼーション温度は、約１０秒間～約１分間、約３５℃～約６５℃の範囲であり得る。
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロイックミラー及び特定の範囲の蛍光発光を監視するためのフィルタを備える）、光子計数光電子増倍管システム、又は蛍光光度計を使用して行うことができる。エネルギー移動を開始するため、又は蛍光体の直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、光ファイバー光源、又は所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行うことができる。
ドナー部分及び対応するアクセプター部分「対応する」に関して本明細書で使用される場合、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有するアクセプター蛍光部分又はダーククエンチャーを指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。したがって、それらの間で効率的な非照射エネルギー移動を行い得る。
蛍光ドナー部分及び対応するアクセプター部分は、一般に、（ａ）高効率Ｆｏｒｓｔｅｒエネルギー移動、（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）、（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト；及び（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、レーザー線付近のその最大励起波長（例えば、ヘリウム－カドミウム４４２ｎｍ又はアルゴン４８８ｎｍ）、高い吸光係数、高い量子収率、及びその蛍光発光に対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するドナー蛍光部分を選択することができる。対応するアクセプター蛍光部分は、高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光部分の発光とのその励起の良好な重複、及び可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）の発光を有するものを選択することができる。
ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ－フィコエリトリン、９－アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４－アセトアミド－４’－イソチオ－シアナトスチルベン－２、２’－ジスルホン酸、７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン、スクシンミル１－ピレンブチレート、及び４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、又はランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユウロピウム、又はテルビウム）が挙げられる。ドナー蛍光部分及びアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティ）又はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得ることができる。
ドナー蛍光部分及びアクセプター蛍光部分を、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合することができる。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を及ぼすので、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離であり得る。一般に、リンカーアームは約１０Å～約２５Åである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、及び蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法も開示している。
ＬＣ Ｒｅｄ ６４０などのアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー（例えば、ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスターシティ）又はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手可能なＣ６－アミノホスホラミダイト）を含有するオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０標識オリゴヌクレオチドを生成することができる。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合させるためによく使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ又はＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アッシュランド）製のフルオレセイン－ＣＰＧ）、アミド－リンカー（ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サンラモン）製のＣＸ－フルオレセイン－ＣＰＧなどの、フルオレセイン－ＮＨＳ－エステル由来）、又はオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン－ＮＨＳ－エステルの結合を必要とする３’－アミノ－ＣＰＧが挙げられる。
リアルタイムＰＣＲによる検出
本開示は、生物学的又は非生物学的試料中の細菌及び真菌標的生物の存在又は非存在を検出する方法を提供する。提供される方法は、試料の汚染、偽陰性、及び偽陽性の問題を回避する。上記方法は、１つ以上のプライマー対を使用して試料からの標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施すること、及びＦＲＥＴ検出工程を含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで行われる。方法を、標的生物の存在を検出するためにプライマー及びプローブを使用して行うことができ、標的遺伝子の検出は、試料中の標的生物の存在を示す。
本明細書に記載されるように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を利用する標識ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出することができる。１つのＦＲＥＴフォーマットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用して、増幅産物の存在又は非存在、したがってＣＡの存在又は非存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば、１種の蛍光色素及び１種のクエンチャーで標識された１種の１本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用し、これは蛍光性であってもよく、そうなくてもよい。第１の蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、ＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分又はダーククエンチャーに移動する。第２の蛍光部分は、一般的には、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリングステップ中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階中に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分とが互いに空間的に分離される。結果として、クエンチャーの非存在下において第１の蛍光部分を励起すると、第１の蛍光部分からの蛍光発光を検出することができる。例として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、試料中のＮＧの存在又は非存在を検出するための本明細書に記載の方法を実施するのに適している。
ＦＲＥＴと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムＰＣＲ法を使用して増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部分及び第２の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部分は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造形成を可能にする配列（例えば、ヘアピン）を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内で二次構造が形成された結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部位が空間的に近接する。標的核酸（すなわち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分が互いに分離され、それにより、適切な波長の光による励起後、第１の蛍光部分の発光を検出することができる。
ＦＲＥＴ技術の別の一般的な形式は、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識することができ、一般に、標的ＤＮＡ分子（例えば、増幅産物）内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの光源によって４７０ｎｍで励起される。ＦＲＥＴの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ ６４０）又はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ ７０５）に伝達する。次いで、アクセプター蛍光部分はより長い波長の光を放出し、これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光学検出システムによって検出される。効率的なＦＲＥＴは、蛍光部分が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重なっている場合にのみ起こり得る。放出されたシグナルの強度は、元の標的ＤＮＡ分子の数（例えば、ＣＡゲノムの数）と相関させることができる。標的核酸の増幅が起こり、増幅産物が産生される場合、ハイブリダイズする工程は、プローブ対のメンバー間のＦＲＥＴに基づく検出可能なシグナルをもたらす。
一般に、ＦＲＥＴの存在は、試料中の標的生物の存在を示し、ＦＲＥＴの非存在は、試料中の標的生物の非存在を示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、又は特定の収集スワブ（アルギン酸カルシウム又はアルミニウムシャフト）の使用はいずれも、試験結果の成功及び／又は精度に影響を及ぼし得る条件である。本明細書に開示される方法を使用すると、例えば４５サイクリング工程内のＦＲＥＴの検出は標的生物（複数可）の存在を示す。
本方法の実施に使用することができる代表的な生物学的試料としては、限定されないが、膣スワブ、糞便検体、血液検体、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚及び軟部組織感染が挙げられる。生物学的試料の収集及び保存方法は、当業者に知られている。生物学的試料を処理して（例えば、当技術分野で公知の核酸抽出方法及び／又はキットによって）標的核酸を放出させ得、又は一部の場合には、生物学的試料をＰＣＲ反応成分及び適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させ得る。
融解曲線分析は、サイクルプロファイルに含めることができる追加の工程である。融解曲線分析は、ＤＮＡ二本鎖の半分が一本鎖に分離した温度として定義される融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特徴的な温度でＤＮＡが融解するという事実に基づいている。ＤＮＡの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、Ｇ及びＣヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子は、Ａ及びＴヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子よりも高いＴｍを有する。シグナルが失われる温度を検出することにより、プローブの融解温度を決定することができる。同様に、シグナルが発生する温度を検出することにより、プローブのアニール温度を決定することができる。増幅産物からのプローブの融解温度（複数可）により、試料中の標的生物（複数可）の有無を確認し得る。
各サーモサイクラーを運転している間に、対照試料も同様にサイクルすることができる。陽性対照試料は、例えば、対照プライマー及び対照プローブを使用して、（記載された標的遺伝子の増幅産物以外の）標的核酸対照鋳型を増幅することができる。陽性対照試料はまた、例えば、標的核酸分子を含むプラスミド構築物を増幅することができる。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマー及びプローブを使用して、内部で（例えば、試料内で）又は患者の試料と並んで実行される別々の試料で増幅し得る。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーション及び／又はＦＲＥＴ反応の成功又は失敗の指標である。各サーモサイクラー実行はまた、例えば、標的鋳型ＤＮＡを欠く陰性対照を含むことができる。陰性対照は汚染を測定することができる。これにより、システム及び試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照反応は、例えば、プライマーが配列特異性によりアニールし、伸長を開始する能力、並びにプローブが配列特異性によりハイブリダイズし、ＦＲＥＴが発生する能力を容易に決定することができる。
一実施形態では、本方法は、汚染を回避するステップを含む。例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、あるサーモサイクラー運転と次のサーモサイクラー運転との間の汚染を低減又は排除するために、米国特許第５，０３５，９９６号、同第５，６８３，８９６号及び同第５，９４５，３１３号に記載される。
ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用して、この方法を実施することができる。一実施形態では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲを記載している：国際公開第９７／４６７０７号、同第９７／４６７１４号、及び同第９７／４６７１２号。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用して動作させることができ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＮＴオペレーティングシステムを利用することができる。試料からのシグナルは、機械が光学ユニット上に毛細管を順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示することができる。蛍光取得時間は１０～１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリングステップの後、蛍光対サイクル数の定量的表示を、全ての試料について連続的に更新することができる。生成されたデータは、さらなる分析のために保存することができる。
ＦＲＥＴの代替として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ又はＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））のような二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて、増幅産物を検出することができる。二本鎖核酸との相互作用の際、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、適当な波長の光で励起した後、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いることもできる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。
本開示の実施形態は、１つ以上の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。
製造品／キット
本開示の実施形態はさらに、膣炎に関連する細菌及び真菌生物を検出するための製造品、組成物又はキットを提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、標的遺伝子を検出するために使用されるプライマー及びプローブを含み得る。組成物は、標的遺伝子を増幅するために使用されるプライマーを含むことができる。特定の実施形態では、組成物はまた、標的遺伝子を検出するためのプローブを含み得る。標的生物（複数可）を検出するための代表的なプライマー及びプローブは、標的核酸分子にハイブリダイズし得る。更に、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素及びＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーション及び検出に必要な適切に包装された試薬及び材料を含み得る。プライマー及びプローブを設計する方法が本明細書に開示され、増幅して標的核酸分子にハイブリダイズするプライマー及びプローブの代表的な例が提供される。
製造品はまた、プローブを標識するための１つ又は複数の蛍光部分を含むことができ、あるいは、キットと共に供給されるプローブを標識することができる。例えば、製造品は、プローブを標識するためのドナー及び／又はアクセプター蛍光部分を含み得る。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分の例を上に提供する。
製造品はまた、試料中の標的生物を検出するプライマー及びプローブを使用するための説明書を有する添付文書又は包装ラベルを含み得る。製造品及び組成物は、本明細書に開示される方法を実施するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、又は汚染を防止するための薬剤）を更に含み得る。そのような試薬は、本明細書に記載の市販の機器の１つに特異的であり得る。
本開示の実施形態は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定しない以下の実施例において更に説明される。
以下の実施例、表及び図は、主題の理解を助けるために提供されており、その主題の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。
実施例１ ＰＣＲアッセイ試薬及び条件
標的細菌及びカンジダ種のリアルタイムＰＣＲ検出は、ｃｏｂａｓ（登録商標）４８００システム又はｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムプラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）のいずれかを使用して行った。増幅試薬の最終濃度を以下に示す：
Figure 2024503343000013
以下の表は、ＰＣＲ増幅反応に使用される典型的な熱プロファイルを示す：
Figure 2024503343000014
Ｐｒｅ－ＰＣＲプログラムは、初期変性及びＲＮＡ鋳型の逆転写のための５５℃、６０℃及び６５℃でのインキュベーションを含んでいた。３種の温度でのインキュベーションは、より低い温度ではわずかにミスマッチした標的配列（生物の遺伝的変異体など）も転写されるが、より高い温度ではＲＮＡ二次構造の形成が抑制され、したがってより効率的な転写をもたらすという有利な効果を併せ持つ。ＰＣＲサイクリングを２つの測定に分け、いずれの測定も１段階の設定を適用する（アニーリングと伸長を組み合わせる）。５５℃での最初の５サイクルは、わずかにミスマッチした標的配列を予備増幅することによって包括性の増加を可能にするが、第２の測定の４５サイクルは、５８℃のアニーリング／伸長温度を使用することによって特異性を高める。
実施例２：アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）の増幅及び検出
アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）の標的遺伝子、２３ｓリボソームＲＮＡ及びｔｕｆＡの増幅及び検出は、実施例１に記載の条件を用いて行った。ＡＶＡＧ＿２３ｓ＿１アッセイのために、配列番号１４のフォワードプライマー、配列番号１５のリバースプライマー及び配列番号１６のプローブを使用した。ＡＶＡＧ＿ＴｕｆＡ＿２アッセイのために、配列番号１７のフォワードプライマー、配列番号１８のリバースプライマー及び配列番号１９のプローブを使用した。配列番号２０のフォワードプライマー、配列番号２１のリバースプライマー及び配列番号２２のプローブをＡＶＡＧ＿ＴｕｆＡ＿３アッセイに使用した。これらのプライマー及びプローブを、ＰＣＲ反応あたり１ｅ５、１ｅ４及び１ｅ３コピーの濃度で存在するゲノムＡ．ｖａｇｉｎａｅＤＮＡで試験した。実験の結果を、図１Ａの成長曲線及び図１Ｂの計算されたＣｔ値として示す。３つのアッセイは全て、Ａ．ｖａｇｉｎａｅの検出について良好な直線性を示した。
実施例３：ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の増幅及び検出
ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の増幅及び検出のために、３つの標的遺伝子を用いた５つのアッセイを実施した。ＧＶＡＧ＿Ｔｕｆ＿１アッセイ（配列番号１のフォワードプライマー、配列番号２のリバースプライマー、配列番号３のプローブ）及びＧＶＡＧ＿Ｔｕｆ＿２アッセイ（配列番号４のフォワードプライマー、配列番号２のリバースプライマー、配列番号３のプローブ）では、ｔｕｆ遺伝子を標的遺伝子として使用した。２３ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、ＧＶＡＧ＿２３ｓ＿５アッセイ（配列番号５のフォワードプライマー、配列番号６のリバースプライマー、配列番号７のプローブ）及びＧＶＡＧ＿２３ｓ＿７アッセイ（配列番号８のフォワードプライマー、配列番号９のリバースプライマー、配列番号１０のプローブ）の標的であった。ＧＶＡＧ＿１６ｓ＿１アッセイのために、配列番号１１のフォワードプライマー、配列番号１２のリバースプライマー及び配列番号１３のプローブを使用して、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅及び検出した。これらのプライマー及びプローブを、ＰＣＲ反応あたり１ｅ５、１ｅ４及び１ｅ３コピーの濃度で存在するゲノムＧ．ｖａｇｉｎａｌｉｓＤＮＡで試験し、結果をＣｔ値として表して図２に示す。
実施例４：ＢＶＡＢ－２の増幅及び検出
１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、ＢＶＡＢ－２の増幅及び検出のための標的遺伝子として使用し、以下のプライマー及びプローブを用いた３つのアッセイを行った：ＢＶＡＢ２＿１６ｓ＿１：配列番号３０のフォワードプライマー、配列番号３１のリバースプライマー、配列番号３２のプローブ；ＢＶＡＢ２＿１６ｓ＿３：配列番号３３のフォワードプライマー、配列番号３４のリバースプライマー、配列番号３５のプローブ；ＢＶＡＢ２＿１６ｓ＿４：配列番号３３のフォワードプライマー、配列番号３６のリバースプライマー、配列番号３７のプローブ。これらのアッセイは、ＰＣＲ反応あたり１ｅ５、１ｅ４及び１ｅ３コピーの濃度で存在する鋳型として１６ｓ ｒＲＮＡプラスミドを使用し、結果をＣｔ値として表して図３に示す。
実施例５：メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型の増幅及び検出
１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型の増幅及び検出のための標的遺伝子として使用し、以下のプライマー及びプローブを用いた３つのアッセイを行った：ＭＥＧＡ１＿１６ｓ＿２：配列番号２３のフォワードプライマー、配列番号２４のリバースプライマー、配列番号２５のプローブ；ＭＥＧＡ１＿１６ｓ＿４：配列番号２６のフォワードプライマー、配列番号２４のリバースプライマー、配列番号２５のプローブ；ＭＥＧＡ１＿１６ｓ＿６：配列番号２７のフォワードプライマー、配列番号２８のリバースプライマー、配列番号２９のプローブ。これらのアッセイは、ＰＣＲ反応あたり１ｅ５、１ｅ４及び１ｅ３コピーの濃度で存在する鋳型として１６ｓ ｒＲＮＡプラスミドを使用し、結果をＣｔ値として表して図４に示す。
実施例６：ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．の増幅及び検出
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．の増幅及び検出は、２つの標的遺伝子、２３ｓリボソームＲＮＡ（２３ｓ ｒＲＮＡ）及びＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）並びに４つのアッセイを利用した。各アッセイでは、以下のプライマー及びプローブを使用した：ＬＢＳ＿２３ｓ＿１：配列番号３８のフォワードプライマー、配列番号３９のリバースプライマー、配列番号４０のプローブ；ＬＢＳ＿２３ｓ＿２：配列番号４１のフォワードプライマー、配列番号４２のリバースプライマー、配列番号４３のプローブ；ＬＢＳ＿ＬＤＨ＿１：配列番号４４のフォワードプライマー、配列番号４７のリバースプライマー、配列番号４６のプローブ；ＬＢＳ＿ＬＤＨ＿２：配列番号４４のフォワードプライマー、配列番号４５のリバースプライマー、配列番号４６のプローブ。これらのプライマー及びプローブを、ＰＣＲ反応あたり１ｅ５、１ｅ４及び１ｅ３コピーの濃度で存在するゲノムラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＤＮＡで試験し、結果をＣｔ値として表して図５に示す。
実施例７ エガセラ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）ｓｐｐ．の増幅及び検出。
エガセラ・レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ）由来の１６ｓリボソームＲＮＡ（１６ｓ ｒＲＮＡ）を、エガセラ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）ｓｐｐ．のＤＮＡ増幅及び検出の標的として使用した。候補プライマー及びプローブ配列の選択は、エガセラ・レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ）、エガセラ・シネンシス（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、エガセラ・チモネンシス（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）及び未分類のエガセラ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）ｓｐ．に対する包含性、並びにアトポビウムｓｐｐ．、コリオバクテリウム・グロメランス（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、コリンセラ・バギナリス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、スラッカ・エキシガ（Ｓｌａｃｋｉａ ｅｘｉｇｕａ）、オルセネラ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）ｓｐｐ．、アセトミクロビウム・ファエカル（Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆａｅｃａｌｅ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｏｔｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ビフォドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）ｓｐｐ．、及びバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）に対する排他性に基づいた。配列番号８４、８５、８７及び８８のプライマー配列並びに配列番号８６及び８９のプローブ配列（表ＶＩＩＩ）を結果として選択した。
実施例８ プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）種の増幅及び検出。
プレボテラ・ビヴィア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｉｖｉａ）由来の１６ｓリボソームＲＮＡ（１６ｓ ｒＲＮＡ）を、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）ｓｐｐ．のＤＮＡ増幅及び検出の標的として使用した。候補プライマー及びプローブ配列の選択は、以下のプレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）種の包含性に基づいた：プレボテラ・アムニー（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｍｎｉｉ）、プレボテラ・ビヴィア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｉｖｉａ）、プレボテラ・ブカリス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｌｉｓ）、プレボテラ・コーポリス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｏｒｐｏｒｉｓ）、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）。プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）、プレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、プレボテラ・オリス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｏｒｉｓ）、プレボテラ・チモネンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）、プレボテラ・デンチコラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、プレボテラ・レオチー（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｌｅｏｓｃｈｅｉｉ）、プレボテラ・コーポリス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｏｒｐｏｒｉｓ）、プレボテラ・マシリエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、プレボテラ・バージェンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、プレオラリス（ボテラ・Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｏｒａｌｉｓ）、及びプレボテラ・ラスコライ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｌａｓｃｏｌａｉｉ）。候補プライマー及びプローブ配列はまた、リフケネラ科（Ｒｉｆｋｅｎｎｅｌｌａｃｅａｅ）、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄａｃｅａｅ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、スネアシア・アムニイ（Ｓｎｅａｔｈｉａ ａｍｎｉｉ）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）及びバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）に対する排他性に基づいた。配列番号９０～９３及び９５～１００のプライマー配列並びに配列番号９４、１０１～１０２（表ＩＸ）のプローブ配列を結果として選択した。
実施例９：カンジダｓｐｐ．の増幅及び検出。
リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子は、試料中のＶＶＣ関連カンジダ種の存在、非存在及び／又はレベルを検出するためのＤＮＡ増幅の標的遺伝子として使用される。ＣＡＰＴ＿ｒＲＮＡ＿１及びＣＡＰＴ＿ｒＲＮＡ＿６アッセイでは、ＶＶＣ関連カンジダ種は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ及びＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（総称してカンジダｓｐｐ．）を含む。ＣＡＰＴ＿ｒＲＮＡ＿１アッセイは、配列番号５４のフォワードプライマー、配列番号５５のリバースプライマー及び配列番号５６のプローブを使用する。ＣＡＰＴ＿ｒＲＮＡ＿６アッセイは、配列番号５７のフォワードプライマー、配列番号５８のリバースプライマー及び配列番号５９のプローブを使用する。両方のアッセイを、ＰＣＲ反応あたり２．５ｅ６、２．５ｅ５及び２．５ｅ４コピーの濃度でＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ及びＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のゲノムＤＮＡを用いて試験し、結果をＣｔ値として表して図６に示す。
ｒＲＮＡ遺伝子は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）を標的とするＣＶＳ＿ｒＲＮＡ＿１及びＣＶＳ＿ｒＲＮＡ＿２アッセイにおける標的遺伝子としても使用された。ＣＶＳ＿ｒＲＮＡ＿１アッセイは、配列番号４８のフォワードプライマー、配列番号４９のリバースプライマー及び配列番号５０のプローブを使用する。ＣＶＳ＿ｒＲＮＡ＿２アッセイは、配列番号５１のフォワードプライマー、配列番号５２のリバースプライマー及び配列番号５３のプローブを使用する。両方のアッセイを、ＰＣＲ反応あたり２．５ｅ６、２．５ｅ５及び２．５ｅ４コピーの濃度でＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａ由来のゲノムＤＮＡを用いて試験し、結果をＣｔ値として表して図７に示す。
実施例１０ マルチプレックスＰＣＲアッセイ
３つのＢＶ関連細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、並びに、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）を含むカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｓｐｐ．を同時に検出するマルチプレックスＰＣＲ単一ウェルアッセイを、４つの異なる検出チャネルを使用して行った。第１のチャネルは、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の１６ｓ ｒＲＮＡを検出する。第２のチャネルは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．のＤ－ＬＤＨ遺伝子を検出する。第３のチャネルは、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）のｔｕｆＡ遺伝子を検出する。第４のチャネルは、カンジダｓｐｐ．の２５ｓ ｒＲＮＡ、並びにカンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）のｒＲＮＡ ＩＴＳセグメントを含む複数のカンジダを検出する。マルチプレックスアッセイで使用されるプライマーとプローブの選択された組み合わせセットを表ＸＩＩに示す。
Figure 2024503343000015
ＰＣＲアッセイ試薬及び条件を実施例１に記載のように使用し、１０，０００（１０Ｋ）及び１，０００（１Ｋ）コピーで様々な鋳型試料に対して試験した実験の結果を、チャネル１、２、３及び４についてそれぞれ図８、９、１０及び１１（カンジダ種のみの場合）の増殖曲線として示す。
前述の発明を明確化及び理解するためにある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更を行うことができることが当業者には明らかであろう。例えば、上述した全ての技術及び装置を、様々な組み合わせで使用することができる。

Claims (18)

  1. 試料中の複数の細菌性膣炎関連（ＢＶ関連）細菌を検出する方法であって、前記複数のＢＶ関連細菌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、並びにアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型、エガセラ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）ｓｐｐ．、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）ｓｐｐ．及び細菌性膣炎関連細菌ＢＶＡＢ－２から選択される群の少なくとも１つであり、前記方法が、
    ａ）前記試料をプライマーセットと接触させて、前記ＢＶ関連細菌由来の核酸が前記試料中に存在する場合に増幅産物を産生することを含む、増幅工程を実施すること；
    ｂ）各増幅産物を１つ又は複数の検出可能なプローブと接触させることを含む、ハイブリダイズ工程を実施すること；及び
    ｃ）各増幅産物の存在を検出することであって、前記増幅産物の存在は、前記試料中の前記ＢＶ関連細菌の存在を示す、各増幅産物の存在を検出すること
    を含み、
    ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号３８、４１又は４４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号３９、４２又は４５、４７又は７３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号４０、４３、４６及び７４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み；
    ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号１、４、５、８又は１１から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２、６、９、又は１２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３、７、１０及び１３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み；
    アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号１４、１７、２０、６７又は７０から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５、１８、２１、６８又は７１から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号１６、１９、２２、６６、６９及び７２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み；
    メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）１型から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号２３、２６又は２７から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４又は２８から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号２５及び２９から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み；
    エガセラ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）ｓｐｐ．から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号８４又は８７から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号８５又は８８から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号８６及び８９から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み；
    プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）ｓｐｐ．から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号９０、９５、９６又は９７から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号９１、９２、９３、９８、９９又は１００から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号９４、１０１及び１０２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み；
    ＢＶＡＢ－２から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号３０又は３３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号３１、３４又は３６から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号３２、３５及び３７から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、方法。
  2. 前記複数のＢＶ関連細菌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、及びアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）であり；
    ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号３８、４１又は４４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号３９、４２又は４５、４７又は７３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号４０、４３、４６及び７４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み；
    ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号１、４、５、８又は１１から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２、６、９、又は１２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３、７、１０及び１３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み；
    アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号１４、１７、２０、６７又は７０から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５、１８、２１、６８又は７１から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号１６、１９、２２、６６、６９及び７２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
  3. ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号４４のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４５のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号４６のオリゴヌクレオチド配列を含み；
    ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号１１のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１２のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号１３のオリゴヌクレオチド配列を含み；
    アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号２０のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号７２のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ハイブリダイズ工程が、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識された前記検出可能なプローブと前記増幅産物とを接触させることを含み、前記検出工程が、前記プローブの前記ドナー蛍光部分と前記アクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、蛍光の存在又は非存在が、前記試料中の前記ＢＶ関連細菌の存在又は非存在を示す、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記増幅工程が、５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 試料中の外陰膣カンジダ症（ＶＶＣ）関連カンジダ種を検出する方法であって、前記ＶＶＣ関連カンジダ種が、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）及びカンジダ・パラプローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（総称してカンジダｓｐｐ．と呼ばれる）、並びにカンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）を含み、前記方法が、
    ａ）前記試料をプライマーセットと接触させて、前記ＶＶＣ関連カンジダ由来の核酸が前記試料中に存在する場合に増幅産物を産生することを含む、増幅工程を実施すること；
    ｂ）各増幅産物を１つ又は複数の検出可能なプローブと接触させることを含む、ハイブリダイズ工程を実施すること；及び
    ｃ）各増幅産物の存在を検出することであって、前記増幅産物の存在は、前記試料中の前記ＶＶＣ関連カンジダの存在を示す、各増幅産物の存在を検出すること
    を含み、
    カンジダｓｐｐ．から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号４８、５１、５４、５７又は７６から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４９、５２、５５、５８又は７７から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号５０、５３、５６、５９、７５及び７８から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み；
    カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号６０、７９又は８２から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号６１、８０又は８３から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号６２及び８１から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み；
    カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号６３のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号６４のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号６５のオリゴヌクレオチド配列を含む、方法。
  7. カンジダｓｐｐ．から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号７６のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号７７のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号７８のオリゴヌクレオチド配列を含み；カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号７９のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号８０のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号８１のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ハイブリダイズ工程が、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識された前記検出可能なプローブと前記増幅産物とを接触させることを含み、前記検出工程が、前記プローブの前記ドナー蛍光部分と前記アクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、蛍光の存在又は非存在が、前記試料中の前記ＶＶＣ関連カンジダの存在又は非存在を示す、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 前記増幅工程が、５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 試料中のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、並びに、カンジダｓｐｐ．、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）から選択される群の少なくとも１つを同時に検出する方法であって、
    ａ）前記試料をプライマーセットと接触させて、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、並びに、カンジダｓｐｐ．、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）から選択される群の少なくとも１つに由来する核酸が前記試料中に存在する場合に増幅産物を産生することを含む、増幅工程を実施すること；
    ｂ）各増幅産物を１つ又は複数の検出可能なプローブと接触させることを含む、ハイブリダイズ工程を実施すること；及び
    ｃ）各増幅産物の存在を検出することであって、前記増幅産物の存在は、前記試料中のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）、並びに、カンジダｓｐｐ．、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）から選択される群の少なくとも１つの存在を示す、各増幅産物の存在を検出すること
    を含み、
    ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号４４のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４５のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号４６のオリゴヌクレオチド配列を含み；ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号１１のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１２のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号１３のオリゴヌクレオチド配列を含み；アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号２０のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号７２のオリゴヌクレオチド配列を含み；
    カンジダｓｐｐ．から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号７６のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号７７のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号７８のオリゴヌクレオチド配列を含み；カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号７９のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号８０のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号８１のオリゴヌクレオチド配列を含み；カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）から増幅産物を産生するための前記プライマーセットが、配列番号６３のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号６４のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記１つ又は複数の検出可能なプローブが、配列番号６５のオリゴヌクレオチド配列を含む、方法。
  11. 試料中の細菌性膣炎関連（ＢＶ関連）細菌を検出するためのキットであって、
    － 配列番号１、４、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２７、３０、３３、３８、４１、４４、６７、７０、８４、８７、９０、９５、９６、及び９７からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、
    － 配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２８、３１、３４、３６、３９、４２、４５、４７、６８、７１、７３、８５、８８、９１、９２、９３、９８、９９、及び１００からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーと、
    － 配列番号３、７、１０、１３、１６、６６、６９、１９、２２、７２、２５、２９、３２、３５、３７、４０、４３、４６、７４、８６、８９、９４、１０１、及び１０２からなる群から選択される第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むプローブと
    を含み、前記プローブが、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーによって生成されるアンプリコンにハイブリダイズするように構成されている、キット。
  12. 前記第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド配列が、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分を含む、請求項１１に記載のキット。
  13. ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び前記核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液をさらに含む、請求項１１又は１２に記載のキット。
  14. 前記第１のオリゴヌクレオチド配列、前記第２のオリゴヌクレオチド配列、及び前記第３のオリゴヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のキット。
  15. 試料中の外陰膣カンジダ症（ＶＶＣ）関連カンジダ種を検出するためのキットであって、
    － 配列番号４８、５１、５４、５７、７６、６０、７９、８２、及び６３からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、
    － 配列番号４９、５２、５５、５８、７７、６１、８０、８３、及び６４からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーと、
    － 配列番号５０、５３、７５、５６、５９、７８、６２、８１、及び６５からなる群から選択される第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むプローブと
    を含み、前記プローブが、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーによって生成されるアンプリコンにハイブリダイズするように構成されている、キット。
  16. 前記第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド配列が、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分を含む、請求項１５に記載のキット。
  17. ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び前記核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液をさらに含む、請求項１５又は１６に記載のキット。
  18. 前記第１のオリゴヌクレオチド配列、前記第２のオリゴヌクレオチド配列、及び前記第３のオリゴヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のキット。
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