JP2023508100A - メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
生物学的サンプルまたは非生物学的サンプル中のｍｅｃＡおよび／またはｍｅｃＣ含有黄色ブドウ球菌（ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ）の存在または非存在の迅速な検出のための方法を記載する。方法は、増幅工程、ハイブリダイズス工程、および検出工程を実施することを含み得る。さらに、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよびｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの遺伝子を標的とするプライマー、プローブ、ならびにｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出のために設計されたキットが提供される。
Description
発明の分野
本開示は、細菌診断の分野に関し、より詳細には、ｍｅｃＡおよびｍｅｃＣ核酸配列を含有するメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の検出に関する。
本開示は、細菌診断の分野に関し、より詳細には、ｍｅｃＡおよびｍｅｃＣ核酸配列を含有するメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の検出に関する。
発明の背景
スタフィロコッカス・アウレウス（「黄色ブドウ球菌」または「ＳＡ」）は通性嫌気性のグラム陽性菌であり、その天然の貯蔵部はヒトの皮膚および鼻を含み、創傷部にも生息し得る。黄色ブドウ球菌を保有するほとんどの人々は感染の兆候を示さない。しかし、黄色ブドウ球菌は、正常な障壁が破られると侵襲性になり、体内で感染症を引き起こす可能性がある。黄色ブドウ球菌は、吹き出物、おでき、および膿瘍などの軽微な皮膚感染症から、肺炎、髄膜炎、および敗血症などの主要な疾患に及ぶ多数の病気を引き起こす可能性がある。皮膚および鼻以外の組織は、障壁、例えば、皮膚または粘膜の内層が破られると感染する可能性があり、これは、フルンケル（ｆｕｒｕｎｃｌｅ）および癰（ｃａｒｂｕｎｃｌｅｓ）をもたらす。黄色ブドウ球菌感染症は、感染者との皮膚接触または感染者が使用する物体との接触を通して人々の間で広がり得る。
スタフィロコッカス・アウレウス（「黄色ブドウ球菌」または「ＳＡ」）は通性嫌気性のグラム陽性菌であり、その天然の貯蔵部はヒトの皮膚および鼻を含み、創傷部にも生息し得る。黄色ブドウ球菌を保有するほとんどの人々は感染の兆候を示さない。しかし、黄色ブドウ球菌は、正常な障壁が破られると侵襲性になり、体内で感染症を引き起こす可能性がある。黄色ブドウ球菌は、吹き出物、おでき、および膿瘍などの軽微な皮膚感染症から、肺炎、髄膜炎、および敗血症などの主要な疾患に及ぶ多数の病気を引き起こす可能性がある。皮膚および鼻以外の組織は、障壁、例えば、皮膚または粘膜の内層が破られると感染する可能性があり、これは、フルンケル（ｆｕｒｕｎｃｌｅ）および癰（ｃａｒｂｕｎｃｌｅｓ）をもたらす。黄色ブドウ球菌感染症は、感染者との皮膚接触または感染者が使用する物体との接触を通して人々の間で広がり得る。
黄色ブドウ球菌は、ペニシリン（メチシリン、オキサシリン、クロキサシリンおよびフルクロキサシリン）を含む主要な抗生物質に対する耐性を発現する顕著な能力を有し、これにより「スーパーバグ」というラベルを得ている。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、ペニシリンに対して耐性になった細菌であり、処置が困難ないくつかのヒト感染症の原因である。ＭＲＳＡは、オキサシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＯＲＳＡ）および多剤耐性黄色ブドウ球菌としても知られているが、黄色ブドウ球菌の非メチシリン耐性株は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）と呼ばれることもある。
ブドウ球菌のメチシリン耐性に必要な遺伝子ｍｅｃＡは、低親和性ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）をコードする（Ｎｉｅｍｅｙｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９９６），１７８（１８）：５４６４－５４７１）。ｍｅｃＣと新たに命名されたｍｅｃＡの新規バリアント（ｍｅｃＡLGA251）は、最近、ヒトおよび動物の両方からの黄色ブドウ球菌分離株で同定された（Ｈａｒｒｉｓｏｎら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，（２０１３），５７（３）：１５２４－１５２８）。この同族体は、ｍｅｃＡ遺伝子と７０％のヌクレオチド同一性を共有しており、その存在は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌と誤診される可能性があるという診断上の問題を引き起こす（Ｐａｔｅｒｓｏｎら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（２０１４），２２（１）：４２－４７）したがって、ｍｅｃＡ含有ＭＲＳＡおよびｍｅｃＣ含有ＭＲＳＡの両方を高感度様式で特異的に検出するための迅速かつ信頼性の高い方法が当技術分野において必要とされている。
発明の概要
本開示の特定の実施形態は、生物学的サンプルまたは非生物学的サンプル中のｍｅｃＡまたはｍｅｃＣ含有黄色ブドウ球菌（ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ）の存在または非存在の迅速な検出、例えば、単一の試験管でのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によるｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの多重検出のための方法に関する。実施形態は、増幅工程およびハイブリダイズ工程を含み得る少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含む、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出方法を含む。さらに、実施形態は、単一の試験管内のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出のために設計されたプライマー、プローブおよびキットを含む。検出方法は、ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＣ遺伝子を標的とするように設計され、これにより、１回の試験でｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出することが可能になる。
本開示の特定の実施形態は、生物学的サンプルまたは非生物学的サンプル中のｍｅｃＡまたはｍｅｃＣ含有黄色ブドウ球菌（ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ）の存在または非存在の迅速な検出、例えば、単一の試験管でのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によるｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの多重検出のための方法に関する。実施形態は、増幅工程およびハイブリダイズ工程を含み得る少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含む、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出方法を含む。さらに、実施形態は、単一の試験管内のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出のために設計されたプライマー、プローブおよびキットを含む。検出方法は、ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＣ遺伝子を標的とするように設計され、これにより、１回の試験でｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出することが可能になる。
一態様では、サンプル中のｍｅｃＡおよび／またはｍｅｃＣ－含有黄色ブドウ球菌を検出する方法であって、サンプル中にｍｅｃＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡが存在する場合、サンプルを、一対のｍｅｃＡ－ＭＲＳＡプライマーおよび／または一対のｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーと接触させて増幅産物を産生させることを含む、増幅工程を実施すること；増幅産物を、１つ以上の検出可能なｍｅｃＡ－ＭＲＳＡプローブおよび／または１つ以上の検出可能なｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブと接触させることを含む、ハイブリダイズ工程を実施すること；および増幅産物の存在または非存在を検出する工程であって、増幅産物の存在は、サンプル中のｍｅｃＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在を示し、増幅産物の非存在は、ｍｅｃＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの非存在を示す、増幅産物の存在または非存在を検出する工程を含む、方法が提供される。本明細書において、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡプライマーの対は、配列番号１の核酸配列またはその相補体を含むかまたはそれからなるフォワードプライマー、および配列番号２の核酸配列またはその相補体を含むかまたはそれからなるリバースプライマーを含み得るかまたはそれからなり得；および／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーの対は、配列番号３もしくは４からなる群から選択される核酸配列またはその相補体を含むかまたはそれからなるフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列またはその相補体を含むかまたはそれからなるリバースプライマーとを含み得るかまたはそれからなり得る。さらに、１つ以上の検出可能なｍｅｃＡ－ＭＲＳＡプローブは、配列番号６の核酸配列またはその相補体を含み得るかまたはそれからなり得、および／または１つ以上の検出可能なｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブは、配列番号７の配列またはその相補体を含み得るかまたはそれからなり得る。
一態様では、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ遺伝子標的の増幅のためのプライマーセットは、配列番号１、２、３、４および５の核酸配列またはその相補体を含み、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ増幅産物の検出のための検出可能プローブは、配列番号６および７の核酸配列またはその相補体を含む。
別の態様は、配列番号１、２、３、４、５、６、および７から選択される核酸配列またはその相補体を含むかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチドであって、１００個以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを提供する。別の態様では、本開示は、配列番号１、２、３、４、５、６および７のうちの１つと少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％など）を有する核酸、またはその相補体を含むオリゴヌクレオチドであって、１００個以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを提供する。一般に、これらのオリゴヌクレオチドは、これらの実施形態では、プライマー核酸、プローブ核酸などであり得る。これらの実施形態の一定のものでは、オリゴヌクレオチドは４０個以下のヌクレオチド（例えば、３５個以下のヌクレオチド、３０個以下のヌクレオチドなど）を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、非修飾ヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーション安定性を変化させるために、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。必要に応じて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識および／または少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの保存的に修飾された変異を含む。特定の核酸配列の「保存的に修飾された変異」または単に「保存的変異」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。当業者であれば、コードされた配列中の単一のアミノ酸または少量のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には４％、２％または１％未満）を変更、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加は、修飾がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的修飾変異」であることを認識するであろう。
一態様では、増幅は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用し得る。したがって、第１および第２の蛍光部分は、プローブの長さに沿って互いに８ヌクレオチド以内であり得る。別の態様では、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよびｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブは、二次構造形成を可能にする核酸配列を含む。そのような二次構造の形成は、一般に、第１の蛍光部分と第２の蛍光部分との間の空間的近接をもたらす。該方法によれば、プローブ上の第２の蛍光部分はクエンチャーであり得る。
本開示は、個体由来の生物学的サンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在または非存在を検出する方法を提供する。そのような方法は、一般に、増幅工程および色素結合工程を含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含む。典型的には、増幅工程は、サンプル中にｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸分子が存在する場合、サンプルを複数対のｍｅｃＡ－ＭＲＳＡプライマーおよびｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーと接触させて１つ以上のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ増幅産物を産生することを含み、色素結合工程は、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ増幅産物を二本鎖ＤＮＡ結合色素と接触させることを含む。そのような方法はまた、増幅産物への二本鎖ＤＮＡ結合色素の結合の存在または非存在を検出することを含み、ここで、結合の存在はサンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在を示し、結合の非存在はサンプル中のｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの非存在を示す。代表的な二本鎖ＤＮＡ結合色素は、臭化エチジウムである。さらに、そのような方法はまた、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ増幅産物と二本鎖ＤＮＡ結合色素との間の融解温度を測定することを含み得、融解温度により、ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在または非存在が確認される。
さらなる態様では、ｍｅｃＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの１つ以上の核酸を検出するためのキットが提供される。キットは、ｍｅｃＡ遺伝子標的および／またはｍｅｃＣ遺伝子標的の増幅に特異的なｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーの複数のセット；およびｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ増幅産物の検出に特異的な１つ以上の検出可能なｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブを含み得る。一態様では、キットは、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分で既に標識されたプローブを含み得、またはプローブを標識するための蛍光部分を含み得る。キットはまた、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼおよび核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液をさらに含み得る。キットはまた、添付文書、ならびにサンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在または非存在を検出するためのプライマー、プローブおよび蛍光色素部分を使用するための説明書を含み得る。本明細書において、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡプライマーの対は、配列番号１の核酸配列またはその相補体を含むかまたはそれからなるフォワードプライマー、および配列番号２の核酸配列またはその相補体を含むかまたはそれからなるリバースプライマーを含み得るかまたはそれからなり得；および／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーの対は、配列番号３もしくは４またはその相補体からなる群から選択される核酸配列を含むかまたはそれからなるフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列またはその相補体を含むかまたはそれからなるリバースプライマーとを含み得るかまたはそれからなり得る。さらに、１つ以上の検出可能なｍｅｃＡ－ＭＲＳＡプローブは、配列番号６の核酸配列またはその相補体を含み得るかまたはそれからなり得、および／または１つ以上の検出可能なｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブは、配列番号７の配列またはその相補体を含み得るかまたはそれからなり得る。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が本主題の実施または試験で使用され得るが、好適な方法および材料が以下に記載される。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。矛盾する場合は、定義をも含む本明細書が優先する。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、図面および発明を実施するための形態、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
核酸増幅によるＭＲＳＡ感染の診断により、細菌感染を迅速かつ正確に検出するための方法が提供される。サンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出するためのリアルタイムアッセイが本明細書中に記載される。ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出するためのプライマーおよびプローブが提供され、そのようなプライマーおよびプローブを含有する製造品またはキットも提供される。他の方法と比較してｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出のためのリアルタイムＰＣＲの感度の増加、ならびにサンプルの封じ込めおよび増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの改善された特徴により、臨床検査室におけるｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ感染の日常的な診断のためのこの技術の実施が実現可能になる。
核酸増幅によるＭＲＳＡ感染の診断により、細菌感染を迅速かつ正確に検出するための方法が提供される。サンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出するためのリアルタイムアッセイが本明細書中に記載される。ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出するためのプライマーおよびプローブが提供され、そのようなプライマーおよびプローブを含有する製造品またはキットも提供される。他の方法と比較してｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出のためのリアルタイムＰＣＲの感度の増加、ならびにサンプルの封じ込めおよび増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの改善された特徴により、臨床検査室におけるｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ感染の日常的な診断のためのこの技術の実施が実現可能になる。
メチシリン耐性遺伝子ｍｅｃＡおよびその同族体であるｍｅｃＣは両方とも、β－ラクタム環（ペニシリン、セファロスポリンおよびカルバペネムなどのβ－ラクタム抗生物質の一次活性部位）に対する親和性が低下したペニシリン結合タンパク質である変化したメチシリン耐性ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ２ａまたはＰＢＰ２’）をコードし（Ｇｕｉｇｎａｒｄら，２００５，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５（５）：４７９－８９）、これは感受性株には存在せず、遠縁の種から得られたと考えられている。ｍｅｃＡおよびｍｅｃＣが、いずれもＭＲＳＡ株の可動性遺伝要素であるブドウ球菌染色体カセットｍｅｃ（ＳＣＣｍｅｃ）上に担持される。ＳＣＣエレメントは、感受性黄色ブドウ球菌にも存在するが、ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＣ遺伝子を保有していないか、または非機能性ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＣ遺伝子を保有している。そのような株は、同じ右端接合部を有し得るため、偽陽性結果の原因となり得る。
ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＣ遺伝子および黄色ブドウ球菌特異的遺伝子を検出することによる鼻検体からのＭＲＳＡ検出は、様々な量の非耐性黄色ブドウ球菌およびメチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＭＲＣｏＮＳ）の両者の存在に起因して、陽性予測値（ＰＰＶ）が低下する。これらの組み合わせは、両方の標的が存在するため、ＭＲＳＡと区別できない。ＭＲＳＡの有病率に応じて、この状況は最大３０％の偽陽性結果をもたらす。より良好なＰＰＶのために、選択された標的はＭＲＳＡに対して特有のものである必要がある。現在知られている唯一の標的はブドウ球菌染色体カセット（ＳＣＣｍｅｃ）であり、これはｍｅｃＣ遺伝子を有する遺伝因子のトランスポゾン組込み部位を増幅する。
ＭＲＳＡのＳＣＣエレメントであるＳＣＣｍｅｃ（機能的ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＣ遺伝子を有する）は、ｍｅｃＣ遺伝子を含有する黄色ブドウ球菌（ｏｒｆＸ）由来のオープンリーディングフレームＸの３’部分に組み込まれた高度に可変な長さ（１６ｋｂ～６７ｋｂ）のトランスポゾンである。ＯｒｆＸは、黄色ブドウ球菌において定義された機能を有さず、黄色ブドウ球菌に特有である。ＳＣＣｍｅｃの統合により、ＭＲＳＡに特有のサインが作り出される。
ＳＣＣｍｅｃエレメントは、２つの必須成分；ｃｃｒ遺伝子複合体（ｃｃｒ）およびｍｅｃ遺伝子複合体（ｍｅｃ）を有する。ｃｃｒ遺伝子複合体はｃｃｒ遺伝子および周囲のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から構成され、ｍｅｃ遺伝子複合体はｍｅｃＣ遺伝子、調節遺伝子、およびｍｅｃＣの上流または下流の挿入配列から構成される。
ＭＲＳＡの分類は、ＭＲＳＡの種々の遺伝子型に基づき得る。遺伝子型に基づくＭＲＳＡ検出および分類のための１つの標的は、ＳＣＣｍｅｃの右端接合部（ＲＥ）であり得る。したがって、ＭＲＳＡタイピングのこの方法は、ＲＥ（ＳＣＣｍｅｃの右端）タイピングと呼ばれる。このタイピング法は、様々な種類のＳＣＣｍｅｃのうち、インテグレーション部位に隣接するＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの右端の多型を利用したものである。
ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ含有黄色ブドウ球菌（ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ）の検出は、黄色ブドウ球菌のｏｒｆＸ遺伝子と、メチシリンに対する耐性を付与するｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＣ遺伝子を保有するＳＣＣｍｅｃとの間のＲＥ接合部にアンプリコンを産生する戦略を利用する。これを達成するために、一方のプライマーを黄色ブドウ球菌のｏｒｆＸ遺伝子の高度に保存された領域に固定し（ｏｒｆＸプライマー）、第２のプライマーをＳＣＣｍｅｃの非保存ＲＥ接合部内に配置する（ＲＥプライマー）。２つのプライマーから得られたアンプリコンは、ｏｒｆＸ遺伝子の一部およびＳＣＣｍｅｃの一部に及ぶ。ＲＥ接合部におけるＳＣＣｍｅｃの非相同的性質のために、独特のＭＲＳＡ株の大部分適用範囲を達成するためには、いくつかの異なるＲＥプライマーが必要である。ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡのこのタイプの同定および検出は、いくつかのグループによって、例えば、Ｈｕｌｅｔｓｋｙらによる米国特許第７，４４９，２８９号および米国特許第７，８３８，２２１号；Ａｉｃｈｉｎｇｅｒらによる米国特許第８，５３５，８８８号；Ｊｏｈｎｓｏｎらによる米国特許第９，９２０，３８１号および米国特許第１０，１９０，１７８号に記載されており、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。しかしながら、前述のように、この戦略は、ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＣ遺伝子が欠損している（完全または部分的に）か、または機能的でない場合、偽陽性結果の原因となり得る。
開示される方法は、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーの１つ以上の対を使用して、サンプルからのｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸分子遺伝子標的の１つ以上の部分を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含み得る。本明細書で使用される「ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡプライマー」または「ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマー」は、ＳＣＣｍｅｃカセット内のＭＲＳＡ中のｍｅｃＡまたはｍｅｃＣをコードする核酸配列に特異的にアニーリングし、適切な条件下でそこからＤＮＡ合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。検討されるｍｅｃＡ－ＭＲＳＡまたはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーの各々は、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含有するように、それぞれのｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ標的核酸分子内またはそれに隣接する標的にアニーリングする。１つ以上のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ増幅産物は、１つ以上のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ核酸がサンプル中に存在るという条件で産生され、したがって１つ以上のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ増幅産物の存在がサンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在を示す。増幅産物は、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡまたはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ用の１つ以上の検出可能プローブに相補的な核酸配列を含むであろう。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程および検出工程を含み、サンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在または非存在を検出するために、サンプルをｍｅｃＡ－ＭＲＳＡまたはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ用の１つ以上の検出可能プローブと接触させる。
本明細書で使用される場合、「増幅する」という用語は、鋳型核酸分子（例えば、ｍｅｃＡまたはｍｅｃＣ）の一方または両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、鋳型核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーを鋳型核酸にアニーリングすること、および増幅産物を生成するためにプライマーから酵素的に伸長することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）ならびにポリメラーゼ酵素の最適な活性のための適切な緩衝液および／または補因子（例えば、ＭｇＣｌ2および／またはＫＣｌ）の存在が必要である。
本本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に知られており、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドだけでなく、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライミング」し得る修飾オリゴヌクレオチド、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’－ＯＨ基を提供し、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される３’→５’ホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによって更に「ヌクレオチド」が結合され得ることを指す。したがって、おそらく意図された機能を除いて、「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「プローブ」の間に基本的な違いはない。
「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への１つ以上のプローブのアニーリングを指す。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
「５’→３’ヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、該酵素は、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・ルーバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ、サーマス・サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティスク（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、サーマス・ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびメタノサーマス・ファービダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離されている。それにもかかわらず、酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをＰＣＲアッセイに使用することもできる。
「その相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであり、正確に相補的である核酸を指す。
核酸に関して使用される場合の「伸長」または「延長」という用語は、追加のヌクレオチド（または他の類似の分子）が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、核酸は、典型的には核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼなどの生体触媒を組み込むヌクレオチドによって必要に応じて伸長される。
２つ以上の核酸配列の状況における「同一」または「パーセント同一性」という用語は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または目視検査によって測定された最大の一致について、比較またはアラインした場合、同一であるか、または同一のヌクレオチド特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適した例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）「Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，Ｇｉｓｈら（１９９３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２，Ｍａｄｄｅｎら（１９９６）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１，Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，およびＺｈａｎｇら（１９９７）「ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６に開示され、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
オリゴヌクレオチドに関して「修飾ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置き換えられる変化を指す。本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて置換され得る例示的な修飾ヌクレオチドとしては、例えば、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類縁体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－０－メチルリボーＵ、２’－０－メチルリボーＣ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、Ｎ６－メチル－ｄＡなどが挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の修飾ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、または当技術分野で知られている。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド置換は、対応する修飾されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、該オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を修飾する。更に説明すると、特定の修飾ヌクレオチド置換は、いくつかの実施形態では、非特異的核酸増幅（例えば、プライマーダイマー形成などを最小限に抑える）を減少させ、意図する標的アンプリコンの収率を増加させることなどができる。これらのタイプの核酸修飾の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。
ｍｅｃＡ－またはｍｅｃＣ含有黄色ブドウ球菌（ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ）
本開示は、例えば、ｍｅｃＡまたはｍｅｃＣ核酸配列の一部を増幅することによってｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出する方法を提供する。ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの様々なサブタイプのＳＣＣｍｅｃの核酸配列が利用可能である（例えば、ｍｅｃＡについてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ７８６５７９、ｍｅｃＣについてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＲ８２３２９２）。具体的には、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸分子標的を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが、本開示の実施形態によって提供される。
本開示は、例えば、ｍｅｃＡまたはｍｅｃＣ核酸配列の一部を増幅することによってｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出する方法を提供する。ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの様々なサブタイプのＳＣＣｍｅｃの核酸配列が利用可能である（例えば、ｍｅｃＡについてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ７８６５７９、ｍｅｃＣについてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＲ８２３２９２）。具体的には、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸分子標的を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが、本開示の実施形態によって提供される。
ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出のために、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡ遺伝子および／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブが提供される。本明細書に例示したもの以外のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸も、サンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出するために使用し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および／または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書中に開示されるｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸中の１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。
より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号１、２、３、４、５、６、および７、配列番号１、２、３、４、５、６、および７の１つと少なくとも、例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号１、２、３、４、５、６、および７とバリアントの相補体から選択される配列を有する核酸を含む。
一実施形態では、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを含むと疑われる生物学的サンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出するために、上記のｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよびｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーおよびプローブのセットが使用される。プライマーおよびプローブのセットは、配列番号１、２、３、４、５、６および７の核酸配列を含むかまたはそれからなる、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡ遺伝子またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ遺伝子核酸配列に特異的なプライマーおよびプローブを含むかまたはそれからなり得る。別の実施形態では、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ標的に対するプライマーおよびプローブは、配列番号１、２、３、４、５、６および７のプライマーおよびプローブのいずれかの機能的に活性なバリアントを含むかまたはそれからなる。
配列番号１、２、３、４、５、６および７のプライマーおよび／またはプローブのいずれかの機能的に活性なバリアントは、開示された方法におけるプライマーおよび／またはプローブを使用することによって同定され得る。配列番号１、２、３、４、５、６および７のいずれかのプライマーおよび／またはプローブの機能的に活性なバリアントは、配列番号１、２、３、４、５、６および７のそれぞれの配列と比較して、記載された方法またはキットにおいて類似またはより高い特異性および感度を提供するプライマーおよび／またはプローブに関する。
バリアントは、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６および７のそれぞれの配列の５’末端および／または３’末端における１つ以上のヌクレオチド付加、欠失または置換、例えば１つ以上のヌクレオチド付加、欠失または置換によって、配列番号１、２、３、４、５、６および７の配列から変化し得る。上に詳述したように、プライマー（および／またはプローブ）は化学的に修飾されていてもよく、すなわち、プライマーおよび／またはプローブは修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。したがって、プローブ（またはプライマー）は修飾オリゴヌクレオチドである。「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類縁体」）は、いくつかの修飾によって天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、依然として、塩基もしくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖もしくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分もしくはリン酸様部分、またはそれらの組み合わせからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を結合させて、「修飾ヌクレオチド」を得ることができる。「ヌクレオチド」中の天然塩基は、例えば７－デアザプリンで置換されてもよく、それによっても同様に「改変ヌクレオチド」が得られる。「修飾ヌクレオチド」または「ヌクレオチド類縁体」という用語は、本出願では互換的に使用される。「修飾ヌクレオシド」（または「ヌクレオシド類縁体」）は、「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類縁体」）について上に概説したように、何らかの修飾によって天然のヌクレオシドとは異なる。
ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡ遺伝子またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ遺伝子核酸配列をコードする核酸分子を増幅する修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、例えば、ＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．、コロラド州カスケード）などのコンピュータプログラムを使用して設計し得る。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出（例えば、電気泳動によって）を容易にするための適切なサイズの増幅産物、一対のプライマーのメンバーに対する同様の融解温度、および各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性でアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に忠実度が低下するほど長くはない）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは８～５０ヌクレオチド長（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０ヌクレオチド長）である。
プライマーのセットに加えて、本方法は、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在または非存在を検出するために１つ以上のプローブを使用し得る。「プローブ」という用語は、合成的または生物学的に産生された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指し、これは、設計または選択により、定義された所定のストリンジェンシーの下で、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡ（標的）核酸および／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ（標的）核酸に特異的に（すなわち、優先的に）ハイブリダイズすることを可能にする特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と称され得る。
いくつかの実施形態では、記載されるｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよびｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブは、少なくとも１つの蛍光標識で標識し得る。一実施形態では、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよびｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブを、ドナー蛍光部分、例えば蛍光色素、および対応するアクセプター蛍光部分、例えばクエンチャーで標識し得る。
一実施形態では、プローブは蛍光部分を含むかまたはそれからなり、核酸配列は配列番号３または７（標識なしで示されている）を含むかまたはそれからなる。
プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の方法で行い得る。実施形態は、増幅産物の検出のために単一のプローブまたは一対のプローブを使用し得る。実施形態に応じて、使用するプローブ（複数可）は、少なくとも１種の標識および／または少なくとも１種のクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常同様の融解温度を有し、各プローブの長さは配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に忠実度が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に１５～３０（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチド長である。
コンストラクトは、それぞれがｍｅｃＡ－ＭＲＳＡまたはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーの１つを含有するベクターと、プローブ核酸分子（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６および７）とを含み得る。コンストラクトは、例えば、対照鋳型核酸分子として使用し得る。使用に適したベクターは、市販されている、および／または当技術分野で日常的な組換え核酸技術法によって製造される。ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよびｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸分子は、例えば、化学合成、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡからの直接クローニングまたはＰＣＲ増幅によって得ることができる。
本方法での使用に適した構築物は、典型的には、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸分子（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６および７の１つ以上の配列を含む核酸分子）に加えて、所望の構築物および／または形質転換体を選択するための選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列、ならびに複製起点を含む。ベクター系の選択は、通常、宿主細胞の選択、複製効率、選択性、誘導性および回収の容易さを含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存する。
ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸分子を含有するコンストラクトは、宿主細胞内で増殖させ得る。本明細書で使用される宿主細胞という用語は、原核生物および真核生物、例えば酵母、植物および動物細胞を含むことを意味する。原核生物宿主には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれ得る。真核生物宿主としては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、ＣＯＳ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、ならびにアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）およびニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）などの植物細胞が挙げられる。コンストラクトを、当業者に一般的に知られている技術のいずれかを使用して宿主細胞に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクションおよびウイルス媒介核酸移入は、核酸を宿主細胞に導入するための一般的な方法である。さらに、ネイキッドＤＮＡを細胞に直接送達することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号）。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号および同第４，９６５，１８８号には、従来のＰＣＲ技術が開示されている。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態において有用なプライマーとしては、記載されるｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドが挙げられる（例えば、配列番号１、２、４、５および６）。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製し得るか、または合成的に生成し得る。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性される。すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲで鋳型として使用することができるようにする前に、２本の鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、または酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性する（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を超える変性）まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、ならびに変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度および核酸長のような反応の特徴に応じて、約９０℃～約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒間～４分間（例えば、１分～２分３０秒、または１．５分）行われる。
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号および同第４，９６５，１８８号には、従来のＰＣＲ技術が開示されている。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態において有用なプライマーとしては、記載されるｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドが挙げられる（例えば、配列番号１、２、４、５および６）。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製し得るか、または合成的に生成し得る。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性される。すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲで鋳型として使用することができるようにする前に、２本の鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、または酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性する（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を超える変性）まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、ならびに変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度および核酸長のような反応の特徴に応じて、約９０℃～約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒間～４分間（例えば、１分～２分３０秒、または１．５分）行われる。
二本鎖鋳型核酸が熱によって変性される場合、反応混合物を、記載されたｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸分子上のその標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却する。アニーリングの温度は、通常、約３５℃～約６５℃、（例えば、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒～約１分（例えば、約２０秒～約５０秒、約３０秒～約４０秒）であり得る。次いで、ポリメラーゼの活性が促進または最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こって、鋳型核酸に相補的な生成物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸鋳型にアニーリングされた各プライマーから伸長生成物を合成するのに充分でなくてはならないが、その相補的な鋳型から伸長生成物を変性させるほど高くすべきではない（例えば、伸長のための温度は、概して、約４０℃～約８０℃（例えば、約５０℃～約７０℃、約６０℃）の範囲である）。伸長時間は、約１０秒～約５分（例えば、約３０秒～約４分、約１分～約３分、約１分３０秒～約２分）であり得る。
ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸を使用し得る。鋳型核酸は精製する必要はなく；鋳型核酸は、ヒト細胞に含まれるｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸などの複合混合物の微量画分であり得る。ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸分子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇら、（編集），１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）に記載されているような通常の技術によって生物学的サンプルから抽出し得る。核酸は、任意の数の供給源、例えばプラスミド、または、細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、または植物もしくは動物などの高等生物を含む天然供給源から得ることができる。
オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、配列番号１、２、４、５および６）を、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と組み合わせる。例えば、鎖伸長反応には、一般的に、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５～１．０μｇの変性された鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼおよび１０％ＤＭＳＯ）が含まれる。反応物は、通常、それぞれ１５０～３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、またはそれらの１種以上の類縁体を含有する。
新規に合成された鎖は、反応の後続工程で使用できる二本鎖分子を形成する。鎖分離、アニーリングおよび伸長の工程は、標的ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸分子に対応する所望量の増幅産物を産生するために必要に応じて頻繁に繰り返し得る。反応の制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリング工程（すなわち、変性、アニーリング、および伸長）は、好ましくは少なくとも１回繰り返される。検出での使用について、サイクリング工程の数は、例えばサンプルの性質に依存する。サンプルが核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリング工程が必要となる。概して、サイクリング工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、または１００回繰り返してもよい。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同大５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号）は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、可視化できるかまたは他の方法で検出および／または定量することができる、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が起こるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光放射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは転移されたエネルギーを異なる波長の光放射の形態で再放射する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同大５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号）は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、可視化できるかまたは他の方法で検出および／または定量することができる、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が起こるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光放射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは転移されたエネルギーを異なる波長の光放射の形態で再放射する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分と、蛍光性であってもなくてもよく、光以外の形態で伝達されたエネルギーを散逸させる対応するクエンチャーとを含有し得る。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光が消光されるように、２つの蛍光部分の間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，９９４，０５６号、および同第６，１７１，７８５号に記載されている。一般的に使用されるドナー－アクセプター対は、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ対を包含する。一般的に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬおよびＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーククエンチャーは、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ノヴァト）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビル）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ－６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ、ミシガン州デクスタ）を包含する。
別の例では、それぞれが蛍光部分を含有する２つのオリゴヌクレオチドプローブは、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズし得る。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物核酸にハイブリダイゼーションすると、ＦＲＥＴシグナルが生成される。ハイブリダイゼーション温度は、約１０秒間～約１分間、約３５℃～約６５℃の範囲であり得る。
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロイックミラーおよび特定の範囲の蛍光発光を監視するためのフィルタを備える）、光子計数光電子増倍管システム、または蛍光光度計を使用して行い得る。エネルギー移動を開始するため、または蛍光体の直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、光ファイバー光源、または所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行うことができる。
ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分に「対応する」に関して本明細書で使用される場合、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有するアクセプター蛍光部分を指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。したがって、それらの間で効率的な非放射エネルギー伝達を生成し得る。
蛍光ドナー部分および対応するアクセプター部分は、一般に、（ａ）高効率Ｆｏｒｓｔｅｒエネルギー移動、（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）、（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト；および（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、レーザー線付近のその最大励起波長（例えば、ヘリウム－カドミウム４４２ｎｍまたはアルゴン４８８ｎｍ）、高い吸光係数、高い量子収率、およびその蛍光発光に対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するドナー蛍光部分を選択し得る。高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光部分の発光とのその励起の良好な重複、および可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）の発光を有する対応するアクセプター蛍光部分を選択することができる。
ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ－フィコエリトリン、９－アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４－アセトアミド－４’－イソチオ－シアナトスチルベン－２、２’－ジスルホン酸、７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン、スクシンミル１－ピレンブチレート、および４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ Ｒｅｄ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、またはランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユウロピウム、またはテルビウム）が挙げられる。ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティ）またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得ることができる。
ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分を、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合し得る。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を及ぼすので、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離であり得る。一般に、リンカーアームは約１０Å～約２５Åである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、および蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法も開示している。
ＬＣ Ｒｅｄ６４０などのアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー（例えば、ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスターシティ）またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手可能なＣ６－アミノホスホラミダイト）を含有するオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、ＬＣ Ｒｅｄ６４０標識オリゴヌクレオチドを生成し得る。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合させるためによく使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アッシュランド）製のフルオレセイン－ＣＰＧ）、アミド－リンカー（ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サンラモン）製のＣＸ－フルオレセイン－ＣＰＧなどの、フルオレセイン－ＮＨＳ－エステル由来）、またはオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン－ＮＨＳ－エステルの結合を必要とする３’－アミノ－ＣＰＧが挙げられる。
ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出
本開示は、生物学的サンプルまたは非生物学的サンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在または非存在を検出する方法を提供する。提供される方法は、サンプル汚染、偽陰性、および偽陽性の問題を回避する。本方法は、複数対のｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーを使用して、サンプルからのｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程、ならびにＦＲＥＴ検出工程を実施することを含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで行われる。ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在を検出するために、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよびｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーおよびプローブを使用して方法を実施し得、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出は、サンプル中のｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在を示す。
本開示は、生物学的サンプルまたは非生物学的サンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在または非存在を検出する方法を提供する。提供される方法は、サンプル汚染、偽陰性、および偽陽性の問題を回避する。本方法は、複数対のｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーを使用して、サンプルからのｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程、ならびにＦＲＥＴ検出工程を実施することを含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで行われる。ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在を検出するために、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよびｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーおよびプローブを使用して方法を実施し得、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出は、サンプル中のｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよび／またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在を示す。
本明細書に記載されるように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を利用する標識ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出し得る。１つのＦＲＥＴフォーマットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用して、増幅産物の有無、したがってｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの有無を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば、１種の蛍光色素および１種のクエンチャーで標識された１種の１本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用し、これは蛍光性であってもよく、蛍光性でなくてもよい。第１の蛍光部分が好適な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーはＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分に移動される。第２の蛍光部分は、一般的には、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階中に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分とが、互いに空間的に分離した状態となる。結果として、クエンチャーの不在下において第１の蛍光部分を励起すると、第１の蛍光部分からの蛍光発光を検出し得る。例として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、サンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在または非存在を検出するための本明細書に記載の方法を実施するのに適している。
ＦＲＥＴと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムＰＣＲ法を使用して増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部分および第２の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部分は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造形成を可能にする配列（例えば、ヘアピン）を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内で二次構造が形成された結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部分が空間的に近接する。標的核酸（すなわち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分が互いに分離され、それにより、適切な波長の光による励起後、第１の蛍光部分の発光を検出することができる。
ＦＲＥＴ技術の別の共通形式は、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識することができ、一般に、標的ＤＮＡ分子（例えば、増幅産物）内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光源によって４７０ｎｍで励起される。ＦＲＥＴの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ６４０）またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ７０５）に伝達する。次いで、アクセプター蛍光部分は、より長い波長の光を放出し、これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光学検出システムによって検出される。効率的なＦＲＥＴは、蛍光部分が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重なっている場合にのみ起こり得る。放出されたシグナルの強度は、元の標的ＤＮＡ分子の数と相関させ得る（例えば、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡまたはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡゲノムの数）。ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ標的核酸の増幅が起こり、増幅産物が産生される場合、ハイブリダイズする工程は、プローブ対のメンバー間のＦＲＥＴに基づく検出可能なシグナルをもたらす。
一般に、ＦＲＥＴの存在はサンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在を示し、ＦＲＥＴの非存在はサンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの非存在を示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、または特定の収集スワブ（アルギン酸カルシウムまたはアルミニウムシャフト）の使用はいずれも、試験結果の成功および／または精度に影響を及ぼし得る条件である。本明細書中に開示される方法を使用すると、例えば、４５サイクリング工程内でのＦＲＥＴの検出は、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡまたはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡに感染していることを示す。
本方法の実施に使用し得る代表的な生物学的サンプルとしては、皮膚スワブ、鼻スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚および軟部組織感染が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルの収集および保存方法は、当技術分野の当業者に知られている。生物学的サンプルを処理（例えば、当技術分野で公知の核酸抽出方法および／またはキットによって）することにより、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ核酸が放出し得、または場合によっては、生物学的サンプルをＰＣＲ反応成分および適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させ得る。
融解曲線分析は、サイクルプロファイルに含め得る追加の工程である。
融解曲線分析は、ＤＮＡ二本鎖の半分が一本鎖に分離した温度として定義される融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特徴的な温度でＤＮＡが融解するという事実に基づいている。ＤＮＡの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、ＧおよびＣヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子は、ＡおよびＴヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子よりも高いＴｍを有する。シグナルが失われる温度を検出することにより、プローブの融解温度を決定することができる。同様に、シグナルが発生する温度を検出することにより、プローブのアニール温度を決定し得る。ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ増幅産物からのｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよびｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブの融解温度により、サンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在または非存在を確認し得る。
各サーモサイクラーランの間に、対照サンプルも同様にサイクルし得る。陽性対照サンプルは、例えば、対照プライマーおよび対照プローブを使用して、（記載された標的遺伝子の増幅産物以外の）標的核酸対照鋳型を増幅し得る。陽性対照サンプルはまた、例えば標的核酸分子を含むプラスミドコンストラクトを増幅し得る。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマーおよびプローブを使用して、内部で（例えば、サンプル内で）または患者のサンプルと並んで実行される別々のサンプルで増幅し得る。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーションおよび／またはＦＲＥＴ反応の成功または失敗の指標である。各サーモサイクラー実行はまた、例えば標的鋳型ＤＮＡを欠く陰性対照を含み得る。陰性対照は汚染を測定し得る。これにより、システムおよび試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照反応は、例えば、プライマーが配列特異性によりアニールし、伸長を開始する能力、ならびにプローブが配列特異性によりハイブリダイズし、ＦＲＥＴが発生する能力を容易に決定し得る。
一実施形態では、本方法は、汚染を回避する工程を含む。例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、あるサーモサイクラー運転と次のサーモサイクラー運転との間の汚染を低減または排除するために、米国特許第５，０３５，９９６号、同第５，６８３，８９６号および同第５，９４５，３１３号に記載される。
ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用して、この方法を実施し得る。一実施形態では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願：国際公開第９７／４６７０７号、国際公開第９７／４６７１４号および国際公開第９７／４６７１２号は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲを開示している。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用して動作させることができ、Ｗｉｎｄｏｗ ＮＴオペレーティングシステムを利用し得る。サンプルからのシグナルは、機械が光学ユニット上にキャピラリーを順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示し得る。蛍光取得時間は１０～１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリング工程の後、蛍光対サイクル数の定量的表示を、全てのサンプルについて連続的に更新し得る。生成されたデータは、さらなる分析のために保存し得る。
ＦＲＥＴの代替として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎまたはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））等の二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて、増幅産物を検出し得る。二本鎖核酸との相互作用の際、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、適当な波長の光で励起した後、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いることもできる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。
本開示の実施形態は、１種以上の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。
製造品／キット
本開示の実施形態はさらに、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出するための製造品またはキットを提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含み得る。ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出のための代表的なプライマーおよびプローブは、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ標的核酸分子にハイブリダイズし得る。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素およびＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーションおよび検出に必要な適切に包装された試薬および材料を含み得る。プライマーおよびプローブを設計する方法が本明細書に開示され、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ標的核酸分子を増幅し、それにハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
本開示の実施形態はさらに、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出するための製造品またはキットを提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含み得る。ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの検出のための代表的なプライマーおよびプローブは、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ標的核酸分子にハイブリダイズし得る。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素およびＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーションおよび検出に必要な適切に包装された試薬および材料を含み得る。プライマーおよびプローブを設計する方法が本明細書に開示され、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ標的核酸分子を増幅し、それにハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
製造品はまた、プローブを標識するための１種以上の蛍光部分を含み得、あるいは、キットと共に供給されるプローブを標識し得る。例えば、製造品は、ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよびｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブを標識するためのドナーおよび／またはアクセプター蛍光部分を含み得る。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分の例を上に提供する。
製造品はまた、サンプル中のｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡを検出するためにｍｅｃＡ－ＭＲＳＡおよびｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプライマーおよびプローブを使用するための説明書を有する添付文書または添付文書ラベルを含み得る。製造品は、本明細書に開示される方法を実施するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、または汚染を防止するための薬剤）を更に含み得る。そのような試薬は、本明細書に記載の市販の機器の１種に特異的であり得る。
本開示の実施形態は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定しない以下の実施例において更に説明される。
以下の実施例および図面は、主題の理解を助けるために提供されており、その主題の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。
実施例１
ＭｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ遺伝子標的
図１は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の検出に使用されるいくつかの標的遺伝子の相対位置を示す。本開示のプライマーおよびプローブは、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ遺伝子を標的とする。
ＭｅｃＡ／ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ遺伝子標的
図１は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の検出に使用されるいくつかの標的遺伝子の相対位置を示す。本開示のプライマーおよびプローブは、ｍｅｃＡ／ｍｅｃＣ遺伝子を標的とする。
実施例２
ＰＣＲ実験条件
ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡ標的遺伝子またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ標的遺伝子のリアルタイムＰＣＲ検出を、ｃｏｂａｓ（登録商標）４８００システムまたはｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムプラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州プレザントン）のいずれかを使用して行った。増幅試薬の最終濃度を以下に示す：
ＰＣＲ実験条件
ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡ標的遺伝子またはｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ標的遺伝子のリアルタイムＰＣＲ検出を、ｃｏｂａｓ（登録商標）４８００システムまたはｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムプラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州プレザントン）のいずれかを使用して行った。増幅試薬の最終濃度を以下に示す：
以下の表は、ＰＣＲ増幅反応に使用される典型的な熱プロファイルを示す：
実施例３
実験結果
図２は、ｍｅｃＡ遺伝子を含むことが知られているＭＲＳＡ株１２７７０に対するｍｅｃＡプライマーおよび標準的なオリゴヌクレオチドベンダーからのプローブを使用した実験のＰＣＲ増殖曲線を示す。ｍｅｃＡ遺伝子が検出されたにもかかわらず、増殖曲線はＳ字形ではなく、その結果、Ｃｔ値（閾値サイクル）を決定し得ず、標的遺伝子濃度の定量を実施できなかった。これに対して、配列番号１のｍｅｃＡフォワードプライマー、配列番号２のｍｅｃＡリバースプライマー、および配列番号３のｍｅｃＡプローブを用いたＰＣＲ実験では、ｍｅｃＡ遺伝子を含むＭＲＳＡ株（株１０７１４、１０８１７および１２２７０）でのみ増幅産物の検出が認められ、ｍｅｃＣ遺伝子を含むＭＲＳＡ株（１２７５６株）やメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）株１０８５３では認められなかった。図３は、このＰＣＲ実験の増殖曲線を示し、決定されたＣｔ値を表ＩＶに示す。
実験結果
図２は、ｍｅｃＡ遺伝子を含むことが知られているＭＲＳＡ株１２７７０に対するｍｅｃＡプライマーおよび標準的なオリゴヌクレオチドベンダーからのプローブを使用した実験のＰＣＲ増殖曲線を示す。ｍｅｃＡ遺伝子が検出されたにもかかわらず、増殖曲線はＳ字形ではなく、その結果、Ｃｔ値（閾値サイクル）を決定し得ず、標的遺伝子濃度の定量を実施できなかった。これに対して、配列番号１のｍｅｃＡフォワードプライマー、配列番号２のｍｅｃＡリバースプライマー、および配列番号３のｍｅｃＡプローブを用いたＰＣＲ実験では、ｍｅｃＡ遺伝子を含むＭＲＳＡ株（株１０７１４、１０８１７および１２２７０）でのみ増幅産物の検出が認められ、ｍｅｃＣ遺伝子を含むＭＲＳＡ株（１２７５６株）やメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）株１０８５３では認められなかった。図３は、このＰＣＲ実験の増殖曲線を示し、決定されたＣｔ値を表ＩＶに示す。
Claims (25)
- サンプル中のｍｅｃＡ含有メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡ）を検出する方法であって、
－ 前記サンプル中にｍｅｃＡ－ＭＲＳＡが存在する場合、前記サンプルを、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補体を含むフォワードプライマー、および配列番号２のヌクレオチド配列またはその相補体を含むリバースプライマーと接触させて増幅産物を産生することを含む増幅工程を実施すること；
－ 前記増幅産物を１つ以上の検出可能なｍｅｃＡ－ＭＲＳＡプローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施する工程であって、前記１つ以上の検出可能なｍｅｃＡ－ＭＲＳＡプローブのうちの１つが配列番号３の配列またはその相補体を含む、ハイブリダイズ工程を実施すること；および
－ 増幅された前記増幅産物の存在または非存在を検出する工程であって、前記増幅された増幅産物の存在が、前記サンプル中のｍｅｃＡ－ＭＲＳＡの存在を示し、前記増幅された増幅産物の非存在が前記サンプル中のｍｅｃＡ－ＭＲＳＡの非存在を示す、増幅された前記増幅産物の存在または非存在を検出する工程
を含む、方法。 - － 前記ハイブリダイズ工程が、前記増幅産物をドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分で標識されたプローブと接触させることを含み；
－ 前記検出する工程が、前記プローブの前記ドナー蛍光部分と前記アクセプター蛍光部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在または非存在を検出することを含み、蛍光ＦＲＥＴの存在または非存在が、前記サンプル中のｍｅｃＡ－ＭＲＳＡの存在または非存在を示す、請求項１に記載の方法。 - 前記ドナー蛍光部分および前記対応するアクセプター蛍光部分が、前記プローブ上で互いに８ヌクレオチド以内にある、請求項２に記載の方法。
- 前記アクセプター蛍光部分がクエンチャーである、請求項２または３に記載の方法。
- 前記増幅工程が、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- － 前記サンプル中にｍｅｃＣ－ＭＲＳＡが存在する場合、前記増幅工程における前記サンプルを、配列番号４もしくは５のヌクレオチド配列またはその相補体を含むフォワードプライマー、および配列番号６のヌクレオチド配列またはその相補体を含むリバースプライマーと更に接触させて増幅産物を産生する工程；
－ 前記ハイブリダイズ工程における前記増幅産物を、１つ以上の検出可能なｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブと更に接触させる工程であって、前記１つ以上の検出可能なｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブのうちの１つが、配列番号７の配列またはその相補体を含む、接触させる工程；および
－ 増幅された前記増幅産物の存在または非存在を検出する工程であって、前記増幅された増幅産物の存在が前記サンプル中のｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在を示し、前記増幅された増幅産物の非存在が前記サンプル中のｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの非存在を示す、増幅された前記増幅産物の存在または非存在を検出する工程
によって、同じ反応において、前記サンプル中のｍｅｃＣ含有メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ）を検出することを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ｍｅｃ－ＭＲＳＡプローブが、前記標識されたｍｅｃＡ－ＭＲＳＡプローブの前記ドナー蛍光部分および前記対応するアクセプター蛍光部分とは異なる、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分で標識されている、請求項６に記載の方法。
- サンプル中のｍｅｃＣ含有メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ）を検出する方法であって、
－ 前記サンプル中にｍｅｃＣ－ＭＲＳＡが存在する場合、前記サンプルを、配列番号４もしくは５のヌクレオチド配列またはその相補体を含むフォワードプライマー、および配列番号６のヌクレオチド配列を含むリバースプライマーと接触させて増幅産物を産生することを含む増幅工程を実施すること；
－ 前記増幅産物を１つ以上の検出可能なｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施する工程であって、前記１つ以上の検出可能なｍｅｃＣ－ＭＲＳＡプローブのうちの１つが配列番号７の配列またはその相補体を含む、ハイブリダイズ工程を実施すること；および
－ 増幅された前記増幅産物の存在または非存在を検出する工程であって、前記増幅された増幅産物の存在が、前記サンプル中のｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在を示し、前記増幅された増幅産物の非存在が前記サンプル中のｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの非存在を示す、増幅された前記増幅産物の存在または非存在を検出する工程
を含む、方法。 - － 前記ハイブリダイズ工程が、前記増幅産物をドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分で標識されたプローブと接触させることを含み；
－ 前記検出する工程が、前記プローブの前記ドナー蛍光部分と前記アクセプター蛍光部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在または非存在を検出することを含み、蛍光ＦＲＥＴの存在または非存在が、前記サンプル中のｍｅｃＣ－ＭＲＳＡの存在または非存在を示す、請求項８に記載の方法。 - 前記ドナー蛍光部分および前記対応するアクセプター蛍光部分が、前記プローブ上で互いに８ヌクレオチド以内にある、請求項９に記載の方法。
- 前記アクセプター蛍光部分がクエンチャーである、請求項９または１０に記載の方法。
- 前記増幅工程が、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
- ｍｅｃＡ含有黄色ブドウ球菌（ｍｅｃＡ－ＭＲＳＡ）の核酸を検出するためのキットであって、
－ 配列番号１の配列またはその相補体を含む第１のオリゴヌクレオチド；
－ 配列番号２の配列またはその相補体を含む第２のオリゴヌクレオチド；および
－ 前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドによって生成されるアンプリコンにハイブリダイズするように構成された、配列番号３またはその相補体を含む第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド
を含む、キット。 - 前記第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分を含む、請求項１３に記載のキット。
- 前記アクセプター蛍光部分がクエンチャーである、請求項１４に記載のキット。
- ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および前記核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を更に含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のキット。
- ｍｅｃＣ含有黄色ブドウ球菌（ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ）の核酸を更に検出するための請求項１３～１６のいずれか一項に記載のキットであって、
－ 配列番号４および５からなる群から選択される配列またはその相補体を含む第４のオリゴヌクレオチド；
－ 配列番号６の配列またはその相補体を含む第５のオリゴヌクレオチド；および
－ 前記第４のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドによって生成されるアンプリコンにハイブリダイズするように構成された、配列番号７またはその相補体を含む第６の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド
を更に含む、キット。 - 前記第６の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、前記第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの前記ドナー蛍光部分および前記対応するアクセプター蛍光部分とは異なる、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分で標識されている、請求項１７に記載のキット。
- ｍｅｃＣ含有黄色ブドウ球菌（ｍｅｃＣ－ＭＲＳＡ）の核酸を検出するためのキットであって、
－ 配列番号４および５からなる群から選択される配列またはその相補体を含む第１のオリゴヌクレオチド；
－ 配列番号６の配列またはその相補体を含む第２のオリゴヌクレオチド；および
－ 前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドによって生成されるアンプリコンにハイブリダイズするように構成された、配列番号７またはその相補体を含む第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド
を含む、キット。 - 前記第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分を含む、請求項１９に記載のキット。
- 前記アクセプター蛍光部分がクエンチャーである、請求項２０に記載のキット。
- ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および前記核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を更に含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載のキット。
- 配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの配列またはその相補体を含むオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが４０個以下のヌクレオチドを有する、請求項２３または２４に記載のオリゴヌクレオチド。
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