JP7141488B2 - マイコプラズマ・ジェニタリウムを検出するための組成物と方法 - Google Patents
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- サンプル中のマイコプラズマ・ジェニタリウム(MG)を検出する方法であって、
- そのサンプル中に標的MG遺伝子の核酸が存在する場合に増幅産物を生成させるため、そのサンプルを標的MG遺伝子プライマーのセットと接触させることを含む増幅工程を実施し;
- その増幅産物を1つ以上の検出可能な標的MG遺伝子プローブと接触させることを含むハイブリダイジング工程を実施し;
- その増幅産物の存在または不在を検出すること、ここで、その増幅産物の存在が、そのサンプル中にMGが存在することを示すとともに、その増幅産物の不在が、そのサンプル中にMGが不在であることを示す、
を含み、
前記標的MG遺伝子プライマーのセットおよび1つ以上の検出可能な標的MG遺伝子プローブは、mgpB部分反復(MgPar)の可変EF領域を増幅及び検出し、
前記標的MG遺伝子プライマーのセットは、配列番号48~49および54~56からなるグループから選択した第1のオリゴヌクレオチド配列を含む第1のMgParプライマーと、配列番号62~66からなるグループから選択した第2のオリゴヌクレオチド配列を含む第2のMgParプライマーとを含み、
検出可能な標的MgPar遺伝子プローブは、配列番号71~89からなるグループから選択した第3のオリゴヌクレオチド配列、またはその相補配列を含む、方法。 - - 前記ハイブリダイジング工程が、前記増幅産物を、ドナー蛍光部分とそれに対応するアクセプタ部分で標識した前記検出可能な標的MG遺伝子プローブと接触させることを含み;
- 前記検出工程が、前記プローブの前記ドナー蛍光部分と前記アクセプタ部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の存在または不在を検出することを含み、蛍光の存在または不在が、前記サンプル中のMGの存在または不在を示す、請求項1に記載の方法。 - 前記増幅工程において5'→3'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ドナー蛍光部分とそれに対応する前記アクセプタ部分が、前記プローブ上で互いに8~20個以下のヌクレオチドの範囲にある、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記アクセプタ部分がクエンチャーである、請求項2~4のいずれか1項に記載の方法。
- MgPa接着オペロン内のmgpB遺伝子の保存領域Aを増幅および検出するための、標的MG mgpB遺伝子プライマーと、1つ以上の検出可能な標的MG mgpB遺伝子プローブとの1つのセットを更に含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的MG mgpB遺伝子プライマーのセットは、
配列番号29~35からなるグループから選択した第1のオリゴヌクレオチド配列を含む第1のプライマーと、配列番号36~41からなるグループから選択した第2のオリゴヌクレオチド配列を含む第2のプライマーとを含み、
前記1つ以上の検出可能な標的MG mgpB遺伝子プローブは、配列番号42~46からなるグループから選択した第3のオリゴヌクレオチド配列、またはその相補配列を含む、請求項6に記載の方法。 - マイコプラズマ・ジェニタリウム(MG)の核酸を検出するためのキットであって、
(a)- 配列番号48~49および54からなるグループから選択した第1のオリゴヌクレオチド配列を含む第1のMgParプライマーと;
- 配列番号62~66からなるグループから選択した第2のオリゴヌクレオチド配列を含む第2のMgParプライマーと;
- 配列番号71~89からなるグループから選択した第3のオリゴヌクレオチド配列、またはその相補配列を含む、蛍光検出可能な標識をしたMgParプローブを含み、
前記蛍光検出可能な標識をしたプローブが、前記第1のプライマーと前記第2のプライマーによって生成するアンプリコンとハイブリダイズする構成にされている、キット。 - 蛍光検出可能な標識をした前記第3のオリゴヌクレオチド配列が、ドナー蛍光部分とそれに対応するアクセプタ部分を含む、請求項8に記載のキット。
- 前記アクセプタ部分がクエンチャーである、請求項9に記載のキット。
- ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、その核酸ポリメラーゼが機能するのに必要な緩衝液のうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項8~10のいずれか1項に記載のキット。
- MgPa接着オペロン内のmgpB遺伝子の保存領域Aを増幅および検出するための、標的MG mgpB遺伝子プライマーと、1つ以上の検出可能な標的MG mgpB遺伝子プライマーとの1つのセットを更に含む、請求項8~11のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的MG mgpB遺伝子プライマーのセットは、配列番号29~35からなるグループから選択した第1のオリゴヌクレオチド配列を含む第1のプライマーと、配列番号36~41からなるグループから選択した第2のオリゴヌクレオチド配列を含む第2のプライマーとを含み、
前記1つ以上の検出可能な標的MG mgpB遺伝子プローブは、配列番号42~46からなるグループから選択した第3のオリゴヌクレオチド配列、またはその相補配列を含む、請求項12に記載のキット。 - 前記第1のオリゴヌクレオチド、前記第2のオリゴヌクレオチド、前記第3のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つが、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項8~13のいずれか1項に記載のキット。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド、前記第2のオリゴヌクレオチド、前記第3のオリゴヌクレオチドが、40個以下のヌクレオチドを有する、請求項8~14のいずれか1項に記載のキット。
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