CN113186316A - 一种生殖支原体核酸实时荧光pcr检测引物、探针及试剂盒 - Google Patents

一种生殖支原体核酸实时荧光pcr检测引物、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生殖支原体核酸实时荧光PCR检测引物、探针及试剂盒，该试剂盒包括扩增反应液、生殖支原体核酸检测液、阳性对照品和阴性对照品；所述生殖支原体核酸检测液包括针对生殖支原体、人类RNase P基因的特异性引物及探针，针对生殖支原体的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，针对生殖支原体的探针序列如SEQ ID NO.3所示。本发明提供的生殖支原体实时荧光PCR检测的引物、探针及试剂盒，能够快速、准确且灵敏地检测出生殖支原体，实验结果重复性好，精密度高，检测时间周期短，最快能在70分钟内完成检测，极大的节约了检测时间，能加快临床诊断效率。

Description

一种生殖支原体核酸实时荧光PCR检测引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体来说，涉及一种生殖支原体核酸实时荧光PCR检测引物、探针及试剂盒。
背景技术
生殖支原体(Mycoplasma genitalium,MG)属于柔膜体纲，支原体目，支原体科，其基因组大小为580kb，是已知最小的能自我复制的细菌，无细胞壁，革兰氏阴性。MG是引起性传播疾病的病原体之一，在男性引起非淋菌性尿道炎(Non-gonococcal urethritis,NGU)，在女性中引起宫颈炎、子宫内膜炎及盆腔炎等，可导致异位妊娠、不孕等不良结局，且生殖支原体的感染可能促进HIV病毒的传播与发展。生殖支原体有很重要的临床意义。
《2018年英国生殖支原体感染处理指南》中指出：一般人群中MG感染率为1-2％，女性略高于男性，在男性NGU患者中，MG感染率高达10-35％，在持续性复发性尿道炎患者中，MG检出率高达40％。在我国，NGU发病率呈逐年升高的趋势，而MG感染是NGU的主要病原体之一，在NGU患者中9-25％可查出MG阳性，在沙眼衣原体阴性的NGU患者中，MG检查出概率高达20-35％。目前，MG已成为重要的性传播病原体之一。
建立早期、快速、准确的检测生殖支原体感染的方法具有重要意义。MG具有苛刻的营养需求，生长极其缓慢，因此尽管培养法是诊断病原微生物的金标准，但培养方法并不适合MG临床诊断。2016年《生殖道支原体感染诊治专家共识》中指出：在血清学方面，生殖支原体与肺炎支原体有很多交叉反应的抗原决定簇，虽然各种血清学检验方法如凝集反应，补体结合等可用来检测生殖支原体的血清学变化，但由于肺炎支原体在泌尿生殖道中可能出现，检测MG会出现假阳性，临床工作中并没有实用性。《2018年英国生殖支原体感染处理指南》指出，在临床标本中采用核酸扩增试验检验MG特异性DNA或RNA是目前唯一的检测方法。目前国内基于PCR技术检测生殖支原体的试剂盒较少，自动化程度不高，假阴性较高，因此，开发一种灵敏度高，检测时间短，假阴性低，快捷简便的试剂盒是临床急需解决的问题。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种用于生殖支原体核酸荧光定量PCR检测的引物、探针和试剂盒，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种生殖支原体核酸实时荧光PCR检测引物及探针，所述引物的序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述探针的序列3’端标记QSY。
根据本发明的另一方面，提供了一种生殖支原体核酸实时荧光PCR检测试剂盒，包括扩增反应液、生殖支原体核酸检测液、阳性对照品和阴性对照品；所述生殖支原体核酸检测液包括针对生殖支原体、人类RNAse P基因的特异性引物及探针，针对生殖支原体的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，针对生殖支原体的探针序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，针对人类RNAse P基因的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，针对人类RNAse P基因的探针序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述扩增反应液包括taq DNA聚合酶、4种dNTP及PCR扩增反应液所需离子。
进一步地，所述阳性对照品为含有生殖支原体MgPa靶序列和人RNase P基因靶序列的质粒。
进一步地，所述阴性对照品为含人RNaseP序列的质粒。
进一步地，所述生殖支原体核酸检测液中针对生殖支原体、人类RNase P基因的特异性引物浓度为200-500nM，探针浓度为100-200nM。
上述试剂盒进行生殖支原体核酸荧光实时定量PCR检测的方法为以生殖支原体DNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。
本发明的有益效果：
(1)加快临床诊断效率：本发明提供了生殖支原体实时荧光PCR检测的引物、探针及试剂盒，能够快速、准确且灵敏地检测出生殖支原体，实验结果重复性好，精密度高；本发明检测时间周期短，最快能在70分钟内完成检测，极大的节约了检测时间，能加快临床诊断效率；
(2)全程质量控制：本发明加入了内参基因的监测，可对标本提取和扩增整个过程进行质量监控，能监控DNA是否成功提取和PCR过程是否顺利进行，以及监控是否出现人工操作失误(整个过程在闭管状态下进行)；
(3)操作简单：本发明仅需操作者将生殖支原体核酸检测液和模板进行混合即可上机检测，检测仪器仅依赖于荧光定量PCR仪器，结果Ct值仪器可自动判读，对操作人员的要求极其简单，临床可推广性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例所述的阳性对照品检测结果；
图2是根据本发明实施例所述的阴性对照品检测结果；
图3是根据本发明实施例所述的模板拷贝数1×10^0-1×10^9的扩增曲线；
图4为根据图3所做标准曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
生殖支原体核酸实时荧光定量PCR试剂盒开发
根据文献报道，本发明最终选定针对生殖支原体MgPa基因区域设计引物探针，在NCBI数据库中选取10种生殖支原体MgPa操纵子全长进行序列比对，在其保守区域设计引物探针，从而保证一对引物和一条探针能够检测出所有生殖支原体株系，并经过BLSAT比对，保证该引物探针只能比对到生殖支原体，而不能比对到其他病原菌上。
同时，本实施例中以人RNaseP基因作为内参基因，设计特异引物和探针。
本发明中的引物、探针如下：
a)生殖支原体MG(黏附蛋白MgPa保守区域)扩增引物、探针：
MG-qF:5’-CAACCAAAGAAAAGACTGGCTAAGA-3’，如SEQ ID NO.1所示，
MG-qR:5’-AAAGAGAAAATAACCACCTACACCTGTT-3’，如SEQ ID NO.2所示，
MG-qP:5’-FAM-AGCCTTTCTAACCGCTGCACTTACCCTTG-3’-QSY，如SEQ ID NO.3所示，
b)内参人RNAse P基因(保守区域)扩增引物、探针：
RNase P-F:5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’，如SEQ ID NO.4所示，
RNase P-R:5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’，如SEQ ID NO.5所示，
RNase P-P:VIC-5’-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3’-BHQ1，如SEQ ID NO.6所示，
在本实施例中，针对生殖支原体MG、内参人RNAse P基因的引物浓度均为200nM；针对生殖支原体MG、内参人RNAse P基因的探针浓度均为100nM。
所述试剂盒还包括：一步法扩增反应液(购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：Q113-02/03)，该反应体系包括taq DNA聚合酶、4种dNTP及各种PCR扩增反应液所需离子，阳性对照品(含有生殖支原体靶序列、人RNAseP基因靶序列的质粒)、阴性对照品(含人RNAse P基因靶序列的质粒)。所述试剂盒保存于-20℃。
采用上述试剂盒对生殖支原体核酸荧光定量PCR检测的方法如下：
(1)样本处理
取200μL样本，按照常规核酸提取即可得到所需DNA。
(2)实时荧光定量PCR扩增
按表1配置PCR扩增MIX(每个反应25μL)。
表1 PCR扩增MIX
组分 1个反应体积
生殖支原体核酸检测液 10μL
1-step预混液 15μL
将配置好的PCR扩增MIX按20μL每个反应孔进行分装。将已处理待测样本、阳性对照品、阴性对照品各5μL加入相应反应孔，上机进行PCR扩增。
扩增程序为：
55℃5min(1个循环)；95℃3min(1个循环)；95℃15sec，60℃30sec，(40个循环)。荧光定量PCR仪参数设定中，以ROX作为参比荧光。本发明使用ABI 7500进行检测。
(3)结果分析：
当FAM荧光通道中扩增曲线呈S型，且Ct≤36时，判断样品为生殖支原体阳性；
当FAM荧光通道中Ct>36或无扩增；VIC荧光通道中扩增曲线呈S型，且Ct≤35时，判断样品为生殖支原体阴性；
当FAM荧光通道中Ct>36或无扩增，且VIC荧光通道中Ct>36或无扩增，判定为实验异常，需要重新提取标本检测或重新取样检测。
阳性对照品检测结果如图1所示，阴性对照品检测结果如图2所示。
生殖支原体体系以不同浓度MgPa靶序列的质粒为模板进行扩增，所得的标准曲线如图3-4所示。图3为模板拷贝数1×10^0-1×10^9的扩增曲线。图4为根据图3所做标准曲线，R2＝0.993，扩增效率Eff％为101.324。
实施例2
准确性：
采用实施例1所述试剂盒对3份来自临床的诊断为生殖支原体感染的阳性阴道拭子进行检测，如表2所示，结果均为阳性，阳性符合率为100％。
表2临床样本检测结果
Figure BDA0003085989210000061
特异性：
采用实施例1所述试剂盒对肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体、沙眼衣原体等13种病原菌进行检测，如表3所示，检测结果均为阴性，符合率100％。
表3 9种病原菌检测结果
Figure BDA0003085989210000062
Figure BDA0003085989210000071
重复性：
采用实施例1所述试剂盒对2份自建阳性企业参考品进行检测，每个样品重复10次，检测结果Ct值的变异系数(CV,％)≤5％。
变异系数(CV,％)的计算公式如下：
Figure BDA0003085989210000072
式中：
CV—变异系数；
s—Ct值的标准差；
x—Ct值的平均值。
最低检测限：实施例1所述试剂盒最低检测限为1×104copies/mL。
上述检测方法及试剂盒使用3份浓度不高于1×104copies/mL含有生殖支原体靶序列的大肠杆菌工程菌作为自建阳性企业参考品进行最低检测限检测，检测结果FAM信号通道Ct值均小于36，均为阳性。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，本发明的试剂盒通过将采集的样本经常规方法提取核酸后，在taq DNA聚合酶的作用下，使用Taqman探针，利用实时荧光信号实现生殖支原体核酸检测；本试剂盒没有复杂的核酸提取过程；荧光定量PCR过程采用一步法进行，操作简单快捷；加入了内参基因的监测，可对标本提取和扩增整个过程进行质量监控，能监控DNA是否成功提取和PCR过程是否顺利进行，以及监控是否出现人工操作失误；本发明仅需操作者将生殖支原体核酸检测液和模板进行混合即可上机检测，检测仪器仅依赖于荧光定量PCR仪器，结果Ct值仪器可自动判读，对操作人员的要求极其简单，临床可推广性高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京华诺奥美基因生物科技有限公司
<120> 一种生殖支原体核酸实时荧光PCR检测引物、探针及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaccaaaga aaagactggc taaga 25
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaagagaaaa taaccaccta cacctgtt 28
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcctttcta accgctgcac ttacccttg 29
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23

Claims (8)

1. 一种生殖支原体核酸实时荧光PCR检测引物及探针，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的生殖支原体核酸实时荧光PCR检测引物及探针，其特征在于，所述探针的序列3’端标记QSY。
3. 一种生殖支原体核酸实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括扩增反应液、生殖支原体核酸检测液、阳性对照品和阴性对照品；所述生殖支原体核酸检测液包括针对生殖支原体、人类RNAse P基因的特异性引物及探针，针对生殖支原体的引物序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，针对生殖支原体的探针序列如SEQ ID NO.3所示。
4. 根据权利要求3所述的生殖支原体核酸实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，针对人类RNAse P基因的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，针对人类RNAse P基因的探针序列如SEQ ID NO.6所示。
5. 根据权利要求3所述的生殖支原体核酸实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液包括taq DNA聚合酶、4种dNTP及PCR扩增反应液所需离子。
6. 根据权利要求3所述的生殖支原体核酸实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有生殖支原体MgPa靶序列和人RNAse P基因靶序列的质粒。
7.根据权利要求3所述的生殖支原体核酸实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为含人RNaseP序列的质粒。
8. 根据权利要求3所述的生殖支原体核酸实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述生殖支原体核酸检测液中针对生殖支原体、人类RNAse P基因的特异性引物浓度为200-500nM，探针浓度为100-200nM。
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