CN111304346A - 基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法 - Google Patents

基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，属于病原体检测和诊断技术领域。包括以下步骤：引物设计;微流控芯片制作;恒温扩增反应体系配制;芯片加样;核酸扩增和结果判读。本发明采用恒温扩增技术和微流控芯片技术，利用具有链置换功能的聚合酶在63℃恒温条件下进行反应，使用荧光染料掺入法进行实时荧光检测，扩增阳性的样品会产生类似实时荧光的“S”形扩增曲线。成功制备的四种生殖道支原体的微流控芯片具有较好的灵敏度、特异性和准确性，整个检测过程在1h内即可完成。Uu、Mg、Mh的最低检测限为1000拷贝/μL，而Up的最低检测限为5000拷贝/μL,在临床上具有广泛的应用前景。

Description

基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法
技术领域
本发明涉及病原体检测和诊断技术领域，尤其涉及一种基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法。
背景技术
支原体是一类大小介于细菌与病毒之间、缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物。目前已发现与生殖道感染有关的支原体主要有解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)、微小脲原体(Ureaplasmaparvum，Up)，人型支原体(Mycoplasma hominis，Mh)、生殖支原体(Mycoplasmagenitalium，Mg)。液体培养法是前国内医疗机构对Uu和Mh的主要检测手段，该法具有操作简便，快速经济，肉眼即可观察，同时进行多种抗生素药敏试验的优点。但该法可能会受到细菌或真菌的污染造成假阳性，或标本中混有的产酸微生物对pH的改变产生干扰造成假阴性。Up和Mg在体外分离培养难度大，在液体培养基中不生长，在固体培养基上菌落大小极不一致，因此不推荐使用培养方法，目前主要靠DNA探针和PCR技术进行检测。血清学检测方法，如凝集反应、酶联免疫吸附试验(ELISA)等，用于检测生殖道支原体的血清学变化。这些方法虽然有助于生殖道支原体致病作用的研究，但在临床工作中这些血清学试验没有实用性。尽管针对生殖道支原体的检测方法日益丰富，但是从技术成熟度以及实验成本等方面综合来看，目前仍没有一项完美的技术能够投入应用到临床诊断中去。
环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展的一种用于快速诊断的核酸体外扩增技术，具有操作简便等优点。微流控技术是在微米尺寸的管道中处理纳升至阿升体积微小流体的技术，具有微型化、集成化等特征，临床诊断仪器和体外仿生模型是微流控芯片在生物医学领域中两个重要的应用方向。李艳燕等作者报道呼吸道病原体核酸恒温扩增芯片十三联检具有覆盖面广、灵敏度高等优点，可快速准确地鉴定下呼吸道感染常见病原体。本发明旨在结合LAMP技术和微流控技术构建一种基因芯片用于生殖道支原体的快速鉴定。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，可快速、准确检测解脲脲原体(Uu)、微小脲原体(Up)、生殖支原体(Mg)和人型支原体(Mh)四种生殖道支原体。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法,包括以下步骤：
(1)引物设计；从公共数据库中获得Uu、Up、Mh、Mg四种支原体的功能基因序列，用Muscle进行多序列比对，结合工具得到consensus序列；以consensus序列为输入，结合工具剪切得到满足要求的引物序列；以剪切得到的引物序列做blast比对，结合工具得到初步的引物筛选结果，利用公共数据库进行进一步的引物筛选和特异性检测，得到最后的引物集；
(2)微流控芯片制作；所述微流控芯片为碟式芯片，所述芯片固定有步骤(1)所述的生殖道支原体引物；
(3)恒温扩增反应体系配制；将恒温扩增试剂于室温解冻、融化，摇匀并离心；在体系区，吸取9.0μL恒温扩增试剂加入200μL离心管中，并移至PCR模板加样区；在PCR模板加样区，加入9.0μL被检样品或者对照品的DNA，摇匀并离心；
(4)芯片加样；在模板区，从试剂盒中取出芯片使其恢复至室温，用移液器吸取18.0μL步骤(3)配制好的核酸扩增反应体系，从进出样口加入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道即停止加样，并用封口膜封住进出样口，将加样后的芯片固定在低速离心机上，以6000rpm离心30秒后取下；
(5)核酸扩增和结果判读；将碟式芯片放入核酸分析仪中进行扩增，温度63℃，时间50分钟，检测完成后软件将自动对荧光数据进行处理和分析。
进一步，所述解脲脲原体(Uu)引物核酸序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述微小脲原体(Up)引物核酸序列如SEQ ID NO.7-12所示，所述人型支原体(Mh)引物核酸序列如SEQ IDNO.13-18所示，所述生殖支原体(Mg)引物核酸序列如SEQ ID NO.19-24所示。
进一步，所述引物满足条件如下；1)35％<GC含量<65％；2)引物不会形成发卡结构，反向互补序列不能长于5mer；3)引物序列不能有超过5个连续单碱基重复；4)引物之间不会形成二聚体。
进一步，所述微流控芯片共24个检测反应池，一张芯片可同时检测3个样品。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于；
本发明采用恒温扩增技术和微流控芯片技术，利用具有链置换功能的聚合酶在63℃恒温条件下进行反应，使用荧光染料掺入法进行实时荧光检测，扩增阳性的样品会产生类似实时荧光的“S”形扩增曲线。
本发明成功制备的四种生殖道支原体的微流控芯片具有较好的灵敏度、特异性和准确性，整个检测过程在1h内即可完成。Uu、Mg、Mh的最低检测限为1000拷贝/μL，而Up的最低检测限为5000拷贝/μL,在临床上具有广泛的应用前景。
本发明不需要复杂的仪器设备，也不需要实验人员的经验判断，避免了不同操作人员的主观因素，检测结果的总体符合率较高，适合于现场检测。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为实施例所用的蝶式微流控芯片；其中I-1～I-8：BC、PC、Uu、Up、Mg、Mh、NC、BC；1-第一进出样口，2-第二进出样口，3-反应池，4-主通道。
图2为芯片的准确性验证结果图。
图3为芯片的灵敏度试验结果图。其中A:Uu 1000拷贝/μL，B:Uu 500拷贝/μL；C:Up5000拷贝/μL，D:Up 1000拷贝/μL；E:Mg 1000拷贝/μL，F:Mg Uu500拷贝/μL；G:Mh 1000拷贝/μL，H:Mh 500拷贝/μL。
图4为芯片特异性验证结果图。其中A:Uu；B:Up；C:Mg；D:Mh；E:Mp；F:Ct；G:Ca；H:Gv；I:H2O。
图5为芯片重复性验证结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例中所用的试剂/仪器设备来源；
(1)标准菌株解脲脲原体(ATCC27618)、微小脲原体(ATCC27815)、人型支原体(ATCC23114)、生殖支原体(ATCC33530)：北京北纳生物有限公司；
(2)引物合成；上海生工生物工程有限公司；
(3)LAMP DNA扩增试剂盒：上海荣研生物科技有限公司。
(4)微流控芯片、RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪:博奥生物集团有限公司。
实施例1用于生殖道支原体检测引物的的设计和制备
从Genebank公共数据库中获得Uu、Up、Mh、Mg这四种支原体的功能基因序列，用Muscle进行多序列比对，结合工具得到consensus序列。以consensus序列为输入，结合工具剪切得到满足要求的引物序列，引物应满足的条件如下：1)35％<GC含量<65％；2)引物不会形成发卡结构，反向互补序列不能长于5mer；3)引物序列不能有超过5个连续单碱基重复；4)引物之间不会形成二聚体。以剪切得到的引物序列做blast比对，结合工具得到初步的引物筛选结果，利用NT等公共数据库进行进一步的引物筛选和特异性检测，得到最后的引物集。在引物设计时，考虑到尽可能多覆盖同种支原体不同亚型的多条序列。经过多次验证，筛除部分可能出现非特异信号的引物，保留特异性较好的引物作为最终的引物集，序列如表1所示。
表1 4种支原体的引物集
Figure BDA0002406826130000061
实施例2基于环介导恒温扩增和微流控芯片的生殖道支原体检测
(1)碟式芯片的设计和制作；碟式芯片结构见图1，每张芯片可检测3个样品(I、II、III)，每个样品含有8个反应池，逆时针依次编号，分别为4个支原体检测引物(Uu、Up、Mg、Mh)、1个阳性对照(PC)、1个阴性对照(NC)、2个空白对照(BC)。每张芯片在特定反应池包埋固定一套引物用于一种核酸靶序列的扩增和检测，每个反应池对应的引物布局见表2。
表2微流控芯片检测指标布局
反应池 检测指标 反应池 检测指标
I-1 BC II-5 Mg
I-2 PC II-6 Mh
I-3 Uu II-7 NC
I-4 Up II-8 BC
I-5 Mg III-1 BC
I-6 Mh III-2 PC
I-7 NC III-3 Uu
I-8 BC III-4 Up
II-1 BC III-5 Mg
II-2 PC III-6 Mh
II-3 Uu III-7 NC
II-4 Up III-8 BC
(2)恒温扩增反应体系的配制:从LAMP DNA扩增试剂盒中取出恒温扩增试剂于室温解冻，使其充分融化，轻摇混匀后瞬时离心至管底。在体系区，吸取9.0μL恒温扩增试剂加入200μL离心管中，盖好管盖后移至PCR模板加样区。在模板加样区，加入9.0μL被检样品或者对照品的DNA，弹指轻摇使其充分混合均匀，瞬时离心至管底。
(3)芯片加样:在模板区，从试剂盒中取出芯片使其恢复至室温，在洁净工作台内打开包装并将芯片进出样口向上，用移液器吸取18.0μL上述配制好的核酸扩增反应体系，从进出样口1加入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道(至少充满2-8孔)即停止加样。取1张封口膜，覆盖于进出样口上，再取一支洁净吸头，向一个方向按压封口膜至贴合紧密。将加样后的芯片固定在低速离心机上，以6000rpm离心30秒后取下。
(4)核酸扩增和结果判读:打开RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪和相应软件，预热10分钟。将碟式芯片放入核酸分析仪中进行扩增，扩增反应程序为一步，温度为63℃，时间为50分钟，检测完成后软件将自动对荧光数据进行处理和分析。
扩增曲线出峰时间≤45min，检测结果为阳性；扩增曲线出峰时间>45min，为可疑阳性样本，需复查。若复查结果≤45min，检测结果为阳性；若复查结果>45min，检测结果为阴性。
实施例3微流控芯片准确性验证
利用实施例2制备的恒温扩增微流控芯片进行准确性验证。以4种支原体的标准菌株为阳性参考品，采用该核酸分析仪芯片对其进行检测，验证该芯片对样品检测的准确性。操作步骤参照实施例2。
该芯片能正确检测4种支原体阳性参考品，如图2所示。本芯片共检测50min，其中Uu扩增曲线出峰时间为10.04min，Up扩增曲线出峰时间为11.58min，Mg扩增曲线出峰时间为17.18min，Mh扩增曲线出峰时间为25.42min。
实施例4微流控芯片灵敏度试验
利用实施例2制备的微流控芯片进行灵敏度验证。以1×106拷贝/μL的4种支原体阳性参考品为试验对象，分别稀释至不同的浓度，采用该芯片对其进行检测，确定该芯片对样品的最低检测限。操作步骤参照实施例2。
该芯片的灵敏度试验结果如图3所示。1000拷贝/μL Uu扩增曲线出峰时间为11.28min，500拷贝/μL时无扩增曲线；5000拷贝/μL Up扩增曲线出峰时间为16.80min，1000拷贝/μL时为41.68min；1000拷贝/μL Mg扩增曲线出峰时间为11.24min，500拷贝/μL时为38.72min；1000拷贝/μL Mh扩增曲线出峰时间为28.90min，500拷贝/μL时无扩增曲线。由此可以得出Uu、Mg、Mh的最低检测限为1000拷贝/μL，而Up的最低检测限为5000拷贝/μL。
实施例5微流控芯片特异性试验
利用实施例2制备的微流控芯片进行特异性验证。以1×105拷贝/μL的4种支原体阳性参考品和5种阴性参考品(肺炎支原体(Mp)、沙眼衣原体(Ct)、白色念珠菌(Ca)、加德纳菌(Gv)、水)为试验对象，以验证该芯片的特异性。操作步骤参照实施例2。
该芯片的特异性试验结果如图4所示，Uu、Up、Mg、Mh扩增曲线出峰时间≤45min，而Mp、Ct、Ca、Gv、H2O除阳性对照外无其他扩增曲线，证实该芯片对4种阳性参考品和5种阴性参考品检测结果正确，并且均无交叉反应。
实施例6微流控芯片重复性试验
利用实施例2制备的微流控芯片进行重复性验证。以最低检测限的4种支原体阳性参考品为试验对象，每个指标重复10次，以验证该芯片的重复性。操作步骤参照实施例2。
该芯片的重复性试验结果如图5和表3所示，4种支原体阳性参考品的10次检测结果一致，表明该芯片的检测重复性能良好，结果稳定可靠。
表3芯片重复性试验数据结果
重复次数 Uu Up Mg Mh
1 10.08 12.04 10.54 26.04
2 11.10 12.56 10.56 28.06
3 11.62 14.08 9.58 30.08
4 11.64 12.60 9.60 28.60
5 12.12 14.62 10.62 31.62
6 11.18 12.14 8.14 30.64
7 13.20 10.16 8.66 25.66
8 13.76 14.68 9.68 25.18
9 10.74 14.22 7.70 24.70
10 10.82 15.72 8.72 23.22
mean 11.626 14.34 9.38 27.38
SD 1.134119 1.65949 1.041793 2.827013
CV 9.76％ 11.57％ 11.11％ 10.33％
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (4)

1.基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)引物设计；从公共数据库中获得Uu、Up、Mh、Mg四种支原体的功能基因序列，用Muscle进行多序列比对，结合工具得到consensus序列；以consensus序列为输入，结合工具剪切得到满足要求的引物序列；以剪切得到的引物序列做blast比对，结合工具得到初步的引物筛选结果，利用公共数据库进行进一步的引物筛选和特异性检测，得到最后的引物集；
(2)微流控芯片制作；所述微流控芯片为碟式芯片，所述芯片固定有步骤（1）所述的生殖道支原体引物；
(3)恒温扩增反应体系配制；将恒温扩增试剂于室温解冻、融化，摇匀并离心；在体系区，吸取9.0μL恒温扩增试剂加入200μL离心管中，并移至PCR模板加样区；在PCR模板加样区，加入9.0μL被检样品或者对照品的DNA，摇匀并离心；
(4)芯片加样；在模板区，从试剂盒中取出芯片使其恢复至室温，用移液器吸取18.0μL步骤（3）配制好的核酸扩增反应体系，从进出样口加入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道即停止加样，并用封口膜封住进出样口，将加样后的芯片固定在低速离心机上，以6000rpm离心30秒后取下；
(5)核酸扩增和结果判读；将碟式芯片放入核酸分析仪中进行扩增，温度63℃，时间50分钟，检测完成后软件将自动对荧光数据进行处理和分析。
2.根据权利要求1所述的基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，其特征在于，所述解脲脲原体（Uu）引物核酸序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述微小脲原体（Up）引物核酸序列如SEQ ID NO.7-12所示，所述人型支原体（Mh）引物核酸序列如SEQ IDNO.13-18所示，所述生殖支原体（Mg)引物核酸序列如SEQ ID NO.19-24所示。
3.根据权利要求1所述的基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，其特征在于，所述引物满足条件如下：1）35%<GC含量<65%；2）引物不会形成发卡结构，反向互补序列不能长于5mer；3）引物序列不能有超过5个连续单碱基重复；4）引物之间不会形成二聚体。
4.根据权利要求1所述的基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，其特征在于,所述微流控芯片共24个检测反应池，一张芯片可同时检测3个样品 。
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