CN108913563A - 一种碟式微流控基因芯片及相关试剂盒与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种碟式微流控基因芯片，在其不同的反应池中分别包含肉毒梭菌atx基因、肺炎链球菌lytA基因、鲍氏不动杆菌gryb基因、结核分枝杆菌RV3877基因、布鲁氏杆菌BCSP31基因、副溶血性弧菌toxR基因、产气荚膜梭菌plc基因、金黄色酿脓葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxA基因、无乳链球菌Sip基因、大肠埃希氏菌uidA基因、松鼠葡萄球菌ropB基因、沙门氏菌invA基因、嗜水气单胞菌Aer基因中的一项或更多项。该芯片能够有效并行检测有害微生物。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种可并行检测14种重要致病菌的碟式微流控基因芯片及检测方法。
背景技术
致病性微生物引起的食源性疾病是全世界首要的食品安全问题，尤其存在于动物源性食品当中。动物在饲养、加工阶段很容易感染细菌、病毒或者寄生虫等病原性微生物，即可能会使食用者感染人畜共患病、出现健康问题甚至影响到其生命安全。世界卫生组织多次强调，为应对可能发生的新发和再发感染性疾病，应当保持警惕，并做好充分的准备。近年来，我国人畜共患病和动物源性食品安全事件频发，兽医公共卫生学所面临的问题和挑战十分严峻。统计资料表明，全国发生的食物中毒病例中，微生物引发的食物中毒人数占59.1％。对人危害严重的食源性微生物主要有沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、产单核细胞李斯特菌、志贺氏菌、布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌及其毒素等。生产食品原料的畜产品污染，是造成细菌和致病菌超标的主要原因之一。比如，我国细菌性食物中毒中，有70％-80％是由沙门菌引起的，而在引起沙门菌中毒的食品中，约90％是肉、蛋、奶等畜产品。因此，《国家中长期科学和技术发展规划纲要》在重点领域、优先主题、重大专项以及基础科学问题中都涉及到重大传染病、畜禽疾病防控、突发公共事件防范与快速处理、生物安全保障等相关问题。重新认识、重视并充分发挥兽医公共卫生在人畜共患病和动物源性食品安全方面的重要防线作用。基于微流控技术研制快速、高效的食源性病原微生物检测芯片及方法，将会为从源头上减少食品安全问题提供重要的技术保障。
现有的食源性致病菌快速检测技术以基因芯片最为常见，如ZL201410473932.8所述方法，芯片基于保守性高于16s rRNA的gyrB和fliC两种基因设计合成120条探针，能够并行检测奇异变形杆菌、停乳链球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌共计十种食源性致病菌及其亚种，灵敏度高达1×102copies/μL。然而，该芯片探针合成成本高昂，探针点制过程复杂，从样本DNA提取-PCR扩增，到芯片杂交和读片耗时长，并且对操作人员的分子生物学实验技术要求较高。
下述14种致病菌是对人畜危害严重的细菌：结核分枝杆菌、布鲁氏杆菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌、肉毒梭菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、金黄色酿脓葡萄球、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、松鼠葡萄球菌和无乳链球菌。现有的微流控芯片基因芯片等检测方法，不能够同时检测上述14种重要食源性致病菌。特别是结核分枝杆菌、布鲁氏杆菌、肉毒梭菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、金黄色酿脓葡萄球、沙门氏菌和嗜水气单胞菌，是畜牧养殖和食品安全的潜在威胁，被国家卫生部明确列为重点防控对象。
本领域需要建立高效廉价快速检测食源性致病菌的手段，以便对这些致病菌进行良好的监控和防治。
发明内容
微流控技术(Microfluidics),又可称为微型全分析系统(Miniaturized totalanalysis systems，uTAS)及芯片实验室(Lab on a chip)，是一种基于微机械加工、生物技术和纳米化学分析等技术发展而来的便携式高通量快速检测技术。微流控芯片是实现微流控技术的平台，其内部结构包括微米级的管道、腔室、气/液泵或阀门等流体器件，可对由微量生物大分子物质及化学试剂等成分组成的微流体进行控制。与其他检测技术相比，微流控芯片检测技术具有以下优势：一是缩减试剂成本；二是能够检测微量样品；三是检测通量高；四是微流体反应速率高，检测过程耗时短；五是自动化程度高，确保了检测结果的准确性、重复性和稳定性；六是便携性强，适用于现场检测。因此，微流控芯片技术在食品安全、医疗卫生及环境检测方面具有良好的应用前景。
基于此，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种可并行检测食源性14种主要致病菌结核分枝杆菌、布鲁氏杆菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌、肉毒梭菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、金黄色酿脓葡萄球、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、松鼠葡萄球菌和无乳链球菌的碟式微流控基因芯片及检测方法，实现对复杂样本的并行快捷、高通量、高特异性、高灵敏度的检测。
本发明采用恒温扩增技术，针对所有靶基因的6个不同区域(即靶基因3’端的F3c、F2c和F1c区，以及靶基因5’端的B1、B2和B3区)设计LAMP引物，在恒温(65℃)条件下利用荧光染料掺入法进行实时荧光检测。扩增阳性的样品会产生类似实时荧光的“S”形扩增曲线，一步完成对靶基因的扩增和检测，可同时对14种重要食源性致病菌的核酸靶基因进行高通量并行检测，是国内目前食源性致病菌检测通量最高的碟式微流控基因芯片产品。
较为具体地，本发明第一方面提供了一种碟式微流控基因芯片：
所述碟式微流控基因芯片包括分别用于检测肉毒梭菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌、结核分枝杆菌、布鲁氏杆菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌、金黄色酿脓葡萄球菌、绿脓杆菌、无乳链球菌、大肠埃希氏菌、松鼠葡萄球菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌中任一项、任两项、任三项、任四项、任五项、任六项、任七项、任八项、任九项、任十项、任十一项、任十二项、任十三项、或全部十四项的反应池，在所述反应池中独立进行LAMP扩增反应。
在一些事实方式中，所述碟式微流控基因芯片包括分别用于检测肉毒梭菌atx基因、肺炎链球菌lytA基因、鲍氏不动杆菌gryb基因、结核分枝杆菌RV3877基因、布鲁氏杆菌BCSP31基因、副溶血性弧菌toxR基因、产气荚膜梭菌plc基因、金黄色酿脓葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxA基因、无乳链球菌Sip基因、大肠埃希氏菌uidA基因、松鼠葡萄球菌ropB基因、沙门氏菌invA基因、嗜水气单胞菌Aer基因中任一项、任两项、任三项、任四项、任五项、任六项、任七项、任八项、任九项、任十项、任十一项、任十二项、任十三项、或全部十四项的反应池。
在一些事实方式中，所述用于检测肉毒梭菌atx基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7；
所述用于检测肺炎链球菌lytA基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:13；
所述用于检测鲍氏不动杆菌gryb基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:23；
所述用于检测结核分枝杆菌RV3877基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:29；
所述用于检测布鲁氏杆菌BCSP31基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:35；
所述用于检测副溶血性弧菌toxR基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:36至SEQ ID NO:41；
所述用于检测产气荚膜梭菌plc基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:42至SEQ ID NO:46；
所述用于检测金黄色酿脓葡萄球菌nuc基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:52；
所述用于检测绿脓杆菌toxA基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:53至SEQ ID NO:58；
所述用于检测无乳链球菌Sip基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:64；
所述用于检测大肠埃希氏菌uidA基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:70；
所述用于检测松鼠葡萄球菌ropB基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:79；
所述用于检测沙门氏菌invA基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:80至SEQ ID NO:85；
所述用于检测嗜水气单胞菌Aer基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:86至SEQ ID NO:91。
在一些事实方式中，所述碟式微流控基因芯片还包括空白对照、阴性对照和扩增阳性对照的LAMP引物组的反应池。
在一些事实方式中，所述空白对照的反应池中不点样；
所述阴性对照的反应池中用双蒸水代替DNA模板；
所述扩增阳性对照的反应池中LAMP引物组序列为SEQ ID NO:92至SEQ ID NO:97。
本发明第二方面提供了一种用于碟式微流控基因芯片的试剂盒：
所述试剂盒包括分别用于扩增肉毒梭菌atx基因、肺炎链球菌lytA基因、鲍氏不动杆菌gryb基因、结核分枝杆菌RV3877基因、布鲁氏杆菌BCSP31基因、副溶血性弧菌toxR基因、产气荚膜梭菌plc基因、金黄色酿脓葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxA基因、无乳链球菌Sip基因、大肠埃希氏菌uidA基因、松鼠葡萄球菌ropB基因、沙门氏菌invA基因、嗜水气单胞菌Aer基因中任一项、任两项、任三项、任四项、任五项、任六项、任七项、任八项、任九项、任十项、任十一项、任十二项、任十三项、或全部十四项的LAMP引物组。
在一些事实方式中，所述用于扩增肉毒梭菌atx基因的LAMP引物组的序列为SEQID NO:1至SEQ ID NO:7；
所述用于扩增肺炎链球菌lytA基因的LAMP引物组的序列为SEQ SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:13；
所述用于扩增鲍氏不动杆菌gryb基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:14至SEQID NO:23；
所述用于扩增结核分枝杆菌RV3877基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:29；
所述用于扩增布鲁氏杆菌BCSP31基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:30至SEQID NO:35；
所述用于扩增副溶血性弧菌toxR基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:36至SEQID NO:41；
所述用于扩增产气荚膜梭菌plc基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:42至SEQID NO:46；
所述用于扩增金黄色酿脓葡萄球菌nuc基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:52；
所述用于扩增绿脓杆菌toxA基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:53至SEQ IDNO:58；
所述用于扩增无乳链球菌Sip基因的LAMP引物组的序列为SEQ SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:64；
所述用于扩增大肠埃希氏菌uidA基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:65至SEQID NO:70；
所述用于扩增松鼠葡萄球菌ropB基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:71至SEQID NO:79；
所述用于扩增沙门氏菌invA基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:80至SEQ IDNO:85；
所述用于扩增嗜水气单胞菌Aer基因的LAMP引物组的序列为SEQ SEQ ID NO:86至SEQ ID NO:91。
在一些事实方式中，所述碟用于碟式微流控基因芯片的试剂盒还包括空白对照的LAMP引物组、阴性对照的LAMP引物组和阳性的LAMP引物组；
其中，所述扩增阳性对照的反应池中LAMP引物组序列为SEQ ID NO:92至SEQ IDNO:97。
本发明第三方面提供了一种碟式微流控基因芯片的检测方法，所述方法是用于非诊断目的，所述检测方法的步骤为：
1)制备碟式微流控基因芯片：
所述碟式微流控基因芯片是根据本发明第一方面所述的碟式微流控基因芯片或根据本发明第二方面所述的用于碟式微流控基因芯片的试剂盒配置得到的碟式微流控基因芯片；
2)提取待检样本的核酸；
3)恒温扩增反应体系的配制：
在体系区，吸取恒温扩增试剂加入离心管中，盖好管盖后将所述离心管移至模板加样区；
在所述模板加样区，加入步骤2)的核酸；
4)碟式微流控基因芯片加样：
在模板区，吸取在步骤3)配制好的核酸扩增反应体系，从进出样口将所述配制好的核酸扩增反应体系加入到所述碟式微流控基因芯片主通道中；
取封口膜，覆盖于进出样口上；
将加样后的所述碟式微流控基因芯片在低速离心机上离心备用；
5)恒温扩增：
预热恒温扩增微流控芯片核酸分析仪；
将所述碟式微流控基因芯片送入核酸分析仪中；
在65℃下恒温扩增50分钟；
6)结果判读；
7)检测完成后使用软件对荧光数据进行处理和分析。
本发明第四方提供了如本发明第一方面所述的碟式微流控基因芯片和/或本发明第二方面所述的用于碟式微流控基因芯片的试剂盒和/或本发明第三方面所述的碟式微流控基因芯片的检测方法在检测食品微生物中的应用或用途。
采用恒温扩增技术和微流控技术，以碟式微流控基因芯片为载体，可并行检测食源性14种重要致病菌，检测灵敏度为500copies/μL，不算入制备基因芯片的时间，整个样品检测时间能在1小时内完成。
附图说明
图1为本发明碟式微流控基因芯片的结构示意图；
其中，1表示反应池，2表示主通道，3表示进出样口1，4表示进出样口2。
图2示出了LAMP引物及其靶基因扩增区域示意图；
图3示出了14种细菌检测芯片的灵敏度试验结果；
图4示出了对奶牛养殖场5份污水样品中致病菌检测结果。
具体实施方式
为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。
1.待检病原菌的选择
选择如下细菌制作碟式微流控基因芯片：肉毒梭菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌、结核分枝杆菌、布鲁氏杆菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌、金黄色酿脓葡萄球菌、绿脓杆菌、无乳链球菌、大肠埃希氏菌、松鼠葡萄球菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌。
2.致病菌引物设计
根据14种致病菌靶基因NCBI的Taxonomy数据库中拉丁文标准名称和TaxonomyID，在NCBI数据库中搜集各菌靶基因序列，并且对靶基因序列相似度进行了Blast比较。根据14种致病菌靶基因NCBI的Taxonomy数据库中拉丁文标准名称和Taxonomy ID，在NCBI数据库中搜集各菌靶基因序列，并且对靶基因序列相似度进行了Blast比较。Blast结果表明，所选靶基因在种内相似度均在95％以上，具有很高的保守性，能够用于突变株的检测。
表1：本发明所用到靶基因序列Blast信息表
利用环介导等温扩增技术(LAMP)引物设计在线工具PrimerExplore V4(https://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)，针对14种致病菌靶基因6个不同区域(即靶基因3’端的F3c区、F2c区和F1c，以及靶基因5’端的B1区、B2区和B3区)，设计2-3对环介导等温扩增技术(LAMP)引物组(如图2所示)。
必须引物：FIP/BIP/F3/B3
FIP引物(Forward InnerPrimer)：包含F1c区和F2区，F1c区与目的基因5′端的F1c区互补，F2区与目的基因3′端的F2c区互补。
BIP引物(Backward InnerPrimer)：包含B1c区和B2区，B1c区与目的基因5′端的B1c区互补，B2区与目的基因3′端的B2c区互补。
F3引物(Forward OuterPrimer)：包含F3区，和目的基因的F3c片段序列互补。
B3引物(Backward OuterPrimer)：包含B3区，和目的基因的B3c片段序列互补。
加速引物：LF/LB：包含在5'端的哑铃状结构上与单链环区(B1和B2之间，或F1和F2之间的区域)互补的序列，增加DNA合成的起始点，加快反应速度。
LF引物(Forward Loop Primer)：位于片段F1与片段F2之间一段序列，以序列片段F1的方向向序列片段F2结合。
LB引物(Backward Loop Primer)：位于片段B1与片段B2之间一段序列，以片段B1的方向向片段B2结合。LB引物不是必须的，但是加入它能够加快反应速度。
所述的用于检测肉毒梭菌atx基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:1至SEQID NO:7。
所述的用于检测肺炎链球菌lytA基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:13。
所述的用于检测鲍氏不动杆菌gryb基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:23。
所述的用于检测结核分枝杆菌RV3877基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:29。
所述的用于检测布鲁氏杆菌BCSP31基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:35。
所述的用于检测副溶血性弧菌toxR基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:36至SEQ ID NO:41。
所述的用于检测产气荚膜梭菌plc基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:42至SEQ ID NO:46。
所述的用于检测金黄色酿脓葡萄球菌nuc基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ IDNO:47至SEQ ID NO:52。
所述的用于检测绿脓杆菌toxA基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:53至SEQ ID NO:58。
所述的用于检测无乳链球菌Sip基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:64。
所述的用于检测大肠埃希氏菌uidA基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:70。
所述的用于检测松鼠葡萄球菌ropB基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:79。
所述的用于检测沙门氏菌invA基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:80至SEQ ID NO:85。
所述的用于检测嗜水气单胞菌Aer基因的核苷酸引物组，其序列为SEQ ID NO:86至SEQ ID NO:91。
上述各引物组及其引物的序列，引物名称与长度以及引物所扩增的基因名称参见表1。
表1：本发明所用到的引物序列信息表
4.对照引物设计
本发明的芯片上还固定有空白对照(BC)、阴性对照(NC)和扩增人基因的LAMP引物(PC)的反应池。
空白对照(BC)不含引物序列，在芯片上，不点样处为BC。
阴性对照(NC)不含引物序列，用ddH2O替代DNA模板，其成分仅为点样液。NC用于判断点样液是否存在核酸污染，其检测结果在正常情况下应该为应为阴性。
阳性对照(PC)引物组特异性检测人源Has2基因，用于判断点样液、反应条件等是否正常，其检测结果在正常情况下应该为阳性。该引物组核酸序列依次为SEQ ID NO：92至SEQ ID NO：97。具体序列信息参见表2。
表2：本发明所用到的对照引物序列信息表
5.基因芯片结构布局与试剂配制
本发明所用的碟式微流控基因芯片(如图1所示)包含24个反应池，逆时针依次编号，其中进出样口1对应的为1号反应池。采用博奥碟式芯片微量点样技术，在特定反应池包埋固定一套LAMP引物用于一种核酸靶序列的扩增与检测特定微生物的特定基因，或者对照基因芯片的结构布局如图1所示，其中每个反应池中引物组名称与对应基因名称参见表3。
表3：上述碟式微流控基因芯片LAMP引物布局
一共包括14组微生物检测引物组，2组质控(阳性对照PC和阴性对照NC)以及空白对照BC引物组的配置方法如表4、表5、表6和表7所示。
表4引物配置浓度
| 引物名称 | 引物浓度 |
| F3 | 0.3μmol/L |
| B3 | 0.3μmol/L |
| FIP | 2.4μmol/L |
| BIP | 2.4μmol/L |
| LF | 1μmol/L |
| LB | 1μmol/L |
以琼脂糖溶液为溶剂，为每一种目标核酸片段的引物组混合使用，其中每种引物的浓度参见表4。
表5：14组微生物检测引物配置方法
表6：阳性对照(PC)引物配置方法
表7：阴性对照(NC)配置方法
6.样本的检测方法
本发明所述的可并行检测食源性14种重要致病菌的碟式微流控基因芯片的检测方法，使用RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪(仪器厂家：博奥生物)和配套试剂与计算软件，依次包括以下步骤：
(1)待检样本核酸的提取：
采用CTAB提取法提取样本的核酸。
(2)恒温扩增反应体系的配制：
从试剂盒中取出恒温扩增试剂(蓝谱生物，货号SLP221)使其充分融化(室温解冻)，轻摇充分混匀后瞬时离心至管底。
在体系区，吸取26.0μL恒温扩增试剂加入准备好的200μL离心管中，盖好管盖后移至PCR模板加样区，每份样品限一个离心管。
在模板加样区，加入26.0μL被检核酸样品(或者对照品)，轻摇、指弹使其充分混合均匀，瞬时离心至管底。每份核酸扩增反应体系总体积为52μL(表8)。
表8：恒温扩增反应体系
| 反应物 | 体积(μL) |
| 恒温扩增试剂 | 26.0 |
| 模板DNA | 26.0 |
| 共计 | 52 |
(3)碟式微流控基因芯片加样：
在模板区，从试剂盒中取出芯片使其恢复至室温，在洁净工作台内打开包装并将芯片进出样口向上，用移液器吸取52μL上述配制好的核酸扩增反应体系，从进出样口1加入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道(至少充满2-23孔)即停止加样。取1张封口膜，覆盖于进出样口上，再取一支洁净吸头，向一个方向按压封口膜至贴合紧密。将加样后的芯片固定在低速离心机上，以6000rpm离心30秒后取下，备用。
(4)恒温扩增：
打开RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪和相应软件，点击“打开光源”按钮，预热10分钟。
点击“出仓”按钮，将芯片盖片向上平稳放置在托盘上，托盘中心定位装置与芯片中心大圆孔对齐，托盘定位小圆柱从芯片中心缺口处穿出以固定芯片。点击“入仓”按钮，将芯片送入核酸分析仪中。
在检测界面的“样本信息”区域录入待检样本的信息，其中样本编号、芯片编号和样品类型为必填项，其它为选填项。样本信息录入后，可点击操作区域的“开始检测”按钮开始样本检测，仪器将按照预设程序(见表9)进行样本检测，在“荧光曲线区域”显示实时荧光曲线，在“状态栏”左侧显示实时监控的温度值，并在“检测状态信息”区域显示剩余时间。检测完成后，软件将自动进行数据分析，同时仪器将自动进行降温处理，待降温到37℃后样本仓将自动出仓，将芯片取出。
表9：核酸扩增反应程序
| 步骤 | 1 |
| 温度(℃) | 65 |
| 时间(分钟) | 50 |
(5)结果判读：
检测完成后软件将自动对荧光数据进行处理和分析，“荧光曲线区域”显示归一化曲线，“检测结果”区域显示质控结果和各检测指标的检测结果。
7.检测灵敏度实施例
为了验证本发明所制备的细菌检测芯片的有效性和灵敏度，将检测肉毒梭菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌、结核分枝杆菌、布鲁氏杆菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌、金黄色酿脓葡萄球菌、绿脓杆菌、无乳链球菌、大肠埃希氏菌、松鼠葡萄球菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌等细菌分别提取基因组DNA，按照表8所述，配制恒温扩增反应体系，使反应体系中的每种细菌DNA模板浓度均为500拷贝/μL。作为待检测样本，使用第6节所述本发明的检测方法进行检测，每个反应池独立进行光学检测，14种细菌检测芯片的灵敏度试验结果参见图3。
从图3可以看出，本发明的基因芯片能够有效地检测500拷贝/μL的相应14种微生物，敏感度较为理想。
8.检测实施例
使用“6.”所述方法，提取5个污水样品(污水1、污水2、污水3、污水4和污水5)中的微生物总DNA，4℃保存备用。
使用“6.”所述方法，利用本发明研发的碟式微流控芯片检测5个污水样品(污水1、污水2、污水3、污水4和污水5)中的致病菌。
针对芯片检出的致病菌种类，平行实施了普通PCR扩增及测序检测，以验证芯片检测这5个污水样品(污水1、污水2、污水3、污水4和污水5)结果的可靠性。
使用表1所述引物，采用普通PCR技术对污水样品平行检测。PCR引物、反应体系和反应程序如表10、表11和表12所述。
对普通PCR扩增5个污水样品的扩增产物进行测序，并使用NCBI数据库的Blast在线工具，比对分析测序结果。对于PCR能够扩增到条带，但测序失败的结果，需要使用NCBI数据库Primer Blast在线工具，对其扩增引物的特异性进行分析。对比奶牛养殖场奶厅污水样品的碟式微流控芯片检测结果和PCR扩增测序结果，明确碟式微流控芯片检测结果的可靠性。
碟式微流控芯片检测污水样品中的致病菌，试验结果如图4-1所示。结果表明，被检5个样品中PC对照和NC对照均正常。
其中，污水1中芯片检出3/14种菌，包括鲍氏不动杆菌、大肠埃希氏菌和无乳链球菌。
其中，污水2中芯片检出5/14种菌，包括鲍氏不动杆菌、大肠埃希氏菌、无乳链球菌、金黄色酿脓葡萄球菌和嗜水气单胞菌。其中，金黄色葡萄球菌出峰最晚，说明样品中金黄色葡萄球菌丰度最低。
其中，污水3中芯片检出3/14种菌，包括鲍氏不动杆菌、大肠埃希氏菌和嗜水气单胞菌。
其中，污水4中芯片检出4/14种菌，包括布鲁氏杆菌、鲍氏不动杆菌、大肠埃希氏菌和嗜水气单胞菌。
其中，污水5中芯片检出3/14种菌，包括无乳链球菌、大肠埃希氏菌和松鼠葡萄球菌。
表10：PCR引物
表11：PCR扩增反应体系
表12：PCR扩增反应程序
采用普通PCR技术对污水样品平行检测，结果如图4-2所示。结果表明，被检5个样品中PCR扩增试验的阴性对照均正常。污水1中PCR扩增出鲍氏不动杆菌、大肠埃希氏菌和无乳链球菌3种菌的靶基因。污水2中PCR扩增出鲍氏不动杆菌、大肠埃希氏菌、无乳链球菌和嗜水气单胞菌4种菌的靶基因。污水3中PCR扩增出鲍氏不动杆菌、大肠埃希氏菌和嗜水气单胞3种菌的靶基因。污水4中PCR扩增出鲍氏不动杆菌、大肠埃希氏菌和嗜水气单胞菌4种菌的靶基因。污水5中PCR扩增出无乳链球菌、大肠埃希氏菌和松鼠葡萄球菌3种菌扩增出。
测序PCR扩增产物，进而使用NCBI数据库BLAST在线工具，基于同源性分析判断PCR产物是否与碟式微流控芯片靶基因序列一致。
其中，污水1中PCR测序检出鲍氏不动杆菌(图4-3)、大肠埃希氏菌(图4-4)和无乳链球菌(图4-5)3种菌。
其中，污水2中PCR测序检出鲍氏不动杆菌(图4-6)、大肠埃希氏菌(图4-7)、无乳链球菌(图4-8)和嗜水气单胞菌(图4-9)4种菌。
其中，污水3中PCR测序检出鲍氏不动杆菌(图4-10)、大肠埃希氏菌(图4-11)和嗜水气单胞(图4-12)3种菌。
其中，污水4中PCR测序检出鲍氏不动杆菌(图4-13)、大肠埃希氏菌(图4-14)和嗜水气单胞菌(图4-15)4种菌。
其中，污水5中PCR测序检出无乳链球菌(图4-17)、大肠埃希氏菌(图4-18)和松鼠葡萄球菌(图4-19)3种菌。
对于PCR能够扩增到条带，但测序失败的结果，需要使用NCBI数据库Primer Blast在线工具，对其扩增引物的特异性进行分析。
对比奶牛养殖场奶厅污水样品的碟式微流控芯片检测结果和PCR扩增测序结果，情况如表13所示。
表13PCR扩增、测序验证碟式微流控芯片可靠性
污水2中，碟式微流控芯片能够检出金黄色葡萄球菌，且出峰晚，峰值低，说明污水2中的金黄色葡萄球菌含量极少。碟式微流控芯片检测灵敏度高于普通PCR检测方法，因此碟式微流控芯片能够检测出金黄色葡萄球菌，而PCR检测法检测不到样品微量金黄色葡萄球菌。
污水4中，虽然PCR扩增检出布鲁氏杆菌条带，但测序失败。进一步在NCBI中对布鲁氏杆菌PCR引物进行序列比对分析，发现该布鲁氏杆菌检测引物仅能够特异性扩增布鲁氏杆菌(图4-16)。因此，尽管PCR测序未检出布鲁氏杆菌，但PCR扩增结果阳性仍说明样品中包含了布鲁氏杆菌。
综上所述，PCR扩增结果和PCR扩增产物测序BLAST结果，良好地验证了碟式微流控芯片检测结果的准确性。
8.小结
本发明在引物设计时，考虑到了尽可能多覆盖同种致病菌不同亚型的多条序列。理论上，特异性引物只要有阳性信号，就表明样品中含有该致病菌。不算入制备基因芯片的时间，整个样品检测时间能在1小时内完成。检测灵敏度为500copies/μL。总体而言，本发明能够实现对食源性14种主要病原菌的高通量、高特异性、高灵敏度、高效快捷的检测，对于上述病原菌的监测和预警具有实际意义。
以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁夏大学
<120> 一种碟式微流控基因芯片及相关试剂盒与用途
<141> 2018-07-05
<160> 97
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌(Clostridium botulinum)
<400> 1
ggggacaaaa tttattataa aaaaa 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌(Clostridium botulinum)
<400> 2
cctatatcat tcccattatt atctt 25
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌(Clostridium botulinum)
<400> 3
tttttctacg cctgcctgtg attttttgat cgcgtatata ttaatgtagt ag 52
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌(Clostridium botulinum)
<400> 4
tttttctacg cctgcctgtg attttttgat cgtgtatata ttaatgtagt ag 52
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌(Clostridium botulinum)
<400> 5
gaaatacctg atgtaggaaa tctaagcatt tattttttat tccttgatca 50
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌(Clostridium botulinum)
<400> 6
cattagtagc taacctatat tcttta 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌(Clostridium botulinum)
<400> 7
gtcaagtagt agtaatgaag tcaaaa 26
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 8
ctagcagatg aagcaggtt 19
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 9
aatcgtcaag ccgttct 17
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 10
ggttattcgt gcaatactcg tgccgaaaac gcttgataca ggga 44
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 11
caaacaacca ctcagaccac gttgcaatat catgcttaaa ctgctcac 48
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 12
ccatatcttg ctaaatgggg catta 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 13
ccatatcttg ctaaatgggg catta 25
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)
<400> 14
ttacgcttga aacatttgaa c 21
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)
<400> 15
gaaattagcg acttgaatac gac 23
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> 鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)
<400> 16
ccgcagaatt caataaacct gttttcgtgt aaccgtatat attcataact t 51
<210> 17
<211> 51
<212> DNA
<213> 鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)
<400> 17
ccgcagaatt caataaacct gttttcgtgt aactgtatat attcataact t 51
<210> 18
<211> 51
<212> DNA
<213> 鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)
<400> 18
ccgcagaatt caataaacct gttttcgtgt aaccgtatat gttcataact t 51
<210> 19
<211> 51
<212> DNA
<213> 鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)
<400> 19
ccgcagaatt caataaacct gttttcgtgt aactgtatat gttcataact t 51
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)
<400> 20
tatgctcgtt tattgaagaa ctcgattttc acctttttgt aagtatgcgc 50
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)
<400> 21
cgtcaagtaa gtaagcatgt ggc 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)
<400> 22
tggttcaagt taatcgaaga tg 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)
<400> 23
tggttcaagt taattgaaga tg 22
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 24
gccaaactca tcatctgg 18
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 25
ccacagcagc atgggaa 17
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 26
agccatcgac ccgaccactt ttgcactatg cctggctgtt 40
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 27
acgtccggcg cgtttcactt tttgatggca gcgatcatgg 40
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 28
ccgtgaggta gacgctca 18
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 29
ggtcgtaaaa cgaactctgg aat 23
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 布鲁氏杆菌(Brucella spp.)
<400> 30
cggattttgc ttccgaatt 19
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 布鲁氏杆菌(Brucella spp.)
<400> 31
atgcagggtt ttgggct 17
<210> 32
<211> 45
<212> DNA
<213> 布鲁氏杆菌(Brucella spp.)
<400> 32
gacaatcggc ctcaagcttc cctcataata ccagtcctct tcccg 45
<210> 33
<211> 44
<212> DNA
<213> 布鲁氏杆菌(Brucella spp.)
<400> 33
ccaaagaata caatcgcttg ccgcgttttt aatcgtttca gtcg 44
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 布鲁氏杆菌(Brucella spp.)
<400> 34
atggttttcg gcataatcta tg 22
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 布鲁氏杆菌(Brucella spp.)
<400> 35
gacaagcgcc gccagag 17
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)
<400> 36
tcaaaggttt acctttgatc c 21
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)
<400> 37
caggcttgag tcatccac 18
<210> 38
<211> 46
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)
<400> 38
ctttcgttgc ttcctaatcg tacaaaaata gtaattcgct cgctga 46
<210> 39
<211> 39
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)
<400> 39
gcggagagac caaacgaagt tctcaaaacc ttgctcacg 39
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)
<400> 40
tcgttgccgc tttgttgg 18
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)
<400> 41
ttaacccgta acgagcttca cga 23
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)
<400> 42
cagaggaaag aaaagaacag ta 22
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)
<400> 43
gctgttcctt tttgagagtt 20
<210> 44
<211> 45
<212> DNA
<213> 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)
<400> 44
tgaccatgca ttaaaatctt tgttaaaata aacacagcag gttgc 45
<210> 45
<211> 47
<212> DNA
<213> 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)
<400> 45
gaggttttgc taaaacagga aaatcacttt gctgcataat cccaatc 47
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)
<400> 46
tactatagtc atgctagcat gagtc 25
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 47
aacagtatat agtgcaactt caa 23
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 48
ctttgtcaaa ctcgacttca a 21
<210> 49
<211> 48
<212> DNA
<213> 金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 49
tcattggttg acctttgtac attaaaaaat tacataaaga acctgcga 48
<210> 50
<211> 48
<212> DNA
<213> 金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 50
agactattat tggttgatac acctggcatt ttctaccatt tttttcgt 48
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 51
ccgtatcacc atcaatcgct t 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 52
tggtcctgaa gcaagtgcat t 21
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 53
caaggtgttc atccacg 17
<210> 54
<211> 17
<212> DNA
<213> 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 54
cgctccagcg cttttcc 17
<210> 55
<211> 38
<212> DNA
<213> 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 55
ctcgtcgccc atctcgatgg actgaacgcc ggtaacca 38
<210> 56
<211> 36
<212> DNA
<213> 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 56
gcacgagagc aacgagatgc gtctgggcca tgacca 36
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 57
tgtagatcgg cgacatgt 18
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 58
catcagccat gccggggtc 19
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)
<400> 59
agcgactgaa gttaagag 18
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)
<400> 60
cgcacggtat gtactgaa 18
<210> 61
<211> 44
<212> DNA
<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)
<400> 61
tgcatttgtt gttgaagctg gttggttccg gtagcacaaa aagc 44
<210> 62
<211> 44
<212> DNA
<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)
<400> 62
ctgcacatcc tgaaaatgca agattaactc cataagttga cgct 44
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)
<400> 63
ctaccggtgt tgctgttgga 20
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)
<400> 64
cctcatgttg cagcttataa agaa 24
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 65
tgtggaattg atcagcgt 18
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 66
gattattgac ccacactttg 20
<210> 67
<211> 38
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 67
ctgcatcggc gaactgatcg ggtgggaaag cgcgttac 38
<210> 68
<211> 38
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 68
tctggtatca gcgcgaagtc taatgagtga ccgcatcg 38
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 69
gcaattgccc ggctttct 18
<210> 70
<211> 17
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 70
gcaggccagc gtatcgt 17
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)
<400> 71
caaacccatt agcagagttg a 21
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)
<400> 72
ccaaattcat taactcttgc ata 23
<210> 73
<211> 43
<212> DNA
<213> 松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)
<400> 73
gtcacgtact tccataccag cataaacgtc gtctatcagc att 43
<210> 74
<211> 43
<212> DNA
<213> 松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)
<400> 74
gtcacgtact tccatgccag cataaacgtc gtctatcagc att 43
<210> 75
<211> 50
<212> DNA
<213> 松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)
<400> 75
gttcactact ctcactacgg tcgttttaat gagttgatta aaccaatgtt 50
<210> 76
<211> 50
<212> DNA
<213> 松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)
<400> 76
gttcactact ctcactatgg tcgttttaat gagttgatta aaccaatgtt 50
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)
<400> 77
acgagttaaa ccacccggtc c 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)
<400> 78
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<211> 20
<212> DNA
<213> 松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)
<400> 79
tgtgtccaat tgaaacgcct 20
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<212> DNA
<213> 沙门氏菌(Salmonella spp.)
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<213> 沙门氏菌(Salmonella spp.)
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<212> DNA
<213> 沙门氏菌(Salmonella spp.)
<400> 82
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<213> 沙门氏菌(Salmonella spp.)
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<213> 沙门氏菌(Salmonella spp.)
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<212> DNA
<213> 沙门氏菌(Salmonella spp.)
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<213> 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)
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<213> 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)
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<213> 人类(human)
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<212> DNA
<213> 人类(human)
<400> 97
atgtttgctt gccagtgcat tttag 25
Claims (10)
1.一种碟式微流控基因芯片，其特征在于：
所述碟式微流控基因芯片包括分别用于检测肉毒梭菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌、结核分枝杆菌、布鲁氏杆菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌、金黄色酿脓葡萄球菌、绿脓杆菌、无乳链球菌、大肠埃希氏菌、松鼠葡萄球菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌中任一项、任两项、任三项、任四项、任五项、任六项、任七项、任八项、任九项、任十项、任十一项、任十二项、任十三项、或全部十四项的反应池，在所述反应池中独立进行LAMP扩增反应。
2.如权利要求1所述的碟式微流控基因芯片，其特征在于：
所述碟式微流控基因芯片包括分别用于检测肉毒梭菌atx基因、肺炎链球菌lytA基因、鲍氏不动杆菌gryb基因、结核分枝杆菌RV3877基因、布鲁氏杆菌BCSP31基因、副溶血性弧菌toxR基因、产气荚膜梭菌plc基因、金黄色酿脓葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxA基因、无乳链球菌Sip基因、大肠埃希氏菌uidA基因、松鼠葡萄球菌ropB基因、沙门氏菌invA基因、嗜水气单胞菌Aer基因中任一项、任两项、任三项、任四项、任五项、任六项、任七项、任八项、任九项、任十项、任十一项、任十二项、任十三项、或全部十四项的反应池。
3.如权利要求2所述的碟式微流控基因芯片，其特征在于：
所述用于检测肉毒梭菌atx基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:7；
所述用于检测肺炎链球菌lytA基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQID NO:8至SEQ ID NO:13；
所述用于检测鲍氏不动杆菌gryb基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:23；
所述用于检测结核分枝杆菌RV3877基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:29；
所述用于检测布鲁氏杆菌BCSP31基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:35；
所述用于检测副溶血性弧菌toxR基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:36至SEQ ID NO:41；
所述用于检测产气荚膜梭菌plc基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:42至SEQ ID NO:46；
所述用于检测金黄色酿脓葡萄球菌nuc基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:52；
所述用于检测绿脓杆菌toxA基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQID NO:53至SEQ ID NO:58；
所述用于检测无乳链球菌Sip基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQID NO:59至SEQ ID NO:64；
所述用于检测大肠埃希氏菌uidA基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:70；
所述用于检测松鼠葡萄球菌ropB基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:79；
所述用于检测沙门氏菌invA基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQID NO:80至SEQ ID NO:85；
所述用于检测嗜水气单胞菌Aer基因的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:86至SEQ ID NO:91。
4.如权利要求1-3中任一项所述的碟式微流控基因芯片，其特征在于：
所述碟式微流控基因芯片还包括空白对照、阴性对照和扩增阳性对照的LAMP引物组的反应池。
5.如权利要求1-4中任一项所述的碟式微流控基因芯片，其特征在于：
所述空白对照的反应池中不点样；
所述阴性对照的反应池中用双蒸水代替DNA模板；
所述扩增阳性对照的反应池中LAMP引物组序列为SEQ ID NO:92至SEQ ID NO:97。
6.一种用于碟式微流控基因芯片的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒包括分别用于扩增肉毒梭菌atx基因、肺炎链球菌lytA基因、鲍氏不动杆菌gryb基因、结核分枝杆菌RV3877基因、布鲁氏杆菌BCSP31基因、副溶血性弧菌toxR基因、产气荚膜梭菌plc基因、金黄色酿脓葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxA基因、无乳链球菌Sip基因、大肠埃希氏菌uidA基因、松鼠葡萄球菌ropB基因、沙门氏菌invA基因、嗜水气单胞菌Aer基因中任一项、任两项、任三项、任四项、任五项、任六项、任七项、任八项、任九项、任十项、任十一项、任十二项、任十三项、或全部十四项的LAMP引物组。
7.如权利要求6所述的用于碟式微流控基因芯片的试剂盒，其特征在于：
所述用于扩增肉毒梭菌atx基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7；
所述用于扩增肺炎链球菌lytA基因的LAMP引物组的序列为SEQ SEQ ID NO:8至SEQ IDNO:13；
所述用于扩增鲍氏不动杆菌gryb基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:14至SEQ IDNO:23；
所述用于扩增结核分枝杆菌RV3877基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:24至SEQID NO:29；
所述用于扩增布鲁氏杆菌BCSP31基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:30至SEQ IDNO:35；
所述用于扩增副溶血性弧菌toxR基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:36至SEQ IDNO:41；
所述用于扩增产气荚膜梭菌plc基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:42至SEQ IDNO:46；
所述用于扩增金黄色酿脓葡萄球菌nuc基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:52；
所述用于扩增绿脓杆菌toxA基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:53至SEQ ID NO:58；
所述用于扩增无乳链球菌Sip基因的LAMP引物组的序列为SEQ SEQ ID NO:59至SEQ IDNO:64；
所述用于扩增大肠埃希氏菌uidA基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:65至SEQ IDNO:70；
所述用于扩增松鼠葡萄球菌ropB基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:71至SEQ IDNO:79；
所述用于扩增沙门氏菌invA基因的LAMP引物组的序列为SEQ ID NO:80至SEQ ID NO:85；
所述用于扩增嗜水气单胞菌Aer基因的LAMP引物组的序列为SEQ SEQ ID NO:86至SEQID NO:91。
8.如权利要求6或7所述的用于碟式微流控基因芯片的试剂盒，其特征在于：
所述碟用于碟式微流控基因芯片的试剂盒还包括空白对照的LAMP引物组、阴性对照的LAMP引物组和阳性的LAMP引物组；
其中，所述扩增阳性对照的反应池中LAMP引物组序列为SEQ ID NO:92至SEQ ID NO:97。
9.一种碟式微流控基因芯片的检测方法，所述方法是用于非诊断目的，所述检测方法的步骤为：
1)制备碟式微流控基因芯片：
所述碟式微流控基因芯片是权利要求1-5中任一项所述的碟式微流控基因芯片或根据权利要求6-8中任一项所述的用于碟式微流控基因芯片的试剂盒配置得到的碟式微流控基因芯片；
2)提取待检样本的核酸；
3)恒温扩增反应体系的配制：
在体系区，吸取恒温扩增试剂加入离心管中，盖好管盖后将所述离心管移至模板加样区；
在所述模板加样区，加入步骤2)的核酸；
4)碟式微流控基因芯片加样：
在模板区，吸取在步骤3)配制好的核酸扩增反应体系，从进出样口将所述配制好的核酸扩增反应体系加入到所述碟式微流控基因芯片主通道中；
取封口膜，覆盖于进出样口上；
将加样后的所述碟式微流控基因芯片在低速离心机上离心备用；
5)恒温扩增：
预热恒温扩增微流控芯片核酸分析仪；
将所述碟式微流控基因芯片送入核酸分析仪中；
在65℃下恒温扩增50分钟；
6)结果判读；
7)检测完成后使用软件对荧光数据进行处理和分析。
10.如权利要求1-5所述的碟式微流控基因芯片和权利要求6-8所述的用于碟式微流控基因芯片的试剂盒和如权利要求9所述的碟式微流控基因芯片的检测方法在检测食品微生物中的应用或用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181130 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |