CN105548545B - 一组活动性结核病诊断标志物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组活动性结核病诊断标志物及其用途,该组活动性结核病诊断标志物的序列对应SEQ:ID:NO:1‑SEQ:ID:NO:15。该组结核病诊断标志物来自结核分枝杆菌的15个抗原,判断被检人是否为活动结核病,检测结果表明,本发明提供的蛋白质组合诊断活动性结核病的最佳工作点的特异性为90.3%,灵敏度为85.4%,均高于现有技术中活动结核病诊断的指标,且本技术为血清学检测,标本容易获取,适用于各种可疑活动性结核病,包括活动性肺结核和肺外结核的诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,涉及一组活动性结核病诊断标志物及其用途。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病,被列为我国重大传染病之一。目前结核分枝杆菌感染人群基数大,发病率高,至今尚无有效的快速血清学诊断方法,给结核病防治工作带来了严峻挑战。因此,在结核病疫情控制面临严峻挑战的今天,筛选结核病新型生物标志候选物,寻求一种新的诊断技术、新药和新疫苗的开发已迫在眉睫。
结核病的早发现、早诊断、早治疗能够提高患者治愈率,减少传染源,较好地控制结核分枝杆菌的传播与扩散,从而降低结核病对社会及国家产生的危害。目前诊断结核病常用的方法有:1、痰涂片抗酸染色检查:对诊断结核病具有重要临床价值,但阳性率仅达30%左右,且不能区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染;2、传统培养法:操作繁琐且耗时长,从临床标本分离出结核分枝杆菌的时间通常≥6周,不利于疾病的早发现及诊断;3、自动化快速培养法:快速(1~2周)、可靠、安全,但是需要昂贵的仪器设备;4、聚合酶链式反应-单链构想多态性分析法(PCR-SSCP法):其影响因素较多(DNA片段长度、凝胶浓度等),可重复性较差,在临床工作中未得到广泛应用;5、RT-PCR法:对检测条件要求高,限制其推广;6、寡核苷酸探针杂交法:是检测结核分枝杆菌的一种快速方法,但存在一定假阴性率和假阳性率,且试剂价格相对昂贵,未得到临床推广;7、基因芯片法:具有时限短、所需样本少、热循环和冷却效率高等优点,但因分析软件要求高,芯片的制作成本高等缺点限制其应用;8、GeneXpert MTB/RIF对肺结核痰涂阴病人及耐利福平结核菌的检测可以在2小时内完成,为肺结核快速诊断提供便利,但在经济欠发达国家和地区,应用仍受限制。肺外结核病的诊断方法更为有限。早期检测方法滞后阻碍活动期结核病患者的及时诊治,不利于挽救病人的生命及结核病传染源的控制。临床上急需高效、价廉、易于推广的实验室检测方法,以评估疾病状态是否活动并可作为新型抗结核药物试验终点参考。目前结核分枝杆菌感染宿主后血液免疫学标志物筛选国内外进行了多方位研究,部分商业试剂已用于结核病检测,但均未获得WHO结核专家组认可大范围运用,关于活动性结核病新型生物标志候选物的筛选与鉴定尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷,提供一组活动性结核病诊断标志物及其用途,该组结核病诊断标志物来自结核分枝杆菌的15个抗原,判断被检人是否为活动结核病,检测结果表明,本发明提供的蛋白质组合诊断活动性结核病的最佳工作点的特异性为90.3%,灵敏度为85.4%,均高于现有技术中活动结核病诊断的指标,且本技术为血清学检测,标本容易获取,适用于各种可疑活动性结核病,包括活动性肺结核和肺外结核的诊断。
其具体技术方案为:
一组活动性结核病诊断标志物,包括抗MT1560IgG抗体、抗Rv0049IgM抗体、抗Rv0270IgM抗体、抗Rv0350IgG抗体、抗Rv0350IgM抗体、抗Rv0494IgM抗体、抗Rv1597IgM抗体、抗Rv2450cIgM抗体、抗Rv2511IgG抗体、抗Rv2688cIgM抗体、抗Rv3480cIgM抗体,抗Rv1860IgG抗体、抗Rv1876IgM抗体、抗Rv2031cIgG抗体和抗Rv2352cIgM抗体,其序列对应SEQ:ID:NO:1-SEQ:ID:NO:15。
本发明所述活动性结核病诊断标志物在筛选活动性结核病诊断产品中的用途。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明通过商品化MtbProtTM结核分枝杆菌蛋白质组芯片筛选活动性结核病诊断分子标志物,该芯片涵盖>95%的编码基因,包含4262个结核分枝杆菌重组蛋白。临床血清样本包括正常对照组、潜伏感染组以及活动性肺结核组,分别独立地与芯片反应,以检测实验组中针对某一种或几种抗原蛋白,具有普遍性的特异性的抗结核抗体(IgG或IgM)。基于初筛结果,选择差异较为明显的94个结核分枝杆菌蛋白质及本研究团队既通过双向凝胶电泳技术分离获得的6个结核分枝杆菌差异表达蛋白质,自制含100个差异表达蛋白质小芯片,送公司点片,每个蛋白重复两点点制,进行200余份血清样本的临床验证,最终获得15个诊断活动性肺结核的候选标志物(MT1560IgG,Rv0049IgM,Rv0270IgM,Rv0350IgG,Rv0350IgM,Rv0494IgM,Rv1597IgM,Rv1860IgG,Rv1876IgM,Rv2031cIgG,Rv2352cIgM,Rv2450cIgM,Rv2511IgG,Rv2688cIgM和Rv3480cIgM)。联合分析这15个蛋白质相应抗体的检测结果,判断被检人是否为活动性结核病,结果表明,本发明提供小芯片辅助诊断活动性肺结核的最佳工作点的特异性为90.3%,灵敏度为85.4%,均高于现有技术中活动性结核病诊断的指标。
附图说明
图1为基于MtbProtTM蛋白质芯片的活动性结核病诊断标志物的发现与筛选流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
一、血清诊断标志物的发现与验证
(一)基于MtbProtTM蛋白质芯片的结核病诊断标志物的发现与筛选:
1.检测原理:购买博翀生物公司MtbProtTM结核分枝杆菌蛋白质组芯片,该芯片包含4262个结核分枝杆菌重组蛋白,涵盖>95%的编码基因。临床血清样本包括正常对照组、结核潜伏感染组、以及活动性结核病组,分别独立地与芯片反应,以检测实验组中针对某一种或几种抗原蛋白,具有普遍性的特异性的抗结核抗体(IgG或IgM),这些抗原蛋白可以作为诊断标志物来表征疾病状态。
2.实验操作人:由芯片服务组生产人员执行操作。
3.流程图如图1所示。
4.实验操作步骤:
1)预封闭:使用芯片孵育盒(广州翀博公司自制),加入5ml封闭液,将待质控芯片从-80℃取出,正面朝上置于孵育盒中;再横向放在侧摆摇床(国产)上,50-60rpm,室温,10min。
2)封闭:倒弃封闭液,迅速加入5ml新的封闭液,侧摆摇床20-30rpm,室温1h。
3)血清样本孵育:倒弃封闭液,迅速加入预先准备好的蛋白样本孵育液3ml,侧摆摇床20-30rpm,室温3h。蛋白样本孵育液:3ml孵育液加入30μl血清(新鲜制备或冻存于-80度,由专利申请人提供)。
4)清洗:将芯片取出,置于加入有40ml清洗液的芯片清洗盒,剧烈晃动10-15次,并更换清洗液,再次剧烈晃动10-15次,充分去除游离一抗;再次更换清洗液,至于水平摇床上,60-70rpm,5min每次,清洗3次。
5)二抗孵育:倒弃清洗液,迅速加入预先准备好的二抗孵育液3ml,侧摆摇床20-30rpm,避光,室温45min。二抗孵育液:使用anti-human IgG荧光二抗(549anti-人IgG,激发光532nm,或635anti-人IgM,激发光635nm,Jackson ImmunoResearch),孵育液稀释抗体至其工作液浓度,总体积为3ml。二抗孵育时避光。
6)清洗:同步骤“4”。注意该过程应避光操作。
7)完成后用ddH20清洗5min x 2次,并冲洗10s。注意该过程应避光操作。
8)干燥。将芯片置于芯片干燥机(博奥生物,Slidewasher),离心干燥。
9)扫描。按照扫描仪(博奥生物,Luxscan 10K)操作规范和使用说明操作,设置参数为:532nm(或对应荧光波长),Power 100%,PMT value 500
10)数据提取:将对应GAL文件打开,将芯片图像和GAL文件每个阵列整体对齐,按下自动对齐按钮,提取数据并保存LPR文件。
(二)基于自行设计(自制)蛋白质小芯片的活动性结核病诊断标志物的验证
基于第一步的初筛结果,选择差异较为明显的94个结核分枝杆菌蛋白质及本研究团队既通过双向凝胶电泳技术分离获得的6个差异表达蛋白质,第二步自行设计(自制)含100个差异表达蛋白质小芯片,送公司点片,每个蛋白重复两点点制,进行200余份血清样本的临床验证。
1.检测原理:特异性的抗体(包括IgG、IgM或其它类型抗体)与固定于芯片上的蛋白进行结合,清洗去除未结合的抗体和其它蛋白质,再用抗人IgM荧光标记二抗(cy5标记,呈现红色)和抗人IgG荧光二抗(cy3标记,呈现绿色)检测,通过荧光扫描仪读取信号,信号的强弱与抗体的亲和力和数量呈正相关。
2.样品要求:患者血清,冻存于-80度(由专利申请人提供)。
3.准备以下溶液:
1)封闭液:1ml10%BSAm,加入9ml 1x PBSml溶液,混匀。
2)孵育液:1x PBST 1x PBST1溶液。
3)清洗液:1x PBST。
4.操作步骤:
1)预封闭:使用芯片孵育盒,加入5ml封闭液,将芯片从-80℃取出,正面朝上置于孵育盒中;再横向放在侧摆摇床上,50-60rpm,室温,10min。
2)封闭:倒弃封闭液,迅速加入5ml新的封闭液,侧摆摇床20-30rpm,室温2h。
3)样本孵育:倒弃封闭液,分别使用1XPBS,0.2XPBS ddH 20q清洗1次,5min/次;然后离心干燥。将专用围栏安装加入样本:孵育液稀释然后离心干燥。将专用围栏安装加入样本:孵育液稀释然后离心干燥。将专用围栏安装加入样本:孵育液稀释1:200,并加入芯片200ul体积,侧摆摇床20-30rpm,4度过夜。
4)清洗:将芯片取出(注意不能触及或划破的上表面)摘除围栏,置于加入有40ml清洗液的芯片盒,剧烈晃动10-15次,并更换清洗液,再剧烈晃动10-15次,充分去除游离一抗;再次更换清洗液,至于水平摇床上充分去60-70,5min每次,清洗3次。
5)荧光标记IgG/IgM二抗孵育:倒弃清洗液,迅速加入预先准备好的二抗孵育液3ml(1∶1000稀释),侧摆摇床20-30rpm,避光,室温45min。注意需要避光。
6)清洗:同步骤“4”。注意该过程应避光操作。
7)完成后用ddH 20清洗5min x 2次,并冲洗10s。注意该过程应避光操作。
8)干燥。将芯片置于芯片机,离心干燥。
9)扫描。按照扫描仪的操作规范和使用说明,设置参数为:635nm,Power 100%Power,PMT value 400:532nm,Power 100%,PMT value 400。
10)数据提取:将对应GALGAL文件打开,将芯片图像GAL文件每个阵列整体对齐,按下自动对齐按钮,提取数据并保存GPR文件。
二、数据分析与文献资料查阅
1.为了消除不同样品、不同芯片之间的系统性差异带来的误差,需要对芯片数据进行归一化处理。归一化过程中,每个蛋白对应的两个点取平均值作为该蛋白响应的信号值。
2.数据分析:按结核病诊断意义,将样本组分为3组:正常对照组、结核潜伏感染组、以及活动性结核病组,进行统计分析以发现活动性结核病诊断性血清分子标志物。
3.首先较独立筛选出候选标志物:根据每个蛋白对每个样本的响应信号值,假设该蛋白在所对比的两组样本中具有显著性差异且在TB组样本中呈更强的响应(免疫响应较强),并计算其可信程度,以T test的P值来表征,当P value<0.05时,表示具有显著差异;同时计算两组样本的信号均值差异比,以fold change(fc,fc=log2(TB组/对照组))来表示,fc越大,表示响应程度越高;另外,对于候选标志物的组合,根据已知分组样本的响应值,基于SPSS统计分析软件,构建判别函数,并最终绘制ROC曲线,给出临床诊断评价指标:特异性和灵敏度。
4.进一步通过SPSS统计软件,优化出最优组合,并生成判别函数(DiscriminationFunction),参数具体为:采用步进式方法,以均值为描述参数,基于fisher函数系数的统计分析,从标志物优选出血清分子标志物。
5.针对活动性结核病诊断的实际问题,从大量样本中,优先进行正常对照组、结核潜伏感染组以及活动性肺结核组进行诊断,最终获得15个标志物组合,分别为MT1560IgG,Rv0049IgM,Rv0270IgM,Rv0350IgG,Rv0350IgM,Rv0494IgM,Rv1597IgM,Rv1860IgG,Rv1876IgM,Rv2031cIgG,Rv2352cIgM,Rv2450cIgM,Rv2511IgG,Rv2688cIgM和Rv3480cIgM。这些标志物组合,可较为准确地区分活动性肺结核与其它样本组,可作为诊断活动性肺结核的候选标志物,特异性为90.3%,灵敏度为85.4%。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一组活动性结核病诊断标志物,其特征在于,包括MT1560IgG、Rv0049IgM、Rv0270IgM、Rv0350IgG、Rv0350IgM、Rv0494IgM、Rv1597IgM、Rv2450cIgM、Rv2511IgG、Rv2688cIgM、Rv3480cIgM,Rv1860IgG、Rv1876IgM、Rv2031cIgG和Rv2352cIgM,MT1560、Rv0049、Rv0270、Rv0350、Rv0350、Rv0494、Rv1597、Rv2450c、Rv2511、Rv2688c、Rv3480c,Rv1860、Rv1876、Rv2031c和Rv2352c的核苷酸序列对应SEQ:ID:NO:1-SEQ:ID:NO:15。
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Families Citing this family (1)
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101424661A (zh) * | 2008-07-23 | 2009-05-06 | 中国人民解放军总医院第二附属医院 | 一种活动性肺结核病的血清诊断模型的建立方法 |
WO2009094212A1 (en) * | 2008-01-23 | 2009-07-30 | The Regents Of The University Of California | Diagnostic assay for detection of active tuberculosis |
CN103698512A (zh) * | 2013-11-25 | 2014-04-02 | 广东体必康生物科技有限公司 | 结核分支杆菌蛋白在制备诊断潜伏性肺结核感染的产品中的用途 |
CN104678097A (zh) * | 2015-03-10 | 2015-06-03 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种用于肺结核诊断的结核分枝杆菌组合抗原 |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009094212A1 (en) * | 2008-01-23 | 2009-07-30 | The Regents Of The University Of California | Diagnostic assay for detection of active tuberculosis |
CN101424661A (zh) * | 2008-07-23 | 2009-05-06 | 中国人民解放军总医院第二附属医院 | 一种活动性肺结核病的血清诊断模型的建立方法 |
CN103698512A (zh) * | 2013-11-25 | 2014-04-02 | 广东体必康生物科技有限公司 | 结核分支杆菌蛋白在制备诊断潜伏性肺结核感染的产品中的用途 |
CN104678097A (zh) * | 2015-03-10 | 2015-06-03 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种用于肺结核诊断的结核分枝杆菌组合抗原 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Comprehensive analysis of exported proteins from Mycobacterium tuberculosis H37Rv;Hiwa Målen et al.;《Proteomics》;20070417;第7卷;1702–1718 * |
Progress on the Biomarkers for Tuberculosis Diagnosis;Tiwei Fu et al.;《Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression 》;20111231;第21卷(第4期);379-391 * |
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Publication number | Publication date |
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