CN103954754A - 一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,该试剂盒能特异性识别细胞因子I-309、MIG、IL-8中至少一个,也可对所识别的细胞因子进行定量分析,也可以联合对结核分枝杆菌抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B的特异性IgG抗体进行特异性识别。本发明试剂盒选用的这3种细胞因子是未感染人群与活动性肺结核病患者中表达差异最显著的,用于作为活动性肺结核病的检测标志物,能够极好地区分患者和非感染者,敏感性为0.952、特异性为1,且其表达量高,可提高诊断的灵敏度,再联合检测这抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B的特异性抗体,进一步加强了诊断的准确性和灵敏性。
Description
技术领域
本发明属于血清学免疫诊断领域,具体涉及一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒。
背景技术
结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的以呼吸道传播为主的传染病,是单因致死率最高的慢性传染性疾病。结核分枝杆菌可以侵入人体全身各种器官,但主要侵犯肺脏,称为肺结核病。到20世纪80年代后期,由于贫困、艾滋病、人口流动和耐药等因素,结核病发病率和死亡率在全球范围内出现快速回升,成为与艾滋病并列的全球性危害最严重的传染病。据世界卫生组织(WHO)估计,全世界约有1/3人口为结核带菌者,其中约5-10%的携带者可发展为活动性肺结核病,每年新发病例1000万,超过300万人死亡。近年来,多重耐药结核(multidrug resistance tuberculosisclebacillus,MDR-TB)的流行以及人类免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus,HIV)感染、器官移植、免疫抑制剂使用等所致免疫损害宿主(immuno-compromised host,ICH)增多和高龄人口中机体免疫力低下等因素,使结核分支杆菌感染更加难以控制。为了进一步提高结核病的诊断、治疗和预防控制的水平,我们迫切需要开发更为准确、快速、有效的诊断产品,用于活动性肺结核的诊断。
目前,根据每种技术所针对的靶标的不同,可将结核病诊断技术分为三大类,分别是病原学方法、分子生物学方法和免疫学方法。
病原学诊断方法以涂片法和各种结核分枝杆菌培养方法为代表。其中,涂片法可快速检测出标本中的抗酸杆菌,一般1个小时内可出结果,是全世界应用最广泛的结核病实验室诊断技术,也常用来监测治疗效果,但其检出率低,一般不超过30%;罗氏培养法是目前结核病诊断的金标准,但其所需要周期长,培养时间一般需要4-8周,而结核病强化期的治疗是2个月。虽然目前临床常用的BACTECTM MGITTM960和BacT/ALERT3D快速培养仪系统在一定程度上缩短了培养时间,提高了检出率,但其需时也较长,如果等培养结果出来再对患者进行干预,将会延误治疗;但如果不等培养结果即进行治疗,又可能因为误诊使患者承受抗结核药物副作用所带来的痛苦。
分子生物学方法是近来发展比较迅速的一个领域,PCR技术及其他体外核酸扩增技术在结核病领域的应用,为结核病的诊断和鉴别诊断开辟了新途径。在PCR技术的基础上已发展出多种的核酸扩增技术,包括PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、序列特异引物—多聚酶链反应(PCR-SSP)、PCR与核酸探针技术的结合、限制性片段长度多态性及限制性内切酶分析等。近两年,结核病的分子生物学诊断仍集中在以核酸扩增为核心的检测技术的应用上,如Xpert Mtb/RIF、Multiplex PCR、分子线性探针测定法、实时荧光PCR技术、恒温扩增技术(LAMP)、基因芯片技术等。结核病分子生物学的研究在不同领域已取得较大进展,随着各种技术不断完善与发展,分子生物学将为结核病的诊断、治疗、流行病学调查等提供更大帮助。
而关于免疫学方法,近年来γ-干扰素释放试验、腺苷脱氨酶(ADA)联合IGRAs、流式细胞术分析T细胞特异性抗原等技术取得了一定的进展,但目前市场上所应用的血清学结核病诊断方法都不能取得令人满意的结果。
发明内容
针对现有技术所存在的问题,本发明通过蛋白芯片技术批量筛选获得能有效区分未感染人群与活动性肺结核患者的细胞因子组合,并结合检测血清中的特异性抗体,开发一种准确性高、灵敏性高、操作简便、检测速度快的活动性肺结核病的血清学免疫诊断试剂盒。
本发明的目的在于提供一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒。
本发明所采取的技术方案是:
一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,该试剂盒能特异性识别细胞因子I-309、MIG或IL-8中至少一个。
进一步的,上述试剂盒可对细胞因子I-309、MIG或IL-8中至少一个进行定量。
进一步的,一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,该试剂盒能特异性识别细胞因子I-309、MIG和IL-8,同时能对这3种细胞因子的含量分别进行定量。
进一步的,一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,该试剂盒能特异性识别细胞因子I-309、MIG和IL-8,同时能对这3种细胞因子的含量分别进行定量,且能特异性识别结核分枝杆菌抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B的特异性IgG抗体。
进一步的,一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,该试剂盒含有蛋白芯片,该蛋白芯片上含有检测指标MIG、I-309、IL-8这3种细胞因子的抗体,及结核分枝杆菌的特异性抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B,并通过ELISA原理对细胞因子I-309、MIG和IL-8进行定量检测,同时特异性识别38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B的特异性IgG抗体。
本发明的有益效果是:
1)本发明通过蛋白芯片技术及生物信息学方法进行批量筛选,从中筛选获得3种表达差异最显著的细胞因子(I-309、MIG和IL-8)作为活动性肺结核病的检测标准物,能够有效区分未感染人群与活动性肺结核病患者,且其表达量高,可提高诊断的灵敏度。
2)38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B是结核分枝杆菌的特异性菌体抗原,能够在活动性肺结核病患者体内诱导相应的特异性IgG抗体产生,在检测上述3种细胞因子的同时,再联合检测这两种抗原的特异性抗体,可进一步加强诊断活动性肺结核病的准确性和灵敏性。
3)利用蛋白芯片技术,将上述3种细胞因子(I-309、MIG和IL-8)的特异性抗体以及38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B抗原点制成芯片,制成利用ELISA原理检测的试剂盒,从而能够在48小时内检测出不同人群外周血中的细胞因子I-309、MIG和IL-8,及抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B的IgG抗体的含量,从而为活动性肺结核病提供一种更为有效的免疫诊断手段,具备有效的准确性和灵敏性,且操作简便,检测时间快,适于推广应用。
4)ELISA原理检测血清当中的标志物,操作简单,技术成熟,是普遍使用的检测原理,相对目前临床所应用的IFN-γ释放实验,本发明直接针对血清标志物,省去了细胞分离、培养、刺激、孵育等繁琐的步骤,直接针对血清中的标志物进行检查,可以方便、快速、稳定地得到检测结果。
附图说明
图1为活动性肺结核病患者(左)和未感染者(右)血清样本的芯片扫描荧光信号图;
图2为不同分组中显著差异表达基因的热图(heatmap)区分效果(a:活动性肺结核病患者,N:未感染者);
图3为细胞因子组间差异倍数与P值的火山图区分效果;
图4为交叉验证错误分类率与阈值的关系(a:活动性肺结核病患者,N:未感染者);
图5为5种细胞因子区分两类人群的ROC曲线;
图6为5种细胞因子区分3类人群的敏感性与特异性示意图;
图7为5种细胞因子区分三类人群的ROC曲线;
图8为蛋白芯片的点样模式图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。
实施例1
一、可用作活动性肺结核的血清标志物的筛选
(1)样本、材料和方法
血清样本信息:如表1所示,12例未感染样本经实验室细胞学检查、临床影像学及病史、查体检查排除活动性肺结核感染后纳入健康组(包括:男6例、女6例,年龄在12~43岁之间,平均20.0岁)血清由惠州市结核病防治所提供(见表1中样本分类为“N”的样品);21例结核病患者血清由深圳市宝安区慢性病防治院提供(包括:男11例、女10例,年龄在19~65岁之间,平均32.0岁)根据临床及实验室检查确诊为活动性肺结核后纳入病人组(见表1中样本分类为“a”的样品),血清样本具体信息如表1所示。
表1芯片血清样本信息
注:样本分类中,N代表未感染人群,a代表活动性肺结核患者人群。
样本采集与保存:抽取静脉血4~5ml于2支真空促凝管中,室温静置约30min,4000rpm离心5min,吸取血清均分至2支2ml低温冻存管中,-70℃冰箱保存备用。
试剂与仪器:一次性真空促凝管购自广州阳普医疗科技股份有限公司;冻存管、及吸头等一次性耗材均为无酶、无菌进口耗材;由RayBiotech公司提供专业扫描及数据处理;蛋白芯片为美国RayBiotech公司细胞因子抗体芯片,芯片货号:QAH-INF-3,其检测的40种细胞因子类型如表2所示;
表2细胞因子抗体芯片(QAH-INF-3)检测的细胞因子类型
统计方法:统计分析采用Arraytools软件的classcomparison、Classprediction及PAM等分析方法。
(2)芯片筛选血清标志物
实验方法:细胞因子抗体芯片操作
1)室温平衡血清;
2)对细胞因子标准品进行梯度稀释;
3)每孔加入100uL样品稀释液,室温孵育30分钟;
4)将血清样本和标准品添加至芯片中孵育过夜,添加过程中严格避免气泡的产生;
5)去除各孔中的样本,加入试剂盒提供的Wash Buffer I各150uL,洗板5次,每次5分钟,完全去除样品孔中的液体;
6)各孔加入所检测的40种细胞因子的抗体80uL,室温孵育1-2小时;
7)去除各孔中的样本,加入试剂盒提供的Wash Buffer II各150uL,洗板5次,每次5分钟,完全去除样品孔中的液体;
8)各孔加入偶联链霉亲和素的Cy3等价染料80uL,室温避光孵育1小时;
9)去除各孔中的样本,加入试剂盒提供的Wash Buffer I各150uL,洗板5次,每次5分钟,完全去除样品孔中的液体。
实验结果:
1)芯片扫描
对上述33份血清样本(12未感染者,21例活动性肺结核病患者)进行芯片扫描,扫描结类似于图1所示,图1为具有代表性的1例活动性肺结核病患者和1例未感染者血清样本的芯片扫描图。
从荧光图片上可以看到活动性肺结核病患者(a)的部分细胞因子信号强度明显高于未感染者,提示说明这些细胞因子在活动性肺结核病患者体内的表达量可能显著性增加。
进一步对相应的荧光信号进行定量,定量结果如表3和表4所示,表3为12例未感染者的外周血中40种细胞因子在芯片上的荧光信号值,表4为21例活动性肺结核病患者的外周血中40种细胞因子在芯片上的荧光信号值。
表312例未感染者的外周血中40种细胞因子在芯片上的荧光信号值。
表421例活动性肺结核病患者的外周血中40种细胞因子在芯片上的荧光信号值。
2)芯片扫描数据分析及标志物的确定
利用Arraytools芯片分析软件中的t-test方法对上述芯片荧光值进行分析,其中有5种细胞因子的荧光信号强度(代表细胞因子含量)在正常人群(N组)和活动性肺结核患者人群(a组)中存在显著性差异(P<0.01),具体分析结果如表5所示。
表5蛋白芯片数据显示未感染者(N)和活动性肺结核患者(a)间具有表达差异的细胞因子。
序号 | 名称 | 荧光信号均值 | 荧光信号均值 | 倍数 | P值 | FDR |
(a) | (N) | (N/a) | ||||
1 | I-309 | 386.14 | 74.88 | 5.16 | 3.71e-05 | 0.000741 |
2 | MIG | 1604.6 | 356.75 | 4.50 | 4.71e-05 | 0.000741 |
3 | Eotaxin-2 | 3653.79 | 1387.24 | 2.63 | 5.42e-05 | 0.000741 |
4 | IL-8 | 3573.68 | 869.11 | 4.11 | 0.0001208 | 0.00124 |
5 | ICAM-1 | 6067.87 | 1501.63 | 4.04 | 0.0008559 | 0.00702 |
表5分析显示,相比正常人群,I-309、MIG、Eotaxin-2、IL-8和ICAM五种细胞因子在活动性肺结核患者中的表达水平极显著增高(p<0.01),增加的倍数均大于2.6。
对表5中具有显著性表达差异的5个细胞因子作进一步的热图(heatmap)区分及火山图(-log10(p-value)VS log2(Fold change))区分的分析,分析结果如图2和图3所示,从中可以看出I-309、MIG、Eotaxin-2、IL-8和ICAM这5种细胞因子对正常人群和活动性肺结核人群的区分效果最明显;因此选取I-309、MIG、Eotaxin-2、IL-8和ICAM这5种细胞因子作为对未感染人群和活动性肺结核人群进行区分与评估的指标具有最显著的效果。
在图3所示的火山图中,当-Log10(P-value)大于1.301时,该细胞因子在两组间的P值小于0.05,说明其具有统计学意义,如I-309、MIG、Eotaxin-2、IL-8、ICAM-1、IL-6sR、Eotaxin这7种细胞因子P值均小于0.05,且I-309、MIG、Eotaxin-2、IL-8、ICAM-1这5种细胞因子的组间差异倍数大于2.6。
同时,利用PAM统计法,对上述5个细胞因子作为临床诊断活动性肺结核的诊断进行效能评估,如图4和图5所示。
从图4中可以看出,当利用I-309、MIG、Eotaxin-2、IL-8和ICAM这5种细胞因子作为区分正常人群和活动性肺结核人群时,其错误区分的系数接近于0,且33例样本(12例正常人,21例活动性肺结核人群)均可完全区分开来。因此利用上述5种细胞因子作为诊断活动肺结核的免疫指标,效果良好。
其诊断效能为:ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线下面积(Area Underthe ROC Curve,AUC)为0.929,非常接近1(如图5所示),说明利用上述5种细胞因子区分正常人群和活动性肺结核患者两种人群的正确的概率非常高,其区分的效能分别为敏感性0.952、特异性1、阳性预测值1、阴性预测值0.923,详见表6。
表65种细胞因子组合区分两类人群的效能评价
分组 | 敏感性 | 特异性 | 阳性预测值(PPV) | 阴性预测值(NPV) |
a | 0.952 | 1 | 1 | 0.923 |
N | 1 | 0.952 | 0.923 | 1 |
注:N代表未感染者,a代表活动性肺结核病患者
二、结核分枝杆菌特异性抗原的筛选与验证
我们选择了四个结核分枝杆菌的特异性抗原(Ag85B、38-KDa、14-16-KDa和32-KDa),作为检测结核病患者血清中抗结核抗体的免疫标志物,首先将这4种抗原制作成蛋白芯片,然后分别检测不同人群中的抗结核分枝杆菌IgG抗体,实验如下:
(1)血清样本收集:集健康人群(N)血浆样本60份,活动性肺结核病患者(P)血浆样本60份,肺部其他疾病患者(O)血浆样本60份(其中,1例为肺部感染,46例为支气管炎,1例为气胸,4例为肺炎,1例为脑出血),样本具体信息如表7所示。
表7细胞因子芯片验证实验样本信息表
(2)结核分枝杆菌抗原测试
①实验方法:
将上述的60例正常人血清、60例活动性肺结核病患者的血清、60例肺部其他疾病患者血清通过免疫斑点法测试,检测抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B这四种结核分枝杆菌特异性抗原是否可以特异性的捕获人血清的抗结核分枝杆菌的特异性抗体。
a)抗原稀释,每种抗原分别稀释为1mg/ml;0.5mg/ml;0.25mg/ml;0.125mg/ml;0.6mg/ml;0mg/ml这6种浓度。
b)点膜:将以上四种抗原点在同一张膜上,每个浓度重复2个点。
c)封闭。
d)去掉封闭液,每张膜分别加入300ul的正常人血清、活动性肺结核病患者血清、结核分枝杆菌感染者血清,室温孵育1hr。
e)去掉血清,每张膜洗涤干净。
f)拍干洗液,每张膜加入300ul的生物素标记的小鼠抗人IgG的IgG(Biotin-Mouseanti Human-IgG-IgG,100ng/ml),室温孵育30min。
g)去掉检测抗体,每张膜洗涤干净。
h)每张膜表面均匀滴加200ul的化学发光液,避光孵育30S,去掉化学发光液,用化学发光成像系统进行成像。
②结果
上述化学发光成像系统扫描结果如表8所示,●代表阳性结果,○代表阴性结果。
表8结核分枝杆菌抗原测试荧光检测结果
对表8中的抗原测试结果作进一步的统计和分析,结果如表9所示。
表9四种抗原测试结果汇总表
根据表9中统计数据,对38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B四种抗原的敏感性和特异性进行分析,结果如表10所示。
表10四种抗原的敏感性和特异性分析表
由表10可知,独立检测时,这四个抗原的特异性较好,都达到了90%以上,但是敏感性不够。38-KDa的特异性最好,但敏感性最差,Ag85B的敏感性最好,但特异性最差。四个结核抗原都可以特异性的检测检核病患者中的抗体,但是独立检测的灵敏度有限,都低于55%。四个结核抗原联合检测可以大大提高对肺结核诊断的灵敏性和特异性,因此,将以上4个抗原可以作为芯片检测中的指标,具有较好的灵敏性和特异性。要提高其检测敏感性,还需要增加其他检测标志物。
三、含5种细胞因子的蛋白芯片对活动性肺结核的诊断效能
(1)蛋白芯片制备
制备蛋白芯片所需要的所有抗体(MIG、I-309、ICAM、IL-8、Eatoxin-2这5种细胞因子的抗体)原材料,并将这些作为检测指标的抗体和结核分枝杆菌的特异性抗原固定在一个固相载体,构成一款芯片。芯片的固相载体,我们选择Millipore公司开发的多聚—L—赖氨酸预处理的玻片。经过测试,该玻片具有很好的蛋白吸附力,又不影响抗体的活性,同时采用5%的BSA可以很好的封闭多余的蛋白结合位点,适合用于做蛋白芯片。点样仪我们采用biodot公司的非接触式点样仪,该点样仪具有较好的点样体积精度和点样位置精度。我们将以上筛选好的包被抗体及抗原溶解在点样缓冲液(5%的蔗糖,10%的甘油),将种抗体和抗原的浓度调为500ug/ml。然后,将配置好的抗体点在40张载玻片上(12孔/张),点样体积为800pl/dot,每个指标点4个重复点,点完后的芯片放在37℃的洁净烘箱中干燥30分钟;然后,每孔加入100ul的封闭液(5%的BSA in PBS)进行封闭2小时;最后拍干封闭液,将芯片放入密封袋中-20℃保存。
(2)临床血清验证:
为了验证我们的芯片的确可以对人血清的这些指标进行定量检测,我们收集了180例的临床血清样本(60例的正常血清样本,60例的活动性肺结核病患者的血清样本,60例肺部其他疾病患者的血清样本),通过我们的制备的芯片进行检测,确定这5个细胞因子组合对诊断活动性肺结核的效能。
利用蛋白芯片对180例血清样本(60例健康人群N,60例活动性肺结核病患者P,60例肺部其他疾病患者O)中的5种细胞因子含量进行检测,这5种细胞因子分别为MIG、I-309、ICAM、IL-8、Eatoxin-2,检测结果如表11所示。
表11蛋白芯片检测三类人群中5种细胞因子的含量(单位:pg/mL)
从表11中可以看出,相比正常人群和肺部其他疾病患者,I-309、MIG、Eotaxin-2、IL-8和ICAM五种细胞因子在活动性肺结核病患者中的含量明显增高,也就是说可以通过检测这5个种细胞因子的含量可以很好地检测出活动性肺结核病。
对I-309、MIG、Eotaxin-2、IL-8和ICAM五种细胞因子区分3类人群的敏感性与特异性及约登指数进行分析,如图6和表12所示,根据5种细胞因子的约登指数,可以更好的确定由5种细胞因子区分不同人群的临界指标,使其敏感性与特异性达到最优范围。
表125种细胞因子区分3类人群的约登指数(单位:ng/mL)
对图7中5种细胞因子的ROC曲线下面积(Area Under the ROC Curve,AUC)进行统计如表13所示。
表135种细胞因子的ROC曲线下面积(Area Under the ROC Curve,AUC)
综合上述结果可知:上述五种用于活动性肺结核诊断的细胞因子中,I-309、IL-8和MIG三种细胞因子的效果最好,其受试者工作曲线下面积均大于0.8,当MIG、IL-8、ICAM、Eatoxin-2和I-309的cutoff分别为1.72、.02、126.7、2.56及0.03时,其诊断效能分别为0.6689、0.2911、0.2640、0.6182及0.6629。
通过对180例临床样本评估数据进行分析后发现,ICAM、Eotaxin-2对于诊断活动性肺结核意义不大;仅细胞因子I309、MIG、IL-8三种细胞因子的诊断效能就接近I309、MIG、IL-8、ICAM、Eotaxin-2五种细胞因子的诊断效能。因此I309、MIG、IL-8三种细胞因子将作为活动性肺结核诊断的关键生物标志物。
四、含种细胞因子和结核分枝杆菌特异性抗原的复合蛋白芯片对活动性肺结核的诊断效能
(一)蛋白芯片制备
制备蛋白芯片所需要的所有抗体(MIG、I-309、ICAM、IL-8、Eatoxin-2这5种细胞因子的抗体)原材料,并将这些作为检测指标的抗体和结核分枝杆菌的特异性抗原固定在一个固相载体,构成一款芯片。芯片的固相载体,我们选择Millipore公司开发的多聚—L—赖氨酸预处理的玻片。经过测试,该玻片具有很好的蛋白吸附力,又不影响抗体的活性,同时采用5%的BSA可以很好的封闭多余的蛋白结合位点,适合用于做蛋白芯片。点样仪我们采用biodot公司的非接触式点样仪,该点样仪具有较好的点样体积精度和点样位置精度。我们将以上筛选好的包被抗体及抗原溶解在点样缓冲液(5%的蔗糖,10%的甘油),将种抗体和抗原的浓度调为500ug/ml。然后,将配置好的抗体和抗原一起点在40张载玻片上(12孔/张),点样体积为800pl/dot,每个指标点4个重复点,指标的位置如下图8所示。点完后的芯片放在37℃的洁净烘箱中干燥30分钟;然后,每孔加入100ul的封闭液(5%的BSA in PBS)进行封闭2小时;最后拍干封闭液,将芯片放入密封袋中-20℃保存。
(二)临床血清验证细胞因子和结核分枝杆菌特异性抗原的联合诊断效能:
(1)临床样本选择:
我们临床血清或者血浆样本包括健康人群81例,活动性肺结核患者78例,肺部其它疾病患者49例。
样本为半透明、无杂质沉淀。有明显溶血、高脂、沉淀或污染的样本剔除。所有样本均的基本信息、临床及实验室诊断结果齐全。样本信息如表14所示。
表14蛋白芯片临床验证样本信息表
(2)结果判断方法:根据上述研究结果,我们初步确定诊断活动性肺结核的判断标准为:4种结核抗原中任意一种抗原阳性即报告阳性结果;I309、MIG、IL-8三种细胞因子的结果读数均大于临界值(cutoff I-309>0.04ng/ml;MIG>1.72ng/ml;IL-8>0.02ng/ml)时,即报告阳性结果。
(3)验证结果:
根据上述结果判断方法,对208例不同人群的临床样本进行蛋白芯片检测,其结果如表15所示。
表15蛋白芯片对208例临床确诊样本检测卡方表
分析相关数据,确定不同检测指标的组成区分不同人群的各项指标,结果如表16~18所示,从表16中可以看出“I-309+MIG+IL-8+38KDa+32K-Da+14-16-KDa+Ag85B”组合的芯片区分正常人群与活动性肺结核患者的诊断效能最好;从表17中可以看出“I-309+MIG+IL-8+38KDa+32K-Da+14-16-KDa+Ag85B”组合的芯片区分肺部其他疾病与活动性肺结核患者的诊断效能最好;从表18中可以看出“I-309+MIG+IL-8+38KDa+32K-Da+14-16-KDa+Ag85B”组合的芯片区分活动性肺结核患者与其他人群的诊断效能最好。
表16芯片区分正常人群与活动性肺结核患者的诊断效能表
表17芯片区分肺部其他疾病与活动性肺结核患者的诊断效能表
表18芯片区分活动性肺结核患者与其他人群※的诊断效能表
其他人群※包括:正常人+肺部其他疾病患者
综上所述,细胞因子I309、MIG、IL-8联合32KDa、38KDa、14-16KDa、Ag85B共同检测活动性肺结核的诊断效能最好,敏感性为91.03%;特异性为90.77%;阳性预测值为85.54%;阴性预测值为94.40%;准确率为90.87%;诊断效能为81.79%。达到临床诊断要求,具有产业化的潜质。
五、一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒
根据上述内容可知,本发明通过蛋白芯片技术,从40种细胞因子中筛选获得3种能够有效区分未感染者与活动性肺结核病患者的细胞因子((I-309、MIG、IL-8),那么细胞因子I-309、MIG、IL-8可作为活动性肺结核病的检测指标,对活动性肺结核病患者和未感染者具有很好的区分效果,可以制备一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,该试剂盒能特异性识别细胞因子I-309、MIG、IL-8中至少一个,从而为诊断活动性肺结核提供一种有效的免疫诊断手段。
另外,细胞因子I-309、MIG、IL-8在活动性肺结核病患者体内含量显著上调,通常为未感染者的1.5倍及以上,那么可以制备一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,该试剂盒能特异性识别细胞因子I-309、MIG、IL-8中至少一个,且能够对所识别的细胞因子进行定量。或者制备一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,该试剂盒能同时分别特异性识别细胞因子I-309、MIG、IL-8,且同时能对这3种细胞因子的含量分别进行定量。
再次,38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B是结核分枝杆菌的特异性菌体抗原,能够在活动性肺结核病患者体内诱导相应的IgG抗体产生,为了进一步加强诊断活动性肺结核的准确性和灵敏性,可以利用蛋白芯片技术,将上述3种细胞因子(I-309、MIG、IL-8)的特异性抗体以及38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B抗原点制成芯片,制成利用ELISA原理检测的试剂盒,从而能够在48小时内检测出不同人群外周血中的细胞因子I-309、MIG、IL-8,及抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B的IgG抗体的含量,从而为活动性肺结核病提供一种更为有效的免疫诊断手段,具备更好的准确性和灵敏性,且操作简便,检测时间快,适于推广应用。
上述诊断试剂盒采用成熟的、简单的、已被大家普遍使用的检测原理,直接针血清中的标志物进行检查,可以方便、快速、稳定地得到检测结果;相对目前临床所应用的IFN-γ释放实验,该方法直接针对血清标志物,省去了细胞分离、培养、刺激、孵育等繁琐的步骤;其中的3种细胞因子是通过上述高能量蛋白芯片方法得到活动性肺结核患者血清中细胞因子表达谱,然后通过信息分析得到表达差异性最显著的3种细胞因子,保证了其作为检测标准物的灵敏性和准确性,同时联合检测结核分枝杆菌特异性的菌体蛋白38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B和Ag85B抗原的特异性抗体,进一步保证了该方法的准确性和灵敏性。
Claims (5)
1.一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,其特征在于:该试剂盒能特异性识别细胞因子I-309、MIG或IL-8中至少一个。
2.根据权利要求1所述的一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,其特征在于:该试剂盒可对细胞因子I-309、MIG或IL-8中至少一个进行定量。
3.一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,其特征在于:该试剂盒能特异性识别细胞因子I-309、MIG和IL-8,同时能对这3种细胞因子的含量分别进行定量。
4.根据权利要求3所述的一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,其特征在于:该试剂盒能特异性识别细胞因子I-309、MIG和IL-8,同时能对这3种细胞因子的含量分别进行定量,且能特异性识别结核分枝杆菌抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B 的特异性IgG抗体。
5.根据权利要求4所述的一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒,其特征在于:该试剂盒含有蛋白芯片,该蛋白芯片上含有检测指标MIG、I-309、IL-8这3种细胞因子的抗体,及结核分枝杆菌的特异性抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B,并通过ELISA原理对细胞因子I-309、MIG和IL-8进行定量检测,同时特异性识别38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B 的特异性IgG抗体。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107449909A (zh) * | 2017-07-25 | 2017-12-08 | 深圳市星系生物科技有限公司 | 一种用于活动性结核诊断的蛋白芯片及试剂盒 |
CN108693345A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-10-23 | 北京睿达时代科技有限公司 | 针对结核病筛查与诊断的组合血清标记物检测试剂 |
CN112285360A (zh) * | 2020-09-23 | 2021-01-29 | 台州市第一人民医院 | I-309在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用 |
CN112782407A (zh) * | 2019-11-01 | 2021-05-11 | 南华大学 | γ干扰素诱导单核细胞蛋白在血清中表达量的检测方法及应用 |
CN114705775A (zh) * | 2022-03-31 | 2022-07-05 | 广东省结核病控制中心 | 一种肺结核评价的血清代谢标志物及其应用 |
CN114791459A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-07-26 | 浙江苏可安药业有限公司 | 用于检测肺结核的血清代谢标志物及其试剂盒 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101216491A (zh) * | 2008-01-08 | 2008-07-09 | 广州益善生物技术有限公司 | 结核分枝杆菌检测液相芯片及其制备方法 |
CN102297968A (zh) * | 2010-06-28 | 2011-12-28 | 程小星 | 辅助诊断结核病的试剂盒 |
CN102590502A (zh) * | 2012-01-11 | 2012-07-18 | 北京市结核病胸部肿瘤研究所 | 辅助诊断结核病患者的试剂盒 |
CN102621331A (zh) * | 2012-04-05 | 2012-08-01 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种检测或辅助检测结核性胸膜炎的试剂盒 |
WO2013175459A2 (en) * | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Stellenbosch University | Method for diagnosing tuberculosis disease |
-
2014
- 2014-04-30 CN CN201410182316.7A patent/CN103954754A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101216491A (zh) * | 2008-01-08 | 2008-07-09 | 广州益善生物技术有限公司 | 结核分枝杆菌检测液相芯片及其制备方法 |
CN102297968A (zh) * | 2010-06-28 | 2011-12-28 | 程小星 | 辅助诊断结核病的试剂盒 |
CN102590502A (zh) * | 2012-01-11 | 2012-07-18 | 北京市结核病胸部肿瘤研究所 | 辅助诊断结核病患者的试剂盒 |
CN102621331A (zh) * | 2012-04-05 | 2012-08-01 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种检测或辅助检测结核性胸膜炎的试剂盒 |
WO2013175459A2 (en) * | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Stellenbosch University | Method for diagnosing tuberculosis disease |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
张占英等: "结核性与肿瘤性胸腔积液中TNF和IL-8含量的研究", 《苏州大学学报(医学版)》 * |
李同霞等: "ADA、IFN-γ及结核分枝杆菌抗体联合检测对结核性胸膜炎的诊断价值", 《中国防痨杂志》 * |
王心静 等: "结核分枝杆菌特异性抗原反应性因子对活动性肺结核的鉴别诊断意义", 《免疫学杂志》 * |
谢汉华,尹本义: "肺结核患者血清IL-8水平的研究初探", 《中国现代医学杂志》 * |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107449909A (zh) * | 2017-07-25 | 2017-12-08 | 深圳市星系生物科技有限公司 | 一种用于活动性结核诊断的蛋白芯片及试剂盒 |
CN108693345A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-10-23 | 北京睿达时代科技有限公司 | 针对结核病筛查与诊断的组合血清标记物检测试剂 |
CN112782407A (zh) * | 2019-11-01 | 2021-05-11 | 南华大学 | γ干扰素诱导单核细胞蛋白在血清中表达量的检测方法及应用 |
CN112285360A (zh) * | 2020-09-23 | 2021-01-29 | 台州市第一人民医院 | I-309在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用 |
CN112285360B (zh) * | 2020-09-23 | 2023-08-22 | 台州市第一人民医院 | I-309在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用 |
CN114791459A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-07-26 | 浙江苏可安药业有限公司 | 用于检测肺结核的血清代谢标志物及其试剂盒 |
CN114791459B (zh) * | 2022-03-29 | 2023-02-14 | 浙江苏可安药业有限公司 | 用于检测肺结核的血清代谢标志物及其试剂盒 |
CN114705775A (zh) * | 2022-03-31 | 2022-07-05 | 广东省结核病控制中心 | 一种肺结核评价的血清代谢标志物及其应用 |
CN114705775B (zh) * | 2022-03-31 | 2023-09-12 | 广东省结核病控制中心 | 一种肺结核评价的血清代谢标志物及其应用 |
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