CN103954755B - 一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒，该试剂盒能特异性识别细胞因子Eotaxin‑2、MIG、Eotaxin、MCSF或IL‑12p70中至少一个，并能对所识别的细胞因子进行定量分析，还可以特异性识别抗原38‑KDa、32‑KDa、14‑16‑KDa和Ag85B的特异性IgG抗体。本发明试剂盒选用的这5种细胞因子是未感染人群与分枝杆菌潜伏感染患者中表达差异最显著的，用于作为分枝杆菌潜伏感染的检测标志物，能够极好地区分潜伏感染者和非感染者，且其表达量高，诊断灵敏度高，再联合检测4种抗原的特异性抗体，进一步加强了诊断的准确性和灵敏性，本发明试剂盒直接针对血清中的标志物进行检查，操作方便、快速，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于免疫诊断领域，具体涉及一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒。
背景技术
结核病是一个于人类发展史并存的古老疾病，目前仍是一个全球性的卫生问题，全世界估计有三分之一的人口感染过结核分枝杆菌，在这些感染人群中将会有10％的进展为活动性结核。每年新发病例1000万，超过300万人死亡。鉴于对人类生命健康的威胁，世界医学工作者一直没有放松对结核病的研究。结核病的发病流程一般是由健康人群到感染人群，然后经历时间长短不一的潜伏期发展成为活动性结核病。流行病学显示全球人口三分之一是结核分枝杆菌的感染者，如何及时发现、确定结核分枝杆菌的感染人群是实验现结核病一级预防的前提。
目前临床现有结核病潜伏感染诊断技术主要是PPD和IFN-γ释放实验。PPD是目前应用最广泛的一种方法，但是其结果判读时间长、结果判读主观性强、敏感性差等缺点。IFN-γ释放实验报告时间两天，检测效能较PPD有所提高，但是其操作繁琐，包括血液采集、细胞分离、细胞刺激培养、免疫学反应、上机检测等多个步骤，且其需要专用的昂贵设备，普及到基层组织不现实。
发明内容
针对现有技术所存在的问题，本发明通过蛋白芯片技术批量筛选获得能有效区分未感染人群与结核分枝杆菌潜伏感染患者的细胞因子组合，并结合检测血清中的特异性抗体，开发一种准确性高、灵敏性高、操作简便、检测速度快的结核分枝杆菌潜伏感染的血清学免疫诊断试剂盒。
本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒，该试剂盒能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF或IL-12p70中至少一个。
进一步的，上述试剂盒可对细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF或IL-12p70中至少一个进行定量。
进一步的，上述试剂盒能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70，同时能对这5种细胞因子的含量分别进行定量。
进一步的，上述试剂盒能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70，同时能对这5种细胞因子的含量分别进行定量，且能特异性识别结核分枝杆菌抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B的特异性IgG抗体。
进一步的，上述试剂盒的检测原理为ELISA原理。
本发明的有益效果是：
1)本发明通过蛋白芯片技术及生物信息学方法进行批量筛选，从中筛选获得5种表达差异最显著的细胞因子(Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p7)作为结核分枝杆菌潜伏感染的检测标志物，能够有效区分未感染人群与结核分枝杆菌潜伏感染患者，且其表达量高，可提高诊断的灵敏度。
2)38-KDa、32-KDa、14-16-KDa及AG85B是结核分枝杆菌的特异性菌体抗原，能够在结核分枝杆菌潜伏感染患者体内诱导相应的特异性IgG抗体产生，在检测上述5种细胞因子的同时，再联合检测这4种抗原的特异性抗体，可进一步加强诊断结核分枝杆菌潜伏感染的准确性和灵敏性。
3)利用蛋白芯片技术，将上述5种细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p7)的特异性抗体以及38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和AG85B抗原点制成芯片，制成利用ELISA原理检测的试剂盒，从而能够在48小时内检测出不同人群外周血中的细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p7，及抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和AG85B的特异性IgG抗体的含量，从而为结核分枝杆菌潜伏感染提供一种更为有效的免疫诊断手段，具备有效的准确性和灵敏性，且操作简便，检测时间快，适于推广应用。
4)ELISA原理检测血清当中的标志物，操作简单，不需要昂贵的设备，技术成熟，是普遍使用的检测原理，相对目前临床所应用的IFN-γ释放实验，本发明直接针对血清标志物，省去了细胞分离、培养、刺激、孵育等繁琐的步骤，直接针血清中的标志物进行检查，可以方便、快速、稳定地得到检测结果。
附图说明
图1为结核分枝杆菌潜伏感染者(左)和健康者(右)血清样本的芯片扫描荧光信号图；
图2为不同分组中显著差异表达基因的热图(heatmap)区分效果(I：结核分枝杆菌潜伏感染者，N：健康者)；
图3为细胞因子组间差异倍数与P值的火山图区分效果；
图4为交叉验证错误分类率与阈值的关系(I：结核分枝杆菌潜伏感染者，N：健康者)；
图5为5种细胞因子区分两类人群的ROC曲线。
具体实施方式
本发明的研究路线为：
1)收集健康组即未感染结核菌人群(Non-infected,N)血清标本12份，结核分枝杆菌潜伏感染患者(I组)人群血清标本21份；
2)利用细胞因子抗体芯片，检测在不同人群外周血血清中40种细胞因子的表达量；
3)采用Arraytools软件的classcomparison、Classprediction及PAM等方法进行统计分析，筛选得到5种具有显著性差异的细胞因子组合，可有效区分未感染人群与结核分枝杆菌潜伏感染患者；
5)选用筛选得到5种具有显著性差异的细胞因子作为结核分枝杆菌潜伏感染的检测标准，并联合检测结核分枝杆菌特异性抗原在患者体内诱导产生的特异性抗体，根据这一机理，制备相应的结核分枝杆菌潜伏感染的免疫诊断试剂盒。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
一、可用作结核分枝杆菌潜伏感染的血清标志物的筛选
(1)样本、材料和方法
血清样本信息：如表1所示，12例未感染样本经实验室细胞学检查、临床影像学及病史、查体检查排除结核分枝杆菌感染后纳入健康组(包括：男6例、女6例，年龄在13～43岁之间，平均20.0岁)血清由惠州市结核病防治所提供(见表1中样本分类为“N”的样品)；21例感染者血清取自选自佛山、广州两地(包括：男10例、女11例，年龄在23～59岁之间，平均38岁)，患者均经PPD实验结果结核分枝杆菌特异性抗体检测均为阳性，但临床及实验室检查均排除结核病，(见表1中样本分类为“I”的样品)。
表1芯片血清样本信息
注：样本分类中，N代表健康人群，I代表结核分枝杆菌潜伏感染人群。
样本采集与保存：抽取静脉血4～5ml于2支真空促凝管中，室温静置约30min，4000rpm离心5min，吸取血清均分至2支2ml低温冻存管中，-70℃冰箱保存备用。
试剂与仪器：一次性真空促凝管购自广州阳普医疗科技股份有限公司；冻存管、及吸头等一次性耗材均为无酶、无菌进口耗材；由RayBiotech公司提供专业扫描及数据处理；蛋白芯片为美国RayBiotech公司细胞因子抗体芯片，芯片货号：QAH-INF-3，其检测的40种细胞因子类型如表2所示；
表2细胞因子抗体芯片(QAH-INF-3)检测的细胞因子类型
统计方法：统计分析采用Arraytools软件的classcomparison、Classprediction及PAM等分析方法。
(2)芯片筛选血清标志物
实验方法：
1)将芯片从-80℃冰箱中取出，室温放置(芯片盒开口处包裹吸水纸可减少水汽进入盒内)，芯片盒上无水珠或者雾气后，开盖取出芯片放入1％BSA中封闭1h，摇床上，速度在60～70转/分；
2)将血清1:100稀释(用上一步骤中的封闭液，10ul血清+990ul封闭液)，加1ml芯片，静置于自制湿盒反应2h；
3)1×TBST溶液冲洗几次，然后1×TBST溶液清洗3次，每次5分钟，放于摇床上，速度在60-70转/分(水平摇床50转；翘板摇床16.7转)；
4)将635/532/488标记的荧光二抗(Goat-anti-Human，JacksonImmuno)1:1000稀释(1ul二抗+999ul封闭液)，加1ml于芯片上，避光，静置于湿盒中反应1.5h；
5)TBST溶液清洗3次，每次5分钟(最后一次延长5min)，ddH2O清洗1次，5分钟，整个清洗过程要避光；
6)离心机甩干，进行芯片扫描；置于50ml离心管内，50ml离心管底垫一些纸，标签向下，然后在50ml离心机上离心甩干；
7)反应后室温避光保存。
实验结果：
1)芯片扫描
对上述33份血清样本(12健康者，21例结核分枝杆菌潜伏感染者)进行芯片扫描，扫描结类似于图1所示，图1为具有代表性的1例结核分枝杆菌潜伏感染者和1例健康者血清样本的芯片扫描图。
从荧光图片上可以看到结核分枝杆菌潜伏感染者(I)的部分细胞因子信号强度明显高于健康者，如图1中左图中方框内的荧光信号，提示说明这些细胞因子在结核分枝杆菌潜伏感染者体内的表达量可能显著性增加。
进一步对相应的荧光信号进行定量，定量结果如表3和表4所示，表3为12例健康者的外周血中40种细胞因子在芯片上的荧光信号值，表4为21例结核分枝杆菌潜伏感染者的外周血中40种细胞因子在芯片上的荧光信号值。
表312例健康者的外周血中40种细胞因子在芯片上的荧光信号值。
表4 21例结核分枝杆菌潜伏感染者的外周血中40种细胞因子在芯片上的荧光信号值。
2)芯片扫描数据分析及标志物的确定
利用Arraytools芯片分析软件中的t-test方法对上述芯片荧光值进行分析，其中有18种细胞因子的荧光信号强度(代表细胞因子含量)在正常人群和结核分枝杆菌潜伏感染人群中存在显著性差异(P<0.05)，具体分析结果如表5所示。
表5蛋白芯片数据显示18种细胞因子在不同人群之间表达差异具有显著性
表5分析显示，相比正常人群，Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70五种细胞因子在潜伏感染人群中的表达水平极显著增高(p<0.01)。
对表5中具有显著性表达差异的18个细胞因子作进一步的热图(heatmap)区分及火山图(-log10(p-value)VSlog2(Foldchange))区分的分析，分析结果如图2和图3所示，从中可以看出Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70这5种细胞因子对正常人群和结核分枝杆菌潜伏感染人群的区分效果最明显；因此选取Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70这5种细胞因子作为对健康人群和结核分枝杆菌潜伏感染人群进行区分与评估的指标具有最显著的效果。
同时，利用PAM统计法，对上述7个细胞因子作为临床诊断结核分枝杆菌潜伏感染的诊断进行效能评估，如图4和图5所示。
当利用Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70等5种细胞因子作为区分正常人群和结核分枝杆菌潜伏感染人群时，其错误区分的系数接近于0，且33例样本(12例正常人，21例结核分枝杆菌潜伏感染人)均可完全区分开来。因此利用上述5种细胞因子作为诊断结核分枝杆菌潜伏感染的免疫指标，效果良好。
其诊断效能为：ROC(ReceiverOperatingCharacteristic)曲线下面积(AreaUndertheROCCurve，AUC)为0.929，非常接近1(如图5所示)，说明利用上述5种细胞因子区分正常人群和结核分枝杆菌潜伏感染两种人群的正确的概率非常高。其区分的效能分别为敏感性0.875、特异性0.75、阳性预测值0.875、阴性预测值0.75，详见表6。
表6 5种细胞因子组合区分两类人群的效能评价
| 分组 | 敏感性 | 特异性 | 阳性预测值(PPV) | 阴性预测值(NPV) |
| I | 0.857 | 0.75 | 0.857 | 0.75 |
| N | 0.75 | 0.857 | 0.75 | 0.857 |
注：N代表健康人群，I代表结核分枝杆菌潜伏感染人群
二、结核分枝杆菌特异性抗原的筛选与验证
通过现有研究信息及生物信息学分析，初步筛选出结核分枝杆菌的特异性抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B。
为了测试四个结核分枝杆菌的特异性抗原(38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B)的抗体是否可以作为活动性肺结核病患者或者结核分枝杆菌感染者血清中的检测抗体，进行以下的验证实验。
(1)血清样本收集：集健康人群(N)血浆样本60份，活动性肺结核病患者(P)血浆样本60份，肺部其他疾病患者(O)血浆样本60份，样本具体信息如表7所示。
表7细胞因子芯片验证实验样本信息表
(2)结核分枝杆菌抗原测试
①实验方法：
将上述的60例正常人血清、60例活动性肺结核病患者的血清、60例肺部其他疾病患者血清通过免疫斑点法测试，检测抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B这四种结核分枝杆菌特异性抗原是否可以特异性的捕获人血清的抗结核分枝杆菌的特异性抗体。
a)抗原稀释，每种抗原分别稀释为1mg/ml；0.5mg/ml；0.25mg/ml；0.125mg/ml；0.6mg/ml；0mg/ml这6种浓度。
b)点膜：将以上四种抗原点在同一张膜上，每个浓度重复2个点。
c)封闭。
d)去掉封闭液，每张膜分别加入300ul的正常人血清、活动性肺结核病患者血清、结核分枝杆菌感染者血清，室温孵育1hr。
e)去掉血清，每张膜洗涤干净。
f)拍干洗液，每张膜加入300ul的生物素标记的小鼠抗人IgG的IgG(Biotin-Mouseanti Human-IgG-IgG，100ng/ml)，室温孵育30min。
g)去掉检测抗体，每张膜洗涤干净。
h)每张膜表面均匀滴加200ul的化学发光液，避光孵育30S，去掉化学发光液，用化学发光成像系统进行成像。
②结果
上述化学发光成像系统扫描结果如表8所示，●代表阳性结果，○代表阴性结果。
表8结核分枝杆菌抗原测试荧光检测结果
对表8中的抗原测试结果作进一步的统计和分析，结果如表9所示。
表9四种抗原测试结果汇总表
根据表9中统计数据，对38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B四种抗原的敏感性和特异性进行分析，结果如表10所示。
表10四种抗原的敏感性和特异性分析表
由表10可知，独立检测时，这四个抗原的特异性较好，都达到了90％以上，但是敏感性不够。38kDa的特异性最好，但敏感性最差，Ag85B的敏感性最好，但特异性最差。四个结核抗原都可以特异性的检测检核病患者中的抗体，但是独立检测的灵敏度有限，都低于55％。四个结核抗原联合检测可以大大提高对肺结核诊断的灵敏性和特异性，因此，将以上4个抗原可以作为芯片检测中的指标，具有较好的灵敏性和特异性。
三、一种结核病潜伏感染的诊断试剂盒
根据上述内容可知，本发明通过蛋白芯片技术，从40种细胞因子中筛选获得5种能够有效区分未感染者与结核分枝杆菌潜伏感染患者的细胞因子(Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70)，那么细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF或IL-12p70可作为结核分枝杆菌潜伏感染的检测指标，对结核分枝杆菌潜伏感染患者和未感染者具有很好的区分效果，可以制备一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒，该试剂盒能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF或IL-12p70中至少一个，从而为诊断活动性肺结核提供一种有效的免疫诊断手段。
另外，细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70在结核分枝杆菌潜伏感染患者体内含量显著上调，通常为未感染者的1.5倍及以上，那么可以制备一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒，该试剂盒能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF或IL-12p70中至少一个，且能够对所识别的细胞因子进行定量。或者制备一种活动性肺结核的免疫诊断试剂盒，该试剂盒能同时分别特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70，且同时能对这5种细胞因子的含量分别进行定量。
再次，38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B是结核分枝杆菌的特异性菌体抗原，能够在结核分枝杆菌潜伏感染患者体内诱导相应的IgG抗体产生，为了进一步加强诊断活动性肺结核的准确性和灵敏性，可以利用蛋白芯片技术，将上述5种细胞因子(Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70)的特异性抗体以及38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B抗原点制成芯片，制成利用ELISA原理检测的试剂盒，从而能够在48小时内检测出不同人群外周血中的细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70，及抗原ESAT-6和CFP10的IgG抗体的含量，从而为结核分枝杆菌潜伏感染提供一种更为有效的免疫诊断手段，具备更好的准确性和灵敏性，且操作简便，检测时间快，适于推广应用。
上述诊断试剂盒采用成熟的、简单的、已被大家普遍使用的检测原理，直接针血清中的标志物进行检查，可以方便、快速、稳定地得到检测结果；相对目前临床所应用的IFN-γ释放实验，该方法直接针对血清标志物，省去了细胞分离、培养、刺激、孵育等繁琐的步骤；其中的5种细胞因子是通过上述高能量蛋白芯片方法得到分枝杆菌潜伏感染人群血清中细胞因子表达谱，然后通过信息分析得到表达差异性最显著的5种细胞因子，保证了其作为检测标准物的灵敏性和准确性，同时联合检测结核分枝杆菌特异性的菌体蛋白38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B抗原的特异性抗体，进一步保证了该方法的准确性和灵敏性。
Claims (5)
1.能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、Eotaxin、MCSF和IL-12p70的试剂盒在制备结核分枝杆菌潜伏感染诊断试剂盒中的应用。
2.能对细胞因子Eotaxin-2、Eotaxin、MCSF和IL-12p70进行定量的试剂盒在制备结核分枝杆菌潜伏感染诊断试剂盒中的应用。
3.能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70，同时能对这5种细胞因子的含量分别进行定量的试剂盒在制备结核分枝杆菌潜伏感染诊断试剂盒中的应用。
4.一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70，同时能对这5种细胞因子的含量分别进行定量，且能特异性识别结核分枝杆菌抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B 的特异性IgG抗体。
5.根据权利要求4所述的一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒的检测原理为ELISA原理。
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| CN108693345A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-10-23 | 北京睿达时代科技有限公司 | 针对结核病筛查与诊断的组合血清标记物检测试剂 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101421617A (zh) * | 2005-09-27 | 2009-04-29 | 国家健康科学研究所 | 结核相关免疫恢复综合征（irs）的诊断方法 |
| CN101438146A (zh) * | 2006-04-04 | 2009-05-20 | 神谷来克斯公司 | 高灵敏标志物分析和分子检测的方法和组合物 |
| CN102297968A (zh) * | 2010-06-28 | 2011-12-28 | 程小星 | 辅助诊断结核病的试剂盒 |
| CN102539745A (zh) * | 2010-12-31 | 2012-07-04 | 中国人民解放军第三〇九医院 | 移植肾排斥反应早期诊断及预警试剂盒及检测方法 |
| CN102844444A (zh) * | 2009-11-30 | 2012-12-26 | 贝勒研究院 | 活性与潜伏性结核分枝杆菌感染的血液转录签名 |
| CN102854305A (zh) * | 2011-12-23 | 2013-01-02 | 中国人民解放军第三〇九医院 | 移植肾排斥反应预警试剂盒及其使用方法 |
| CN103237901A (zh) * | 2010-03-01 | 2013-08-07 | 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 | 用于治疗诊断的生物标志物 |
| CN103703371A (zh) * | 2011-04-29 | 2014-04-02 | 癌症预防和治疗有限公司 | 使用分类系统及其试剂盒识别和诊断肺部疾病的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2011338203A1 (en) * | 2010-12-09 | 2013-07-11 | David K. Crossman | Biomarkers for tuberculosis and HIV/AIDS |
| WO2013175459A2 (en) * | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Stellenbosch University | Method for diagnosing tuberculosis disease |
-
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101421617A (zh) * | 2005-09-27 | 2009-04-29 | 国家健康科学研究所 | 结核相关免疫恢复综合征（irs）的诊断方法 |
| CN101438146A (zh) * | 2006-04-04 | 2009-05-20 | 神谷来克斯公司 | 高灵敏标志物分析和分子检测的方法和组合物 |
| CN102844444A (zh) * | 2009-11-30 | 2012-12-26 | 贝勒研究院 | 活性与潜伏性结核分枝杆菌感染的血液转录签名 |
| CN103237901A (zh) * | 2010-03-01 | 2013-08-07 | 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 | 用于治疗诊断的生物标志物 |
| CN102297968A (zh) * | 2010-06-28 | 2011-12-28 | 程小星 | 辅助诊断结核病的试剂盒 |
| CN102539745A (zh) * | 2010-12-31 | 2012-07-04 | 中国人民解放军第三〇九医院 | 移植肾排斥反应早期诊断及预警试剂盒及检测方法 |
| CN103703371A (zh) * | 2011-04-29 | 2014-04-02 | 癌症预防和治疗有限公司 | 使用分类系统及其试剂盒识别和诊断肺部疾病的方法 |
| CN102854305A (zh) * | 2011-12-23 | 2013-01-02 | 中国人民解放军第三〇九医院 | 移植肾排斥反应预警试剂盒及其使用方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Differential cytokine secretion and early treatment response in patients with pulmonary tuberculosis;J. F. Djoba Siawaya et al;《Clinical and Experimental Immunology》;20091231;第156卷;第69－77页 * |
| Discriminating between latent and active tuberculosis with multiple biomarker responses;Marc Frahm et al;《Tuberculosis》;20110531;第91卷(第3期);第250－256页 * |
| Early Specific Host Response Associated with Starting Effective Tuberculosis Treatment in an Infection Controlled Placebo Controlled Mouse Study;Alice L. den Hertog et al;《PLOS ONE》;20130228;第8卷(第2期);第1－7页 * |
| Exploratory Study on Plasma Immunomodulator and Antibody Profiles in Tuberculosis Patients;Resmi Ravindran et al;《Clinical and Vaccine Immunology》;20130831;第20卷(第8期);第1283－1290页 * |
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