CN103760345B - 一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒。本发明所提供的试剂盒含有如下物质：1）结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库；所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库由序列表中序列1-19所示氨基酸序列组成的19条多肽中的全部或部分组成；2）经荧光染料A标记的抗CD3的抗体；3）经荧光染料B标记的抗γ-干扰素的抗体；4）高尔基体阻断剂；所述荧光染料A和所述荧光染料B所发荧光颜色不同。本发明提供了一种新的可用于结核分枝杆菌感染检测的方法，实验证明，本发明可直接利用外周血进行抗原刺激，无需分离外周血单个核细胞，实验数据显示用于结核分枝杆菌感染检测具有较高的灵敏度和特异性，且操作简便，成本较低，具有较高的临床应用价值。

Description

一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒及其应用，特别涉及一种基于流式细胞术利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒及其应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病，据WHO资料估计，全球约三分之一的人口受结核分枝杆菌隐性感染，每年新发活动性感染病例九百多万，死亡一百万例以上。近年来，我国结核病发病率居高不下，每年新发病例超过一百万，死亡近二十万例，对我国公民的健康、社会的安定和经济的发展带来严重的危害。
结核病的早期诊断对于控制患者疾病进展和感染的蔓延具有重要意义。目前，结核病临床诊断仍然缺乏高灵敏度和高特异性的手段。传统的结核菌素皮下试验所用的抗原（PPD）因为能够跟卡介苗（BCG）的接种产生交叉反应使得其产生较高比例的假阳性，而临床诊断的“金标准”结核菌培养则有时间长，阳性率低等缺陷。另外，基于X射线透射和临床表现的诊断则特异性较低，容易与其他肺部感染或疾病相混淆。
免疫学研究表明，结核分枝杆菌作为一种胞内寄生菌，其分泌的一些蛋白能够激发高水平的T细胞免疫反应，而针对这些蛋白中包含的T细胞表位特异性T细胞检测给TB的诊断带来了新的机遇。通过结核杆菌与BCG菌株基因组的研究比较发现了在所有BCG菌株中完全缺失的基因片段RD1，针对RD1区编码的蛋白ESAT-6和CFP-10特异性T细胞分泌产生的IFN-γ的检测（IGRAs），催生了两种商品化结核诊断试剂盒，即基于酶联免疫斑点技术（ELISPOT）的T-SPOT.TB和基于酶联免疫吸附技术（ELISA）的QuantiFERON-TBGold。目前，这两种诊断试剂盒已经分别于2007年和2008年在美国得到FDA批准上市，作为结核病临床诊断的辅助手段。ELISPOT方法需要对外周血样本进行分离，得到外周血单个核细胞并对细胞进行计数后方可进行后续的抗原刺激等试验，同时对相关实验与检测仪器的要求较高，在临床单位的普及率不高。
然而，中国特殊的结核病流行病学及生态环境、由于专利保护产生的高成本，使得这些诊断产品并不适用于中国广泛的临床诊断应用，因此亟需开发具有自主知识产权的结核病快速诊断试剂。此外绝大多数免疫检测方法如ELISPOT方法均需要首先从全血中分离外周血单个核细胞并对细胞进行计数后方可进行检测，因此开发一种利用全血直接进行相关检测实验的方法可大大提高相关试剂在临床的适用性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒。
本发明所提供的利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，具体可含有如下物质：
（1）结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库；
所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库由序列表中序列1-19所示氨基酸序列组成的19条多肽中的全部或部分组成；
（2）经荧光染料A标记的抗CD3的抗体；
（3）经荧光染料B标记的抗γ-干扰素的抗体；
（4）高尔基体阻断剂；
所述荧光染料A和所述荧光染料B所发荧光颜色不同。
在所述试剂盒中，所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库中的多肽既可为每条独立包装，也可按照等质量混合以后一起包装。
在本发明中，所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库由序列表中序列1-19所示氨基酸序列组成的19条多肽组成。
在所述试剂盒中，还含有说明书；
所述说明书中记载：按照包括如下步骤的方法检测待测个体是否被结核分枝杆菌感染：
（a）向离体的待测外周血中加入所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库，37℃孵育14-18h（如18h）；
（b）向步骤（a）的体系中加入所述高尔基体阻断剂，37℃孵育4-6h（如6h）；
（c）将步骤（b）的体系离心后，向沉淀中加入细胞固定液，避光反应15-25min（如20min），再加入通透缓冲液；
（d）向步骤（c）的体系中加入所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体和所述经荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体，避光反应20-30min（如30min）；
（e）将步骤（d）的体系离心，取细胞沉淀，加入染色缓冲液，进行流式细胞检测；
（f）结果判断：若经所述流式细胞仪检测，双阳性细胞的比例大于0.2%，且为空白对照组中双阳性细胞比例的两倍以上，则所述待测个体被结核分枝杆菌感染或候选被结核分枝杆菌感染；反之，则所述待测个体未被结核分枝杆菌感染或候选未被结核分枝杆菌感染；
所述对空对照组为：与如上步骤（a）-（f）相比，仅缺少步骤（a）中所述“向待测外周血中加入所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库”的步骤；
所述双阳性细胞为被如下两种抗体同时标记的细胞：所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体和所述荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体。
所述双阳性细胞的比例为双阳性细胞的数量占被检测细胞总数的百分比。
在本发明中，所述外周血为人外周血，所述抗CD3的抗体为抗人CD3的抗体，所述抗γ-干扰素的抗体为抗人γ-干扰素的抗体。
在所述试剂盒中，所述抗CD3的抗体进一步为抗CD3的单克隆抗体；所述抗γ-干扰素的抗体进一步为抗γ-干扰素的单克隆抗体。
更加具体的，在本发明中，所述经荧光染料A标记的抗CD3的抗体为经异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗CD3的单克隆抗体；所述经荧光染料B标记的抗γ-干扰素的抗体为经R-藻红蛋白（R-PE）标记的抗γ-干扰素的单克隆抗体。
在本发明的一个实施例中，所述经异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗CD3的单克隆抗体具体为北京旷博生物技术有限公司产品，其产品目录号为6610004。所述经R-藻红蛋白（R-PE）标记的抗γ-干扰素的单克隆抗体具体为eBioscience公司产品，其产品目录号为12-7319-81。所述高尔基体阻断剂具体为eBioscience公司产品，其产品目录号为00-4506-51。
为了提高检测的准确性，所述试剂盒中还可含有作为阳性对照的T细胞非特异性刺激物。
所述T细胞非特异性刺激物可为植物凝集素（PHA）或刀豆蛋白A（ConA）。
进一步，所述试剂盒中还可含有细胞固定液和/或通透缓冲液和/或染色缓冲液。
在本发明中，所述细胞固定液、所述通透缓冲液和所述染色缓冲液均为进行流式细胞检测对细胞进行前处理过程中的常用试剂。具体而言，在本发明的一个实施例中，所述细胞固定液为eBioscience产品，货号为00-8222-49；所述通透缓冲液为eBioscience产品，货号为00-8333-56；所述染色缓冲液为北京旷博生物技术有限公司产品，产品目录号为6910031。
除以上外，所述试剂盒中还可含有其他流式检测所需试剂及耗材。
本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的制备方法。
所述试剂盒的制备方法，具体可包括将所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库、所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体、所述经荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体和所述高尔基体阻断剂分别单独包装的步骤。
所述试剂盒在利用外周血体外检测结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞免疫反应中的应用也属于本发明的保护范围。所述应用为非疾病诊断性应用。
本发明的再一个目的是提供一种检测外周血中是否含有结核分枝杆菌特异性T细胞的方法。所述方法为非疾病诊断性方法。
本发明所提供的检测外周血中是否含有结核分枝杆菌特异性T细胞的方法，具体可包括如下步骤：
（a）向离体的待测外周血中加入所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库，37℃孵育14-18h（如18h）；
（b）向步骤（a）的体系中加入所述高尔基体阻断剂，37℃孵育4-6h（如6h）；
（c）将步骤（b）的体系离心后，向沉淀中加入所述细胞固定液，避光反应15-25min（如20min），再加入所述通透缓冲液；
（d）向步骤（c）的体系中加入所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体和所述经荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体，避光反应20-30min（如30min）；
（e）将步骤（d）的体系离心，取细胞沉淀，加入所述染色缓冲液，进行流式细胞检测；
（f）结果判断：若经所述流式细胞仪检测，双阳性细胞的比例大于0.2%，且为空白对照组中双阳性细胞比例的两倍以上，则所述待测外周血中含有或候选含有结核分枝杆菌特异性T细胞；反之，则所述待测外周血中不含有或候选不含有结核分枝杆菌特异性T细胞；
所述对空对照组为：与如上步骤（a）-（f）相比，仅缺少步骤（a）中所述“向待测外周血中加入所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库”的步骤；
所述双阳性细胞为被如下两种抗体同时标记的细胞：所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体和所述荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体。
所述双阳性细胞的比例为双阳性细胞的数量占被检测细胞总数的百分比。
在以上所述试剂盒或所述方法的步骤（a）中，所述“向待测外周血中加入所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库”为：向每500μl的所述待测外周血中加入的每条多肽的质量均为10μg。
在以上所述试剂盒或所述方法的步骤（b）中，所述高尔基体阻断剂的用量可为所述待测外周血体积的1/250。
在以上所述试剂盒或所述方法的步骤（b）中，在37℃孵育4-6h（如6h）后，还可包括如下步骤：加入所述待测外周血4倍体积的所述染色缓冲液。
在以上所述试剂盒或所述方法的步骤（c）中，所述离心为25℃1500rpm离心3min。所述细胞固定液的加入量可为所述待测外周血体积的2/5。
在以上所述试剂盒或所述方法的步骤（c）中，所述“加入所述通透缓冲液”具体为：加入所述待测外周血4倍体积的所述通透缓冲液，离心（如1500rpm）3min，弃上清，向沉淀中再加入所述待测外周血4倍体积的所述通透缓冲液，离心（如1500rpm）3min，弃上清，向沉淀中再加入所述待测外周血1/5体积的所述通透缓冲液。
在以上所述试剂盒或所述方法的步骤（d）中，所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体的用量为所述待测外周血体积的8/500；所述经荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体的用量为所述待测外周血体积的1/100。
在以上所述试剂盒或所述方法的步骤（d）中，在所述避光反应20-30min（如30min）后，还包括如下步骤：加入所述待测外周血8倍体积的所述染色缓冲液。
在以上所述试剂盒或所述方法的步骤（e）中，所述离心为1500rpm离心3min。所述染色缓冲液的加入量为所述待测外周血体积的1/5。
本发明提供了一种新的可用于结核分枝杆菌感染检测的胞内因子染色方法，并且实验证明，本发明可直接利用外周血进行抗原刺激，无需分离外周血单个核细胞，实验数据显示用于结核分枝杆菌感染检测具有较高的灵敏度和特异性，且操作简便，临床适用性强，成本较低，可以用于结核分枝杆菌感染检测，具有较高的临床应用价值。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒的开发
本发明所提供的利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒包含：
1、结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库；
所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库由序列表中序列1-19所示氨基酸序列组成的19条多肽组成；
2、阳性对照刺激物-植物凝集素（PHA）溶液；
3、细胞培养用24孔板；
4、FITC（异硫氰酸荧光素）标记人CD3单克隆抗体，R-PE(R-phycoerythrin,R-藻红蛋白)标记人γ-干扰素单克隆抗体；
5、高尔基体阻断剂（BrefeldinA）；
6、细胞固定液与通透缓冲液。
7、其他流式检测检测所需试剂及耗材。
实施例2、应用实施例1的试剂盒进行结核分枝杆菌感染临床检测
一、外周血样本的采集
志愿者病例的筛选标准为同时满足以下临床诊断标准：
（1）临床主治医生根据志愿者临床表现确诊为肺结核；
（2）结核分枝杆菌分离培养菌落呈阳性；
（3）X射线影像呈现肺部病变；
（4）结核菌素皮下试验结果为阳性，斑点直径大于1cm。
健康志愿者筛选标注为同时满足以下：
（1）无结核临床症状；
（2）无其他疾病或感染。
经过筛选的个体经临床医生体检合格后，由试验者告知具体项目流程及所需血液的数量，经志愿者同意并签署知情同意书，临床医生将对志愿者进行采血。最终本项目筛选了11例结核病志愿者和7例健康志愿者，采血时使用含有肝素锂抗凝的一次性真空采血管（格雷纳，奥地利），每名志愿者采血约20-25ml，采血后立即颠倒防止凝血。
二、应用实施例1的试剂盒进行结核分枝杆菌感染临床检测
（一）本发明应用实施例1的试剂盒进行检测的方法
结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库溶液的配置：将19条多肽分别每条以DMSO溶解，再等质量（以多肽质量计）混合，再用RPIM1640培养基稀释至每条多肽的终浓度为20μg/ml，备用。
1、抗原刺激：
在一块24孔细胞培养板中加入志愿者外周血500μl/孔，每例样本分为3孔，其中1孔加入500μl结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库溶液、1孔加入500μl植物凝集素（PHA）溶液（Sigma，货号L1668；配制方法：以细胞培养基溶解至浓度为50μg/ml）（阳性对照），另1孔加入500μlRPIM1640培养基（空白对照），盖上盖子，在37℃5%CO2培养箱中孵育18小时。
2、添加阻断剂：
在步骤1孵育18小时后，向每孔中加入2μl高尔基体阻断剂（BrefeldinA）（eBioscience公司产品，其产品目录号为00-4506-51），继续孵育6小时。防止γ-干扰素分泌到胞外。
3、后续处理及结果获取：
（1）孵育结束后，迅速在每孔加入2ml染色缓冲液（北京旷博生物技术有限公司产品，产品目录号为6910031），混匀转入流式管中，在25℃条件下用水平离心机1500rpm离心3min，弃上清。
（2）每管中加入200μl细胞固定液（eBioscience产品，货号为00-8222-49），振匀，避光反应20min。
（3）每管加入2ml通透缓冲液（eBioscience产品，货号为00-8333-56），振匀1500rpm离心3min，弃上清。并重复该步骤一次。
（4）振荡重悬，每管加入100μl通透缓冲液（eBioscience产品，货号为00-8333-56），再加入胞内荧光抗体FITC-CD3（北京旷博生物技术有限公司产品，其产品目录号为6610004）8μl，PE-IFNγ（eBioscience公司产品，其产品目录号为12-7319-81）5μl。加完后，振匀，避光反应30min。
（5）振荡重悬，每管加入4ml染色缓冲液（北京旷博生物技术有限公司产品，产品目录号为6910031），1500rpm离心3min，弃上清。
（6）每管加入100μl染色缓冲液（北京旷博生物技术有限公司产品，产品目录号为6910031），振荡重悬后上BectonDickinsonFACSCalibur流式细胞仪检测。结果分析应用CellsQuest软件。
阳性反应判断标准：双阳性细胞的比例大于0.2%，且为空白对照组中双阳性细胞比例的两倍以上（所述双阳性细胞的比例为双阳性细胞的数量大于上机检测细胞总数的百分比），说明待测外周血中含有结核分枝杆菌特异性T细胞，从而判定相应的个体被结核分枝杆菌感染。所述双阳性细胞为被如下两种抗体同时标记的细胞：所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体和所述荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体。本实施例中所有结核病例或健康志愿者外周血对结核抗原的反应均按照此标准进行量化并作出阳性或阴性反应判断，每个样本反应值超过此标准判定为阳性反应，低于此标准判定为阴性反应。
实验重复三次。
（二）ELISPOT对照方法
采用现有商品化T-SPOT.TB试剂盒（OxfordImmunotec公司产品）进行。本试剂盒中包括酶标抗体、ESAT-6多肽库和CFP-10多肽库及显色底物等。
1、PBMCs的分离及抗原刺激
（1）先将新鲜采集的外周血用121℃高压灭菌冷却后的磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）稀释一倍，即20ml外周血加入到20ml的PBS中混匀，将稀释的血样小心加入到事先准备好的15ml淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品，货号LTS10771）中，加入时十分小心，缓慢加入，避免界面混乱。
（2）25℃条件下用水平离心机700g或2000rpm/min离心20min，刹车时减速调到最慢。离心后的样品分四层，将上层血浆用巴斯德移液管吸出，之后小心吸出淋巴细胞层至新的离心管中。
（3）用等体积的磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）等体积稀释吸出的淋巴细胞层，之后离心（2000rpm，10min，25℃）。弃掉上清，重悬后加入无血清RPIM1640培养基约7ml清洗，离心1500rpm，5min，25℃。注：此步骤时若发现红细胞较多，可以加入红细胞裂解液裂解掉红细胞，6ml红细胞裂解液，裂解5min，到时间后加入6mlPBS，1500rpm离心5min。
（4）弃上清，重悬，加7-8ml含10%（体积分数）血清（Hyclone）的RPIM1640培养基清洗，离心1500rpm，5min，25℃。
（5）弃掉上清后用3ml含10%（体积分数）血清的RPIM1640培养基重悬，取适量于血球计数板上进行细胞计数，并最终调整至2.5×106细胞/ml密度。
（6）每个结核病例及健康志愿者分得的PBMCs同时进行T-SPOT.TB检测，刺激物分两孔，1孔加入50μlESAT-6多肽库（试剂盒随附），另1孔加入50μlCFP-10多肽库（试剂盒随附）。再向每孔中加入100μl步骤（5）稀释后的PBMCs细胞，加完后将ELISPOT板置37℃，5%CO2条件下孵育18小时。
2、后续处理及结果获取：
（1）孵育结束后，弃掉孔内细胞液，迅速在每孔加入200μl常温的去离子水清洗2次，之后PBST清洗3次。
（2）去除洗液，在吸水纸上用力扣干，每孔加入50μl稀释的酶标检测抗体（试剂盒随附），室温孵育2h。
（3）显色：去除酶标检测抗体溶液，PBST清洗3次，之后PBS清洗2次。在吸水纸上用力扣干，之后每孔加入50μl显色底物溶液（试剂盒随附），室温孵育7分钟后，当看到清晰的斑点时，用蒸馏水冲洗膜的双面以中止反应。
（5）37℃或室温下晾干，之后将ELISPOT板用自动读板仪（C.T.L）对ELISPOT孔内反应的点数进行计数，之后调整参数并进行质量控制，给出最终反应结果。
阳性反应判断标准：ELISPOT结果按照T-SPOT.TB试剂盒说明书进行判断。
实验重复三次。
结果显示，以上应用实施例1的试剂盒进行临床检测的方法在结核病例中的检测敏感度达到100%（11/11），且与7名健康志愿者结果比较，特异性达100%，与作为对照的ELISPOT法相比，基本一致，无统计学差异（表1）。且三次重复实验的结果均如表1所示。因此，应用实施例1的试剂盒能够有效的检测结核分枝杆菌感染。
表1应用实施例1的试剂盒进行临床检测的方法与ELISPOT法诊断特异性和灵敏度
统计
结核病例 灵敏度 健康志愿者 特异性
本发明方法 11/11 100% 0/7 100%
ELISPOT法 11/11 100% 0/7 100%
注：特异性表示为：（1-健康志愿者阳性反应数/健康志愿者总数）×%。

Claims (3)

1.一种检测外周血中是否含有结核分枝杆菌特异性T细胞的非疾病诊断治疗性方法，包括如下步骤：
(a)向离体的待测外周血中加入结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库，37℃孵育14-18h；
所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库由序列表中序列1-19所示氨基酸序列组成的19条多肽中的全部或部分组成；
(b)向步骤(a)的体系中加入高尔基体阻断剂，37℃孵育4-6h；
(c)将步骤(b)的体系离心后，向沉淀中加入细胞固定液，避光反应15-25min，再加入通透缓冲液；
(d)向步骤(c)的体系中加入经荧光染料A标记的抗CD3的抗体和经荧光染料B标记的抗γ-干扰素的抗体，避光反应20-30min；
(e)将步骤(d)的体系离心，取细胞沉淀，加入染色缓冲液，进行流式细胞检测；
(f)结果判断：若经所述流式细胞仪检测，双阳性细胞的比例大于0.2％，且为空白对照组中双阳性细胞比例的两倍以上，则所述待测外周血中含有或候选含有结核分枝杆菌特异性T细胞；反之，则所述待测外周血中不含有或候选不含有结核分枝杆菌特异性T细胞；
所述空白对照组为：与如上步骤(a)-(f)相比，仅缺少步骤(a)中所述“向离体的待测外周血中加入结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库”的步骤；
所述双阳性细胞为被如下两种抗体同时标记的细胞：所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体和所述荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述经荧光染料A标记的抗CD3的抗体为经异硫氰酸荧光素标记的抗CD3的单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述经荧光染料B标记的抗γ-干扰素的抗体为经R-藻红蛋白标记的抗γ-干扰素的单克隆抗体。
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