CN104569390A - 一种γ-干扰素定量检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种γ-干扰素定量检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及一种γ-干扰素定量检测方法及试剂盒。发明的γ-干扰素定量检测方法，包括以下步骤：1)采用碳二亚胺法制备捕获荧光微球；2)γ-干扰素的体外释放；3)捕获荧光微球与γ-干扰素的结合；4)抗原抗体复合物的制备；5)定量检测。发明的γ-干扰素定量检测试剂盒，包括荧光微球、偶联缓冲液、碳二亚胺、NHS活化剂、以及荧光素标记的抗人γ-干扰素抗体。发明γ-干扰素定量检测方法及试剂盒，操作较为简单、同时有效实现γ干扰素定量检测。

Description

一种γ-干扰素定量检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及一种γ-干扰素定量检测方法及试剂盒。
背景技术
结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO估计，全球有约20亿人感染结核分枝杆菌，每年有约200万人死于结核。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的2倍以上。结核病的临床表现多样，可以累及全身各个系统，尤其是肺外结核病变往往十分隐匿，给临床诊断带来极大的困难。传统的结核病诊断方法存在成本高、耗费时间长的问题，给结核患者和家庭带来沉重负担。近年来，有一类用于诊断结核分枝杆菌感染的新方法进入了人们的视线，即γ-干扰素释放试验(interferongamma release assay，IGRA)，对结核患者的诊断带来了新的途径，该方法准确率高，不要回访，逐渐被欧美等发达国家所采用。γ-干扰素是致敏的淋巴细胞再次受到抗原刺激时释放的一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制。该类试验采用ELISA/ELISPOT(酶联免疫吸附/酶联免疫斑点)方法定量检测检测全血/外周血单核细胞在结核菌特异性抗原刺激下释放γ-干扰素的水平，用于诊断潜伏性结核分枝杆菌感染以及结核病。但是现有试剂盒在实现γ干扰素定量的同时，操作相对繁琐，中间涉及多步的洗涤和加样，浪费人力且容易造成污染。
有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种γ-干扰素定量检测方法及试剂盒，使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种操作较为简单、同时有效实现γ干扰素定量检测的γ-干扰素定量检测方法。
本发明的γ-干扰素定量检测方法，包括以下步骤：
1)捕获荧光微球的制备：采用碳二亚胺法制备，依次包括以下步骤：
a、将荧光微球悬液经洗涤液清洗后，加入偶联缓冲液、碳二亚胺和NHS活化剂避光下混匀；
b、加入抗人γ-干扰素抗体混匀避光下混匀；
c、加入封闭液后避光摇振后得到捕获荧光微球；
d、将捕获荧光微球放入储存缓冲液中避光保存；
2)γ-干扰素的体外释放：采集结核菌特异性抗原刺激下的全血样本，经分装、培养和离心后，收集血浆溶液；
3)捕获荧光微球与γ-干扰素的结合：将步骤1)中得到的捕获荧光微球与步骤2)中得到的血浆溶液混合，室温孵育得到待检溶液；
4)抗原抗体复合物的制备：在待检溶液中加入荧光素标记的抗人γ-干扰素抗体，室温孵育得到抗原抗体复合物；
5)定量检测：利用流式细胞仪对步骤4)制备的抗原抗体复合物进行检测。
进一步的，还包括对照组检测：以酪蛋白溶液替代步骤2)中收集的血浆溶液，重复步骤3)、4)和5)。
进一步的，还包括标准曲线的制备：用样本稀释液倍比稀释γ-干扰素标准品以替代步骤2)中收集的血浆溶液，重复步骤3)、4)和5)，根据不同浓度的γ-干扰素标准品产生的荧光信号的强度不同绘制标准曲线。
进一步的，所述抗人γ-干扰素抗体为鼠源抗人γ-干扰素抗体。
进一步的，所述荧光素标记的抗人γ-干扰素抗体为荧光素标记(APC-CY7)的兔源抗人γ-干扰素抗体。
本发明的另一目的是提供一种操作较为简单、同时有效实现γ干扰素定量的γ-干扰素定量检测试剂盒，包括荧光微球、偶联缓冲液、碳二亚胺、NHS活化剂、以及荧光素标记的抗人γ-干扰素抗体。
进一步的，还包括酪蛋白溶液和γ-干扰素标准品。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：1)流式液相蛋白定量技术是借助流式细胞仪通过抗原抗体反应和荧光标记法完成对可溶性蛋白进行定性定量的一种分析技术，随着流式细胞仪的普及和广泛使用，以荧光微球作为载体的生物检测技术已经渗透到细胞生物学、分子生物学、免疫学、医学等各个领域。由于流式细胞仪具有可根据微球粒径及所带特征荧光信号对微球进行特异性识别的能力，因此可利用荧光微球结合流式细胞术建立特异分子的检测技术。羧基荧光微球由于自身具有发光的特性，加上羧基可以和抗体的氨基进行共价结合，从而具有特异的靶向性。本发明利用荧光微球标记抗γ-干扰素抗体结合流式细胞术建立的γ-干扰素定量检测方法及试剂盒，具有操作较为简单、同时有效实现γ干扰素定量检测的优点。2)本发明所采用的荧光微球具有粒径均一、稳定性好，比表面积大、可通过化学偶联的方法和相应的抗体结合，实现了抗体的“细胞”化。3)只需一步既可以实现γ-干扰素的快速定量检测，省去了传统方法的洗涤步骤，规避了在操作过程造成交叉污染的风险，增加了检测结果的可信度。4)通过增加不同粒径大小的微球和相应的目的抗体偶联，同时添加到同一个样本中，从而实现单一样本的多个项目的同时检测，省时省力。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明中抗原抗体复合物的模式图；
图2是γ-干扰素标准品浓度为125pg/ml时的流式细胞分析图；
图3是倍比稀释γ-干扰素标准品的荧光值标准曲线；
图4是本发明技术方法与国外相关试剂盒的相关性分析。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一
本发明的γ-干扰素定量检测方法，包括以下步骤：
1)捕获荧光微球的制备
为了实现捕获微球的靶向性，需要对荧光微球进行抗γ-干扰素抗体的化学偶联(碳二亚胺法)：
a、取1μL200-220nm的荧光微球(激发波长488nm)悬液(约1×105个/μL)用洗涤液(PBS 0.01mol/L，pH7.4)洗一遍；
b、加入80μL偶联缓冲液(NaH2PO4，0.1mol/l，pH6.2)和10μL碳二亚胺和NHS(5mg/mL)活化剂，混匀；
c、室温下避光摇振20分钟；
d、向活化微球中加入100μL(4μg/mL)鼠源抗人γ-干扰素抗体(购自invitrogen)，混匀；
e、室温下避光摇振2小时；
f、用洗涤液洗3次；
g、加入200μL封闭液(0.01mol/l PBS+1％BSA+0.02％NaN3)；
h、室温下避光摇振1小时；
i、将包被好的微球放在800μL储存缓冲液(0.01mol/lPBS+1％BSA+0.02％NaN3)中4℃避光保存。
2)γ-干扰素的体外释放
本方法检测的γ-干扰素由结核菌特异性抗原刺激进行γ-干扰素的体外释放，体外释放的γ-干扰素分别用作γ干扰素的平行检测和对照，具体的γ干扰素体外释放如下：
a、采集：采用静脉穿刺术，使用肝素抗凝的真空采血管采集全血标本，采集量不低于4ml。
b、分装：在2小时之内将全血标本轻柔颠倒混匀3-5次后分装到“N”、“T”、“P”三种培养管中，1ml/管。
c、培养：将培养管轻柔颠倒混匀5次后迅速放入37℃培养22±2小时，培养过程中保持试验管直立。
d、离心：培养后的全血以3000-5000转/分钟离心10分钟，取血浆进行ELISA检测，注意不可吸到细胞层。
3.捕获荧光微球与γ-干扰素的结合：将具有特异靶向γ干扰素的捕获微球100μL与步骤2中获得的血浆溶液混合(50μl)，室温孵育1个小时，让捕获微球和γ-干扰素充分结合。
4.抗原抗体复合物的制备：在步骤3中加入100μl(1:2000稀释)荧光素标记(APC-CY7)的兔源抗人γ-干扰素抗体(购自invitrogen)(荧光素标记(APC-CY7)包括荧光基团和羊抗小鼠IgG)，轻轻混匀后室温反应1小时，从而在水溶液中得到捕获荧光微球-γ干扰素-荧光素标记的抗人γ干扰素的三明治形式的抗原抗体复合物，如图1所示。
5.对照组检测：以50ng/ml的酪蛋白溶液替代步骤2中的血浆溶液，重复步骤3和4，作为特异性对照。
6.标准品的稀释和标准曲线的绘制：用样本稀释液(0.01mol/l PBS)倍比稀释标准品使γ-干扰素标准品的终浓度分别在2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml，同时参与上述步骤4和5的反应，根据不同浓度的γ-干扰素标准品产生的荧光信号的强度不同绘制标准曲线。
7.定量检测：利用流式细胞仪对上述制备的抗原抗体复合物进行检测，如图1所示，逐个地通过检测区的微球双抗夹心复合物，因荧光微球自身颜色和荧光标记的羊抗小鼠IgG颜色而具有两种荧光信号，当两种信号同时被检测出即达到了“双阳”时，就表明微球与γ-干扰素已连接。利用FSC/SSC以及PE/APC-CY7散点图，根据不同浓度的标准品的荧光信号强度不同绘制标准曲线，待测的γ-干扰素的浓度可以根据标准曲线进行换算而得到。
由于抗体具有特异的靶向性，为此捕获微球可与实验组中的γ-干扰素结合，而不与对照组中的酪蛋白结合，表现为利用流式细胞术检测的结果是实验组复合物的具有“双阳”的荧光出现，而对照组没有。因此，本发明实现了流失细胞仪对可溶性γ-干扰素的定量检测。
本发明的γ-干扰素定量检测试剂盒，包括荧光微球、偶联缓冲液、碳二亚胺、NHS活化剂、以及荧光素标记的抗人γ-干扰素抗体，与上述γ-干扰素定量检测方法中所用到的试剂一致。
实施例二
本发明实施例一中的γ-干扰素定量检测方法，其试验结果分析过程如下：
1.标准曲线的绘制
1.1使用样本稀释液对γ干扰素的标准品进行一系列的倍比稀释，终浓度分别是2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml。
1.2将上述不同浓度的标准品50μl分别添加到装有50μl的捕获微球的样本管中室温孵育1小时，再向上述样本管中添加100μl的荧光素标记的抗人γ干扰素抗体的微球，室温反应1小时。
1.3用BD公司的CANTOII流式细胞仪进行荧光型号的检测，计数2000个微球，取FSC/SSC和PE/APC-CY7散点图，根据FSC/SSC散点图划出P1的微球门，PE/APC-CY7显示P1的荧光信号值,举例说明在标注品浓度是125pg/ml时，其FSC/SSC和PE/APC-cy7的流式细胞分析图如图2所示。根据全部的标准品浓度和荧光信号值结果，绘制标准曲线如图3所示。
2.精密度分析
用结核菌特异性抗原进行γ-干扰素的体外释放和γ干扰素的定量检测，从中挑取一份浓度为126.7pg/ml的样本，按照上述具体实施1中的步骤反复检测10次，通过具体实施1中的标准曲线计算样本的实测浓度，其结果和精密度如表1.
3.相关性分析
利用国外公司生产的现有的试剂盒，刺激10份结核感染患者的外周血释放γ-干扰素后同时用该试剂盒和本专利发明的试剂盒做平行对比，其相关性如图4。
由图4可以看出，两种测定方法的相关系R2为0.9961，回归方程为y＝1.0474x-3.5217.说明本试剂与现有的进口试剂测定病人的外周血中的γ-干扰素的含量相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
4.抗干扰能力分析
本发明和国内相关检测试剂盒同时进行抗干扰能力分析试验，向已知浓度的样本中分别添加终浓度为500mg/dl的血红蛋白、600mg/ml的乳糜、100mg/ml的甘油三酯、50mg/dl的胆红素，检测结果如表2。加入不同的干扰物种后，对各种干扰物的相对误差均在5％以内，较国内的试剂盒有较强的抗干扰能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种γ-干扰素定量检测方法，其特征在于：采用碳二亚胺法制备，包括以下步骤：
1)捕获荧光微球的制备：依次包括以下步骤：
a、将荧光微球悬液经洗涤液清洗后，加入偶联缓冲液、碳二亚胺和NHS活化剂避光下混匀；
b、加入抗人γ-干扰素抗体混匀避光下混匀；
c、加入封闭液后避光摇振后得到捕获荧光微球；
d、将捕获荧光微球放入储存缓冲液中避光保存；
2)γ-干扰素的体外释放：采集结核菌特异性抗原刺激下的全血样本，经分装、培养和离心后，收集血浆溶液；
3)捕获荧光微球与γ-干扰素的结合：将步骤1)中得到的捕获荧光微球与步骤2)中得到的血浆溶液混合，室温孵育得到待检溶液；
4)抗原抗体复合物的制备：在待检溶液中加入荧光素标记的抗人γ-干扰素抗体，室温孵育得到抗原抗体复合物；
5)定量检测：利用流式细胞仪对步骤4)制备的抗原抗体复合物进行检测。
2.根据权利要求1所述的γ-干扰素定量检测方法，其特征在于：还包括对照组检测：以酪蛋白溶液替代步骤2)中收集的血浆溶液，重复步骤3)、4)和5)。
3.根据权利要求1所述的γ-干扰素定量检测方法，其特征在于：还包括标准曲线的制备：用样本稀释液倍比稀释γ-干扰素标准品以替代步骤2)中收集的血浆溶液，重复步骤3)、4)和5)，根据不同浓度的γ-干扰素标准品产生的荧光信号的强度不同绘制标准曲线。
4.根据权利要求1所述的γ-干扰素定量检测方法，其特征在于：所述抗人γ-干扰素抗体为鼠源抗人γ-干扰素抗体。
5.根据权利要求1所述的γ-干扰素定量检测方法，其特征在于：所述荧光素标记的抗人γ-干扰素抗体为荧光素标记(APC-CY7)的兔源抗人γ-干扰素抗体。
6.一种γ-干扰素定量检测试剂盒，其特征在于：包括荧光微球、偶联缓冲液、碳二亚胺、NHS活化剂、以及荧光素标记的抗人γ-干扰素抗体。
7.根据权利要求6所述的γ-干扰素定量检测试剂盒，其特征在于：还包括酪蛋白溶液和γ-干扰素标准品。
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