CN101713782A - 单抗纳米微球联合检测特异性血小板自身抗体的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一组单抗纳米微球联合检测特异性血小板自身抗体的试剂盒，包含以牛血清白蛋白封闭分别已连有单克隆抗体SZ-2，SZ-22，SZ-21和7E3的四种单抗-聚苯乙烯纳米微球PBS溶液各3ml，聚苯乙烯纳米微球浓度为2mg/ml，浓度为15μg/ml的异硫氰酸荧光素连接的羊抗人多克隆抗体6ml和PBS液。用单抗-微球与血小板裂解液标本震荡孵育，经PBS洗涤，加入异硫氰酸荧光素连接的羊抗人多克隆抗体，洗涤后用PBS重悬，在流式细胞仪上检测，分别得到四种微球的平均荧光强度值，根据它与健康人对应的基本对照值之比率，确定血小板特异性自身抗体是否阳性，为早期诊断ITP提供依据。检测过程简单，灵敏度高，特异性好。

Description

单抗纳米微球联合检测特异性血小板自身抗体的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种单抗纳米微球联合检测血小板特异性自身抗体的试剂盒，用于检测血液中的血小板特异性自身抗体，为免疫介导的血小板减少综合征提供诊断依据。本发明还涉及该试剂盒的制备及用于检测血小板特异性自身抗体的方法。

背景技术

特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)是一种免疫介导的血小板减少综合征，是临床最常见的出血性疾病，约占出血性疾病总数的30％。一般认为，该病是由自身抗体致敏的血小板被单核巨噬细胞系统过度破坏所致，以广泛皮肤、粘膜或内脏出血，血小板减少，骨髓巨核细胞发育、成熟障碍，血小板生存时间缩短及血小板自身抗体出现为特征。血小板自身抗体主要为抗血小板膜糖蛋白(GP)IIb/IIIa为主要的自身抗体，其次为抗GPIb自身抗体，少数表现为抗GPIa/IIa、GPIV自身抗体。因此对血小板特异性自身抗体的检测是免疫介导的血小板减少综合征的诊断依据。目前国内外检测血小板特异性自身抗体的方法主要有单克隆抗体特异性血小板抗原固定术(MAIPA)、抗原捕获酶联免疫吸附试验(MACE)和流式细胞术(FCM)。MAIPA和MACE方法由于操作复杂、用血量大、灵敏度低等技术上的限制而极少应用于临床诊断。FCM分析血小板膜糖蛋白特异性自身抗体的方法尚不成熟。1995年，Koksch等利用流式细胞术荧光共振能量转移的方法，测定抗血小板膜糖蛋白特定位点的自身抗体，然而该方法步骤繁琐，难以标准化，无法作为诊断ITP的常规检查。

发明内容

本发明的目的是提供一种单抗纳米微球联合检测血小板特异性自身抗体的试剂盒和采用该试剂盒检测血小板特异性自身抗体的方法，它能快速、简便、准确地检测血小板自身抗体，以便于对自身免疫性疾病的早期诊断。本发明还提供了该试剂盒的制备方法。

本发明检测血小板特异性自身抗体的试剂盒的组成为：

(1).以牛血清白蛋白封闭的分别连有单克隆抗体SZ-2，SZ-22，SZ-21和7E3的四种单抗-聚苯乙烯纳米微球，溶剂为PBS，聚苯乙烯纳米微球浓度为2mg/ml，四种单抗-聚苯乙烯纳米微球包括：

SZ-2-纳米微球溶液3ml，单克隆抗体SZ-2的浓度30μg/ml，

SZ-22-纳米微球溶液3ml，单克隆抗体SZ-22的浓度为60μg/ml，

SZ-21-纳米微球溶液3ml，单克隆抗体SZ-21的浓度为30μg/ml，

7E3-纳米微球溶液3ml；单克隆抗体7E3的浓度为20μg/ml；

SZ-2，SZ-22，SZ-21和7E3分别为抗人血小板膜糖蛋白GPIb，GPIIb，GPIIIa和GPIIb/IIIa的单克隆抗体。

(2).硫氰酸荧光素连接的羊抗人多克隆抗体6ml，浓度为15μg/ml；

(3).PBS液，是0.15mol/LNaCl、0.01mol/LNa₂HPO4和0.01mol/LNaH₂PO4的混合溶液，pH7.4。

上述试剂盒用于检测血小板特异性自身抗体的方法，其特征是如下步骤：

(1).取血小板裂解液待检标本四份，每份50μl，分别加入50μl SZ-2-纳米微球、SZ-22-纳米微球、SZ-21-纳米微球、7E3-纳米微球，室温震荡孵育2h，用0.01mol/LPBS洗涤液洗涤，离心，弃上清；

(2).分别加入异硫氰酸荧光素连接的羊抗人多克隆抗体100μl，室温震荡孵育30min，用洗涤液PBS洗涤，然后用600μl PBS重悬；

(3).四份悬液分别在流式细胞仪上检测，每份计数1500-2000个微球，根据FSC/SSC散点图和FL-2的直方图，分别得到SZ2、SZ22、SZ21、7E3四种被检微球的平均荧光强度值；

(4).分别以健康人血小板裂解液的SZ2、SZ22、SZ21、7E3四种单抗微球的各平均荧光强度作为基本对照；计算出步骤(3)测得的四种微球的各平均荧光强度值与对应的基本对照的平均荧光强度值之比率，当比率分别大于1.37、1.24、1.48、1.19时，判为阳性。

上述剂盒的制备方法，其特征是如下步骤：

(1).单克隆抗体的纯化

用亲和层析柱Protein G-Sepharose 4B纯化单克隆抗体SZ-2、SZ-21、SZ-22和7E3，经浓缩透析后分别得到单克隆抗体SZ-2、SZ-21、SZ-22和7E3的PBS溶液。

(2).单克隆抗体与纳米微球的连接

用0.1M、pH9.6碳酸缓冲液分别稀释单克隆抗体SZ-2、SZ-22、SZ-21和7E3至终浓度为30、60、30和20μg/ml；

经丙酮洗涤的聚苯乙烯纳米微球加入上述单克隆抗体中，4℃摇床过夜后，离心，弃上清；用吐温-20PBS溶液洗涤，离心，弃上清；然后用20mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液封闭微球，摇床2h，用吐温-20PBS溶液洗涤，离心，弃上清；加0.01mol/LPBS重悬纳米微球，至纳米微球浓度为2mg/ml，按剂量分装，4℃保存；

(3).配制异硫氰酸荧光素连接的羊抗人多克隆抗体，浓度为15μg/ml，按剂量分装；

(4).配制PBS液，使溶液中含有0.15mol/L NaCl、0.01mol/L Na₂HPO4和0.01mol/L NaH₂PO4pH7.4；按剂量分装。

(5)各分装物装入试剂盒，4℃保存。

本发明试剂盒，包含分别携带抗人血小板膜糖蛋白GPIb、GPIIb、GPIIIa、GPIIb/IIIa复合物的四种单克隆抗体SZ-2、SZ-22、SZ-21和7E3(分别是抗原CD42b、CD41b、CD61、CD61a的单克隆抗体)的聚苯乙烯纳米微球，即SZ-2-纳米微球、SZ-22-纳米微球、SZ-21-纳米微球和7E3-纳米微球，这些微球能够在体外分别特异性地捕获血小板糖蛋白GPIb、GPIIb、GPIIIa、GPIIb/IIIa特异性抗原分子CD42b、CD41b、CD61、CD61a，并能够在流式细胞仪上应用，从而能联合测定ITP(免疫性血小板减少)患者GPIb、GPIIb、GPIIIa和GPIIb/IIIa的自身抗体，达到临床明确诊断ITP患者亚类，指导ITP患者治疗。本试剂盒检测的是血小板上的自身抗体，所以特别为早期诊断ITP提供依据。研究表明，SZ-2-纳米微球、SZ-22-纳米微球、SZ-21-纳米微球和7E3-纳米微球的表面抗体饱和载量变化非常小，变异系数分别为2.15％、2.65％、4.22％、3.05％。纳米微球表面抗体结合量至少是传统ELISA板抗体结合量的四倍，从客观上增大了该方法的检测灵敏度。因此，用本发明试剂盒及其建立的进行血小板特异性自身抗体的检测方法重复性好，四种单克隆抗体纳米微球的批内变异系数分别为3.26％、2.86％、1.65％、4.94％；批间变异系数分别为5.86％、4.74％、5.69％、7.56％。经35例健康献血者和血小板减少症患者58例(其中初诊ITP患者41例，非免疫性血小板减少患者(NITP)17例)分别进行联合检测抗GPI、GPIIb、GPIIIa和GPIIb/IIIa的自身抗体，结果表明，ITP患者组荧光强度明显高于正常人。用本试剂盒及检测方法用血量少，只要2ml；操作简便，时间较短，重复性好；标本预处理过程简单，整个过程只要4小时；灵敏度高，特异性好。本单克隆抗体纳米微球除了应用于诊断ITP患者血小板自身抗体外，也能检测其他自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮等患者的抗血小板自身抗体。

附图说明

图1(A)是健康人标本的散射光信号图；

图1(B)～图1(E)分别是健康人的四种自身抗体SZ2、SZ22、SZ21、7E3的荧光强度检测结果。

图1(F)是患者标本的散射光信号图；

图1(G)～图1(J)分别是患者的四种自身抗体SZ2、SZ22、SZ21、7E3检测结果。

图2(A)-图2(D)分别是ITP患者组和正常对照组生成的受试者SZ2、SZ21、SZ22、7E3的工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)。

具体实施方式

实施例1试剂盒的制备

一.单克隆抗体的制备和纯化

本例中的单克隆抗体SZ-2、SZ-21、SZ-22和7E3由发明人自制。单克隆抗体SZ-2、SZ-21、SZ-22和7E3腹水分别在pH8.0，0.1M PB(0.1mol/L Na₂HPO₄，0.1mol/LNaH₂PO₄，pH8.0))中透析，离心(8000rpm)，取上清约1ml过柱(亲和层析柱ProteinG-Sepharose 4B)使各单克隆抗体与蛋白G充分结合，用0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.8)洗脱，收集各单克隆抗体峰。将收集的各单克隆抗体用聚乙二醇20000浓缩，然后在0.01M PBS中透析4小时，得到纯的单克隆抗体SZ-2、SZ-21、SZ-22和7E3，置于低温冰箱备用。

二.单克隆抗体与纳米微球的连接

用缓冲液(0.1M，pH9.6碳酸缓冲液)分别稀释单克隆抗体SZ-2(CD42b)、SZ-22(CD41b)、SZ-21(CD61)和7E3(CD61a)，各单克隆抗体稀释的终浓度分别为30、60、30、20μg/ml。

聚苯乙烯纳米微球(直径为18.39μm，简称纳米微球，深圳市纳微生物科技有限公司)用丙酮洗涤，然后分别加入上述单克隆抗体中，4℃摇床过夜，用洗涤液(0.05％吐温-20-PBS)洗3遍，用20mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液封闭微球(室温摇床2h)，然后洗涤3遍(1500rpm，离心5分钟)，0.01mol/L PBS重悬纳米微球，使纳米微球浓度为2mg/ml，按每份3ml分装，4℃保存。

三.试剂盒分装

每试剂盒中装入：

1.四种单抗的纳米微球溶液各一份，每份3ml，

2.浓度为15μg/ml的硫氰酸荧光素连接的羊抗人多克隆抗体(FITC-GAH-IgG)(购自法国Immuotech公司)6ml。

3.PBS液，pH7.4.

实施例2血小板特异性自身抗体的检测

一.血小板裂解液的制备

根据患者和健康人血小板计数，用EDTA抗凝的硅化管采集外周静脉血2ml，轻轻混匀后800rpm离心10min，取上层富血小板血浆，3000rpm离心10min，分离血浆-20℃保存(用做MAIPA)，取血小板沉淀，用0.05％EDTA-PBS洗涤血小板3遍，计数血小板，调整血小板浓度到1×10⁷个/ml，吸取400μl，3000rpm离心5min后弃掉上清，加入240μl浓度为0.5％的Triton X-100(室温20min)，3000rpm离心5min，吸取上清至4个Eppendorf管，每管50μl，即得到血小板裂解液。

二.用流式细胞仪检测

吸取单克隆抗体纳米微球各50μl，分别加入50μl血小板裂解液，室温震荡孵育2h，洗涤液0.01mol/L PBS洗3遍后，分别加入100μl的FITC-GAH-IgG(15μg/ml)，室温震荡孵育30min，洗涤液洗一遍，用600μl的PBS(0.01mol/L)重悬。在流式细胞仪上检测，计数1500-2000个微球，取FSC/SSC散点图和FL-2的直方图，根据FSC/SSC散点图划出检测R1微球分析区域，FL-2的直方图中显示R1中的检测微球的平均荧光强度值，每次检测都使用相同的仪器设置。同时做三个健康人血小板的四种单克隆抗体纳米微球的平均荧光强度作为基本对照，用各组每个标本的平均荧光强度和基本对照荧光强度的比率来判断阴阳性。

实施例3微球上连接的单克隆抗体稳定性检测

将四种单克隆抗体-纳米微球(SZ-2-纳米微球、SZ-22-纳米微球、SZ-21-纳米微球和7E3-纳米微球)4℃放置45天，每隔9天取50μl单克隆抗体-纳米微球与10μl的FITC-GAH-IgG(0.75mg/ml)反应，用流式细胞仪检测微球平均荧光强度值，用来反映抗体与微球连接的稳定性。结果显示，检测微球表面抗体量变化非常小，变异系数分别为2.15％、2.65％、4.22％、3.05％，并且可在4℃至少存放45天。

实施例4单克隆抗体-纳米微球稳定性测定

批内重复性检测：取1份患者血小板标本进行4种抗体检测(CV％)，一天内重复检测20次，批内变异系数分别为3.26％、2.86％、1.65％、8.09％；

批间重复性测定：取同一个健康人的10⁷个血小板与微球孵育30min，再加FITC标记CD61单克隆抗体，上机检测，连续做8天，批间变异系数分别为5.86％、4.74％、5.69％、7.56％。实验结果充分说明单克隆抗体纳米微球稳定性高，检测数据重复性好。

实施例5临床标本采集和抗体测定

采集血小板减少患者58例的血小板标本，其中初诊ITP患者41例，男9例，女32例，年龄19-61岁(中位年龄36岁)，标本采集时患者血小板数目为(2-90)×109/L，均符合美国血液病学会慢性ITP的诊断标准，均未用过激素、免疫抑制剂及脾脏切除等治疗；非免疫性血小板减少患者(NITP)17例，男8例、女9例，年龄15-63岁(中位年龄32岁)，包括再生障碍性贫血5例，急性白血病9例，骨髓增生异常综合征3例，诊断符合1998年《血液病诊断及疗效标准》(第3版)；正常血小板来自苏州大学附属第一医院35例健康献血员，年龄20～52岁(中位年龄35岁)，其中男12名、女23名。

计算每个标本各抗体平均荧光强度与基本对照的比率，ITP组、NITP组、正常对照组，各组荧光强度比率的中位值及其上、下限(见表.1)，若将ITP组的GPIb、GPIIb、GPIIIa、GPIIb-IIIa四种抗体检测结果比率分别大于1.37、1.24、1.48、1.19判为阳性。

图1(F)-图1(J)为其中1例患者自身抗体检测得的荧光强度，各图分别表示四种抗体平均荧光强度分别为9.16、6.33、6.44、6.57。图1(B)-(E)表示一正常人自身抗体检测结果，表示平均荧光强度分别为0.59、0.61、0.58、0.69。经计算，此患者四种抗体检测得到的荧光强度分别为正常人的15.53、10.38、11.10、9.52倍，因此患者四种抗体均为阳性。图1(A)和图1(F)分别表示受试健康人及患者标本微粒的大小和特性。

图2(A)-图2(D)分别为SZ2、SZ21、SZ22、7E3的ROC曲线，图中纵坐标为灵敏度，横坐标为1-特异性。四组ROC曲线下面积的AUC值均大于0.7，说明该方法对于ITP疾病的诊断具有很高的准确性，特异性可达94.29％以上。

本试剂盒检测血小板特异性自身抗体的敏感性73.2％(表2)，而用改良MAIPA法检测的敏感性只有51.2％。对该两种方法采用样本率比较的χ2检验，进行分析如表2，可知本方法检测敏感度高于改良间接MAIPA法(χ2＝4.34，p＜0.05)，经检验得ITP组与其余两组差异有显著性(P＜0.01)，且NITP组与正常对照组差异无显著性，实验结果表明本试剂盒及其检测方法能够用于测定自身免疫性疾病中抗血小板自身抗体，从而明确诊断ITP患者的抗体分类。

表1ITP组、NITP组、正常对照组与基本对照荧光强度比率的中位数以及上下限

ITP组与NITP和正常对照组比较有显著差异，^*P＜0.01

表2ITP组纳米微球技术与MAIPA检测结果敏感性比较

n＝41，采用两样本率比较的χ²检验，纳米微球技术检测的总敏感性高于改良MAIPA法，^*P＜0.05

Claims (3)

1.单抗纳米微球联合检测特异性血小板自身抗体的试剂盒，其特征是该试剂盒组成为：

(1)以牛血清白蛋白封闭的分别连有单克隆抗体SZ-2，SZ-22，SZ-21和7E3的四种单抗-聚苯乙烯纳米微球，溶剂为PBS，聚苯乙烯纳米微球浓度为2mg/ml，四种单抗-聚苯乙烯纳米微球包括：

SZ-2-纳米微球PBS溶液3ml，单克隆抗体SZ-2的浓度30μg/ml，

SZ-22-纳米微球溶液3ml，单克隆抗体SZ-22的浓度为60μg/ml，

SZ-21-纳米微球溶液3ml，单克隆抗体SZ-21的浓度为30μg/ml，

7E3-纳米微球溶液3ml；单克隆抗体7E3的浓度为20μg/ml；

SZ-2，SZ-22，SZ-21和7E3分别为抗人血小板膜糖蛋白GPIb，GPIIb，GPIIIa和GPIIb/IIIa的单克隆抗体；

(2)异硫氰酸荧光素连接的羊抗人多克隆抗体6ml，浓度为15μg/ml；

(3).PBS液，是0.15mol/L NaCl、0.01mol/L Na₂HPO₄和0.01mol/L NaH₂PO₄的混合溶液，pH7.4。

2.权利要求1的剂盒用于检测血小板特异性自身抗体的方法，其特征是如下步骤：

(1)取血小板裂解液待检标本四份，每份50μl，分别加入50μl SZ-2-纳米微球、SZ-22-纳米微球、SZ-21-纳米微球、7E3-纳米微球，室温震荡孵育2h，用0.01mol/L PBS洗涤液洗涤，离心，弃上清；

(2).分别加入异硫氰酸荧光素连接的羊抗人多克隆抗体100μl，室温震荡孵育30min，用洗涤液PBS洗涤，然后用600μl PBS重悬；

(3).四份悬液分别在流式细胞仪上检测，每份计数1500-2000个微球，根据FSC/SSC散点图和FL-2的直方图，分别得到四种被检微球的各平均荧光强度值；

(4).分别以健康人血小板裂解液的SZ2、SZ22、SZ21、7E3四种单抗微球的各平均荧光强度作为基本对照；计算出步骤(3)测得的四种微球的各平均荧光强度值与对应的基本对照的平均荧光强度值之比率，当比率分别大于1.37、1.24、1.48、1.19时，判为阳性。

3.权利要求1的剂盒的制备方法，其特征是如下步骤：

(1).单克隆抗体的纯化

用亲和层析柱Protein G-Sepharose 4B纯化单克隆抗体SZ-2、SZ-21、SZ-22和7E3，经浓缩透析后分别得到单克隆抗体SZ-2、SZ-21、SZ-22和7E3的PBS溶液；

(2).单克隆抗体与纳米微球的连接

用0.1M、pH9.6碳酸缓冲液分别稀释单克隆抗体SZ-2、SZ-22、SZ-21和7E3至终浓度为30、60、30和20μg/ml；

经丙酮洗涤的聚苯乙烯纳米微球加入上述单克隆抗体中，4℃摇床过夜后，离心，弃上清；用吐温-20PBS溶液洗涤，离心，弃上清；然后用20mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液封闭微球，摇床2h，用吐温-20PBS溶液洗涤，离心，弃上清；加0.01mol/L

PBS重悬纳米微球，至纳米微球浓度为2mg/ml，4℃保存；

(3).配制异硫氰酸荧光素连接的羊抗人多克隆抗体，浓度为15μg/ml，按剂量分装；

(4).配制PBS液，使溶液中含有0.15mol/LNa2Cl、0.01mol/LNa2HPO₄、0.01mol/LNaH2PO4，pH7.4；按剂量分装；

(5)各分装物装入试剂盒，4℃保存。

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