CN106872705A - 一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒 - Google Patents

一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106872705A
CN106872705A CN201611265043.8A CN201611265043A CN106872705A CN 106872705 A CN106872705 A CN 106872705A CN 201611265043 A CN201611265043 A CN 201611265043A CN 106872705 A CN106872705 A CN 106872705A
Authority
CN
China
Prior art keywords
platelet
fluorescent microsphere
blood
glycoprotein
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611265043.8A
Other languages
English (en)
Inventor
段生宝
李勇
陈晔洲
蒙青林
王红梅
丁少华
魏双施
刘欢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Original Assignee
Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS filed Critical Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Priority to CN201611265043.8A priority Critical patent/CN106872705A/zh
Publication of CN106872705A publication Critical patent/CN106872705A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供了一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒，包括如下步骤：(1)将不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面，得到抗原特异性荧光微球，备用；(2)将抗原特异性荧光微球加入到待测样本中进行孵育反应，洗涤，备用；(3)向步骤(2)中加入荧光标记的抗人IgG进行孵育反应、洗涤，然后进行流式细胞检测；所述的血小板抗体特异性鉴别方法，解决了现有技术中的血小板抗体检测主要针对血小板表面的抗原‑自身血小板抗体复合物，其检测的并非血浆或血清中游离的血小板抗体，检测血小板抗体的结果不精确的问题，且本发明所述方法步骤简单，易操作，耗时短，效率更高。

Description

一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检验领域，特别是涉及一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒。
背景技术
血小板抗体是患者在输血、妊娠或移植等过程中接触外来血小板抗原所产生的致病性抗体，可致敏血小板并使其遭破坏，引起血小板减少，导致血小板输注无效症(plalelet transfusion refractoriness，PTR)，胎母同种异体免疫血小板减少症(foetal-maternal alloimmune thromLocyte penia，FMAIT)，输血后紫癜(posttransfusion purpura，PTP)，以及移植相关同种异体免疫血小板减少症(transplantation-associated alloimmune thrombocytopenia，TAAT)等多种病症，患者易出现淤点、瘀斑及出血等症状，严重者甚至会发生死亡。免疫性疾病患者在机体免疫系统紊乱的情况下亦可产生针对自身血小板的抗体，导致自身免疫性血小板减少症(idiopathic thrombocytopenia，ITP)。
血小板抗体包括抗HLAⅠ类抗体及抗血小板糖蛋白或HPA抗体。临床血小板相关免疫性疾病患者体内通常能检出抗HLA I类抗体。但血小板更多的是由HLAⅠ类抗体和抗GP或HPA抗体等多种抗体共同作用，包括抗HLAⅠ、抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPⅠa/Ⅱa、抗GPⅠb/Ⅸ、抗GPⅣ抗体。
为了能够准确的检测血小板抗体，如中国专利文献CN102230935A中公开的高通量荧光单抗纳米微球试剂盒，利用该试剂盒，向待测样本血小板裂解液中加入分别以牛血清白蛋白封闭连有不同单克隆抗体的荧光纳米微球进行孵育，然后再加入PBS缓冲液重悬，然后加入异硫氰酸荧光素再次孵育、重悬，然后采用流式细胞仪检测得到待测样本中的血小板抗体。然而上述方案主要针对患者体内的自身血小板抗体，即与患者血小板表面抗原结合的抗体。而临床血小板较少症患者大多数为同种异体免疫性疾病患者，此类患者真正需要检测的是血液中或血浆中游离的血小板抗体(即非自身血小板抗体)。可见上述文献中鉴别方法主要应用在自身免疫性血小板减少症患者体内的自身血小板抗体检测，不适用于检测同种异体免疫性疾病患者体内游离的血小板抗体。同时，上述文献中待测样本为血小板裂解液，其只能检测到血小板表面的血小板抗体，而无法检测血浆或血清中的游离的血小板抗体，同样导致检测结果不够精确，而且在血小板裂解过程中易导致抗原结构发生破坏，进而导致荧光微球不能与该抗原结合，进而无法检测到该抗原特异性结合的血小板抗体，造成血小板抗体的漏检，进一步导致检测结果不准确。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术不能检测同种异体免疫性疾病患者体内游离的血小板抗体，检测结果不准确以及检测过程复杂、效率低的问题，进而提供一种检测结果准确、检测过程简单、高效的一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒。
为此，本发明提供了一种血小板抗体特异性鉴别方法，包括如下步骤：包括如下步骤：
(1)将不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面，得到抗原特异性荧光微球，备用；
(2)将所述抗原特异性荧光微球加入到待测样本中进行孵育反应，洗涤，备用；
(3)向步骤(2)中加入荧光标记的抗人IgG进行孵育反应、洗涤，然后进行流式细胞检测。
所述的鉴别方法，所述血小板特异性糖蛋白为HLAⅠ类、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ和GPⅣ。
所述的鉴别方法，所述HLAⅠ类糖蛋白具有A2、A11、A31、A68、B7、B18、B35和B40抗原。
所述的鉴别方法，所述GPⅡb/Ⅲa糖蛋白具有HPA1a和HPA 4b抗原。
所述的鉴别方法，所述GPⅠa/Ⅱa糖蛋白具有HPA 5a和HPA 5b抗原。
所述的鉴别方法，所述步骤(2)中，所述孵育条件为35-39℃，反应时间为15-45分钟。优选的，所述孵育条件为37℃，反应时间为30分钟。
所述的鉴别方法，所述步骤(2)中，所述抗原特异性荧光微球与待检样本按照体积比为(0.5-1.5)：1。优选的，所述抗原特异性荧光微球与待检样本按照体积比为1：1。
所述的鉴别方法，所述步骤(3)中，所述孵育条件为20-30℃，反应时间为15-25分钟。优选的，所述孵育条件为25℃，反应时间为20分钟。
所述的鉴别方法，所述步骤(3)中，向步骤(2)中洗涤后的所述荧光微球与荧光标记抗人IgG按照体积比为(0.5-2):1混合。优选的，所述荧光微球与荧光标记抗人IgG按照体积比为1:1混合。
所述的鉴别方法，所述步骤(3)中，所述抗人IgG的浓度为(0.5-1.5)mg/mL。优选的，所述抗人IgG的浓度为1mg/mL。
所述的鉴别方法，所述步骤(1)中，取所述荧光微球与血小板特异性糖蛋白特异性单克隆抗体混合，在20-30℃下反应2-3小时，然后洗涤，将上述获得的所述荧光微球与所述血小板特异性糖蛋白混合，在35-39℃下反应0.5-1.5小时，然后洗涤，悬浮，即得所述抗原特异性荧光微球阵列。
所述的鉴别方法，所述步骤(1)中，配制所述荧光微球溶液，向所述荧光微球中加入缓冲液，最终所得所述荧光微球溶液浓度为0.5％-1.5％(v/v)。优选的，所述荧光微球溶液浓度为1％(v/v)。
所述的鉴别方法，所述步骤(1)中，在配制所述荧光微球溶液前，所述荧光微球采用0.5mg/mL-1.5mg/mL的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)活化。优选的，所述荧光微球采用1mg/mL的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)活化。
所述的鉴别方法，所述步骤(1)中，取所述荧光微球与血小板特异性糖蛋白特异性单克隆抗体混合，所述单克隆抗体终浓度为0.2-0.3mg/mL。优选的，所述单克隆抗体终浓度为0.25mg/mL。
本发明提供了一种用于血小板抗体特异性检测的试剂盒，包括由不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面得到的抗原特异性荧光微球阵列。
所述的试剂盒，包括如下所述抗原特异性荧光微球：以血小板特异性糖蛋白HLAⅠ类连接在荧光微球a的表面，得到抗原特异性荧光微球Y-a；以血小板特异性糖蛋白GPⅡb/Ⅲa连接在荧光微球b的表面，得到第一抗原特异性荧光微球Y-b；以血小板特异性糖蛋白GPⅠa/Ⅱa连接在荧光微球c的表面，得到第一抗原特异性荧光微球Y-c；以血小板特异性糖蛋白GPⅠb/Ⅸ连接在荧光微球d的表面，得到第一抗原特异性荧光微球Y-d；和以血小板特异性糖蛋白GPⅣ连接在荧光微球e的表面，得到第一抗原特异性荧光微球Y-e。
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明所述的血小板抗体特异性鉴别方法，包括如下步骤：(1)将不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面，得到抗原特异性荧光微球，备用；(2)将所述抗原特异性荧光微球加入到待测样本中进行孵育反应，洗涤，备用；(3)向步骤(2)中加入荧光标记的抗人IgG进行孵育反应、洗涤，然后进行流式细胞检测；所述的血小板抗体特异性鉴别方法，由于将不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面获得的抗原特异性荧光微球可以与血浆或血清中游离的血小板结合，进而可以检测血浆或血清中游离的血小板抗体，检测得到的血小板抗体结果更精确，解决了现有技术中的血小板抗体检测主要针对血小板表面的抗原-自身血小板抗体复合物，其检测的并非血浆或血清游离的血小板抗体，检测血小板抗体的结果不精确的问题，且所述方法步骤简单，易操作，耗时短，效率更高。
(2)本发明所述的血小板抗体特异性鉴别方法，所述血小板特异性糖蛋白为HLAⅠ类、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ和GPⅣ；通过选择上述的血小板特异性糖蛋白制备得到的抗原特异性荧光微球可以实现一次性检测血浆或血清中游离的抗HLAⅠ类、抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPⅠa/Ⅱa、抗GPⅠb/Ⅸ、抗GPⅣ抗体等五类血小板抗体的特异性鉴别，检测更全面，检测过程简单、准确。
(3)本发明所述的用于血小板抗体特异性鉴别的试剂盒，包括由不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面得到的抗原特异性荧光微球；所述试剂盒可以检测血浆或血清中游离的血小板抗体，并且可以鉴别抗体特异性检测结果更加精确，采用所述试剂盒检测过程简单、高效，易操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中HLAⅠ类糖蛋白涵盖抗原图谱；
图2a是本发明实施例4中健康人血浆标本的血小板抗体检测图；
图2b是本发明实施例4中待测样本的血小板抗体检测图。
具体实施方式
下述实施例中涉及到的试剂或仪器生产厂家如下：
流式细胞仪购自BD公司，型号为LSRFortessa；
荧光微球购自Spherotech公司，型号为CPAK-5067-5A；
荧光标记抗人IgG购自sigma公司，型号为F9512；
DEAE-52阴离子交换层析柱购自GE whatman公司，型号为4057-200；
G-25凝胶层析柱购自sigma公司，型号为G25150；
琼脂糖活化4B购自sigma公司，型号为CL4B200；
WGA购自sigma公司，型号为L9640；
离心机购自长春博研公司生产厂家，型号为BYL；
NS1骨髓瘤细胞购自DSMZ公司，型号为Cells-0880；
牛血清购自四季青公司，型号为LC002；
小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，清洁级，体重18-25克范围。
实施例1HLAⅠ类糖蛋白抗原的提取
调查我国临床有意义的HLAⅠ类抗体类别，结合HLAⅠ类抗原交叉反应性特点，尽可能降低HLAⅠ类抗体漏检几率，设计需提取的HLAⅠ类糖蛋白抗原组合如下：A2、A11、A31、A68、B7、B 18、B35和B40抗原，HLAⅠ类糖蛋白涵盖抗原图谱参见图1。因此，本实施例提供了一种提取上述抗原组合的HLAⅠ类糖蛋白抗原的方法，所述提取步骤如下：
(1)培养并收集表达上述相关HLAⅠ类糖蛋白抗原的人白细胞或血小板细胞，保存至-80℃，提取一次需3×109个细胞；
(2)取3×109个所述人白细胞或血小板细胞，用生理盐水洗涤3次，留取压积细胞，按压积细胞和裂解液的体积比为1：100的比例加入细胞裂解液(所述裂解液成分如下：50mM的pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，含150mM NaCl，5mM EDTA，1％(v/v)NP-40，1mM苯甲基璜酰氟，0.1mM碘乙酰胺，1％(v/v)抑肽酶，10μg/mL胰蛋白酶抑制剂，0.01mM抑肽素，0.01mM亮抑酶肽)，在4℃下裂解1小时；
(3)取步骤(2)中的裂解后的产物在4℃条件下，于100000g离心60分钟，留取上清；
(4)WGA柱层析：采用10mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液(含2mM的MgCl2、0.15M的NaCl)平衡所述WGA柱后上样，然后采用0.25M的N-乙酰氨基葡萄糖洗脱，最后收集洗脱液，备用；
(5)亲和层析：将所得的WGA柱层析洗脱液的上清用亲和层析柱(抗HLAⅠ类单克隆抗体交联活化4B)纯化，采用平衡液为50mM的pH 8.0Tris-HCl缓冲液(含0.1％(v/v)NP-40及10μg/mL胰蛋白酶抑制剂)平衡所述亲和层析柱后上样，采用50mM的pH 11.5二乙胺洗脱，收集得到的洗脱液立即用1M pH 8.0Tris-HCl中和至中性；
(6)蛋白检测：将上述步骤(5)中收集得到的亲和层析洗脱液用0.1M的pH7.4的PBS(含0.1％NP-40)透析，4℃透析过夜，次日浓缩，测定含量及纯度，既得抗原组成为A2、A11、A31、A68、B7、B 18、B35和B40抗原的所述HLAⅠ类糖蛋白抗原。
实施例2血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ和GPⅣ的提取
本实施例提供了一种血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ和GPⅣ的提取方法，包括如下步骤：
(1)取新鲜富血小板血浆(PRP)于1300g下，离心10分钟后，弃上清，得所述血小板压积细胞(5×1010个)，用0.1M的pH 7.4PBS(含2.5mM EDTA)洗涤3次；
(2)裂解：向上述洗涤后的所述血小板压积细胞中加入50mL裂解液(所述裂解液为10mM的pH7.4的Tris-HCl缓冲液，其中含0.15M的NaCl、1mM的苯甲基璜酰氟、2.5mM的EDTA以及0.5％(v/v)Lubrol PX)，在4℃裂解45分钟，期间震荡混匀，然后再加入50mL上述的裂解液，在4℃裂解30分钟使其充分裂解，备用；
(3)4℃条件下，在100000g下离心30分钟后，留取上清液(含血小板糖蛋白)，备用；
(4)柱层析1：将上述上清液用BSA-交联活化4B层析柱层析，以去除与BSA和琼脂糖非特异结合的成分，采用平衡液为10mM pH 7.4Tris-HCl缓冲液(含0.15M NaCl、0.5％(v/v)Lubrol PX)平衡所述层析柱，然后上样，收集未结合的流穿液；
(5)柱层析2：将上述收集的流穿液用血小板特异性单克隆抗体-交联活化4B层析柱提取，其中采用平衡液为10mM的pH 7.4Tris-HCl缓冲液(含0.15M NaCl和0.5％(v/v)Lubrol PX)，然后分别用10mM的pH7.4Tris-HCl缓冲液(含1M NaCl和0.5％(v/v)LubrolPX)和50mM pH 11.5二乙胺(含0.1％(v/v)Lubrol PX)洗脱，收集洗脱液，并立即用2M的pH8.0的Tris-HCl缓冲液将所述洗脱液中和至中性；
(6)蛋白检测：将步骤(5)的亲和层析洗脱液用0.1M的pH 7.4PBS(含0.1％(v/v)NP-40)透析，4℃透析过夜，次日浓缩，测定含量及纯度，即得所述血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ和GPⅣ。
实施例3抗人血小板单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及单抗的制备与纯化
本实施例提供了抗人血小板单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及单抗的制备与纯化，包括如下步骤：
(1)采集新鲜O型全血，于200g离心10分钟，提取上层富血小板血浆，然后1000g离心10分钟，弃上清，留取压积血小板，用0.01M pH 7.4PBS缓冲液(含0.5％(w/v)EDTA)洗涤2次，并最终调节血小板浓度为108个/mL的血小板悬液；取0.5mL上述血小板悬液通过腹腔、背部皮下多点免疫小鼠，共免疫4次，间隔期为10天。融合前2天用0.2mL上述血小板悬液经鼠尾静脉加强注射1次；
(2)取免疫后的小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，并将小鼠脾细胞悬液和培养好的NS1骨髓瘤细胞按10:1(v/v)的比例混合，采用50％(w/v)PEG4000作融合剂，将小鼠脾细胞和NS1骨髓瘤细胞进行融合，所得的融合细胞悬于含20％(v/v)新生牛血清的选择培养基内培养7日，备用；
(3)将兔抗人血小板多抗用0.05M的pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至10μg/mL，包被酶标板100μL/孔，在4℃下过夜，次日用0.01M的pH 7.4PBS(含0.03-0.06％(v/v)Tween-20)洗涤5次，控干，然后加入50μL/孔的所述血小板悬液，200g离心5分钟后洗涤3次，加入待检的细胞培养上清，37℃下孵育后采用间接ELISA法进行检测，选取检测结果阳性孔内的融合细胞经有限稀释法进行多次单克隆培养，待单细胞生长成亚克隆后再进行测定，阳性克隆扩大后液氮冷冻保存；
(4)培养步骤(3)中经克隆筛选的杂交瘤细胞株，注射至经致敏的小鼠腹腔内，每只约106个细胞，观察小鼠腹腔，并在约5-10天内采集所述小鼠的腹水；
(5)取所述小鼠腹水，边搅拌边缓慢加入等体积比例的饱和硫酸铵溶液，搅拌1小时后在4℃下静置过夜，次日将已沉淀的所述小鼠腹水离心，收集沉淀并用少量生理盐水溶解，然后采用G-25凝胶层析柱去除其中的硫酸铵，采用DEAE-52阴离子交换层析柱纯化单抗，并用不同浓度的NaCl溶液洗脱，采用SDS-PAGE电泳和间接ELISA法进行纯化抗体的纯度和效价测定，即得所述抗人血小板单克隆抗体。
实施例4血小板抗体鉴别的流式细胞免疫分析方法的建立
本实施例提供了一种血小板抗体鉴别方法，包括如下步骤：
(1)取五种不同荧光梯度的荧光微球a、b、c、d和e，所述荧光微球采用浓度为1mg/mL的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)活化后，分别用0.01M的pH5.0醋酸钠缓冲液配制成浓度为1％(v/v)的所述荧光微球溶液，将所述荧光微球溶液分别与HLAⅠ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ、GPⅣ五种血小板糖蛋白特异性单克隆抗体结合，即荧光微球a溶液加入仅含HLAⅠ血小板糖蛋白特异性单克隆抗体(抗HLAⅠ单克隆抗体)中，所述单克隆抗体终浓度为0.25mg/mL，将荧光微球b溶液加入抗GPⅡb/Ⅲa血小板糖蛋白特异性单克隆抗体中，所述单克隆抗体终浓度为0.25mg/mL，以此类推，上述荧光微球溶液与血小板糖蛋白特异性单克隆抗体的反应条件为25℃下2.5小时，然后用0.01M的pH 7.2PBS洗涤2次，然后分别将获得的表面连接有血小板糖蛋白特异性单克隆抗体的荧光微球与对应的血小板特异性糖蛋白结合，所述血小板特异性糖蛋白终浓度为0.25mg/mL，反应条件为37℃下1小时，然后用0.01M的pH 7.2PBS洗涤3次，并用1％(v/v)兔血清悬浮，分别得到所述抗原特异性荧光微球Y-a、Y-b、Y-c、Y-d和Y-e的悬浮液，备用；
(2)将步骤(1)中制备得到的所述抗原特异性荧光微球Y-a、Y-b、Y-c、Y-d和Y-e悬浮液的混合液与待检样本按照体积比为1：1混合，37℃孵育30分钟，然后用0.01M的pH7.2PBS(含0.05％(v/v)Tween20)洗涤2次，备用；
(3)向步骤(2)中洗涤后的所述荧光微球与荧光标记抗人IgG(浓度为0.1mg/mL)按照体积比为1：1混合，20-30℃孵育20分钟，然后用0.01M的pH 7.2PBS(含0.05％Tween20)洗涤1次，并采用悬浮液为质量浓度为0.9％的NaCl溶液悬浮至0.5mL，采用流式细胞仪分析检测。
采用人的含有抗HLAⅠ类抗体的血浆，源自临床血小板减少症患者标本作为待测样本。按照上述方法进行检测，检测结果见图2b；采用健康人的血浆，源自献血员标本按照上述方法进行检测，检测结果见图2a；其中图2a为阴性检测结果，图2b为阳性检测结果，说明健康人血浆标本中血小板抗体阴性；而临床血小板减少症患者标本(待测样本)中血小板抗体阳性，并且抗体特异性为抗HLAⅠ类抗体。
实施例5血小板抗体鉴别的流式细胞免疫分析方法的建立
本实施例提供了一种血小板抗体特异性鉴别方法，包括如下步骤：
(1)取五种不同荧光梯度的荧光微球a、b、c、d和e，所述荧光微球采用浓度为0.5mg/mL的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)活化后，分别用0.01M的pH5.0醋酸钠缓冲液配制成浓度为1.5％(v/v)的所述荧光微球溶液，将所述荧光微球溶液分别与HLAⅠ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ、GPⅣ五种血小板糖蛋白特异性单克隆抗体结合，即荧光微球a溶液加入仅含HLAⅠ血小板糖蛋白特异性单克隆抗体(抗HLAⅠ单克隆抗体)中，所述单克隆抗体终浓度为0.2mg/mL，将荧光微球b溶液加入抗GPⅡb/Ⅲa血小板糖蛋白特异性单克隆抗体中，所述单克隆抗体终浓度为0.2mg/mL，以此类推，上述荧光微球溶液与血小板糖蛋白特异性单克隆抗体的反应条件为20℃下3小时，然后用0.012M的pH 7.2PBS洗涤1次，然后分别将获得的表面连接有血小板糖蛋白特异性单克隆抗体的荧光微球与对应的血小板特异性糖蛋白结合，所述血小板特异性糖蛋白终浓度为0.2mg/mL，反应条件为35℃下1.5小时，然后用0.012M的pH 7.2PBS洗涤3次，并用0.5％(v/v)兔血清悬浮，分别得到所述抗原特异性荧光微球Y-a、Y-b、Y-c、Y-d和Y-e的悬浮液，备用；
(2)将步骤(1)中制备得到的所述抗原特异性荧光微球Y-a、Y-b、Y-c、Y-d和Y-e悬浮液的混合液与待检样本按照体积比为2：1混合，35℃孵育45分钟，然后用0.012M的pH7.2PBS(含0.05％(v/v)Tween20)洗涤2次，备用；其中所述待测样本为含有抗HLAⅠ类抗体的血浆，源自临床血小板减少症患者标本。
(3)向步骤(2)中洗涤后的所述荧光微球与荧光标记抗人IgG(浓度为0.3mg/mL)按照体积比为1：2混合，30℃孵育25分钟，然后用0.012M的pH 7.2PBS(含0.05％Tween20)洗涤1次，并采用悬浮液为质量浓度为1.0％的NaCl溶液悬浮至0.5mL，采用流式细胞仪分析检测。
实施例6血小板抗体鉴别的流式细胞免疫分析方法的建立
本实施例提供了一种血小板抗体特异性鉴别方法，包括如下步骤：
(1)取五种不同荧光梯度的荧光微球a、b、c、d和e，所述荧光微球采用浓度为1.5mg/mL的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)活化后，分别用0.01M的pH5.0醋酸钠缓冲液配制成浓度为0.5％(v/v)的所述荧光微球溶液，将所述荧光微球溶液分别与HLAⅠ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ、GPⅣ五种血小板糖蛋白特异性单克隆抗体结合，即荧光微球a溶液加入仅含HLAⅠ血小板糖蛋白特异性单克隆抗体(抗HLAⅠ单克隆抗体)中，所述单克隆抗体终浓度为0.3mg/mL，将荧光微球b溶液加入抗GPⅡb/Ⅲa血小板糖蛋白特异性单克隆抗体中，所述单克隆抗体终浓度为0.3mg/mL，以此类推，上述荧光微球溶液与血小板糖蛋白特异性单克隆抗体的反应条件为30℃下2小时，然后用0.008M的pH 7.2PBS洗涤2次，然后分别将获得的表面连接有血小板糖蛋白特异性单克隆抗体的荧光微球与对应的血小板特异性糖蛋白结合，所述血小板特异性糖蛋白终浓度为0.3mg/mL，反应条件为39℃下0.5小时，然后用0.008M的pH 7.2PBS洗涤3次，并用1.5％(v/v)兔血清悬浮，分别得到所述抗原特异性荧光微球Y-a、Y-b、Y-c、Y-d和Y-e的悬浮液，备用；
(2)将步骤(1)中制备得到的所述抗原特异性荧光微球Y-a、Y-b、Y-c、Y-d和Y-e悬浮液的混合液与待检样本按照体积比为0.5：1混合，39℃孵育15分钟，然后用0.008M的pH7.2PBS(含0.05％(v/v)Tween20)洗涤2次，备用；其中所述待测样本为血清；
(3)向步骤(2)中洗涤后的所述荧光微球与荧光标记抗人IgG(浓度为0.0.5mg/mL)按照体积比为2：1混合，20℃孵育15分钟，然后用0.008M的pH 7.2PBS(含0.05％Tween20)洗涤1次，并采用悬浮液为质量浓度为0.8％的NaCl溶液悬浮至0.5mL，采用流式细胞仪分析检测。
实施例7血小板抗体鉴别的流式细胞免疫分析方法的建立
本实施例提供了一种用于血小板抗体特异性鉴别的试剂盒，包括如下所述抗原特异性荧光微球：以血小板特异性糖蛋白HLAⅠ类连接在荧光微球a的表面，得到抗原特异性荧光微球Y-a；以血小板特异性糖蛋白GPⅡb/Ⅲa连接在荧光微球b的表面，得到抗原特异性荧光微球Y-b；以血小板特异性糖蛋白GPⅠa/Ⅱa连接在荧光微球c的表面，得到抗原特异性荧光微球Y-c；以血小板特异性糖蛋白GPⅠb/Ⅸ连接在荧光微球d的表面，得到抗原特异性荧光微球Y-d；和以血小板特异性糖蛋白GPⅣ连接在荧光微球e的表面，得到抗原特异性荧光微球Y-e。
本实施例还提供了一种配制所述血小板抗体特异性鉴别的试剂盒的方法，步骤如下：
取五种不同荧光梯度的荧光微球a、b、c、d和e，所述荧光微球采用浓度为1mg/mL的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)活化后，分别用0.01M的pH5.0醋酸钠缓冲液配制成浓度为1％(v/v)的所述荧光微球溶液，将所述荧光微球溶液分别与HLAⅠ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ、GPⅣ五种血小板糖蛋白特异性单克隆抗体结合，即荧光微球a溶液加入仅含HLAⅠ血小板糖蛋白特异性单克隆抗体(抗HLAⅠ单克隆抗体)中，所述单克隆抗体终浓度为0.25mg/mL，将荧光微球b溶液加入抗GPⅡb/Ⅲa血小板糖蛋白特异性单克隆抗体中，所述单克隆抗体终浓度为0.25mg/mL，以此类推，上述荧光微球溶液与血小板糖蛋白特异性单克隆抗体的反应条件为20-30℃下2-3小时，然后用0.01M的pH 7.2PBS洗涤2次，然后分别将获得的表面连接有血小板糖蛋白特异性单克隆抗体的荧光微球与对应的血小板特异性糖蛋白结合，所述血小板特异性糖蛋白终浓度为0.25mg/mL，反应条件为37℃下1小时，然后用0.01M的pH 7.2PBS洗涤3次，并用1％(v/v)兔血清悬浮，分别得到所述抗原特异性荧光微球Y-a、Y-b、Y-c、Y-d和Y-e的悬浮液，分装在干净的试剂瓶中，保存，即得。
本实施例提供了一种利用上述试剂盒进行血小板抗体特异性鉴别方法，包括如下步骤：
(1)将上述试剂盒中的所述抗原特异性荧光微球Y-a、Y-b、Y-c、Y-d和Y-e悬浮液的混合液与待检样本按照体积比为1：1混合，37℃孵育15分钟，然后用0.01M的pH 7.2PBS(含0.05％(v/v)Tween20)洗涤2次，备用；其中所述待测样本为血清；
(2)向步骤(2)中洗涤后的所述荧光微球与荧光标记抗人IgG(浓度为0.1mg/mL)按照体积比为1：1混合，20℃孵育15分钟，然后用0.01M的pH 7.2PBS(含0.05％Tween20)洗涤1次，并采用悬浮液为质量浓度为0.9％的NaCl溶液悬浮至0.5mL，采用流式细胞仪分析检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种血小板抗体特异性鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面，得到抗原特异性荧光微球，备用；
(2)将所述抗原特异性荧光微球加入到待测样本中进行孵育反应，洗涤，备用；
(3)向步骤(2)中加入荧光标记的抗人IgG进行孵育反应、洗涤，然后进行流式细胞检测。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，所述血小板特异性糖蛋白为HLA Ⅰ类、GP Ⅱb/Ⅲa、GP Ⅰa/Ⅱa、GP Ⅰb/Ⅸ和GPⅣ。
3.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述HLA Ⅰ类糖蛋白具有A2、A11、A31、A68、B7、B18、B35和B40抗原。
4.根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述GP Ⅱb/Ⅲa糖蛋白具有HPA1a和HPA 4b抗原。
5.根据权利要求2-4任一项所述的鉴别方法，其特征在于，所述GP Ⅰa/Ⅱa糖蛋白具有HPA 5a和HPA 5b抗原。
6.根据权利要求1-5任一项所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述孵育条件为35-39℃，反应时间为15-45分钟。
7.根据权利要求1-6任一项所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述孵育条件为20-30℃，反应时间为15-25分钟。
8.根据权利要求1-7任一项所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(1)中，取所述荧光微球与血小板特异性糖蛋白特异性单克隆抗体混合，在20-30℃下反应2-3小时，然后洗涤，将上述获得的所述荧光微球与所述血小板特异性糖蛋白混合，在35-39℃下反应0.5-1.5小时，然后洗涤，悬浮，即得所述抗原特异性荧光微球阵列。
9.一种用于血小板抗体特异性鉴别的试剂盒，其特征在于，包括由不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面得到的抗原特异性荧光微球阵列。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，包括如下所述抗原特异性荧光微球：
以血小板特异性糖蛋白HLA Ⅰ类连接在荧光微球a的表面，得到抗原特异性荧光微球Y-a；
以血小板特异性糖蛋白GP Ⅱb/Ⅲa连接在荧光微球b的表面，得到第一抗原特异性荧光微球Y-b；
以血小板特异性糖蛋白GP Ⅰa/Ⅱa连接在荧光微球c的表面，得到第一抗原特异性荧光微球Y-c；
以血小板特异性糖蛋白GP Ⅰb/Ⅸ连接在荧光微球d的表面，得到第一抗原特异性荧光微球Y-d；和
以血小板特异性糖蛋白GPⅣ连接在荧光微球e的表面，得到第一抗原特异性荧光微球Y-e。
CN201611265043.8A 2016-12-30 2016-12-30 一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒 Pending CN106872705A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611265043.8A CN106872705A (zh) 2016-12-30 2016-12-30 一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611265043.8A CN106872705A (zh) 2016-12-30 2016-12-30 一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106872705A true CN106872705A (zh) 2017-06-20

Family

ID=59165411

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611265043.8A Pending CN106872705A (zh) 2016-12-30 2016-12-30 一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106872705A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588046A (zh) * 2018-05-11 2018-09-28 武汉博百欧生物科技有限公司 从人体血液中性粒细胞嗜天青颗粒中制备天然髓过氧化物酶的方法
CN108715833A (zh) * 2018-06-01 2018-10-30 天晴干细胞股份有限公司 一种负载血小板裂解液的微球制备方法
CN110988364A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 天津美瑞特医疗科技有限公司 一种应用流式细胞术检测移植后gvhd相关细胞因子的方法及检测试剂盒
CN111077001A (zh) * 2020-01-12 2020-04-28 天津市宝坻区人民医院 抗血小板抗体生物薄片的制作方法
CN112666357A (zh) * 2020-12-31 2021-04-16 宝锐生物科技泰州有限公司 一种抗血小板抗体检测信号制剂的制备方法、抗血小板抗体检测信号制剂及应用
CN112698043A (zh) * 2020-12-31 2021-04-23 宝锐生物科技泰州有限公司 一种血小板抗体检测试剂盒、应用及检测方法
CN112710846A (zh) * 2020-12-16 2021-04-27 江苏伟禾生物科技有限公司 一种测定血小板抗体检测的板式免疫荧光试剂盒及其制备方法
CN116047054A (zh) * 2023-03-08 2023-05-02 江西赛基生物技术有限公司 用于检测血小板抗体的试剂盒及其制备方法和使用方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101246173A (zh) * 2007-10-22 2008-08-20 侯明 检测血小板特异性抗体的流式微球方法
CN101713782A (zh) * 2009-10-27 2010-05-26 苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公司 单抗纳米微球联合检测特异性血小板自身抗体的试剂盒
CN103323586A (zh) * 2013-06-14 2013-09-25 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种血小板磁化免疫标记分析方法
CN203606367U (zh) * 2013-06-24 2014-05-21 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条
CN104569413A (zh) * 2015-01-12 2015-04-29 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种血小板抗体检测的免疫纳米磁珠酶联免疫检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101246173A (zh) * 2007-10-22 2008-08-20 侯明 检测血小板特异性抗体的流式微球方法
CN101713782A (zh) * 2009-10-27 2010-05-26 苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公司 单抗纳米微球联合检测特异性血小板自身抗体的试剂盒
CN103323586A (zh) * 2013-06-14 2013-09-25 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种血小板磁化免疫标记分析方法
CN203606367U (zh) * 2013-06-24 2014-05-21 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条
CN104569413A (zh) * 2015-01-12 2015-04-29 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种血小板抗体检测的免疫纳米磁珠酶联免疫检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. FUJIWARA ET AL: "Application of bead array technology to simultaneous detection of human leucocyte antigen and human platelet antigen antibodies", 《VOX SANGUINIS》 *
LEENDERT PORCELIJIN ET AL: "A new bead‐based human platelet antigen antibodies detection assay versus the monoclonal antibody immobilization of platelet antigens assay", 《IMMUNOHEMATOLOGY》 *
WINNIE CHONG ET AL: "Detection of human platelet antigen‐1a alloantibodies in cases of fetomaternal alloimmune thrombocytopenia using recombinant β3 integrin fragments coupled to fluorescently labeled beads", 《IMMUNOLOGY》 *
汪世华: "《生物医学实验技术系列丛书-抗体技术》", 31 March 2009, 军事医学科学出版社 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588046A (zh) * 2018-05-11 2018-09-28 武汉博百欧生物科技有限公司 从人体血液中性粒细胞嗜天青颗粒中制备天然髓过氧化物酶的方法
CN108715833A (zh) * 2018-06-01 2018-10-30 天晴干细胞股份有限公司 一种负载血小板裂解液的微球制备方法
CN108715833B (zh) * 2018-06-01 2021-09-14 天晴干细胞股份有限公司 一种负载血小板裂解液的微球制备方法
CN110988364A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 天津美瑞特医疗科技有限公司 一种应用流式细胞术检测移植后gvhd相关细胞因子的方法及检测试剂盒
CN111077001A (zh) * 2020-01-12 2020-04-28 天津市宝坻区人民医院 抗血小板抗体生物薄片的制作方法
CN111077001B (zh) * 2020-01-12 2022-05-10 天津市宝坻区人民医院 抗血小板抗体生物薄片的制作方法
CN112710846A (zh) * 2020-12-16 2021-04-27 江苏伟禾生物科技有限公司 一种测定血小板抗体检测的板式免疫荧光试剂盒及其制备方法
CN112666357A (zh) * 2020-12-31 2021-04-16 宝锐生物科技泰州有限公司 一种抗血小板抗体检测信号制剂的制备方法、抗血小板抗体检测信号制剂及应用
CN112698043A (zh) * 2020-12-31 2021-04-23 宝锐生物科技泰州有限公司 一种血小板抗体检测试剂盒、应用及检测方法
CN116047054A (zh) * 2023-03-08 2023-05-02 江西赛基生物技术有限公司 用于检测血小板抗体的试剂盒及其制备方法和使用方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106872705A (zh) 一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒
Schreiber et al. Anti-alprenolol anti-idiotypic antibodies bind to beta-adrenergic receptors and modulate catecholamine-sensitive adenylate cyclase.
Hummeler et al. Identification of poliovirus particles of different antigenicity by specific agglutination as seen in the electron microscope
US4420558A (en) Bright field light microscopic method of enumerating and characterizing subtypes of white blood cells and their precursors
EP2010920B1 (en) Blood group antigens of different types for diagnostic and therapeutic applications
Winchester et al. Lymphocyte surface membrane immunoglobulin
CN107102135A (zh) 用于减少非特异性结合的免疫检验方法和试剂
CN108680756A (zh) 一种不完全抗体检测试剂盒及检测方法
CN102279269A (zh) 胱抑素c检测剂盒的制备方法
CN110016462A (zh) 从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性b淋巴细胞的方法
CN109387627A (zh) 一种基于胎盘样硫酸软骨素a的癌症筛查和早期诊断的试剂方法
Mollnes et al. Detection and quantification of the terminal C5b‐9 complex of human complement by a sensitive enzyme‐linked immunosorbent assay
US4687734A (en) Immunoassay for the detection of human colon cancer using a polyclonal antibody derived from a capillary culture of tumor cells
KR100280239B1 (ko) 호염기구에 결합하는 모노클론성 항체, 호염기구의 분리방법, 호염기구로부터의 케미칼 메디에이터의 유리방법, 및 호염기구 유래 케미칼 메디에이터의 유리시험법
Briner et al. Studies on the immunochemistry of human low density lipoproteins utilizing an hemagglutination technique
CN106996971A (zh) 检测人外周血EVs‑TRPC5含量的试剂盒及方法
Neumüller et al. Influence of chloroquine or acid treatment of human platelets on the antigenicity of HLA and the ‘thrombocyte‐specific’glycoproteins Ia/IIa, IIb, and IIb/IIIa
CN105567724A (zh) 一种胃泌素释放肽前体蛋白表达载体的构建、单抗及试剂盒的制备方法
JP2006317220A (ja) 成人ｔ細胞白血病の診断器具
US4547466A (en) Detecting rheumatoid factor with synthetic particles having immune complexes thereon
Klein et al. Experimental induction of rheumatoid factor-like substances in animal trypanosomiasis
Patel et al. Separation of T and B lymphocytes from human peripheral blood mononuclear cells using density perturbation methods
CN111175488A (zh) 一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的方法及检测试剂盒
CN111217910B (zh) 单克隆抗体对及其在检测髓过氧化物酶蛋白中的应用
CN109266620B (zh) 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170620

RJ01 Rejection of invention patent application after publication