CN111077001B - 抗血小板抗体生物薄片的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗血小板抗体生物薄片的制作方法，属于利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，属于免疫生物技术领域。本发明的技术方案是：生物薄片上形成有凹槽的反应区，反应区上同时包被有血小板和Hep‑2细胞，进行荧光染色，通过血小板和Hep‑2细胞两种组织抗原荧光进行阴阳性分析判断，其使用方法和与原有间接免疫荧光法相同，经济方便易行，是一种排除抗核抗体干扰的免疫荧光检测方法。
Description
技术领域
本发明属于免疫生物技术领域；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法。
背景技术
血小板抗体有两类，一类主要是针对人类组织相容性抗原的抗体，即血小 板表面相关抗体，一类是针对GP抗原的血小板特异性抗体，测定方法为免疫印迹技术，ELISA 法，微柱凝胶技术，分子生物学技术，免疫荧光技术等，其中免疫荧光技术最为常用，采用人（O型血）血小板涂片，检测血小板膜糖蛋白主要为GPⅡb/Ⅲa为主要的自身抗体。
在应用间接免疫荧光法检测抗血小板抗体时，常常因荧光强度判断标准不一，每个操作人员掌握的技术标准不同，受抗核抗体的干扰等而使结果出现不一致的现象，为了排除抗核抗体干扰，本发明将血小板生物薄片同时包被有血小板和Hep-2细胞，在相同条件操作下，通过血小板和Hep-2细胞两种组织抗原荧光比较进行阴阳性判断。
发明内容：
为了解决现有技术中抗血小板抗体间接免疫荧光法受抗核抗体的干扰而使结果出现偏差问题，本发明提供一种经济方便易行，准确性更高、能够消除内源性抗核抗体干扰的测定方法。
本发明的技术方案是：生物薄片上形成有凹槽的反应区同时包被有血小板和Hep-2细胞，在相同操作条件下进行荧光染色，通过血小板和Hep-2细胞两种组织抗原荧光进行阴阳性分析判断，其使用方法和与原有间接免疫荧光法相同，经济方便易行，是一种排除抗核抗体干扰的免疫荧光检测方法。
本发明与现有技术相比有如下优点：为了排除抗核抗体的干扰，本发明将血小板生物薄片反应区同时包被有血小板和Hep-2细胞，在相同条件操作下，通过血小板和Hep-2细胞两种组织抗原荧光强度进行比较，当血小板荧光强度高于Hep-2细胞，就可以抗血小板抗体阳性，当Hep-2细胞和抗血小板抗体同时出现阳性时，应考虑为抗核抗体交叉反应造成的假阳性，血小板和Hep-2细胞可以在在相同条件下进行操作。
附图说明：
图1为本发明抗血小板抗体生物薄片示意图
图中：1.生物薄片 2.反应区
3. 凹槽 4.血小板
5. Hep-2细胞 6.盖玻片
具体实施方式：
下面通过抗血小板抗体生物薄片的制作方法实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
生物薄片的制作：应用磷酸盐缓冲液洗涤血小板和Hep-2细胞混悬液5次，进行15000G离心10min，弃去上清液, 继续用10ml PBS-T缓冲液5%(V/V)TritonX-100PBS混悬,用PBS调整混合细胞数至100个/μl，点片到含有多聚赖氨酸的玻璃或者聚苯乙烯薄片上,冷风吹干后,密封,2～8℃低温保存,如图1所示 。
实施例2
实验操作：
样本准备：待检血清样本用PBS吐温缓冲液1:10稀释，将11.1µl血清样本加入到100µlPBS吐温缓冲液中并充分混匀。加样：将25μl稀释后的血清样本加至生物薄片反应区后，37℃温育30分钟，应避免产生气泡。冲洗：用盛于烧杯内的PBS吐温缓冲液冲洗载片1秒钟，然后立即将生物载片浸入装有PBS吐温缓冲液的洗杯中，浸泡至少5分钟。加样：将25μLFITC标记的荧光二抗加至生物薄片的反应区上后，开始温育37℃温育30分钟，应避免产生气泡。冲洗：用烧杯内的PBS吐温缓冲液冲洗载片1秒钟，然后立即将生物载片浸入装有PBS吐温缓冲液的洗杯中，浸泡至少5分钟。封片：滴加25μL甘油/PBS至生物薄片反应区上，盖上盖玻片。
仪器： EUROStar Ⅲ PLUS 荧光显微镜
结果判断
在荧光显微镜下观察检测结果，观察组织器官时用20×物镜，观察细胞基质用40×物镜。激发滤片：488nm，分光滤镜：510nm，阻挡滤镜：520nm。
荧光模式（阳性反应）：在相同条件下操作下，通过血小板和Hep-2细胞两种组织抗原荧光强度进行比较，当血小板荧光强度高于Hep-2细胞，就可以抗血小板抗体阳性，当Hep-2细胞和抗血小板抗体同时出现阳性时，应考虑为抗核抗体交叉反应造成的假阳性。抗血小板抗体阳性时，生物薄片整个表面上所有血小板出现一特异性的均匀荧光，如果只是少数细胞出现荧光，不应判断为阳性。抗血小板抗体阳性样本的荧光模型必须与阳性对照的荧光模型基本一致。
Claims (3)
1.一种抗血小板抗体生物薄片的制作方法，其特征在于生物薄片上形成有凹槽的反应区包被有血小板和Hep-2细胞两种组织抗原，应用磷酸盐缓冲液洗涤血小板和Hep-2细胞混悬液5次，进行15000G离心10min，弃去上清液,继续用10ml PBS-T缓冲液5％(V/V)TritonX-100PBS混悬,用PBS调整混合细胞数至100个/μl，点片到含有多聚赖氨酸的玻璃或者聚苯乙烯薄片上,冷风吹干后,密封,2～8℃低温保存。
2.根据权利要求1所述的一种抗血小板抗体生物薄片的制作方法，其特征在于检测方法为：待检血清样本用PBS吐温缓冲液1:10稀释，将11.1μl血清样本加入到100μlPBS吐温缓冲液中并充分混匀；加样：将25μl稀释后的血清样本加至生物薄片反应区后，37℃温育30分钟，应避免产生气泡；冲洗：用盛于烧杯内的PBS吐温缓冲液冲洗载片1秒钟，然后立即将生物载片浸入装有PBS吐温缓冲液的洗杯中，浸泡至少5分钟；加样：将25μL FITC标记的荧光二抗加至生物薄片的反应区上后，开始温育37℃温育30分钟，应避免产生气泡；冲洗：用烧杯内的PBS吐温缓冲液冲洗载片1秒钟，然后立即将生物载片浸入装有PBS吐温缓冲液的洗杯中，浸泡至少5分钟；封片：滴加25μL甘油/PBS至生物薄片反应区上，盖上盖玻片。
3.根据权利要求1所述的一种抗血小板抗体生物薄片的制作方法，其特征在于结果判断：通过血小板和Hep-2细胞两种组织抗原荧光强度进行比较，当血小板荧光强度高于Hep-2细胞，为抗血小板抗体阳性，当Hep-2细胞和抗血小板抗体同时出现阳性时，为抗核抗体交叉反应造成的假阳性。
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