CN115840051A - 基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，实现以涂片细胞形态学技术为基础结合免疫标记技术准确检测血液/骨髓涂片特定形态白血病细胞的免疫标记及诊断方法和工艺路线。将制备的三价镱离子和三价铒离子掺杂四氟钇钠上转换纳米颗粒经过修饰和抗体偶联制备出免疫荧光探针标记细胞用于细胞荧光场成像，结合瑞氏/瑞‑姬氏染液复染后明场成像的细胞形态，实现同一视野内涂片血液肿瘤细胞的形态特点及免疫标记特征协同检测、评估。稀土上转换材料免疫荧光探针特异性好、荧光信号强，为实现以细胞形态学为基础的血液肿瘤细胞联合免疫标记准确诊断血液/骨髓涂片血液肿瘤细胞提供了新方法。
Description
技术领域
本发明涉及基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，属于检测技术领域，该工艺可协同用于骨髓涂片血液肿瘤细胞的形态学观察、免疫标记和血液肿瘤类型的判断。
背景技术
白血病是血液系统的恶性疾病，俗称“血癌”，是国内十大高发恶性肿瘤之一，白血病的有效治疗依靠分析患者来源的血液肿瘤细胞进行分型诊断。世界卫生组织主张应用细胞形态学（Morphology）、免疫学（Immunology）、细胞遗传学（Cytogenetics）和分子生物学（Molecular）分型，即MICM分型。其中，细胞形态学和免疫标记检测是整个诊断体系最基础和最为重要的手段。
细胞形态学特征分析具有所见即所得的天然优势，但白血病细胞形成的内在因素复杂，细胞类型繁多，容易造成观察者误读误判。一些分化程度过低的细胞，细胞形态类别特征不突出，仅依靠形态学观察难以准确诊断，结合免疫标记则可大大提升诊断的准确性。稀土掺杂无机纳米晶具有独特的优势，如光稳定性好、信噪比高、易于生物偶联、生物相容性高、成本低等，作为新一代荧光标记材料用于CD抗体免疫标记具有广泛的应用前景。
本发明公开基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，利用稀土离子掺杂四氟钇钠纳米颗粒偶联抗体制备免疫荧光探针用于白血病细胞荧光成像，结合瑞氏/瑞-姬氏染色后的细胞明场成像，实现了同一视野下涂片血液肿瘤细胞免疫标记-形态学协同检测评估。
发明内容
1.本发明的目的是建立一种基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺。
2.本发明所述的技术路线是指上转换荧光探针标记的免疫荧光细胞图联合瑞氏/瑞-姬氏染色后的细胞形态图，实现相同视野下骨髓涂片白血病细胞的准确分类和诊断。
本发明的目的是这样实现的，一种基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，其特征在于，采用的免疫荧光探针为CD抗体偶联的三价镱离子和三价铒离子掺杂四氟钇钠上转换纳米颗粒，通过抗原-抗体识别能用于白血病细胞特异性免疫荧光成像，协同瑞氏/瑞-姬氏染色后的白血病细胞形态明场成像，能实现相同视野下骨髓涂片白血病细胞的准确诊断。
本发明所述的基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，其特征在于，所述免疫荧光探针的制备方法，包括步骤如下：（1）上转换纳米材料的制备与修饰：在通氮气情况下，将含有Y3+的无机盐，Yb3+的无机盐，Er3+的无机盐和氟化氢钠在油酸和十八烯中反应，反应结束后分离得到纳米材料NaYF4:Yb3+,Er3+UCNPs；所述纳米材料为晶体，晶格间距为0.52 nm，纳米颗粒尺寸为20～30 nm；所述纳米材料经过盐酸酸洗和聚丙烯酸修饰后得纳米材料混悬液、备用；（2）免疫荧光探针的制备与偶联：使用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）加入步骤（1）得到的纳米材料混悬液，室温下混匀，加入适量抗体，继续室温下混匀，离心除去未结合抗体，得沉淀物，将沉淀物加入纯水中，超声后离心，制得纳米材料-CD38抗体偶联物，以牛血清白蛋白（BSA）封闭，所得免疫荧光探针溶解于4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液，于4℃冰箱中储存备用。
所述的基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，其特征在于，免疫荧光探针标记白血病细胞的方法，其具体操作如下：（1）待弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞生长至培养瓶的70~80%，观察其生长状态良好时，收集其细胞悬浮液，离心后用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，用PBS配置细胞浓度为5×105/mL；（2）取适量的免疫荧光探针加入细胞混悬液中，于室温孵育30分钟；（3）孵育完毕后，通过1000 rpm离心力将标记后的细胞沉淀，未与细胞偶联的探针仍留在上清液中，移除上清液；加入PBS清洗细胞3次以除去未偶联的探针，得到免疫荧光探针-细胞偶联物；（4）取100 μL所述的免疫荧光探针-细胞偶联物，与900 μL PBS混匀后滴加到离心制片机或甩片机的沉降槽中，通过离心力将细胞移至粘附型玻片上，玻片于室温下晾干备用。
所述的基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，其特征在于，瑞氏/瑞-姬氏染液染色方法，具体操作步骤为：滴加瑞氏/瑞姬染液于粘附玻片上，充分覆盖细胞分布区域5~10秒，滴加磷酸盐缓冲液为瑞氏/瑞姬氏染液量1~3倍，将瑞氏/瑞姬氏染液和缓冲液充分混匀，室温下染色20~40分钟，然后用流水进行冲洗，晾干备用。
具体地说，本发明所述的一种基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，依序包括如下步骤：
（1）免疫荧光探针的制备
称量一定的乙酸钇、乙酸镱、乙酸铒和乙酸钠于油酸和十八烯中，160 ℃反应30分钟，然后冷却至50 ℃左右。加入2 mM氟化氢钠，升温至310 ℃反应1小时。待反应结束后，冷却至室温，所得纳米颗粒于环己烷中超声解聚，再加入乙醇，离心5分钟（12000 rpm），此解聚-沉淀步骤重复3次。将所得的纳米颗粒于环己烷中超声解聚，加入等体积1%盐酸溶液，充分震荡，然后加入等量乙醇，超声、离心（12000 rpm，5分钟）。将纳米颗粒沉淀于纯水中超声解聚，再加入乙醇，离心（12000 rpm，5分钟），此水洗-离心步骤重复3次。将水溶性的纳米颗粒加入至1%聚丙烯酸溶液中，室温下混匀2小时，离心（12000 rpm，10分钟）除去未连接的聚丙烯酸，此水洗-离心步骤重复3次，最后溶解于纯水中备用。
分别称取10 mg的NHS和10 mg的EDC，溶解于200 μL的0.1 M MES（pH 6.0）中，并加入定量的纳米材料混悬液，室温下混匀30分钟。加入定量的抗体，继续室温下混匀2小时。然后离心（12000 rpm，5分钟）除去未结合抗体。沉淀加入500 μL纯水，超声2分钟后离心（12000 rpm，5分钟），此水洗-离心步骤重复三次。使用5 wt% BSA封闭1小时后，离心（12000rpm，5分钟）以便除去上清液中剩余的BSA。利用10 mM HEPES洗涤纳米材料，超声2分钟后离心（12000 rpm，5分钟），此洗涤-离心过程重复3次。最后溶解于HEPES，4 ℃冰箱中储存备用，即制得免疫荧光探针。
（2）免疫荧光探针偶联细胞与制片
待DLBCL细胞生长至培养瓶的70~80%，观察其生长状态良好时，收集其细胞悬浮液，离心后用PBS（0.1 M，pH7.4）重悬细胞，然后用适量的PBS配置细胞浓度为5×105/mL。取适量的免疫荧光探针加入细胞混悬液中，于室温避光孵育30分钟。孵育结束后，通过离心（1000 rpm，5分钟）沉淀标记细胞，并移除上清液。沉淀中加入2 mL PBS清洗细胞并离心（1000 rpm，5分钟），此清洗-离心过程重复3次，即得到免疫荧光探针-细胞偶联物。取10μL所述的标记细胞混悬液，使用PBS稀释为5×104/mL浓度，滴加到离心制片机（甩片机）的沉降槽中，通过离心力将细胞移至粘附型玻片上，玻片于室温下晾干备用。
（3）瑞氏/瑞-姬氏染色与显微镜成像
将干燥的玻片置于水平玻片染色架上，滴加瑞氏/瑞姬染液于所述粘附玻片上，充分覆盖细胞分布区域5~10秒，滴加磷酸盐缓冲液，为瑞氏/瑞姬氏染液量1~3倍，将染液和缓冲液充分混匀，室温下染色20~40分钟，反应结束后用流水进行冲洗，晾干备用。使用外接980 nm激光器的倒置荧光显微镜进行成像，于明场下观察、聚焦、采集图像，然后打开荧光通道挡板，观察免疫标记显色情况，进行原位图像采集。
本发明优点:细胞形态学联合免疫标记检测可提升对血液肿瘤细胞诊断的准确性。稀土掺杂无机纳米晶具有光稳定性好、信噪比高、易于生物偶联、毒性低和成本低等独特优势，适合用于作为白血病免疫分型探针的发光材料。
附图说明
图1为本发明的基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺中NaYF4:Yb3+,Er3+UCNPs的透射电镜图，插图为高分辨透射电镜图。
图2为本发明的基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺中NaYF4:Yb3+,Er3+UCNPs的X射线粉末衍射图。
图3为本发明的基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺中免疫荧光探针制备过程的表征。
图4为本发明的基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断血液/骨髓涂片白血病细胞的细胞形态和免疫荧光图。
图5为本发明的基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断血液/骨髓涂片白血病细胞的临床样本细胞形态和免疫荧光图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及使用效果更加清晰，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
实施例1：
基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺中NaYF4:Yb3+,Er3+UCNPs的制备步骤如下：
在50 mL圆底烧瓶中加入0.273 g乙酸钇、0.076 g乙酸镱、0.0084 g乙酸铒、0.272g乙酸钠、10 mL油酸和10mL十八烯，通入氮气，160 ℃反应30分钟，然后冷却至50 ℃。加入0.124 g氟化氢钠，升温至320 ℃反应1小时。待反应结束后，冷却至室温，所得纳米颗粒于环己烷中超声解聚，再加入乙醇，离心5分钟（12000 rpm），此解聚-沉淀步骤重复3次，即得到NaYF4:Yb3+,Er3+UCNPs。
对制备得到的NaYF4:Yb3+,Er3+UCNPs分别进行透射电镜测试和X射线粉末衍射测试。图1为实施例1制备得到的NaYF4:Yb3+,Er3+UCNPs的透射电镜图，从图1中可以看出所制备的上转换纳米颗粒为六边形结构，尺寸为25 nm左右，形貌较为均一，晶格为0.52 nm。图2为实施例1制备得到的NaYF4:Yb3+,Er3+UCNPs的X射线粉末衍射图，从图2中可以看出所制备的纳米颗粒没有杂相，对应的PDF卡片号JCPDS: No. 28-1192。
实施例2：
基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺中免疫荧光探针的制备步骤如下：
（1）将实施例1所得的纳米颗粒（1 mL）于1 mL环己烷中超声解聚，加入2 mL 1 wt%盐酸溶液，充分震荡，静置后取其上清液，移至3 mL无水乙醇，超声、离心（12000 rpm，5分钟）获得纳米颗粒沉淀。将纳米颗粒沉淀于纯水中超声解聚，离心（12000 rpm，5分钟），此水洗-离心步骤重复3次，获得水溶性纳米颗粒。将水溶性纳米颗粒加入至1 wt%聚丙烯酸溶液中，室温下混匀2小时，离心（12000 rpm，10分钟）除去剩余的聚丙烯酸，此水洗-离心步骤重复3次，最后溶解于纯水中获得纳米材料混悬液。（2）分别称取10 mg的EDC和10 mg的NHS，溶解于200 μL的0.1 M MES（pH 6.0）中，并加入步骤（1）制得的纳米材料混悬液，室温下混匀30分钟。加入适量CD38抗体，继续室温下混匀2小时。离心（12000 rpm，5分钟）除去未结合抗体。沉淀物加入500 μL纯水，超声2分钟后离心（12000 rpm，5分钟），此水洗-离心步骤重复3次后用5 wt% BSA封闭，待5 wt% BSA封闭1小时后，离心（12000 rpm，5分钟）以除去上清液中残留的BSA，获得免疫荧光探针。使用10 mM HEPES洗涤免疫荧光探针，超声2分钟后离心（12000 rpm，5分钟），此洗涤-离心步骤重复3次。最后溶解于HEPES，4 ℃冰箱中储存备用，即制得免疫荧光探针。
如图3所示，经过1 wt%盐酸酸洗的纳米材料表面带正电（37.38 mV，曲线a），聚丙烯酸修饰后的纳米材料混悬液带负电（-20.19 mV，曲线b），连接上抗体后，zeta电势为-9.97 mV（曲线c）。zeta电势的改变说明酸洗和聚丙烯酸修饰成功，修饰后的纳米材料和抗体偶联成功，即免疫荧光探针制备成功。
实施例3：
基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺中免疫荧光标记联合细胞形态学成像的步骤如下：
待DLBCL细胞生长至培养瓶的70~80%，观察其生长状态良好时，收集其细胞悬浮液，离心后用PBS洗三遍后，用适量的PBS配置细胞浓度为5×105/mL。取200 μL实施例2制得的免疫荧光探针加入到1 mL上述浓度5×105/mL细胞混悬液中，避光室温孵育30分钟。孵育结束后，通过离心（1000 rpm，5分钟）沉淀探针标记的细胞，并移除上清液。沉淀中加入2 mLPBS，震荡/吹打混匀，离心（1000 rpm，5分钟）移除上清，此清洗-离心步骤重复3次，去除未结合探针，得到免疫荧光探针-细胞偶联物。使用PBS稀释细胞浓度为5×104/mL浓度，滴加1mL细胞混悬液到离心制片机的沉降槽中，通过离心力将细胞移至粘附型玻片上，玻片于室温下晾干备用。对照组为细胞于不含免疫荧光探针的PBS中孵育30分钟、离心、清洗、制片、室温下晾干备用（空白对照组）。实验组1是将细胞于不含免疫荧光探针的PBS中孵育30分钟、离心、清洗、制片，并且在晾干后的粘附玻片上滴用瑞氏/瑞-姬氏染液复染20~30分钟左右，流水冲洗30~45秒，室温下晾干备用。实验组2是将细胞于含有免疫荧光探针的PBS中孵育30分钟、离心、清洗、制片、室温下晾干备用。实验组3是将细胞于含有免疫荧光探针的PBS中孵育30分钟、离心、清洗、制片，并且在晾干后的粘附玻片上滴加瑞氏染液复染，常温染色20~-30分钟，流动水冲洗30~45 s，室温下晾干备用。
图4为免疫荧光标记联合细胞形态学成像图，图中：A、B、C、D表示显微镜明场图，A’、B’、C’、D’表示显微镜荧光场图，A’’、B’’、C’’、D’’表示明场-荧光场重叠图。在980 nm激光激发下，空白对照组（图4中的A）和实验组1（图4中的B）细胞无荧光，实验组2（图4中的C）和实验组3（图4中的D）经探针标记的细胞均有荧光，说明探针可通过抗原-抗体识别偶联至细胞表面。在明场下，经过复染可以观测到白血病细胞直径、核仁直径、胞核成熟度、胞核畸形度等形态学特征，切换激光光源可观察细胞免疫标记，可以实现白血病患者细胞的精准识别和诊断。
实施例4：
基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺中临床样本的免疫荧光标记联合细胞形态学成像的步骤如下：
血液样本白细胞数可参考血细胞计数仪测定的白细胞数值，骨髓样本可采用改良牛鲍计数板法计数白细胞的含量，取含有1.5×105个有核细胞数的细胞悬液于流式细胞管中，加入20 μL免疫荧光探针，室温孵育30分钟。孵育结束后，通过离心（1000 rpm，5分钟）沉淀探针标记的细胞，并移除上清液。沉淀中加入2 mL PBS，震荡/吹打混匀，离心（1000 rpm，5分钟）移除上清，此清洗-离心步骤重复3次，去除未结合探针，得到免疫荧光探针-细胞偶联物。（对于红细胞含量较高的样本在孵育结束离心并去除上清液后添加1mL溶血素，震荡混匀，静置3分钟，1000 rpm离心5分钟，弃上清，加入2mL PBS混匀，1000 rpm离心5分钟，弃上清，此清洗-离心步骤重复2次）。加入1 mL PBS，震荡混匀，并将该1 mL免疫荧光探针-细胞偶联物转移到离心制片机的沉降槽中，通过离心力将细胞移至粘附型玻片上，玻片于室温下晾干。然后在干燥的粘附玻片上滴用瑞氏/瑞-姬氏染液复染20~30分钟左右，流水冲洗30~45s，室温下晾干备用。
图5为临床样本的免疫荧光标记联合细胞形态学成像图。该血液样本在复染后，明场视野下，可以观察细胞分布情况及细胞形态，初步形态分析确定白血病/靶细胞（图5中的A），白血病细胞为观察CD标记的靶细胞。切换980 nm激光光源，激发后，经探针特异性标记的白血病细胞有明显的荧光（图5中的B）和（图5中的C），说明该患者白血病细胞有表达CD38抗原标记，且探针可通过细胞表面抗原与CD38抗体特异识别从而偶联至靶细胞表面。该患者临床确诊为急性单核细胞白血病（M5），原、幼单核细胞表达CD38抗原，成像结果与之相符，说明基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术可在形态识别的基础上联合细胞的免疫标记准确诊断血液/骨髓涂片白血病细胞。
Claims (4)
1.一种基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，其特征在于，采用的免疫荧光探针为CD抗体偶联的三价镱离子和三价铒离子掺杂四氟钇钠上转换纳米颗粒，通过抗原-抗体识别能用于白血病细胞特异性免疫荧光成像，协同瑞氏/瑞-姬氏染色后的白血病细胞形态明场成像，能实现相同视野下骨髓涂片白血病细胞的准确诊断。
2.如权利要求1所述的基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，其特征在于，所述免疫荧光探针的制备方法，包括步骤如下：（1）上转换纳米材料的制备与修饰：在通氮气情况下，将含有Y3+的无机盐，Yb3+的无机盐，Er3+的无机盐和氟化氢钠在油酸和十八烯中反应，反应结束后分离得到纳米材料NaYF4:Yb3+,Er3+ UCNPs；所述纳米材料为晶体，晶格间距为0.52 nm，纳米颗粒尺寸为20～30 nm；所述纳米材料经过盐酸酸洗和聚丙烯酸修饰后得纳米材料混悬液、备用；（2）免疫荧光探针的制备与偶联：使用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）加入步骤（1）得到的纳米材料混悬液，室温下混匀，加入适量抗体，继续室温下混匀，离心除去未结合抗体，得沉淀物，将沉淀物加入纯水中，超声后离心，制得纳米材料-CD38抗体偶联物，以牛血清白蛋白（BSA）封闭，所得免疫荧光探针溶解于4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液，于4℃冰箱中储存备用。
3.如权利要求1或2所述的基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，其特征在于，免疫荧光探针标记白血病细胞的方法，其具体操作如下：（1）待弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞生长至培养瓶的70~80%，观察其生长状态良好时，收集其细胞悬浮液，离心后用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，用PBS配置细胞浓度为5×105/mL；（2）取适量的免疫荧光探针加入细胞混悬液中，于室温孵育30分钟；（3）孵育完毕后，通过1000 rpm离心力将标记后的细胞沉淀，未与细胞偶联的探针仍留在上清液中，移除上清液；加入PBS清洗细胞3次以除去未偶联的探针，得到免疫荧光探针-细胞偶联物；（4）取100 μL所述的免疫荧光探针-细胞偶联物，与900 μL PBS混匀后滴加到离心制片机或甩片机的沉降槽中，通过离心力将细胞移至粘附型玻片上，玻片于室温下晾干备用。
4.如权利要求1-3任一所述的基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，其特征在于，瑞氏/瑞-姬氏染液染色方法，具体操作步骤为：滴加瑞氏/瑞姬染液于粘附玻片上，充分覆盖细胞分布区域5~10秒，滴加磷酸盐缓冲液为瑞氏/瑞姬氏染液量1~3倍，将瑞氏/瑞姬氏染液和缓冲液充分混匀，室温下染色20~40分钟，然后用流水进行冲洗，晾干备用。
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