CN111308068A

CN111308068A - 一种基于上转换发光纳米材料的检测试纸及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111308068A
Application number: CN202010150692.3A
Authority: CN
Inventors: 徐峰; 游民黎; 巩燕; 杨仁杰
Original assignee: Suzhou Dianan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Dianan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2020-06-19

Abstract

本发明提供了一种基于上转换发光纳米材料的检测试纸及其制备方法和应用。所述检测试纸包括分析膜和结合垫，所述结合垫的一端与分析膜重合，重合处所述结合垫位于分析膜的上方，所述分析膜上包被至少三条检测线，所述结合垫上结合至少三种发光颜色的检测探针，所述检测探针为上转换发光纳米探针。本发明提供的检测试纸可以同时检测多个目标物，并利用不同发光颜色的上转换发光纳米材料，使检测试纸的结果更容易区分，同时避免多个目标物之间的交叉反应带来的影响，提高检测结果的准确度。

Description

一种基于上转换发光纳米材料的检测试纸及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫层析检测技术，具体涉及一种检测试纸及其制备方法和应用，尤其涉及一种基于上转换纳米材料的检测试纸及其制备方法和应用。

背景技术

上转换发光纳米材料(Upconverting Nanoparticles,UCNPs)是将长波长激发光转换成短波长发射光的新型荧光探针材料，具有独特的发光性质和良好的化学稳定性。UCNPs主要是掺杂稀土元素的固体化合物，其组成一般包括基质和激活剂，基质主要为稀土化合物，如氧化物、硫化物、卤化物、硫氧化物和卤氧化物等，激活剂主要为稀土离子Pr³⁺、Nd³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺、Ho³⁺、Er³⁺和Tm³⁺等，而双掺杂型上转换材料还包括敏化剂。

通过参杂镧系稀土元素到主体基质中，实现把近红外(NIR)激发光转化为可见或紫外发射光，UCNPs的发光机制使得它与传统的有机荧光团和量子点相比，展现出高的化学发光稳定性，低毒性，同时还具有窄的发射带和大的斯托克斯位移(超过500nm)。并且相对于紫外和可见光，生物样品在近红外光下自发荧光较弱，且近红外光散射少，因此近红外激发光对组织有较大的穿透深度(大于10mm)，信噪比高，这些特点使得UCNPs成为生物标记和成像技术领域理想的荧光探针。UCNPs标记物具有连续发光和发光稳定性好，灵敏度高、选择性好、便于观察、操作简单且不损伤样本等诸多优点，被广泛的应用在医学生物、激光技术、光纤通讯技术等方面。

免疫层析技术(Immunochromatography assay,ICA)又叫侧向流动分析法(LF,Lateral flow assay)，是二十世纪九十年代以来在酶联免疫吸附试验的基础上发展起来的快速诊断技术。它是基于抗原抗体的特异性识别，利用毛细管虹吸作用，使液体样品在试纸条上横向流动，目标物被分析膜上捕获蛋白捕获，从而检测结合物标记的荧光探针的荧光强度来判断目标物浓度的方法。ICA依标记荧光探针和检测对象不同，可以做到定性和定量检测。ICA操作简单，造价低廉，检测时间通常在30min之内，而且制备的试纸条保存方法简单，常温就可保存，且有效期长，因此广泛用于食品、医疗和农业等方面的检测。

最初的ICA系统信号输出基于胶体金团聚而发生肉眼可见的颜色变化，不需要专门的仪器检测设备，但是只能做到定性或半定量检测。目前，可用于ICA中作生物标记的材料包括传统的纳米金，新兴的量子点，碳纳米颗粒(CNPs,carbon nanoparticles)与UCNPs等。基于UCNPs与ICA联用的技术，因样品在NIR处自吸收低，UCNPs自身化学稳定，无光漂白，因而能够实现比其他纳米探针更灵敏，更精确的半定量和定量检测，开辟了探索免疫层析法准确快速检测的新领域。

免疫层析技术凭借其简单快速、易操作等优势被广泛地应用于许多领域，但是该技术在快速检测过程中仍存在着一些问题并有很大的提升空间。免疫层析试纸只能进行单目标物检测，而某些疾病的检测需要同时检测多项数据，例如急性心肌梗死(Acutemyocardial infarction,AMI)的早期诊断需要检测心梗三项，即肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌红蛋白(Myo)和肌钙蛋白(cTn)，同时检测这三项指标才能确认诊断结果。

因此，如何利用免疫层析试纸实现多目标物的检测，且减小目标物之间的相互影响，保证检测结果的灵敏度和精确度，是制备免疫层析试纸时亟需解决的问题。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于上转换发光纳米材料的检测试纸，所述检测试纸可以同时检测多个目标物，同时利用不同颜色的上转换发光纳米材料，减小待测目标物之间的相互影响，提高检测结果的灵敏度和精确度。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于上转换纳米材料的检测试纸，所述检测试纸包括分析膜和结合垫，所述结合垫的一端与分析膜重合，重合处所述结合垫位于分析膜的上方，所述分析膜上包被至少三条检测线，所述结合垫上结合至少三种发光颜色的检测探针，所述检测探针为上转换发光纳米探针。

本发明提供的检测试纸，包括至少三条检测线，相比于单条检测线，可以实现多种目标物的检测，而且通过多种颜色的检测探针，可以避免目标物之间的相互影响，使检测结果易于区分，排除交叉反应，使结果更加精确。

作为本发明优选的技术方案，所述上转换发光纳米探针为具有生物修饰分子的上转换发光纳米材料。

优选地，所述生物修饰分子为核酸适配体或抗体。

所述生物分子如核酸适配体或抗体等能够与待测目标物结合。

所述核酸适配体包括可以与待测目标物结合的互补DNA片段、RNA片段或核酸类似物等。

优选地，所述上转换发光纳米材料选自NaYF₄:Yb,Er、NaYF₄:Yb,Tm、NaYF₄:Er,Tm、NaGdF₄:Er,Tm、NaYF₄:Yb,Ho或NaYF₄:Yb,Gd中任意三种或至少四种发光颜色不同的组合，例如可以是NaYF₄:Yb,Er、NaYF₄:Yb,Tm和NaYF₄:Er,Tm的组合。

其中，NaYF₄:Yb,Er为发绿光的镱铒共掺四氟钇钠，NaYF₄:Yb,Tm为发蓝光的镱铥共掺四氟钇钠，NaYF₄:Er,Tm为发红光的铒铥共掺四氟钇钠，以这三种上转换发光纳米材料为检测探针的基础结构，可以便于区分检测线上所含待测物的种类，避免交叉影响。

作为本发明优选的技术方案，所述检测试纸的分析膜上还包被质控线。

优选地，所述上转换发光纳米材料具有一层或两层以上的包裹层。

优选地，所述包裹层为NaYF₄、NaGdF₄、NaYF₄:Yb或NaGdF₄:Yb的中任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述上转换发光纳米材料通过热分解法、水热法、溶剂热法或沉淀法中任意一种方法制备。

目前，上转换发光纳米材料的合成方法主要有热分解法、水热法、溶剂热法或沉淀法。纳米粒子的大小分布、形态、发光波长和水溶性等性质随合成方法不同有所差别，故需要根据实际应用选择最佳的合成方法。其中，热分解法和溶剂热法是当前主流合成方法，因为这两种方法对晶体的形貌、大小和分散性等可以做到较为有效控制。

作为本发明优选的技术方案，所述检测线为含有核酸适配体或抗体的检测线。所述检测线中含有的核酸适配体或抗体能够与待测目标物或者所述生物分子结合。

优选地，所述质控线为含有第二抗体的质控线。

本发明中，当生物分子与检测线选择的是核酸适配体与待测目标物结合时，则不需要添加质控线；当生物分子为抗体或核酸链与待测目标物结合时，则需要添加第二抗体或相应互补核酸链作为质控线与生物分子结合，以确保检测结果的有效性。

优选地，所述分析膜为硝酸纤维素膜。

作为本发明优选的技术方案，所述检测线位于分析膜上靠近结合垫的一侧。

优选地，所述检测线之间的距离为3～5mm，例如可以是3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm等。

优选地，所述质控线位于分析膜上远离结合垫的一侧。

优选地，所述质控线与相邻的检测线的距离为3～5mm，例如可以是3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm等。

作为本发明优选的技术方案，所述多目标物检测试纸还包括样品垫、支撑垫和吸水垫。

优选地，所述分析膜固定在支撑垫的中间，所述吸水垫位于分析膜的一侧，所述结合垫位于分析膜远离吸水垫的一侧，所述样品垫位于结合垫远离分析膜的一侧。

优选地，所述样品垫的一端与结合垫的重合，重合处所述样品垫位于结合垫上方，所述吸水垫的一端与分析膜重合，重合处所述吸水垫位于分析膜上方。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的检测试纸的制备方法，包括如下步骤：

将所述检测试纸的结合垫置于分析膜的一端，重合处所述结合垫位于分析膜的上方，在所述分析膜上添加至少三条检测线，再将至少三种发光颜色的上转换发光纳米探针添加到所述结合垫上得到所述检测试纸。

作为本发明优选的技术方案，所述制备方法还包括如下步骤：将样品垫置于所述结合垫远离分析膜的一端，两者重合处所述样品垫位于结合垫上方，将吸水垫置于所述分析膜远离结合垫的一端，两者重合处所述吸水垫位于分析膜的上方，将所述样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫固定于支撑垫上。

第三方面，本发明还提供一种如第一方面所述的检测试纸在制备医用检测试剂盒中的应用。

例如本发明提供的检测试纸及其制备方法可用于制备心肌梗塞三联试剂盒，提高检测心梗三项的效率和准确度。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明采用多色的上转换纳米材料实现对于至少三种目标物的检测结果的区分，通过颜色的区别可以很轻松地分辨出每条检测线所检测的目标物种类，避免多目标物检测时交叉反应对结果灵敏度和特异性的影响。本发明提到的多目标物检测试纸，可以通过不同的发光颜色强度区分检测物的浓度，提高检测结果的准确度。

附图说明

图1是基于上转换发光纳米材料的检测试纸的结构示意图。

图2是应用实施例2中红外激光器正常通道的检测结果图。

图3是应用实施例2中红外激光器红色通道的检测结果图。

图4是应用实施例2中红外激光器绿色通道的检测结果图。

图5是应用实施例2中红外激光器蓝色通道的检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，所述聚丙烯酸修饰的UCNPs的制备方法为溶解热法。以聚丙烯酸修饰的可发红光的NaYF₄:Er,Tm的合成为例，具体合成步骤为：

在干净的100mL三口烧瓶中加入30mL十八烯，12mL油酸，再加入2mL0.5mol/L稀土离子氯化物晶体粉末的水溶液，控制各种稀土元素的摩尔比例为Y:Er:Tm＝88:10:2。在稀有气体Ar气流的保护下，隔绝空气加热到160℃，保温1小时，使稀有氯化物晶体粉末完全溶解，并抽真空除去结合水；停止加热冷却至室温；

此时，慢慢滴加10mL溶解NH₄F和NaOH的甲醇溶液到上述体系中，其中NH₄F为4mmoL，NaOH为2.5mmoL，滴加完毕室温继续搅拌2小时。慢慢升温至100℃，抽真空除去甲醇，在Ar气保护下迅速升温至300℃，反应1.5小时。反应完毕后，冷却至室温。反应产物在8000rpm下离心10min，沉淀用环己烷与乙醇混合液反复洗涤3次，最后将所得NaYF₄:Er,Tm溶于10mL环己烷中保存待用；

将1mL NaYF₄:Er,Tm 15.8mg聚丙烯酸，2mL乙醇加入1mL氯仿中混合，将混合物分散并搅拌过夜。然后，将产物用乙醇离心并洗涤两次，得到聚丙烯酸修饰的可发红光的NaYF4:Er,Tm上转换发光纳米材料，然后重新分散在5mL PBS溶液中待用。

实施例1

本实施例通过如下实验步骤制备基于上转换发光纳米材料的检测试纸。

(1)制备三种发光颜色的上转换发光纳米探针

1.制备检测肌酸激酶同工酶抗体的上转换发光纳米探针：

将1mg聚丙烯酸修饰的NaYF₄:Er,Tm溶解于200uL pH为6.1的MES buffer，25℃下加入6μL的6mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，6μL的6mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，超声状态下活化30min；加入800μL 20mM的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES buffer)，25μg配置好的肌酸激酶同工酶抗体(CKMB-03，FRPON)溶液，37℃摇床孵育2小时。加入30μL甘氨酸溶液，8000r/min离心5min。弃上清，重溶于1000μL超纯水，超声均匀，得到检测肌酸激酶同工酶抗体的上转换发光纳米探针，4℃冰箱保存。

2.制备检测肌红蛋白抗体的上转换发光纳米探针：

将1mg聚丙烯酸修饰的NaYF₄:Yb,Er溶解于200μL pH为6.1的MES buffer，25℃下加入6μL的6mg/mL EDC，6μL的6mg/mL NHS，超声状态下活化30min；加入800μL 20mM的MESbuffer，25μg配置好的肌红蛋白抗体(grMy1-02，Abgree)溶液，37℃摇床孵育2小时。加入30μL甘氨酸溶液，8000r/min离心5min。弃上清，重溶于1000μL超纯水，超声均匀，得到肌红蛋白抗体上转换发光纳米探针，4℃冰箱保存。

3.制备肌钙蛋白抗体上转换发光纳米探针：

将1mg聚丙烯酸修饰的NaYF₄:Yb,Tm溶解于200μL pH为6.1的MES buffer，25℃下加入6μL的6mg/mL EDC，6μL的6mg/mL NHS，超声状态下活化30min；加入800μL 20mM的MESbuffer，25μg配置好的肌钙蛋白抗体(MAB85941，R&D)溶液，37℃摇床孵育2小时。加入30μL甘氨酸溶液，8000r/min离心5min。弃上清，重溶于1000μL UCNP保存液，超声均匀，得到肌钙蛋白抗体上转换发光纳米探针，4℃冰箱保存。

(2)制备检测试纸

使用塑料粘合剂将结合垫(1.9cm×30cm)、硝酸纤维素膜(2.0cm×30cm)和吸收垫(2.5cm×30cm)以长边相互2mm的重叠安装在支撑垫(6.0cm×30cm)上，将组装的垫片沿长边切割得到120条检测试纸(6cm×0.25mm)，所得检测试纸的结构示意图如图1所示；

在所得的检测试纸分别添加三条0.5μL的100μM肌酸激酶同工酶抗体(CKMB-04，FRPON)、肌红蛋白抗体(grMy1-04，Abgree)、肌钙蛋白抗体(MAB85942，R&D)和二抗(grSA6-01，Abgree)，产生距离3mm的三条检测线和质控线；将滴加了抗体和二抗的试纸条置于37℃的烘箱中干燥2h；

随后，将步骤(1)中制备的3种检测探针各10μL滴加到检测试纸的结合垫上；将这些测试条在37℃的烘箱中再干燥30min，得到含有3种上转换发光纳米探针和3条检测线的检测试纸，检测试纸在25℃下保存以供进一步使用。

实施例2

本实施例通过如下实验步骤制备基于上转换纳米材料的检测试纸。

(1)制备三种发光颜色的上转换发光纳米探针

分别制备HBV适配体上转换发光纳米探针、HIV适配体上转换发光纳米探针和沙门氏杆菌适配体上转换发光纳米探针，制备方法同实施例1中制备肌酸激酶同工酶抗体上转换发光纳米探针；最终得到发红光的HBV适配体上转换发光纳米探针，发绿光的HIV适配体上转换发光纳米探针和发蓝光的沙门氏杆菌适配体上转换发光纳米探针。

其中，HBV适配体(Generay，序列为SEQ ID NO.1：

5′-GGGAATTCGAGCTCGGTACCCACAGCGAACAGCGGCGGACATAATAGTGCTTACTACGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGG-3′)

HIV适配体(Generay，序列为SEQ ID NO.2：

5′-ACGAAGCUUGAUCCCGUUUGCCGGUCGAUCGCUUCGA-3′)

沙门氏杆菌适配体(Generay，序列为SEQ ID NO.3：

5′-GCTGAGTCTGAGTCGTATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3′)

(2)检测试纸的制备方法同实施例1，区别仅在于所述检测试纸上不需要添加质控线，其余操作步骤同实施例1。

应用实施例1

利用实施例1制备的多目标物检测试纸检测含有肌酸激酶同工酶、肌红蛋白和肌钙蛋白的溶液。

将三种检测目标物，肌酸激酶同工酶、肌红蛋白和肌钙蛋白作为待测目标物混合液加入试纸条，20分钟后用980nm红外激光器(LL980-10WG，长春亮丽光电有限公司)检测观察试纸的检测结果。

本发明采用的三色上转换发光纳米探针因为发射峰窄，相互之间没有荧光干扰，故可通过不同颜色通道的分离而把每条检测线上的非特异性信号分离出来，从而得到每条检测线真实的灰度值信号。

具体信号强度如表1所示：

表1

由上表可知，本发明提供的检测试纸在检测心梗三项(即肌酸激酶同工酶、肌红蛋白、肌钙蛋白)时，质控线检测到有荧光信号强度，红色通道下肌酸激酶同工酶检测线信号强度最高，绿色通道下肌红蛋白检测线信号强度最高，蓝色通道下肌钙蛋白检测线信号强度最高，通过不同通道分离出每条检测线的真实灰度值，从而进一步计算各待测物质的浓度，使检测结果更加准确，同时避免了物质之间的相互干扰，增加检测结果的可靠性。

应用实施例2

利用实施例2制备的多目标物检测试纸检测含有HIV、HBV和沙门氏菌的溶液。

将三种检测目标物，HIV、HBV和沙门氏菌作为待测目标物混合液加入试纸条，20分钟后用980nm红外激光器检测观察试纸的检测结果。

检测结果分析：

正常通道下观察，三条检测线分别呈现不同的颜色，且HIV检测线呈红色，HBV检测线呈绿色，沙门氏菌检测线呈蓝色，待测目标物容易区分，因此由图2可知，待测溶液中含有HIV、HBV和沙门氏菌抗原；由图3-5可知，在红色通道下，HIV检测线亮度最高，绿色通道下，HBV检测线亮度最高，蓝色通道下，沙门氏菌检测线亮度最高；在进行多目标物检测时，交叉反应不可避免，即HIV检测线上可能会结合有HBV与沙门氏菌的检测探针，若直接测量检测线荧光强度而对目标物浓度进行判断的话，会造成明显误差。

本发明可以通过除去绿色和蓝色荧光，仅在红色通道下观察HIV检测线的荧光强度，更加准确地测量待测溶液中HIV的浓度；同样的，在绿色通道和蓝色通道下可以分别观察到HBV和沙门氏菌检测线上对应待测物质的浓度，使得结果更加准确。综上所述，本发明利用上转换发光纳米材料制备得到的多目标物检测试纸，可以检测多种目标物质，避免多目标物的交叉反应，使检测结果更加准确。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州缔因安生物科技有限公司

<120> 一种基于上转换发光纳米材料的检测试纸及其制备方法和应用

<130> 20200303

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gggaattcga gctcggtacc cacagcgaac agcggcggac ataatagtgc ttactacgac 60

ctgcaggcat gcaagcttgg 80

<210> 2

<211> 37

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 2

acgaagcuug aucccguuug ccggucgauc gcuucga 37

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gctgagtctg agtcgtatgg cggcgtcacc cgacggggac ttgacattat gacag 55

Claims

1.一种基于上转换发光纳米材料的检测试纸，其特征在于，

所述检测试纸包括分析膜和结合垫，所述结合垫的一端与分析膜重合，重合处所述结合垫位于分析膜的上方；

所述分析膜上包被至少三条检测线；

所述结合垫上结合至少三种发光颜色的检测探针，所述检测探针为上转换发光纳米探针。

2.根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述上转换发光纳米探针为具有生物修饰分子的上转换发光纳米材料；

优选地，所述生物修饰分子为核酸适配体或抗体；

优选地，所述上转换发光纳米材料包括NaYF₄:Yb,Er、NaYF₄:Yb,Tm、NaYF₄:Er,Tm、NaGdF₄:Er,Tm、NaYF₄:Yb,Ho或NaYF₄:Yb,Gd中任意三种或至少四种发光颜色不同的组合。

3.根据权利要求1或2所述的检测试纸，其特征在于，所述检测试纸的分析膜上还包被质控线。

4.根据权利要求1-3任一项所述的检测试纸，其特征在于，所述上转换发光纳米材料具有一层或两层以上的包裹层；

优选地，所述包裹层为NaYF₄、NaGdF₄、NaYF₄:Yb或NaGdF₄:Yb的中任意一种或至少两种的组合；

5.根据权利要求1-4任一项所述的检测试纸，其特征在于，所述检测线为含有核酸适配体或抗体的检测线；

优选地，所述质控线为含有第二抗体的质控线；

优选地，所述分析膜为硝酸纤维素膜。

6.根据权利要求1-5任一项所述的检测试纸，其特征在于，所述检测线位于分析膜上靠近结合垫的一侧；

优选地，所述检测线之间的距离为3～5mm；

优选地，所述质控线位于分析膜上远离结合垫的一侧；

优选地，所述质控线与相邻的检测线的距离为3～5mm。

7.根据权利要求1-6任一项所述的检测试纸，其特征在于，所述检测试纸还包括样品垫、支撑垫和吸水垫；

优选地，所述分析膜固定在支撑垫的中间，所述吸水垫位于分析膜的一侧，所述结合垫位于分析膜远离吸水垫的一侧，所述样品垫位于结合垫远离分析膜的一侧；

8.一种如权利要求1-7任一项所述的检测试纸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下步骤：

将样品垫置于所述结合垫远离分析膜的一端，两者重合处所述样品垫位于结合垫上方，将吸水垫置于所述分析膜远离结合垫的一端，两者重合处所述吸水垫位于分析膜的上方，将所述样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫固定于支撑垫上。

10.如权利要求1-7任一项所述的检测试纸在制备医用检测试剂盒中的应用。