KR20200024736A - 타겟 물질 검출을 위한 방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
a) 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 타겟 물질에 도킹 스트랜드(docking strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계; c) 상기 도킹 스트랜드에 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및 d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법이 제공된다.
Description
본 명세서에 개시된 기술은 일반적으로 타겟 물질 검출을 위한 방법 및 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 매우 높은 감도로 타겟 물질을 다중 검출할 수 있는 방법 및 키트에 관한 것이다.
바이오마커는 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용하여 몸속의 변화를 알아낼 수 있는 생물학적인 지표를 말한다. 생명체로부터 유래된 특정 시료에 포함되어 있는 바이오마커를 검출하는 방법으로 생명체의 정상 또는 병리적인 상태를 확인 할 수 있고, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정 가능하다. 최근에는 암을 비롯해 심장질환, 뇌졸중, 치매 등 각종 난치병을 진단하기 위한 효과적인 방법이라는 점에서 의료계의 각광을 받고 있다.
통상적으로 사용되는 바이오마커 검출 기술은 주로 ELISA 기반의 기술로서, 최대 수~수십 pg/ml 수준의 민감도를 가지므로 바이오마커를 검출하기 위해서는 민감도에 비례하는 일정량 이상의 생체시료를 필요로 한다.
바이오마커를 이용하여 종양의 발생 유무를 판별하는 경우, 한 번의 검사에서 한 가지의 바이오마커를 판별하여 여러 번 검사를 반복하는 경우가 대부분이다. 그러나, 종양이 발생하게 되면, 하나의 바이오마커의 수치만 변하는 것이 아니라 2 이상의 바이오마커의 수치가 변하게 된다. 따라서, 종양의 발생 여부를 확인하기 위해서는 여러 종의 바이오마커를 동시에 검출하는 것이 발병 여부 판별의 정확도를 높일 수 있다.
현재의 기술로 다수의 바이오마커를 검출하기 위해서는 검출하고자 하는 바이오마커의 수에 비례하는 혈액의 양과 키트가 요구된다. 이는 다량의 채혈에 따른 피검자의 심리적, 신체적 부담 및 다수의 검출용 키트 사용에 따른 경제적 부담을 유발할 뿐만 아니라, 질병의 조기 진단에도 어려움을 가져올 수 있어 2종 이상의 바이오마커를 동시에 진단할 필요가 있다.
따라서 미량의 생체 시료를 이용하여 2종 이상의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있도록, 높은 민감도와 다중 진단이 가능한 기술이 요구되는 실정이다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, a) 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 타겟 물질에 도킹 스트랜드(docking strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계; c) 상기 도킹 스트랜드에 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및 d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, a) 기판에 핵산 또는 핵산 유사체를 타겟 물질로서 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 기판에 도입된 상기 타겟 물질의 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 타겟 물질의 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및 c) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, a) 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 타겟 물질에 태그 스트랜드(tagged strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계; c) 상기 태그 스트랜드는 1종 이상의 상기 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 상기 억셉터 형광 물질을 포함하는 단계; 및 d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법이 제공된다.
일 구현예에 있어서, 상기 도너 형광 물질의 흡광도가 최대인 파장이 상기 억셉터 형광 물질의 흡광도가 최대인 파장보다 짧고, 상기 도너 형광 물질의 발광도가 최대인 파장이 상기 억셉터 형광 물질의 발광도가 최대인 파장보다 짧을 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 도너 형광 물질을 여기시키기 위한 여기광의 파장에서 상기 도너 형광 물질의 흡광계수(extinction coefficient)가 상기 억셉터 형광 물질의 흡광계수보다 3배 이상 큰 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질의 Fㆆrster 반경은 0.208 nm 이상일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 도너 형광 물질 및 상기 억셉터 형광 물질은 링커에 의해 상기 도킹 스트랜드 또는 상기 별도 스트랜드와 결합된 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 링커의 길이는 10nm 이하인 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상술한 타겟 물질 검출방법은 상기 형광 신호의 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 2 이상이 되도록 광학필터의 파장을 제어하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 별도 스트랜드는 상기 도너 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 도너 스트랜드; 및 상기 억셉터 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 억셉터 스트랜드를 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 물질이 2종 이상이고, 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드 중 적어도 하나는 검출하고자 하는 상기 타겟 물질들의 종류에 따라 서로 다른 염기서열을 갖거나, 종류 또는 부착 위치가 서로 다른 형광 물질을 갖는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 물질 검출방법은 상기 타겟 물질의 판독 후 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드 중 적어도 하나 이상을 제거한 다음 제거한 것과 상이한 도너 스트랜드 또는 상이한 억셉터 스트랜드를 적용하여 상기 d) 단계를 수행함으로써 타겟 물질들을 종류별로 판독하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 도킹 스트랜드에 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드가 동시에 결합했을 때 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드 사이의 갭의 간격은 상기 도킹 스트랜드의 지속길이(persistence length)보다 짧은 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 물질 검출방법은 상기 형광 신호의 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 2 이상을 유지하면서, 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드가 상기 도킹 스트랜드에 결합하는 데 필요한 시간이 10분 이내가 되도록 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드의 농도를 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 경우 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드의 농도가 10nM 내지 10uM일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 도킹 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드가 핵산일 경우, 상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 억셉터 스트랜드의 염기서열 개수는 8 이상일 수 있다. 이때 상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 도너 스트랜드의 염기서열 개수는 6 내지 12일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 도킹 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드가 핵산 유사체일 경우, 상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 억셉터 스트랜드의 염기서열 개수는 5 이상일 수 있다. 이때 상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 도너 스트랜드의 염기서열 개수는 3 내지 9일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 억셉터 스트랜드 또는 상기 도킹 스트랜드는 각 스트랜드 내에서 서로 프렛쌍을 형성하는 형광 물질들을 2종 이상 구비할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 별도 스트랜드는 도너 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 도너 스트랜드를 포함하고, 상기 도킹 스트랜드는 1종 이상의 억셉터 형광 물질을 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 별도 스트랜드는 상기 억셉터 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 억셉터 스트랜드를 포함하고, 상기 도킹 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질을 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 태그 스트랜드는 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 간에 인접하여 형성된 프렛쌍들을 2종 이상 구비할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 프렛에 의한 형광 신호의 측정은 하기 식으로 정의되는 FRET 효율을 측정하는 것일 수 있다.
FRET 효율 = (억셉터가 내는 빛의 세기)/(도너와 억셉터가 내는 빛의 세기 합)
일 구현예에 있어서, 상기 FRET 효율의 측정은 상기 도너 또는 상기 억셉터의 광표백 전후의 빛의 밝기를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 프렛쌍들 사이의 간격은 각 프렛쌍의 FRET 효율에 영향을 미치지 않도록 조절된 것일 수 있다. 이때 상기 프렛쌍들 사이의 간격은 적어도 5nm인 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 판독 단계는 형광 물질들 간 거리에 따라 서로 구분되는 프렛(FRET) 효율의 차이를 측정하여 2종 이상의 타겟 물질들을 동시에 판독하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 판독 단계는 서로 다른 종류의 형광 물질 간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼의 차이를 측정하여 2종 이상의 타겟 물질들을 동시에 판독하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 물질 검출방법은 상기 형광 신호를 이미징하는 영역의 단위 면적당 상기 타겟 물질들의 개수로부터 상기 시료 중의 상기 타겟 물질의 농도를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 도킹 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브를 포함하되,
상기 도킹 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 억셉터 형광 물질을 포함하고, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다.
일 구현예에 있어서, 상기 태그 스트랜드는 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 간에 인접하여 형성된 프렛쌍들을 2종 이상 구비할 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, a) 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 도킹 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브; 및 b) 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 포함하되, 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비되며, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 타겟 물질인 핵산 또는 핵산 유사체의 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 포함하되, 상기 별도 스트랜드는 적어도 하나의 도너 형광 물질을 구비한 도너 스트랜드; 및 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비한 억셉터 스트랜드를 포함하며, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 태그 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브를 포함하되, 상기 태그 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 억셉터 형광 물질을 포함하고, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 물질을 부착하기 위한 기판을 더 포함할 수 있다. 상기 기판에는 상기 타겟 물질을 포획하기 위한 1종 이상의 포획 프로브가 고정될 수 있다. 상기 포획 프로브는 태그 스트랜드를 구비할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 물질 검출용 키트는 상기 검출 프로브의 태그 스트랜드 및 상기 포획 프로브의 태그 스트랜드와 상보적으로 결합함으로써 프렛쌍을 형성할 수 있는 브릿지 스트랜드를 더 포함할 수 있다.
도 1a 내지 도 1k는 FRET-PAINT의 원리와 특성을 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2e는 DNA-PAINT 및 FRET-PAINT의 이미징 속도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3h는 FRET-PAINT의 다중화 성능을 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4c는 다양한 농도 범위의 바이오마커를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 도너와 억셉터의 각 스펙트럼 간의 겹침을 나타낸다.
도 6은 도킹 스트랜드와 결합된 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 나타낸다.
도 7은 도너 형광물질(실선)과 억셉터 형광물질(점선)의 발광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8a는 카메라로 측정한 억셉터 형광 신호를 나타낸다.
도 8b는 신호의 크기와 잡음의 크기를 비교한 그래프이다.
도 9는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 10는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 태그 스트랜드에 표지된 도너 및 억셉터를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 11은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 단일분자 현미경을 이용하여 이미징하는 과정을 나타낸 것이다.
도 12는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 도너 및 억셉터의 FRET 효율 측정을 나타낸 것이다.
도 13은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 2 이상의 도너-억셉터 FRET쌍이 표지된 태그 스트랜드를 나타낸 것이다.
도 14는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 2 이상의 도너-억셉터 FRET쌍의 도너 및 억셉터의 조합의 경우를 나타낸 것이다.
도 15는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 바이오마커의 종류 검출을 개략적으로 도시한 것이다.
도 16은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 17은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 18은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 19 내지 도 21는 본 명세서에 개시된 기술의 다양한 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 22는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 N종의 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 23은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 N종의 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 24는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 25는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 26은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 27은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 마이크로 RNA 검출용 키트를 개략적으로 도시한 것이다.
도 28은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 흡광 스펙트럼 및 발광 스펙트럼 데이터를 나타낸 것이다.
도 29는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출 원리를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 30은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따라 도너 스트랜드의 농도를 달리하여 형광 이미지를 측정한 것이다.
도 31은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 32는 도너와 억셉터 간의 거리에 따른 발광스펙트럼의 차이를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 33은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 34a 내지 도 34c는 2종 이상의 억셉터가 표지되는 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 35a 및 도 35b는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 검출 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 36a 및 도 36b는 본 명세서에 개시된 기술의 몇몇 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트들을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 37은 상기 도 36b와 같이 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 포함되는 검출용 키트를 이용하여 바이오마커의 종류를 판별하는 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 38a 및 38b는 본 명세서에 개시된 기술의 몇몇 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트들을를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 39는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 마이크로 RNA 검출용 키트를 예시적으로 도시한 것이다.
도 2a 내지 도 2e는 DNA-PAINT 및 FRET-PAINT의 이미징 속도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3h는 FRET-PAINT의 다중화 성능을 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4c는 다양한 농도 범위의 바이오마커를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 도너와 억셉터의 각 스펙트럼 간의 겹침을 나타낸다.
도 6은 도킹 스트랜드와 결합된 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 나타낸다.
도 7은 도너 형광물질(실선)과 억셉터 형광물질(점선)의 발광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8a는 카메라로 측정한 억셉터 형광 신호를 나타낸다.
도 8b는 신호의 크기와 잡음의 크기를 비교한 그래프이다.
도 9는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 10는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 태그 스트랜드에 표지된 도너 및 억셉터를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 11은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 단일분자 현미경을 이용하여 이미징하는 과정을 나타낸 것이다.
도 12는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 도너 및 억셉터의 FRET 효율 측정을 나타낸 것이다.
도 13은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 2 이상의 도너-억셉터 FRET쌍이 표지된 태그 스트랜드를 나타낸 것이다.
도 14는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 2 이상의 도너-억셉터 FRET쌍의 도너 및 억셉터의 조합의 경우를 나타낸 것이다.
도 15는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 바이오마커의 종류 검출을 개략적으로 도시한 것이다.
도 16은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 17은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 18은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 19 내지 도 21는 본 명세서에 개시된 기술의 다양한 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 22는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 N종의 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 23은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 N종의 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 24는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 25는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 26은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 27은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 마이크로 RNA 검출용 키트를 개략적으로 도시한 것이다.
도 28은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 흡광 스펙트럼 및 발광 스펙트럼 데이터를 나타낸 것이다.
도 29는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출 원리를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 30은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따라 도너 스트랜드의 농도를 달리하여 형광 이미지를 측정한 것이다.
도 31은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 32는 도너와 억셉터 간의 거리에 따른 발광스펙트럼의 차이를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 33은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 34a 내지 도 34c는 2종 이상의 억셉터가 표지되는 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 35a 및 도 35b는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 검출 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 36a 및 도 36b는 본 명세서에 개시된 기술의 몇몇 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트들을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 37은 상기 도 36b와 같이 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 포함되는 검출용 키트를 이용하여 바이오마커의 종류를 판별하는 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 38a 및 38b는 본 명세서에 개시된 기술의 몇몇 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트들을를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 39는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 마이크로 RNA 검출용 키트를 예시적으로 도시한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어에 대하여 간단히 설명한다.
본 명세서에서 "바이오마커"는 생명체의 정상 또는 병리적인 상태를 확인할 수 있는 생체물질을 모두 포함한다.
본 명세서에서 "프렛"은 인접한 2개의 형광 물질의 공명에 의해 에너지가 전달되는 메커니즘을 의미한다. 구체적으로는, 빛에 의해 여기(excited)된 형광 물질의 에너지가 인접한 다른 형광 물질에 전달되는 현상을 일컫는 용어로, 당업자가 인식하는 통상적인 프렛의 의미를 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "프렛 효율"은 빛에 의해 여기(excited)된 형광 물질의 에너지가 인접한 다른 형광 물질에 전달되는 현상을 이용하여, 형광 물질 사이의 거리에 따라 상이한 에너지 전달 효율을 값으로 나타낸 것을 의미하고, 당업자가 인식하는 통상적인 프렛 효율의 의미를 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "도너"는 빛을 받아 여기되면 에너지를 전달하는 형광 물질을 의미하고, 2 이상의 형광 물질이 인접하는 경우, 상대적으로 짧은 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 형광 물질을 의미한다.
본 명세서에서 "억셉터"는 여기상태의 도너로부터 에너지를 전달받는 형광 물질을 의미하고, 2 이상의 형광 물질이 인접하는 경우, 상대적으로 긴 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 형광 물질을 의미한다.
본 명세서에서 "스트랜드"는 생체고분자의 사슬 또는 생체고분자를 모사하여 합성한 고분자의 사슬로서, 상기 생체고분자는 단일가닥 또는 이중가닥 구조를 가질 수 있으며, 핵산, 핵산 유사체, 폴리펩타이드 또는 탄수화물을 포함한다. 상기 핵산은 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함하고, 상기 핵산 유사체는 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모폴리노 핵산(MNA), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA)을 포함한다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 다양한 구현예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 구현예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 구현예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 구현예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 다양한 구현예들을 설명함에 있어, 동일한 구성 요소는 달리 설명되지 않는 한 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
최근 단분자 형광현미경 기술의 개발로 분자를 하나씩 관찰할 수 있게 되었고 이를 바이오마커 검출에 적용함으로써 민감도는 fg/ml 수준으로 1000배 가량 증가하게 되었다(Nature 473, 484-488, 2011). 통상적으로 사용하는 형광 이미징에서는 관찰하려는 분자에 형광 물질을 고정하여, 서로 다른 종류의 바이오마커를 형광신호를 이용해 구분하는 방법을 사용한다. 이때 각각 서로 다른 색의 형광 물질을 고정하고 색깔 차이를 이용해 바이오마커의 종류를 구분하는 방법을 사용하나, 통상의 이미지 센서로 구분하여 관찰할 수 있는 형광 물질의 종류는 3~4가지 정도이다. 따라서, 단분자 형광현미경 기술을 사용할 경우, 민감도는 fg/ml로 기존 방법에 비해 1000배 가량 증가하나 검출할 수 있는 바이오마커의 종류는 여전히 3~4 가지 정도로 제한된다.
한편, 단분자 형광현미경 기술에 DNA-PAINT 기술(Nature Methods 11, 313-318, 2014)을 적용함으로써 높은 민감도를 유지하는 동시에 다양한 바이오마커를 동시에 분석할 수 있다. 관찰하고자 하는 바이오마커에 형광 물질 대신 도킹 스트랜드가 결합되어 있는 검출항체를 붙이고, 도킹 스트랜드에 잠시 (수 초 이내) 붙었다가 떨어지는 이미저 스트랜드에 형광 물질을 붙인 후 도킹 스트랜드에 결합된 이미저 스트랜드의 형광 신호를 검출함으로써 높은 민감도를 유지한 채 한 가지 색의 형광 물질로 많은 종류의 바이오마커를 검출할 수 있다.
그러나, DNA-PAINT 기술을 이용할 경우 이미저 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합했는지 여부와 무관하게 모든 이미저 스트랜드가 형광 신호를 방출하므로 높은 노이즈가 생성되며, 이로 인해 이미저 스트랜드의 농도는 수 nM ~ 수십 nM로 제한되어 검출 속도가 느려지는 단점이 발생한다.
이에, 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따르면, 단분자 형광현미경의 높은 민감도를 유지하면서 다양한 타겟 물질을 동시에 검출하는 방법으로서, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)에 기초한 DNA-PAINT 기술인 FRET-PAINT 기술이 제공된다. FRET이란 최초에 여기된 도너(donor)의 여기된 상태의 에너지가 억셉터(acceptor)로 전달되는 현상을 의미한다. 도너 물질은 일반적으로 억셉터 물질에 비해 더 짧은 파장의 빛을 방출하게 되는데, 이때의 방출 파장은 억셉터의 흡수 파장과 중첩(spectral overlap)된다. 에너지 전달 속도와 효율은 도너의 방출 파장과 억셉터의 흡수 파장의 중첩의 정도, 도너의 양자 효율, 도너와 억셉터의 전이 쌍극자의 상대적인 배열 정도, 그리고 도너와 억셉터 사이의 거리 등에 의존하게 된다.
예를 들어 FRET-PAINT 기술에 따르면, 도킹 스트랜드에 두 가지 DNA 결합 자리들을 가질 수 있으며, 각각 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 위한 자리가 될 수 있다. 단일 분자 국지화(single-molecule localization)를 위해서 억셉터의 FRET 신호가 사용된다. FRET-PAINT 기술을 사용하면 억셉터가 직접 여기되지 않고 FRET에 의해 여기되어 이미저(도너 및 억셉터) 농도를 수십~수백배 높일 수 있으므로 DNA-PAINT에 비해 이미징 스피드가 수십~수백 배 향상될 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 타겟 물질 검출방법이 제공된다. 상기 타겟 물질 검출방법은 a) 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 타겟 물질에 도킹 스트랜드(docking strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계; c) 상기 도킹 스트랜드에 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및 d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼의 전부 또는 일부를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함한다.
각 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저 상기 a) 단계에서 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입한다.
상기 기판은 타겟 물질을 포획하고 관찰하기 위한 영역으로 그 형태는 특별히 제한되지 않으나, 평판, 구형 입자, 막대형 구조, 및 기타 비정형 구조의 형태를 가질 수 있으며 그 재질도 유리, 석영, 플라스틱 등으로 이루어질 수 있다. 상기 기판은 통상 유리 재질로 된 평판 형태의 슬라이드 글라스나 커버슬립일 수 있다. 바람직하게는 상기 기판은 #1 또는 #1.5 커버슬립일 수 있다.
상기 시료는 검출 대상이 되는 타겟 물질을 함유한 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 점막액, 뇨 등일 수 있으며, 예를 들어 질환이 의심되는 동물 또는 인간 개체로부터 분리 수득된 것일 수 있다.
상기 타겟 물질은 관심있는 검출 대상이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 금속(Ca, Mg, Pb 등), 금속 이온 또는 생체물질일 수 있다. 상기 생체물질은 바이오마커, 혈액, 혈장, 혈청, 체액, 단백질, 펩타이드, 핵산, 박테리아, 바이러스, 소포체, miRNA, 엑소좀, 순환종양세포 등일 수 있다. 바람직하게는 상기 타겟 물질은 바이오마커일 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술은 세포, 조직 및 기관 등을 관찰하는 데 사용될 수 있다. 특히 본 명세서에 개시된 기술이 한 번의 검사에서 여러 종의 생체물질을 검출하여 신속하게 질병을 조기진단할 수 있다는 점에서 바이오마커 검출용으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 바이오마커는 생물처리과정, 병원성을 일으키는 과정, 치료를 위한 약리학적 과정의 측정 또는 평가 등의 통상적인 과학 또는 의료분야에서 사용되는 것이면 제한 없이 이용가능하고, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 바이오마커는 예를 들어 혈액, 타액, 소변 등의 생체액에서 검출할 수 있는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 단백질 또는 대사물질일 수 있으며, 구체적으로는 AFP(alpha fetoprotein), CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, 칼시토닌(calcitonin), 칼레티닌(calretinin), CEA(carcinoembryonic antigen), CD34, CD99, MIC-2, CD117, 크라모그라닌(chromogranin), 사이토케라틴(cytokeratin, various types: TPA, TPS, Cyfra21-1), 데스민(desmin), EMA(epithelial membrane antigen), Factor VIII, CD31, FL1, GFAP(glial fibrillary acidic protein), GCDFP-15(gross cystic disease fluid protein), HMB-45, hCG(human chorionic gonadotropin), 면역글로불린(immunoglobulin), 인히빈(inhibin), 케라틴(keratin, various types of keratin), 백혈구 마커(lymphocyte marker), MART-1(Melan-A), Myo D1, MSA (muscle-specific actin), 뉴로필라멘트(neurofilament), NSE(neuron-specific enolase), PLAP(placental alkaline phosphatase), PSA(prostate-specific antigen), PTPRC(CD45), S100 protein, SMA(smooth muscle actin), 시냅토파이신(synaptophysin), TK(thymidine kinase), Tg(thyroglobulin), TTF-1(thyroid transcription factor-1), M2-PK, 바이멘틴(vimentin), 인터루킨(interleukin), CD24, CD40, 인테그린(integrin), 시스타틴(cystatin), 인터페론(interferon), TNF(tumor necrosis factor), MCP, VEGF, GLP, ICA, HLA-DR, ICAM, EGFR, FGF, BRAF, GFEB, FRS, LZTS, CCN, 뮤신(mucin), 렉틴(lectin), 아포리포단백질, 티로신, 신경세포 접착분자 유사 단백질, 파이브로넥틴, 포도당, 요산, 탄산탈수효소 또는 콜레스테롤 등일 수 있다.
또한 상기 시료는 상기 바이오마커가 포함되지 않은 용액으로 희석될 수 있으며, 상기 시료에 포함된 상기 바이오마커의 농도는 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 크게 차이가 날 수 있다. 바람직하게는 이미지 센서에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 희석될 수 있다. 바람직하게는 서로 다른 비율로 희석된 동일한 시료에 대해서 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1:10 내지 1000의 중량비로 수 차례 희석하여 사용할 수 있다.
상기 타겟 물질은 상기 기판에 직접 부착될 수도 있고, 상기 기판에 부착된 포획 프로브를 통해 상기 기판에 도입될 수도 있다. 한편, 상기 기판은 표면에 원치 않는 항원, 항체, 형광 물질 등이 붙지 않도록 폴리에틸렌글리콜(PEG)이나 아크릴아마이드를 포함한 적절한 중합체로 코팅될 수 있다.
상기 포획 프로브는 타겟 물질과 특이적으로 결합하여 기판에 고정시키는 역할을 수행하는 물질로서, 항체 또는 압타머일 수 있으며, 예를 들어 바이오마커와 특이적으로 결합하여 포획할 수 있는 포획항체일 수 있다. 상기 포획항체의 표면에 비오틴(biotin)을 도입하고 상기 기판에는 비오틴과 결합하는 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 스트렙타비딘(strepavidin)을 도입하여 상기 포획항체를 상기 기판에 부착시킬 수 있다.
예를 들어 검출 대상인 바이오마커는 측정 과정의 속도 및 편의성을 위해 포획항체에 의하지 않고 기판의 표면에 직접 부착될 수 있으며, 측정 결과의 정확성을 높이기 위해 바이오마커 분자는 기판의 표면에 고정되어 있는 포획항체에 항원-항체 반응을 통해 부착될 수 있다.
상기 바이오마커를 기판의 표면에 직접 부착하는 경우, 예를 들어 커버 슬립을 비드 용액으로 코팅한 다음 시료에 해당하는 세포를 배양하여 고정시켜 사용할 수 있다. 또한 상기 포획 항체를 기판에 흡착시켜 사용할 경우, 이러한 부착은 예컨대 pH 9.5인 0.06M 탄산염 완충용액 또는 중탄산염 완충용액으로 상기 포획 항체를 희석시키고 하고 그 희석액을 기판에 일정 온도에서 일정 시간 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 그 다음 기판에 흡착된 포획 항체는 기판에 시료 또는 가공된 시료를 처리할 경우 그 시료 중의 바이오마커와 결합체를 형성하게 되며, 결합체가 형성된 후에는 비특이적으로 결합된 항체를 제거하거나 오염물질 등을 제거하기 위한 목적으로 Tween 20과 같은 세척 완충액이나 증류수 등의 세척제로 세척하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 b) 단계에서, 상기 타겟 물질에 도킹 스트랜드(docking strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시킨다. 상기 검출 프로브는 항체 또는 압타머일 수 있으며, 예를 들어 검출 대상인 바이오마커와 특이적으로 결합할 수 있는 검출항체에 도킹 스트랜드를 태깅할 수 있다.
본 명세서에서 상기 포획항체와 검출항체로서 사용되는 '항체'는 구체적으로 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어, 가변 영역 및 목적하는 생물 활성을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에서의 항체는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하고, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), 나노바디(nanobody) 또는 scFv를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 scFv, Fab, 나노바디(nanobody) 및 면역글로불린 분자일 수 있다.
검출 프로브인 항체 또는 압타머에 도킹 스트랜드를 부착하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 단백질 분자와 핵산 분자를 결합시키는 방법에 의해서 수행될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 서로 다른 반응기를 동시에 가지고 있는 화합물을 사용하여 핵산 분자와 단백질 분자 간의 결합 반응을 수행하여 부착할 수 있다. 일례로 SMCC (succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)는 아민(amine)에 반응하는 NHS-ester와 싸이올(thiol)에 반응하는 말레이미드(maleimide) 그룹을 가지고 있는데, 싸이올기가 부착되어 있는 도킹 스트랜드를 SMCC와 반응시킨 후 그 결과물을 검출항체와 반응시키면 검출항체의 N-말단 또는 라이신에 있는 아민기와 반응하여 검출항체에 도킹 스트랜드를 붙일 수 있다.
측정의 정확성 면에서, 상기 검출항체는 1차 항체일 수 있으며, 도킹 스트랜드가 1차 항체에 부착될 수 있다. 한편 측정 속도의 신속성 면에서, 상기 검출항체는 1차 항체 및 2차 항체의 조합으로 사용될 수 있으며, 도킹 스트랜드가 2차 항체에 부착될 수 있다.
상기 1차 항체는 바이오마커에 특이적으로 결합하는 면역글로불린일 수 있으며 항체의 종류는 제한되지 않는다. 후술할 실시예에서는 항-튜블린(anti-tubulin) 항체, 항-Tom20(anti-Tom20) 또는 항-Th20(anti-Th20) 항체가 사용되었다.
상기 2차 항체는 바이오마커에 결합한 1차 항체에 결합하는 항체를 의미하고 사용하는 항체의 종류는 제한되지 않는다. 후술할 실시예에서는 당나귀 항-래빗 IgG(Donkey anti-rabbit IgG) 항체 또는 당나귀 항-랫 IgG(donkey anti-rat IgG) 항체가 사용되었다.
다음 c) 단계에서, 상기 도킹 스트랜드에 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시킨다.
이때 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것일 수 있다.
상기 별도 스트랜드는 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합할 수 있는 스트랜드로서 스트랜드에 부착된 형광 물질에 따라 도너 스트랜드(donor strand), 억셉터 스트랜드(acceptor strand), 프렛 스트랜드(fret strand) 등으로 구분될 수 있다. 상기 도너 스트랜드는 도너 역할을 하는 형광 물질을 구비한 스트랜드이고 상기 억셉터 스트랜드는 상기 도너 형광 물질의 에너지를 전달받아 여기될 수 있도록 억셉터 역할을 하는 형광 물질을 구비한 스트랜드이다. 상기 프렛 스트랜드에는 하나의 스트랜드 내에 서로 프렛쌍을 형성하는 도너 형광 물질과 억셉터 형광 물질이 동시에 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 별도 스트랜드는 상기 도너 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 도너 스트랜드; 및 상기 억셉터 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 억셉터 스트랜드를 포함할 수 있다.
서로 다른 두 종류의 형광 물질이 매우 가까이 위치할 때 한 형광물질(도너)의 에너지가 다른 형광 물질(억셉터)로 전달되는 현상을 FRET이라 하는데, 이러한 현상을 이용하여 타겟 물질을 효과적으로 검출할 수 있다. 억셉터가 빛을 내기 위해서는 도너로부터 에너지를 전달받아야만 하고, 이는 오로지 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 동시에 결합할 때만 일어나므로 억셉터의 형광 신호가 나타나는 곳에 타겟 물질이 위치함을 알 수 있다.
도 1b는 도 1a의 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용한 FRET-PAINT 기술을 사용하여 타겟 물질을 검출하는 원리를 나타낸다. 프렛(FRET)이 일어나면 도너의 에너지가 억셉터로 전달되어 도너는 어두워지고 억셉터가 밝게 빛을 내는 것을 알 수 있다.
상기 방식은 DNA-PAINT의 이미저 스트랜드를 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드로 나눈 것으로, 이때 도너 스트랜드에 표지된 형광 물질을 λex 파장의 빛으로 여기(excitation)하여 나타나는 도너의 형광 신호를 광학 필터로 제거하여 억셉터의 형광 신호를 관찰할 수 있다. 즉 모든 도너 형광 물질은 빛을 내지만 광학필터에 의해 모두 제거되고, 관찰하고자 하는 억셉터 형광 물질은 도너를 여기하는 λex 파장의 빛에 직접 여기되지 않아 배경잡음이 매우 낮아질 수 있다. DNA-PAINT와 달리 도너에 의한 배경잡음은 무시할 정도로 작으므로 도너 스트랜드의 농도를 예를 들어 수백 nM 정도로 매우 높일 수 있어 측정 속도가 수백 배 빨라지는 장점이 있다.
일 구현예에서, 상기 별도 스트랜드는 상기 억셉터 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 억셉터 스트랜드를 포함하고, 상기 도킹 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 도킹 스트랜드에 상기 형광 물질로서 양자점을 도입할 경우 형광 단백질(fluorescent protein), 유기 형광분자(organic fluorophore) 등에서 발생하는 광표백(photobleaching) 현상이 일어나지 않는다. 따라서 도너 형광물질의 광표백 문제를 해결하기 위해 도입했던 도너 스트랜드가 불필요해지고, 도너 스트랜드를 사용하지 않음으로써 배경잡음이 낮아져 신호대잡음비가 높아지고, 구성이 간단해져 경제성이 높아지며, 분석 과정이 간단해질 수 있다.
상기 도킹 스트랜드(docking strand)나 상기 별도 스트랜드를 포함한 스트랜드는 핵산, 폴리펩타이드, 또는 탄수화물일 수 있다. 바람직하게는 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드가 상보적 결합이 가능하고, 합성이 용이하고 저렴한 동시에, 원하는 부위에 형광 물질을 부착하기 용이하다는 측면에서, 상기 스트랜드는 핵산일 수 있다.상기 핵산은 상보적 결합이 가능한 DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA 및 TNA로 이루어진 군에서 선택될 수 있는 단일 가닥(single strand) 또는 이중 가닥(double strand)을 가질 수 있다.
상기 도킹 스트랜드는 상기 검출 프로브에 결합되어 있는 가닥이며, 이미저 스트랜드, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드 등이 상기 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합할 수 있다. 상기 이미저 스트랜드(imager strand)는 DNA-PAINT 기술을 이용할 경우에 사용될 수 있으며, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 FRET-PAINT 기술을 이용할 경우 사용될 수 있다.
상기 이미저 스트랜드의 염기서열은 검출하는 바이오마커의 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가질 수 있으며, 예를 들어, 두 가지의 서로 상이한 바이오마커에 각각 결합하는 경우에는, 두 개의 이미저 스트랜드가 최소 하나 이상의 염기가 다를 수 있다. 즉 바이오마커의 종류 수에 상관없이 바이오마커의 종류에 따라 결합하는 각각의 이미저 스트랜드의 염기서열이 모두 상이할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드는 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가질 수 있다. 예를 들어, N가지의 서로 상이한 바이오마커를 검출하는 경우 N개의 도너 스트랜드와 N개의 억셉터 스트랜드가 이용될 수 있으며, 이들의 염기서열이 상이할 수 있다. 즉, 도너 스트랜드에 대해서 각각의 도너 스트랜드가 최소 하나 이상의 염기가 다르고, 상이한 바이오마커에 결합하는 각각의 억셉터 스트랜드도 최소 하나 이상의 염기가 다르며, 각각의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 염기서열이 모두 상이할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 억셉터 스트랜드는 전체 검출대상 바이오마커에 대해서 동일하거나, 일부 바이오마커에 대해서 동일한 염기서열을 가지고, 상기 도너 스트랜드는 상기 억셉터 스트랜드의 염기서열과 상이하며, 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 두 가지 상이한 바이오마커를 검출하는 경우, 상이한 바이오마커에 각각 결합하는 도너 스트랜드의 염기서열은 최소 하나 이상의 염기가 다르나, 동일한 염기서열을 가진 한 가지 억셉터 스트랜드를 검출에 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 도너 스트랜드는 전체 검출대상 바이오마커에 대해서 동일하거나, 일부 바이오마커에 대해서 동일한 염기서열을 가지고, 상기 억셉터 스트랜드는 상기 도너 스트랜드의 염기서열과 상이하며, 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 두 가지 서로 상이한 바이오마커를 검출하는 경우, 상이한 바이오마커에 각각 결합하는 억셉터 스트랜드는 최소 하나 이상의 염기가 다르나, 한 가지 도너 스트랜드를 검출하는 데 사용할 수 있다.
또한, 상기 도킹 스트랜드는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드에 대해 상보적인 염기서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "스트랜드"는 일반적인 형태, 형광 물질 부착이 가능하도록 기능기가 도입된 형태, 또는 형광 물질이 이미 부착된 형태 등 다양한 형태를 가질 수 있다. 상기 스트랜드에 기능기를 도입하면 원하는 위치에 원하는 형광 물질을 부착할 수 있으며 하나의 스트랜드에 동일 또는 상이한 기능기를 여러 개 부착시킬 수도 있다. 스트랜드의 어느 위치에 도너와 억셉터를 부착하느냐에 따라 도너와 억셉터 사이의 거리가 달라지고 FRET 효율 또한 달라질 수 있다. 이러한 성질을 이용하면 타겟 물질의 다중 검출이 가능하다.
상기 형광 물질은 자외선, 전기에너지, 열에너지 등의 외부 에너지에 의해 여기되어 그 에너지를 빛으로 바꾸는 물질로서, 유기 형광체 또는 무기 형광체를 포함할 수 있다. 상기 유기 형광체의 예는 로다민(Rhodamine), 알렉사(Alexa) Fluor dye, 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), FAM(5-carboxy fluorescein), ATTO dye, BODIPY, CF dye, Cyanine(Cy) dye, DyLight Fluor 및 텍사스 레드(Texas Red)일 수 있고, 상기 무기 형광체의 예는 양자점을 들 수 있다.
이때 상기 도너 스트랜드(donor strand)에 결합되어 있는 형광 물질의 발광스펙트럼 최대값의 파장은 상기 억셉터 스트랜드(acceptor strand)에 결합되어 있는 형광 물질의 흡광스펙트럼 최대값의 파장보다 짧다.
한편 도너와 억셉터 관계인 두 형광 물질 사이의 FRET 신호 강도는 프렛쌍을 이루는 두 형광 물질 사이의 거리와 관계가 있다. 예를 들어 DNA 스트랜드의 경우 A, T, G, C 네 종류의 염기, 5탄당 및 인산을 포함하는 뉴클레오타이드가 선형으로 길게 이어져 있고 두 개의 가닥이 염기-염기 간에 상보적으로 결합한다. 각 뉴클레오타이드의 염기, 5탄당 또는 인산 중 어디든 원하는 작용기나 형광 물질을 부착할 수 있으며 DNA 이중 나선에서 인접한 두 염기 사이의 거리가 0.34nm이므로 매우 정밀하게 프렛쌍의 거리를 조절할 수 있다. 만약 서로 다른 두 개의 형광 물질을 M개의 염기를 사이에 두고 한 가닥의 DNA에 표지하고 싶다면 특정 염기에 아민을 달고 M개 떨어진 염기에 thiol(sulfhydryl; SH)기를 단다. 그 다음 아민과 반응하는 NHS-ester가 달린 형광물질 A와 thiol과 반응하는 maleimide가 달린 형광 물질 B를 DNA와 반응시킴으로써 프렛쌍을 표지할 수 있다. 여러 서로 다른 반응기를 사용함으로써 3개 이상의 형광 물질 표지도 가능하다. (ex: DNA 특정 위치에 알데하이드기를 부착하고 알데하이드기와 반응하는 하이드라자이드가 달린 형광 물질 C 부착)
상기 타겟 물질과 상기 검출 프로브 또는 상기 포획 프로브 사이의 특이적 결합 반응은 샌드위치 ELISA와 같은 면역반응에 의한 결합 방식 또는 특이적 압타머(aptamer) 결합 방식에 의해 진행될 수 있다.
다음 d) 단계에서, 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독함으로써 타겟 물질을 검출할 수 있다. 상기 형광 신호의 측정은 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼의 전부 또는 일부를 측정하는 방식일 수 있다. 예를 들어 타겟 물질들을 프렛 효율로 구분할 때는 각 형광물질 스펙트럼의 일부(주로 피크)만을 측정하고, 스펙트럼 모양으로 구분할 때는 스펙트럼의 전부를 측정할 수 있다.
상기 d) 단계는 상기 c) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 형광신호는 도킹 스트랜드에 이미저 스트랜드가 결합하거나 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합한 경우에 발생할 수 있으며, 구체적으로는 도킹 스트랜드에 이미저 스트랜드가 결합하여 일정시간 머무르거나, 도너 스트랜드에 결합된 형광 물질(도너)과 억셉터 스트랜드에 결합된 형광 물질(억셉터)이 도킹 스트랜드에 의해 일정시간 매우 가까이 위치하였을 때 형광신호가 발생할 수 있다. 상기와 같이 발생한 형광신호는 고감도 이미지 센서(EMCCD, sCMOS, iCMOS 등)를 이용하여 검출할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 물질 검출방법은 상기 타겟 물질의 판독 후 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드 중 적어도 하나 이상을 제거한 다음 제거한 것과 상이한 도너 스트랜드 또는 상이한 억셉터 스트랜드를 적용하여 상기 d) 단계를 수행함으로써 타겟 물질들을 종류별로 판독하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기에는 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드 모두를 제거한 후에 상이한 스트랜드들을 조합하여 적용할 수도 있고, 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드 중 하나를 도킹 스트랜드에 안정적으로 결합시켜 제거하지 않고 공통 스트랜드로 사용하고 안정적으로 결합되지 않은 나머지 스트랜드를 제거하는 경우를 포함한다.
상기 방법에 따르면, 각 스트랜드의 염기서열을 차이를 이용해 다중 검출을 하므로 N종의 타겟을 검출하기 위해서 관찰하고자 하는 타겟의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드 (또는 억셉터 스트랜드 또는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드 모두)를 N회 넣어주고 씻어내는 과정을 반복할 수 있다. 예를 들어, 다중 검출을 위해서 하기의 과정으로 상기 c) 및 상기 d) 단계를 검출하고자 하는 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 수행함으로써 다중 바이오마커를 검출할 수 있다. 상기 도너 스트랜드에 형광 물질이 결합되어 있는 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 결합시킨 다음, 발생하는 형광 신호를 검출한다. 그 다음 기 결합된 스트랜드(들)을 제거하고, 상이한 스트랜드(들)을 이용하여 동일한 방법을 반복하여 형광 신호를 검출할 수 있다. 이러한 과정을 여러 번 반복하여 수행할 수 있고, 바람직하게는 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 바이오마커를 검출할 수 있다. 예를 들어, 9개의 염기로 이루어진 도너 스트랜드는 4의 9제곱에 해당하는 262,144개의 염기서열을 가질 수 있고 이는 인체 내 모든 단백질의 수보다 크므로 모든 바이오마커에 서로 다른 염기서열의 도킹 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 배정함으로써 모든 바이오마커를 순차적으로 측정할 수 있다.
도너 형광 물질과 억셉터 형광 물질 사이의 FRET 반응은 다양한 방식으로 측정될 수 있다.
형광 신호가 발생할 때 통상 회절 현상에 의해 실제 타겟 물질이 차지한 영역보다 더 큰 영역에서 빛이 발생하므로 기판 상에 두 종류의 타겟 물질이 매우 가까이 위치하고 동시에 형광 신호를 낼 경우에 점 형태의 발광 영역이 겹쳐 정확한 측정이 어려울 수 있다.
일 구현예에서, 도킹 스트랜드 자체에 억셉터 형광 물질이 표지되어 있거나 억셉터 스트랜드가 결합되어 있는 상태에 있는 경우, 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합하는 순간 나타나는 형광 신호의 FRET 효율 또는 발광 스펙트럼을 측정하여 바이오마커를 검출할 수 있다. 이때에는 모든 도킹 스트랜드에 최소 한 번 이상 도너 스트랜드가 결합하여 FRET 효율 또는 발광 스펙트럼을 측정해야 하므로 모든 바이오마커를 검출하는 데 다소 시간이 걸릴 수 있으나(수십 초~수 분), 매우 근접한 두 개의 바이오마커를 구분할 수 있다. 매우 가까운 두 개의 형광 물질이 동시에 빛을 낸다면 카메라에는 두 배 밝은 하나의 점으로 보이고 각 형광 물질의 FRET 효율을 구분할 수 없지만, 두 개의 형광 물질이 시간을 두고 하나씩 빛을 낸다면 각 점의 정확한 위치와 FRET 효율을 측정할 수 있으므로 두 바이오마커가 무엇인지 알 수 있다. 또한 다중 검출을 위해 한 도킹 스트랜드에서 여러 FRET 효율을 검출할 수 있다는 장점도 있다. 만약 여러 개의 FRET 효율을 갖는 형광 물질들이 동시에 빛을 방출한다면 각각의 FRET 효율을 알 수 없다.
일 구현예에서, 도킹 스트랜드에 도너 형광 물질과 억셉터 형광 물질이 모두 표지되어 있거나 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 모두 결합되어 있는 상태에서 도너를 여기시키고 형광신호를 측정할 수도 있다. 이때 도너를 여기하자마자 모든 형광분자가 빛을 내므로 짧은 시간에 측정할 수 있으나 바이오마커의 농도가 높아 형광분자 사이의 거리가 가까워 점 형태의 발광 영역이 겹치면 정확한 측정이 어려울 수 있고, 한 바이오마커에서 여러 FRET 효율을 측정할 수 없어 다중검출할 수 있는 수가 줄어들 수 있다. 하지만 발광 스펙트럼을 측정하는 경우에는 스펙트럼의 모양으로 판단하므로 다중검출에 문제가 없을 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다. 상기 타겟 물질 검출용 키트는 a) 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 도킹 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브; 및 b) 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 포함한다. 이때 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비되며, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타낼 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 물질을 부착하기 위한 기판이 더 포함될 수 있다. 상기 타겟 물질을 제외한 다른 물질의 비특이적 결합을 제외하거나 상기 타겟 물질의 부착을 용이하게 하기 위해 기판 위에 적절한 코팅층이 도입되거나 표면개질이 행해질 수 있다. 상기 타겟 물질은 상기 기판 위에 직접 부착되거나 상기 기판에 미리 부착된 포획 프로브를 통해 포획되는 방식으로 도입될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 물질 검출용 키트는 a) 도킹 스트랜드가 결합된 1종 이상의 검출항체; 및 b) 형광 물질이 결합된 1종 이상의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 포함할 수 있으며, 바이오마커에 상기 도킹 스트랜드가 부착된 검출항체를 결합시키고, 상기 도킹 스트랜드를 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드의 결합에 따른 신호를 검출하는 바이오마커 다중 검출용 키트일 수 있다.
상기 키트는 i) 기판, ii) 포획항체, iii) 도킹 스트랜드가 결합된 1차 검출항체; 또는 도킹 스트랜드가 결합되지 않은 1차 검출항체 및 도킹 스트랜드가 결합된 2차 검출항체, 및 iv) 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 기판, 포획항체, 도킹 스트랜드가 결합된 1차 검출항체, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드로 구성될 수 있다.
상기 키트는 바이오마커를 검출하기 위한 체외진단 제품일 수 있으며, 예를 들어 RUO(research use only) 또는 IUO(investigational use only) IVD(in vitro diagnostic) 제품일 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 시료 중의 타겟 물질이 핵산 또는 핵산 유사체인 타겟 물질 검출방법이 제공된다. 상기 방법은 a) 기판에 핵산 또는 핵산 유사체를 타겟 물질로서 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 기판에 도입된 상기 타겟 물질의 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 타겟 물질의 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및 c) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함할 수 있다.
여기서는 상술한 일 측면에 따른 기술과 달리 타겟 물질이 핵산 또는 핵산 유사체이므로 도킹 스트랜드를 이미 구비한 것과 같다는 것이다. 바람직하게는 생명체의 정상 또는 병리적인 상태를 확인 할 수 있다는 면에서 상기 타겟 물질은 RNA, miRNA(microRNA), cfDNA(cell-free 또는 circulating free DNA), ctDNA(circulating tumor DNA)일 수 있다.
일 구현예에서, 본 타겟 물질 검출방법은 a) 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 핵산을 기판의 표면에 부착하는 단계; b) 상기 a) 단계의 핵산에 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 형광 신호 검출 후 기 결합된 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 b) 및 c) 단계를 검출하고자 하는 RNA 종류 개수만큼 반복하여 바이오마커를 다중 검출할 수 있다.
상기 각 단계를 구체적으로 설명하자면, i) 먼저 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 핵산을 기판의 표면에 부착한다. 상기 핵산은 바이오마커로 기능할 수 있어 검출대상이 될 수 있는 핵산을 나타내며, 바람직하게는 비-코딩 RNA(Non-coding RNA)일 수 있다. 상기 비-코딩 RNA는 특정 단백질에 대한 아미노산 코드가 없는 RNA의 유형으로, 유전자 서열을 번역하는 mRNA와 달리 다양한 형태로 존재하며, mRNA 부산물, 분해물 또는 별도의 전사과정을 통해 생성될 수 있으며, 염색체 활동이나 단백질 발현을 조절하는 역할 등을 하는 것으로 알려져 있다. 검출 대상이 되는 RNA는 miRNA, snRNA, snoRNA, aRNA, siRNA, piRNA, exRNA, scaRNA와 같은 작은 RNA를 포함하며, 바람직하게는 마이크로 RNA일 수 있다.
상기 마이크로 RNA(MicroRNA, miRNA)는 약 22개의 염기로 구성된 작은 비발현 RNA 분자로, RNA 침묵과 전사 이후의 유전자 발현 조절 등의 기능을 하는데 혈액, 소변 등 다양한 생체액에서 발견되고 다양한 질병에 의해 그 수치가 변화하여 바이오마커로서 각광받고 있다.
타겟 물질이 핵산인 경우 항원-항체 반응으로 포획할 수 없으므로, 검출하고자 하는 핵산의 일부와 상보적인 염기서열을 갖는 포획프로브를 기판에 고정한 후, 이 포획프로브와 상보적으로 결합하도록 하여 핵산를 기판의 표면에 부착한다. 상기 시료는 핵산가 포함되지 않은 용액으로 희석될 수 있으며, 시료에 포함된 핵산 농도는 그 종류에 따라 매우 크게 차이 나므로 이미지 센서에 적당한 수의 핵산 분자가 검출되도록 다양한 비율로 희석될 수 있다.
다음 ii)단계로서, 상기 i)단계의 핵산에 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시킨다. 이때 상기 포획프로브와 상보적으로 결합하고 있지 않은 핵산 단일 가닥 부위와 상보적으로 결합할 수 있도록 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 염기서열을 정할 수 있다. 한편 상기 포획프로브, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드는 DNA, RNA, PNA, LNA 등에서 선택될 수 있다.
다음 iii)단계에서, 상기 ii)단계에서 발생하는 형광 신호를 검출한다. 상기 형광신호는 포획프로브와 상보적으로 결합하고 있지 않은 핵산 단일 가닥 부위에 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합한 경우에 발생할 수 있다. 보다 구체적으로는 포획프로브와 상보적으로 결합하고 있지 않은 핵산 단일 가닥 부위에 이미저 스트랜드가 결합하여 일정시간 머무르거나, 도너 스트랜드에 결합된 형광 물질(도너)와 억셉터 스트랜드에 결합된 형광 물질(억셉터)가 핵산에 의해 일정시간 매우 가까이 위치하였을 때 형광 신호가 발생할 수 있다. 상기와 같이 발생한 형광신호는 초감도 이미지 센서(EMCCD, sCMOS, iCMOS 등)를 이용하여 검출할 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 시료 중의 타겟 물질로서 핵산 또는 핵산 유사체를 검출하기 위한 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다. 상기 타겟 물질 검출용 키트는 타겟 물질인 핵산 또는 핵산 유사체의 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 포함한다. 이때 상기 별도 스트랜드는 적어도 하나의 도너 형광 물질을 구비한 도너 스트랜드; 및 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비한 억셉터 스트랜드를 포함하며, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타낼 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 물질 검출용 키트는 a) 형광 물질이 결합된 1종 이상의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 포함하며, 핵산에 상기 이미저 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드의 결합에 따른 신호를 검출하는 바이오마커 다중 검출용 키트일 수 있다.
상기 키트는 상기 핵산을 부착하기 위한 기판을 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 기판에는 검출대상 핵산의 일부와 상보적인 염기서열을 갖는 포획프로브가 고정된 것일 수 있다. 또는 상기 기판은 포획프로브를 부착할 수 있도록 표면처리된 것일 수 있다.
후술할 실시예들을 통해 하기와 같이 FRET-PAINT가 종래의 DNA-PAINT보다 우수한 장점을 확인하였다.
FRET-PAINT가 현미경으로 검사가 가능한지 확인하기 위하여, 석영 표면에 도킹 스트랜드를 고정시킨 다음 형광 물질이 결합된 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 주입한 후, 단일분자 이미지를 촬영한 결과 형광 강도가 명확하게 나타나는 것을 확인하였다(실시예 1-1, 도 1c 참조).
또한 2개의 FRET 페어(Cy3-Cy5 및 Alexa488-Cy5)를 이용하여 동일한 실험을 실행한 결과, Alexa488-Cy5 FRET 페어(FRET pair)는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 갭이 2nt 일 때, Cy3-Cy5 FRET 페어는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 갭이 6 nt 일 때 형광신호가 가장 높은 것을 확인하였다(실시예 1-1, 도 1d 참조).
초고해상도 형광 이미징을 측정하여 다양한 DNA 농도에서 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 신호에 대한 노이즈 비율(signal-to-noise ratio, SNR)을 비교한 결과, DNA-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 5nM 이상일 때 단일-분자 이미지에 노이즈가 발생하였고, FRET-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 100nM 이상인 경우에 노이즈가 발생하였다. 이로부터 DNA-PAINT에 비해 FRET-PAINT의 경우 더 높은 이미저 농도에서 동일한 SNR을 얻을 수 있다는 것을 확인하였다(실시예 1-1, 도 1e 내지 1k 참조).
세포에 도킹 스트랜드가 결합된 튜블린 항체를 사용하여 면역 염색을 한 다음 DNA-PAINT 방식을 이용하여 미세소관을 관찰하였고, FRET-PAINT 방식을 이용하여 동일한 부위의 미세소관을 관찰하였다. 또한 DNA-PAINT 이미징 속도와 FRET-PAINT 이미징 속도를 정량화하여 비교하였으며, DNA-PAINT는 10Hz 속도로 총 30분 동안 촬영하였고, FRET-PAINT는 10Hz 속도로 총 60초 동안 촬영하여 관찰한 결과, DNA-PAINT에 비해 FRET-PAINT의 이미징 속도가 더 빠른 것을 확인하였다(실시예 1-2, 도 2a 내지 도 2e 참조).
한편 세포에 도킹 스트랜드가 결합된 튜블린 항체와 Tom20 항체를 처리한 다음, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 순차적으로 처리하는 방법과, 동시에 처리하는 방법으로 처리한 다음 이미지를 관찰한 결과, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 순차적으로 처리하는 경우가 다중화 이미징에 더 효과적이라는 것을 확인하였다(실시예 1-3, 도 3a 내지 도 3h 참조).
바이오마커 농도에 따라 관찰 화면에 나타난 분자의 개수를 측정한 결과 10 pg/mg~400 pg/ml 범위에서는 개별 분자가 잘 구분되어 바이오마커 농도를 측정할 수 있으나 1000 pg/ml 이상 농도에서는 분자들이 겹치기 시작해 정확한 농도를 측정할 수 없음을 확인하였다. 대략 100 pg/ml의 농도가 되도록 적당한 비율로 희석한 후 분자의 개수를 측정하고 희석한 비율로 나눠 바이오마커 농도를 구할 경우 본래 바이오마커 농도를 정확하게 측정할 수 있음을 확인하였다. 현재 널리 쓰이는 바이오마커 농도(수 pg/ml~수십 ng/ml) 범위에서 정확한 측정이 가능함을 확인하였다(실시예 1-4, 도 4a 내지 도 4c 참조).
상술한 바에 따르면, 단분자 형광현미경과 FRET-PAINT 시스템을 이용하면 기존의 방식에 비해 1000배 더 높은 민감도로 다양한 바이오마커를 극소량의 생체액으로부터 검출할 수 있기 때문에, 기존 바이오마커 진단의 문제점을 해결하여 암을 포함한 다양한 질병의 조기 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
한편, 본 명세서를 통틀어 타겟 물질 검출을 효율적으로 하려면 도너와 억셉터 간의 FRET 효과를 최대화할 필요가 있다. 이를 위해서 적절한 도너와 억셉터를 선택함으로써, 도너와 억셉터의 효과적인 스펙트럼 겹침이 되도록 하여 최적의 에너지 이동을 유도하는 것이 바람직하다.
도 5는 도너와 억셉터의 각 스펙트럼 간의 겹침을 나타낸다.
일 구현예에서, 도너의 흡광도가 최대인 파장이 억셉터의 흡광도가 최대인 파장보다 짧고, 도너의 발광도가 최대인 파장이 억셉터의 발광도가 최대인 파장보다 짧도록 도너와 억셉터를 정할 수 있다. 그 결과 도너에서 억셉터로 에너지가 전달될 수 있으며, 도너의 흡광도가 최대인 파장이 억셉터의 흡광도가 최대인 파장보다 짧으므로 특정 파장의 여기광(excitation light)을 이용해 선택적으로 도너만 여기하는 것이 가능하다. 또한 도너의 발광도가 최대인 파장이 억셉터의 발광도가 최대인 파장보다 짧으므로 광학필터, 프리즘, 회절격자 등을 이용해 도너의 형광신호를 제거하고, 억셉터의 형광신호를 선택적으로 검출할 수 있다.
한편, 도너와 억셉터 사이의 FRET 효율 EFRET은 아래 식 1과 같다.
(식 1)
이때 R은 도너와 억셉터 사이의 거리이고, R0(Forster radius)는 FRET 효율이 0.5가 되는 도너와 억셉터 사이의 거리로 아래 식 2와 같이 정의될 수 있다.
(식 2)
상기 식 2에서, κ는 쌍극자 방향(dipole orientation)의 영향을 나타내는 상수이고, n은 매질의 굴절 계수(refractive index)를 나타내는 상수이다. ΦD는 도너 형광물질의 양자 수율(quantum yield)로서 도너 형광물질의 종류에 따라 달라진다. JDA는 스펙트럼 겹침 적분(spectral overlap integral)으로 아래 식 3과 같이 정의될 수 있다.
(식 3)
상기 식 3에서, εA는 억셉터 형광물질의 흡광계수, FD는 도너 형광분자의 발광 강도(fluorescence emission intensity)이다. 도너 형광물질의 발광 스펙트럼과 억셉터 형광물질의 흡광 스펙트럼 사이의 겹침 정도에 따라 달라 달라지므로 ΦD와 함께 R0를 결정하는 중요한 요소이다.
예를 들어, 도너를 여기시키는 데 사용되는 여기광의 파장에서 도너의 흡광계수(extinction coefficient)가 억셉터의 흡광계수(extinction coefficient)보다 3배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상 크도록 도너와 억셉터를 정할 수 있다. 이 경우 대다수의 억셉터는 여기광(excitation light)이 아닌 프렛에 의해 도너로부터 에너지를 전달받아 여기될 수 있다. 도너의 흡광계수 대 억셉터의 흡광계수 비가 크면 클수록 억셉터는 여기광이 아닌 프렛에 의해서 여기되므로 신호대잡음비가 더욱 커지는 장점이 있다. 따라서 도너의 흡광계수 대 억셉터의 흡광계수 비는 크면 클수록 바람직하다.
타겟 물질을 용이하게 검출하기 위해서는 형광 신호를 배경 잡음으로부터 식별가능하도록 도너와 억셉터 간의 FRET 효율이 0.05 이상인 것이 바람직하다.
이를 위해서 상술한 타겟 물질 검출방법과 같이 억셉터 신호를 관찰할 경우, 도너와 억셉터의 Forster 반경 (또는 Forster distance)가 예를 들어 0.208 nm 이상이 되도록 도너와 억셉터 형광물질을 정하는 것이 바람직하다. 다른 예로서, 후술하겠지만 FRET 효율을 측정하여 타겟 물질을 다중 검출을 하는 경우에는 도너와 억셉터 간의 도너와 억셉터의 Forster 반경 (또는 Forster distance)가 예를 들어 0.83 nm 이상이 되도록 도너와 억셉터 형광물질을 정하는 것이 바람직하다. 핵산을 이용해 도너와 억셉터 사이의 거리를 조절할 경우 두 형광물질 사이의 최단 거리는 1 bp (base pair), 즉 0.34 nm이므로 Forster 반경(Forster radius)이 0.208 nm 이상이면 0.34 nm 거리에서 FRET 효율이 0.05 이상이 될 수 있다. Forster radius가 이보다 작을 경우 1 bp 거리에서 FRET 효율이 0에 수렴해 억셉터 신호를 관찰하기 어려울 수 있다. Forster radius가 클수록 동일한 거리에서 FRET 효율이 높고, 따라서 억셉터가 더욱 밝게 관측되므로 Forster radius는 클수록 바람직하다.
다른 예로, FRET 효율을 측정하여 다중 검출을 하는 경우에는 Forster radius가 0.83 nm 미만일 경우 거리에 따른 FRET 효율의 감소가 커 도너와 억셉터 사이의 거리가 3 bp만 되어도 FRET 효율이 0.05 미만으로 감소하여 억셉터 신호를 관찰하기 어렵고, FRET 효율도 측정하기 어려울 수 있다. 따라서 타겟 물질을 3종 이상 검출하기 위해서는 Forster radius가 0.83 nm 이상인 것이 바람직하며, Forster radius가 클수록 더 넓은 거리 범위에서 FRET 효율을 구분하여 검출할 수 있으므로 Forster radius는 클수록 바람직하다.
한편, 최적의 에너지 이동을 유도하기 위해 도너와 억셉터 간의 상호작용을 고려하여 적절한 도너와 억셉터 간의 간격을 정할 필요가 있다.
도 6은 도킹 스트랜드와 결합된 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 나타낸다. 도 6을 참조하면, 도너 및 억셉터 형광 물질의 실제 간격은 예를 들어 형광 물질이 부착된 스트랜드의 염기 사이의 거리가 기준이 될 수 있다. 도너 형광 물질과 억셉터 형광 물질을 각각 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드에 부착함에 있어서 스트랜드의 어느 위치에 도너와 억셉터를 부착하는가에 따라서도 달라질 수 있고, 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 얼마만큼의 간격(갭)을 두고 결합하는가에 따라서도 달라질 수 있다.
일 구현예에서, 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 동시에 결합했을 때 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드 사이의 갭(단일 가닥 부분)의 간격은 단일가닥 도킹 스트랜드의 지속길이(persistence length)보다 짧은 것이 바람직하다.
예를 들어 DNA 이중가닥(double strand)의 염기-염기 사이의 거리는 0.34 nm이고, 지속길이가 50 nm인 것에 비해 단일가닥(single strand)의 염기-염기 사이의 거리는 0.5 nm 이상이고, 지속길이는 수 nm 내외에 불과하다. 여기서 지속길이(persistence length)는 DNA와 같은 고분자 사슬(polymer chain)이 직선 상태를 유지하는 거리로서 고분자 사슬의 구조, 전하, 버퍼 내 염의 농도 등에 따라 달라질 수 있다. 단일가닥 도킹 스트랜드의 지속길이보다 갭(gap)의 길이가 더 긴 경우 갭 어딘가에서 도킹 스트랜드가 꺾일 수 있으며, 이 경우 도너-억셉터 사이의 거리는 의도한 거리보다 훨씬 가까워질 수 있어 의도한 형광 신호를 얻을 수 없으므로 문제를 야기할 수 있다. 따라서 도킹 스트랜드가 직선 상태를 유지할 수 있도록 갭의 길이가 도킹 스트랜드의 지속길이보다 짧은 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 스트랜드 상에 형광 물질을 부착할 때 스트랜드와 형광물질 사이에 유연한 링커(linker)를 둘 수 있다. 상기 링커에 의해 형광 분자가 자유롭게 회전할 수 있으므로 관찰자가 관찰하는 방향에 무관하게 일정한 밝기가 유지될 수 있다. 상기 링커는 -CH2-나 -CH2CH2O-와 같은 유연하거나 회전 가능한 반복단위를 1개 이상 포함할 수 있다. 상기 링커의 길이는 0.1nm 이상, 최대 10nm 이하일 수 있다. 상기 링커의 길이가 길수록 형광분자가 관찰되는 위치가 크게 변화하므로 링커가 지나치게 길 경우 근처 타겟 물질과 구분이 어려울 수 있다. 따라서 링커의 길이는 10 nm 이하로 제한을 두는 것이 바람직하다.
도너 및 억셉터 형광 물질로서, Alexa, CF와 같은 친수성 형광물질, Cy, 양자점과 같은 소수성 형광물질 모두 사용 가능하나 형광 물질 간에 상호작용이 일어날 만큼 거리가 가까운 경우에는 친수성 형광물질만을 사용하거나 친수성 형광물질과 소수성 형광물질을 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 소수성 형광물질 사이의 거리가 매우 가까울 경우 둘 사이의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)으로 인해 형광 신호가 불안정해질 수 있다(도 1d의 Cy3-Cy5).
일 구현예에서, 형광 신호를 안정화하기 위해 형광 물질 자체 또는 형광 물질 근처에 Cyclooctatetraene (COT), nitrobenzyl alcohol (NBA), trolox 등의 안정화 물질을 부착하거나 이를 버퍼에 포함시킬 수 있다.
일 구현예에서, 산소에 의한 형광물질의 광표백(photobleaching)을 방지하기 위해 산소를 제거하기 위한 물질(Glucose + glucose oxidase + catalase, PCA + PCD 등)을 버퍼에 포함시킬 수 있다.
한편 타겟 물질 검출시 검출 정확도를 향상시키기 위해 형광 신호의 노이즈(잡음)를 최소화할 필요가 있다. 이를 위해 광학필터로 도너의 발광 파장을 적절히 제거하여 도너로부터 나오는 형광 신호를 최소화할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 형광 신호의 신호대잡음비(SNR)가 2 이상이 되도록 광학필터의 파장을 제어할 수 있다. 예를 들어, long-pass 필터의 컷온 파장, short-pass 필터의 컷오프 파장, band-pass 또는 band-rejection 필터의 시작 파장은 억셉터 발광 스펙트럼이 0.01인 파장보다 길거나 같고, 도너 발광 스펙트럼이 0.01인 파장보다 짧거나 같을 수 있다.
도 7은 도너 형광물질(실선)과 억셉터 형광물질(점선)의 발광 스펙트럼을 나타낸 것이다. λmin은 억셉터의 발광 스펙트럼이 0.01인 파장, λmax는 도너의 발광스펙트럼이 0.01인 파장을 나타낼 수 있다.
도너 신호를 제거하고, 억셉터 신호를 검출하기 위해서 특정 파장보다 긴 파장을 통과시키는 long-pass dichroic mirror 또는 dichroic filter를 사용하거나, 특정 파장보다 짧은 파장을 통과시키는 short-pass dichroic mirror 또는 dichroic filter를 사용하거나, 특정 파장대를 통과 또는 반사시키는 band-pass dichroic mirror 또는 dichroic filter를 사용할 수 있다.
컷온(cut on) 파장보다 긴 파장을 통과시키는 long-pass dichroic filter(이하 필터)를 예로 들어 설명하면, 필터의 컷온(cut on) 파장이 λmin보다 짧을 경우 광학필터를 통과하는 억셉터 신호는 동일한 반면 도너 신호는 증가하므로 신호대잡음비는 낮아질 수 있다. 따라서 컷온 파장은 λmin보다 길거나 같은 것이 바람직하다. 필터의 컷온 파장이 λmax보다 클 경우 광학필터를 통과하는 도너 신호는 동일한 반면 억셉터 신호는 감소하므로 신호대잡음비는 낮아질 수 있다. 따라서 컷온 파장은 λmax보다 짧거나 같은 것이 바람직하다.
본 명세서에서, 신호대잡음비는 하기와 같이 정의될 수 있다. 도 8a는 카메라로 측정한 억셉터 형광 신호를 나타낸다. 신호의 크기와 잡음의 크기를 비교하기 위해 흰색 점선을 따라 단면을 그리면 도 8b와 같다. 도 8b는 신호의 크기와 잡음의 크기를 비교한 그래프이다. 이 그래프를 가우스 함수로 피팅하여 얻은 가우스 함수의 높이(amplitude)를 '신호'로 정의할 수 있다. 억셉터 형광 신호가 없는 나머지 모든 픽셀들의 값을 히스토그램으로 그리면 정규분포를 따른다. 이 정규분포의 반치전폭(full width at half maximum; FWHM)을 '잡음'으로 정의한다. 따라서 상기 신호와 상기 잡음의 비율을 신호대잡음비(signal to noise ratio, SNR)로 정의할 수 있다.
한편 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 농도 증가에 따라 노이즈가 발생할 수 있다. 따라서 노이즈는 줄이고 정확한 억셉터 신호를 판별하도록 하는 것이 바람직하다. SNR을 고려하면, 타겟 신호의 검출이 가장 잘되는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 농도 조건을 선택할 수 있다.
일 구현예에서, 정해진 도너-억셉터 형광 물질의 조합 및 광학필터 하에서 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합하는 데 필요한 평균 시간이 50-100초가 되도록 하는 도너 스트랜드의 농도는 10 nM 이상이며, 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 2 이상이 되도록 하는 도너 스트랜드의 농도는 10 uM 이하일 수 있다.
억셉터가 신호를 내기 위해서는 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합해야 한다. 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합하는 데 필요한 평균 시간은 하기 식 4와 같이 도킹 스트랜드 주변 도너 스트랜드의 농도에 반비례한다.
(식 4)
도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합하는 데 필요한 평균 시간 = (500~1000 s x nM)/[도너 스트랜드 농도(nM)]
따라서 1 nM일 때 500~1000초, 10 nM일 때 50~100초, 100 nM일 때 5~10초가 소요될 수 있다. 타겟 물질을 정확히 검출하기 위해서는 해당 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 적어도 5 회 이상 결합해야 하며, 경제성을 고려하여 전체 측정을 10분 이내에 완료하기 위해서는 도너 스트랜드의 농도가 10 nM 이상인 것이 바람직하다.
도너 스트랜드의 농도가 증가하면 억셉터 신호의 크기는 동일한 반면 잡음의 크기는 증가하므로 신호대잡음비가 감소할 수 있다. 따라서 신호대잡음비가 2 이상이 되기 위해서는 도너 스트랜드의 농도가 10 uM 이하, 바람직하게는 5uM이하이다. 한편 도너 스트랜드와 달리 억셉터 스트랜드는 도킹 스트랜드에 결합한 후 오랜 시간 유지되므로 억셉터 스트랜드의 농도는 1 uM 이하로도 충분하다.
한편 도너 스트랜드나 억셉터 스트랜드의 길이에 따라 각각 도킹 스트랜드에 결합한 후 유지되는 시간을 조절할 수 있다. 도킹 스트랜드에 억셉터 스트랜드의 결합이 안정적으로 오래 유지되면, 도너 스트랜드를 넣었을 때에 빠른 시간 내에 이미징할 수 있어 검출 시간을 단축할 수 있다. 이미징 시간이 동일한 경우에는 낮은 농도의 도너 스트랜드를 적용하여도 바이오마커 검출에 용이할 수 있다.
일 구현예에서, 스트랜드가 DNA 또는 RNA일 경우, 도킹 스트랜드와 상보적인 염기서열 개수는 도너 스트랜드의 경우 6 이상 12 이하, 억셉터 스트랜드의 경우 8 이상이 바람직하다. 본 실시예에서는 통상 7 내지 9 nt 길이의 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하도록 사용했으나 버퍼 내 양이온의 농도가 높으면 더 짧은 길이도 가능하고, 양이온 농도가 낮으면 더 긴 길이도 가능하다. 또한 실제 상보적인 결합을 하는 길이는 7인데 중간에 상보적 결합을 하지 않는 미스매치(mismatch) 서열을 넣을 경우 전체 길이를 얼마든지 길게 할 수 있으므로 전체 길이가 아닌 상보적 결합의 개수로 표현하는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 스트랜드가 DNA, RNA가 아닌 PNA, LNA, GNA 등일 경우, 도킹 스트랜드와 상보적인 염기서열 개수는 도너 스트랜드 경우 3 이상 9 이하, 억셉터 스트랜드의 경우 5 이상이 바람직하다. 상기 XNA 들은 DNA, RNA보다 결합력이 더 강하므로 더 적은 상보적 결합으로도 활용이 가능하여 상보적인 염기서열 개수가 적어질 수 있다.
도킹 스트랜드의 길이는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 의도한 상보적 결합을 할 수 있는 최소 길이 이상이 바람직하다. 상술한 바와 마찬가지로 미스매치 서열 또는 gap(single-stranded DNA 부분)을 넣을 경우 얼마든지 길이를 늘일 수 있으므로 최소 길이 이상으로 표현하였다.
억셉터 스트랜드는 도킹 스트랜드에 결합한 후 오래 유지되거나 분리되지 않도록 길게 제작될 수 있으며, 억셉터 형광물질 자체를 도킹 스트랜드에 직접 부착하는 것도 가능하다. 항상 여기광에 의해 여기되고 빛을 내는 도너와 달리 억셉터는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 도킹 스트랜드에 동시에 결합했을 경우에만 빛을 내므로 광표백의 우려가 낮다.
도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합 시 억셉터 스트랜드가 이미 도킹 스트랜드에 결합하고 있어 FRET에 의해 억셉터가 빛을 낼 확률을 높이기 위해 상대적으로 긴 억셉터 스트랜드를 사용하고 억셉터 스트랜드보다 짧은 길이의 도너 스트랜드를 선택할 수 있다.
억셉터 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합한 후 결합이 유지되는 시간을 a, 억셉터 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합하는 데 걸리는 시간을 b라고 하면 도킹 스트랜드에 억셉터 스트랜드가 결합해있을 확률은 a/(a+b)가 된다. a는 억셉터 스트랜드의 길이가 길어질수록, 염의 농도가 높아질수록 커지고, b는 억셉터 스트랜드의 농도가 높을수록 작아질 수 있다. 만약 위의 확률이 1이라면 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합할 때마다 억셉터가 신호를 내는 것이다. 반면 확률이 0.5라면 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합했을 때 억셉터가 신호를 낼 확률은 0.5에 불과하므로 도너 스트랜드가 두 배 더 많이 결합해야 동일한 억셉터 신호를 얻을 수 있다는 것이다. 결국 확률이 높을수록, 즉 a가 크거나 b가 작을수록 검출시간은 짧아질 수 있다.
일 구현예에서, 기존 세포 이미징에서는 억셉터의 광표백이 우려되었으나 바이오마커 검출에서는 광표백될 가능성이 낮으므로 억셉터 스트랜드의 길이를 늘이거나 억셉터 형광물질을 도킹 스트랜드에 직접 부착함으로써 a를 늘이는 게 바람직하다. 억셉터 스트랜드의 농도를 높임으로써 b를 줄일 수도 있으나 신호대잡음비 측면에서 바람직하지 않다.
한편, DNA는 음의 전하를 띄고 있으므로 DNA끼리 서로 밀어내는 경향이 있어 이를 상쇄하기 위해 양전하를 버퍼에 넣는 것이 바람직하다. DNA끼리 상보적으로 결합할 경우 한 염기 당 2개 또는 3개의 수소결합(당기는 힘)이 생기므로 염기서열이 길어질수록 결합이 더 안정적일 수 있다. Na+의 농도가 500mM이고, 억셉터 스트랜드 길이가 10 nt일 때 평균 40초 동안 결합이 유지되는데 길이가 더 길어질수록 결합이 유지되는 시간은 더 길어질 수 있다.
또한 예를 들어, PNA는 DNA와 달리 음의 전하를 띄지 않으므로 PNA-PNA, PNA-DNA의 결합은 DNA-DNA 결합보다 훨씬 안정적이므로 억셉터 스트랜드만 PNA나 LNA를 사용하고 도킹과 도너 스트랜드는 DNA를 사용할 수도 있다.
한편, 타겟 물질이 검출 과정에서 시료 중 타겟 물질의 농도가 지나치게 높을 경우 신호 겹침에 의해서 정확한 정량이 어려울 수 있다.
대다수 타겟 물질의 혈중 농도는 알려져 있지만 피검자의 상태에 따라 그 수치는 매우 크게 달라질 수 있다. 또한 타겟 물질의 종류에 따라 농도는 10-15 g/ml에서 10-3 g/ml까지 1012배 가량 차이날 수 있다.
따라서 검출화면 상에 적당한 수의 타겟 물질의 수가 나타나도록 예를 들어 하기와 같은 방법으로 희석할 필요가 있다. 먼저 well 1, well 2, well 3 등이 구비된 웰 플레이트(well plate) 또는 랩텍(Lab-Tek)를 준비한다. 농도가 낮을 것으로 예상되는 타겟 물질의 포획 항체와 검출 항체는 well 1과 well 2에, 농도가 높을 것으로 예상되는 타겟 물질의 포획 항체와 검출 항체는 well 2와 well 3에 적용한다.
혈액을 표준 농도로 희석한 용액은 well 1에, 이를 추가로 희석한 용액은 well 2에, 이를 더욱 희석한 용액은 well 3에 주입하여 타겟 물질을 기판에 고정시킨다. 농도가 낮을 것으로 예상되는 타겟 물질을 well 1에서 검출을 시도했을 때 적당한 수의 타겟 물질이 나타날 경우 측정을 마무리하고, 너무 적은 수의 타겟 물질이 나타날 경우 well 1의 여러 영역을 측정해 이를 종합하며, 너무 많은 수의 타겟 물질이 나타나 분석이 불가능할 경우 well 2에서 검출을 시도한다.
농도가 높을 것으로 예상되는 타겟 물질을 well 2에서 검출을 시도했을 때 적당한 수의 타겟 물질이 나타날 경우 측정을 마무리하고, 너무 적은 수의 타겟 물질이 나타날 경우 well 2의 여러 영역을 측정해 이를 종합하며, 너무 많은 수의 타겟 물질이 나타나 분석이 불가능할 경우 well 3에서 검출을 시도할 수 있다. 또는 너무 많은 수의 타겟 물질이 나타나 분자 간 겹침이 문제가 되는 경우 도너 스트랜드의 농도를 낮추거나, 버퍼 내 염의 농도를 낮추거나, 본래 도너 스트랜드 대비 미스매치가 있거나 길이가 짧아 도킹 스트랜드와의 상보적 결합 수가 적은 대체 도너 스트랜드를 넣어 분자간 겹침 문제를 해결할 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이 상술한 타겟 물질 검출방법 및 키트를 사용할 경우 기존의 방식에 비해 1000배 이상 더 높은 민감도로 다양한 바이오마커를 극소량의 생체액으로부터 검출할 수 있어 암을 포함한 다양한 질병의 조기진단에 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 전술한 바와 같이 억셉터 형광 신호를 관찰하는 방법 외에 타겟 물질별로 다양한 프렛쌍이 도입된 스트랜드를 이용하여 프렛 효율을 측정함으로써 여러 타겟 물질을 다중 검출하는 방법이 제공될 수 있다.
본 명세서에 개시된 또 다른 측면에 의하면, 형광 물질로 표지된 태그 스트랜드(tagged strand)가 구비된 검출 프로브를 이용한 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다. 상기 타겟 물질 검출용 키트는 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 태그 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브를 포함한다. 이때 상기 태그 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 억셉터 형광 물질을 포함하고, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타낸다.
일 구현예에서, 상기 태그 스트랜드는 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 간에 인접하여 형성된 프렛쌍들을 2종 이상 구비할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 물질 검출용 키트는 기판; 형광 물질이 표지된 2종 이상의 태그 스트랜드; 및 상기 태그 스트랜드가 결합된 2종 이상의 검출항체를 포함하고, 상기 형광 물질에 의한 FRET 효율을 이용하여 2종 이상의 바이오마커 종류를 동시에 판별하는 다중 바이오마커 동시 검출용 키트일 수 있다. 상기 형광 물질은 상기 태그 스트랜드의 특정염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너 또는 억셉터로 작용하는 것일 수 있다. 상기 태그 스트랜드에 표지된 도너와 억셉터 간의 거리에 따라 상이하게 측정되는 FRET 효율의 측정값을 이용함으로써 2종 이상의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있다.
상기 검출항체는 바이오마커를 항원-항체반응을 이용하여 검출하기 위한 검출 프로브로서, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류만큼 이종의 것을 사용함이 바람직하다. 또, 검출 시 FRET 효율을 측정하기 위해서는 각각의 검출항체는 형광 물질이 표지된 태그 스트랜드가 결합된 것을 사용함이 바람직하다. 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에서는 태그 스트랜드로 DNA를 주로 사용하였으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는, DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA, TNA와 같은 핵산 또는 이의 유사체, 폴리펩타이드나 탄수화물과 같은 생체 고분자일 수 있다.
상기 "FRET 효율"은 빛에 의해 여기된 형광 물질의 에너지가 인접한 다른 형광 물질에 전달되는 현상에서, 형광 물질 사이의 거리에 따라 상이한 에너지 전달 효율을 값으로 나타낸 것으로, 구체적으로는 아래와 같이 계산되는 값을 의미한다.
(식 5)
FRET 효율 = (억셉터가 내는 빛의 세기)/(도너와 억셉터가 내는 빛의 세기 합)
이때, 도너 또는 억셉터의 빛의 세기는 도너와 억셉터 간의 거리에 따라 영향을 받을 수 있으나, 도너와 억셉터를 원하는 특정 염기, 3'- 또는 5'-말단, 또는 기본골격 상에 표지하여 도너와 억셉터 사이의 거리를 조절함으로써, FRET 효율을 제어할 수 있다.
이때, FRET 효율은 도너를 여기하기 위한 빛에 의해 억셉터가 여기되며 내는 빛, 도너와 억셉터가 내는 빛을 분리하기 위해 사용하는 광학부품(ex: dichroic mirror)에 의해 완벽하게 분리되지 않은 도너와 억셉터가 내는 빛의 일부, 또는 도너와 억셉터가 내는 빛의 파장 차이에 따른 이미지 센서의 검출 효율 차를 보정한 값일 수 있다.
FRET 효율을 이용한 타겟 물질의 검출은 예를 들어 하기와 같은 방식으로 이루어질 수 있다. 도너와 억셉터 사이에 존재하는 염기의 수가 1개라고 할 때 간격을 1이라고 한다면, 도너와 억셉터 사이 간격을 1, 2, 3, … n으로 하는 2종 이상의 태그 스트랜드를 제작한다. 각각의 간격에 대한 FRET 효율을 측정하여 간격에 대한 FRET 효율을 데이터베이스화한다. 같은 종류의 검출항체에는 같은 종류의 태그 스트랜드를 부착하고, 다른 종류의 검출항체에는 다른 종류의 태그 스트랜드를 부착한다. 이후, 바이오마커가 포함된 시료와 반응을 진행하면, 특정 바이오마커는 특정 검출항체와 결합하게 되는데, 이때, 각 분자의 도너와 억셉터가 내는 빛의 세기를 측정하여 FRET 효율을 계산한다. 데이터베이스화된 값과 계산한 값을 비교하여, 검출에 사용된 검출항체의 종류를 확인할 수 있으므로, 최종적으로 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
예를 들어, 전술한 내용으로 FRET 효율을 구분할 수 있는 간격을 4 이상 20 이하의 정수라고 가정한다면, 1종의 도너와 1종의 억셉터로 제작할 수 있는 태그 스트랜드는 17가지가 된다. 만일, 동일한 조건으로 도너와 억셉터가 2쌍 존재한다면, 289가지가 되고, 3쌍이 존재하면 4,913가지가 되므로, 최소한의 형광 물질 종류를 이용하여 다종의 바이오마커를 검출할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 태그 스트랜드는 2 이상의 서로 상이한 형광 물질이 표지된 것일 수 있다. 도 9는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 도시한 것이다. 도 9을 보면, 기판에는 바이오마커가 고정되어 있고, 바이오마커에는 태그 스트랜드(검출항체태그)가 부착된 검출항체가 결합되어 있다. 도 9에는 N종의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 N종의 검출항체와 이에 부착된 N종의 태그 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 도시되어 있다.
상기 키트가 이와 같이 구성되는 이유는 각각의 바이오마커와 결합한 검출항체의 태그 스트랜드로부터 동일한 FRET 효율이 측정된다면 검출된 바이오마커의 종류를 특정할 수 없기 때문이다. 따라서, 구분이 가능할 정도의 FRET 효율의 측정값을 획득하기 위해서는 검출하고자 하는 바이오마커의 수만큼 상이한 태그 스트랜드를 이용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 2종 이상의 태그 스트랜드는 표지된 도너와 억셉터 사이에 존재하는 염기의 수가 상이한 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, 태그 스트랜드는 도너 및 억셉터 각각이 표지된 위치에 따라 모두 상이한 FRET 효율을 가지는 것일 수 있다. 이때, 상기 태그 스트랜드는 복수의 도너 또는 억셉터가 표지되는 것일 수 있다. 이 경우, 2 이상의 도너는 억셉터와 상이한 종류의 형광 물질이고, 2 이상의 도너는 서로 다른 종류의 형광 물질일 수 있다. 또 다른 경우, 2 이상의 억셉터는 도너와는 상이한 종류의 형광 물질이고, 2 이상의 억셉터는 서로 다른 종류의 형광 물질일 수 있다. 일례로, 상기 태그 스트랜드는 도 10에 도시된 바와 같이, 태그 스트랜드에 1개의 억셉터와 복수의 도너가 표지된 것일 수 있다. 이때, 도너와 억셉터는 서로 이종의 형광 물질이고, 복수 개의 도너는 모두 상이한 종류의 형광 물질인 것이 바람직하다. 가령, 전술한 내용으로 FRET 효율을 구분할 수 있는 간격을 4 이상 20 이하의 정수라고 가정한다면, 이론적으로는, 하나의 FRET 효율로 제작할 수 있는 태그 스트랜드는 17가지가 된다. 즉, 4개의 도너와 1개의 억셉터로 구성된 태그 스트랜드를 제작하는 경우라면, 도너1-도너2, 도너2-도너3, 도너3-도너4, 도너4-억셉터 사이의 총 4개의 FRET 효율로 제작할 수 있는 태그 스트랜드의 종류는 이론상 17x17x17x17=83,521 가지가 된다.
도 11은 도 10과 같이 구성된 태그 스트랜드에 표지되는 형광 물질로부터 FRET 효율을 측정하는 과정을 나타낸 것으로, 단일분자 현미경을 이용하여 형광 물질을 이미징하는 원리를 개략적으로 나타낸 것이다.
먼저, 기판에 형광 물질이 표지된 태그 스트랜드를 고정한 뒤, 도 11과 같은 단일분자 형광현미경을 이용하여 빛의 밝기를 관찰한다. 이때, 빛의 회절현상(diffraction)에 의해 약 300nm 이내에 위치한 분자들은 서로 구분되지 않고 하나의 점으로 관찰될 수 있다. 따라서, 한 태그 스트랜드에 여러 형광 물질이 표지되어 있어도, 전체 거리가 300nm 이하가 되도록 배치된 형광 물질은 하나의 점으로 보이게 된다. 반면에, 서로 다른 형광 물질은 서로 다른 파장의 빛을 발산하므로, 특정 파장대의 빛만 반사 또는 통과시키는 광학부품(ex: dichroic mirror)을 이용해 방출되는 빛을 파장에 따라 분리하면 특정 형광 물질의 밝기를 측정할 수 있다.
도 11의 왼쪽 이미지는 하나의 카메라에 4종의 형광 물질(Cy2, Cy3, Cy5, Cy7)을 한 화면으로 출력하여 확인하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이고, 도 11의 오른쪽 이미지는, 형광 물질의 종류에 따라 각기 다른 카메라를 통해 이미징 하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다. 도너와 억셉터에 의해 생성된 FRET 효율을 이미징하는 방법으로서 전술한 내용의 방법을 이용할 수 있고, 특별히 제한을 두지는 않으나, 구체적으로는, 도너카메라와 억셉터카메라 각각을 통해 도너와 억셉터의 빛의 세기를 이미징함이 분석시간 측면에서 바람직하다.
도 12는 Cy3, Cy5의 도너 및 Cy7의 억셉터가 표지된 태그 스트랜드를 이용하여 전술한 방법으로 이미징한 결과를 함께 나타낸 것이다. 도 12를 보면, 도 11의 왼쪽 이미지와 같은 방법으로 밝기를 측정한 결과, 가장 왼쪽부터 Cy3, Cy5, Cy7 순으로 이미징된 결과가 하나의 모니터를 통해 확인되었다. 도 12와 같이 제작된 태그 스트랜드에 빨간색의 레이저를 조사하는 경우, 먼저 Cy5가 여기되고, FRET에 의해 Cy7으로 에너지가 전달되어 Cy7도 빛을 낼 수 있게 되므로, Cy3의 영역에서는 아무것도 나타나지 않고, Cy5 및 Cy7의 영역에서만 밝은 점이 관찰된다. 이때, 각 점의 밝기 비율로부터 Cy5와 Cy7 사이의 FRET 효율을 측정하여 거리를 확인할 수 있다. 추가적으로, 녹색의 레이저를 조사하는 경우, Cy3가 여기되고, FRET에 의해 Cy5 및 Cy7으로 에너지가 전달되어 모두 빛을 내게 된다. 이 경우, 앞선 경우를 통해 확인된 Cy5 와 Cy7 사이의 FRET 효율을 이용하여 Cy3와 Cy5 사이의 거리를 확인 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 도 13 및 도 14과 같이 도너-억셉터로 구성되는 FRET쌍이 2쌍 이상 표지되는 구성일 수 있다.
1개의 태그 스트랜드에 도너 및 억셉터로 구성되는 FRET쌍이 2 이상 표지되는 경우에는, 각각의 FRET쌍이 서로의 FRET 효율에 미치는 영향을 최소화하기 위해, 일정 거리 이상 이격하여 표지함이 바람직하다. 구체적으로는, 각 FRET쌍은 5nm 이상 이격하여 표지됨이 더욱 바람직하다.
상기 태그 스트랜드는 도너 및 억셉터로 구성되는 2 이상의 FRET쌍을 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 2 이상의 FRET쌍은 도너 및 억셉터 사이의 간격이 상이한 것일 수 있으며, 바람직하게는, 측정시 발생할 수 있는 오차범위와 노이즈를 감안하여, 충분히 구별이 가능한 FRET 효율이 측정될 정도로 간격이 상이한 것일 수 있다.
다른 일례로, 상기 2 이상의 FRET쌍에 동일종의 도너를 이용하는 경우, 표지되는 억셉터 각각은 서로 동일 또는 상이한 종류를 사용할 수 있으나, 상기 도너와는 상이한 종류임이 바람직하다.
또 다른 일례로, 상기 2 이상의 FRET쌍에 동일종의 억셉터를 이용하는 경우, 표지되는 도너 각각은 서로 동일 또는 상이한 종류를 사용할 수 있으나, 상기 억셉터와는 상이한 종류임이 바람직하다.
구체적으로, 1개의 태그 스트랜드에 2쌍의 FRET쌍이 표지되는 경우, 상기 FRET쌍의 도너 및 억셉터는 아래의 4가지 경우로 조합되는 것일 수 있다.
i) 상기 FRET쌍의 도너는 서로 동일한 형광 물질이고, 억셉터도 서로 동일한 형광 물질일 수 있다
ii) 상기 FRET쌍의 도너는 서로 상이한 형광 물질이고, 억셉터는 서로 동일한 형광 물질일 수 있다.
iii) 상기 FRET쌍의 도너는 서로 동일한 형광 물질이고, 억셉터는 서로 상이한 형광 물질일 수 있다.
iv) 상기 FRET 쌍의 도너는 서로 상이한 형광 물질이고, 억셉터도 서로 상이한 형광 물질일 수 있다.
도 13은 상기 i)의 경우를 일례로 나타낸 것이다. 도 13을 보면, 도너1 및 도너2가 A라는 형광 물질로 표지되어 있고, 억셉터1 및 억셉터2가 B라는 형광 물질로 표지되어 있다. 각각의 도너와 억셉터가 동일한 형광 물질로 표지되기 때문에 이 경우, 4개의 도너 및 억셉터가 모두 인접해 있으면 각각의 도너-억셉터로 구성되는 FRET쌍의 FRET 효율에 영향을 미치게 된다. 따라서, 도 13과 같이, 하나의 태그 스트랜드에 동일한 도너 및 억셉터를 2 이상 표지하는 경우에는 각각의 FRET쌍은 최소 5nm 이상 이격하여 표지하는 것이 바람직하다.
도 14a 내지 도 14c는 전술한 ii) 내지 iv)의 FRET쌍 조합을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 14a는 상기 ii)의 경우를 나타낸 것으로, 도 14a의 도너 1은 A라는 형광 물질로, 도너2는 B라는 형광 물질로 표지된 것이다. 이때, 억셉터 1 및 억셉터2는 모두 C라는 동일한 형광 물질로 표지된 것으로, 1개의 태그 스트랜드에 표지된 2쌍의 FRET 쌍에 동일종의 억셉터가 표지된 경우를 설명하는 그림이다.
또, 도 14b는 상기 iii)의 경우를 나타낸 것으로, 도 14b의 도너 1 및 도너2는 모두 A라는 동일한 형광 물질로 표지되고, 억셉터 1은 형광 물질 B로, 억셉터2는 형광 물질 C로 표지된 것이다. 또한, 도 14c는 상기 iv)의 경우를 나타낸 것으로, 도너 1은 형광 물질 A, 도너 2는 형광 물질B, 억셉터 1은 형광 물질 C, 억셉터2는 형광 물질 D로 표지되어, 모두 다른 종류의 형광 물질로 표지된 태그 스트랜드의 경우를 설명하고 있다.
도 14a 내지 도 14c에 나타낸 그림을 보면, 모두 도너1-억셉터1의 제1 FRET쌍과 도너2-억셉터2의 제2 FRET쌍은 소정거리 이격된 상태로 표지된 것을 확인할 수 있다. 이는, 앞서 도 13에서 설명한 바와 같이, 인접한 FRET 쌍이 주는 영향을 최소화하기 위한 것이다. 또, 제1 FRET쌍과 제2 FRET쌍의 도너 및 억셉터 간의 간격은 동일 또는 상이할 수 있다. 다만, 제1 FRET 쌍과 제2 FRET쌍에 사용되는 도너 및 억셉터의 종류가 서로 동일한 경우 제1 FRET쌍과 제2 FRET쌍의 FRET 효율이 각각 i) a, b인 태그 스트랜드와 ii) b, a인 태그 스트랜드가 존재한다면, 상기 i) 및 ii)의 태그 스트랜드를 서로 구분할 수 없으므로, 상기 i) 또는 ii) 중 어느 하나의 태그 스트랜드만 이용할 수 있다.
일 구현예에 따른 태그 스트랜드는, 2이상의 FRET쌍을 포함할 수 있으며, 그 구성은 전술한 내용과 같을 수도 있다. 즉, 상기 태그 스트랜드는 도 13에 도시한 것과 유사하게 구현될 수 있고, 도 14a, 도 14b 또는 도 14c의 구성과 같을 수도 있다.
전술한 바와 같은 구성의 키트를 이용하여 FRET 효율을 측정함에 있어, 도너를 여기시킨 뒤, 일정 시간이 지나면 형광 물질이 더 이상 빛을 방출하지 못하는 광표백(photobleached)된 상태가 된다. 일단 광표백이 되면 빛의 세기가 변하게 된다. 이 경우에도 광표백 전과 후의 빛의 밝기를 측정하여 비교함으로써 각 도너-억셉터 상의 FRET 효율을 측정할 수 있다.
광표백 전후의 밝기를 비교하여 FRET 효율을 측정하는 기본적인 원리는 다음과 같다. 도너가 광표백이 될 경우, 도너는 광표백에 의해 더 이상 빛을 방출하거나 억셉터에 에너지를 전달하지 못하게 되고, 억셉터는 도너로부터 에너지를 받을 수 없게 되므로, 도너와 억셉터 모두의 빛의 세기가 감소하게 된다. 반면, 억셉터가 광표백될 경우, 도너는 억셉터로 에너지를 전달하지 못하므로 모든 에너지를 빛을 방출하는 데 사용하므로 도너의 밝기는 더 증가하고 억셉터의 밝기는 감소하게 된다. 보다 구체적인 원리는 후술할 실시예 2-3을 통해 설명하도록 한다.
일 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 포획항체를 더 포함하는 것일 수 있다.
도 16은 포획항체를 포함하는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 키트를 개략적으로 나타낸 것으로 이 경우, 포획항체는 기판에 미리 부착된 상태일 수 있고, 혹은 검출과정에서 부착되는 것일 수 있다. 상기 포획항체는 태그 스트랜드가 결합된 것일 수 있다.
이때, 상기 포획항체에 결합된 태그 스트랜드("포획항체태그"로 명명)는 전술한 검출항체에 결합된 태그 스트랜드("검출항체태그"로 명명)와 동일 또는 유사한 기본골격으로 이루어진 것일 수 있으며, 구체적으로는 상기 태그 스트랜드는 바람직하게는, DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA, TNA와 같은 핵산 또는 이의 유사체, 폴리펩타이드나 탄수화물과 같은 생체 고분자일 수 있다. 가령, 도 17에 도시한 바와 같이 구성되는 것일 수 있으나, 특별히 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 브릿지 스트랜드를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 브릿지 스트랜드는 전술한 검출항체태그 및 포획항체태그와 동일 또는 유사한 기본골격을 사용함이 바람직하며, 구체적으로는 염기서열이 존재하는 단일가닥의 핵산을 이용함이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 브릿지 스트랜드는 검출항체태그 및 포획항체에 결합된 포획항체태그와 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
상기 브릿지 스트랜드로 단일가닥의 핵산을 이용하는 경우, 브릿지 스트랜드의 일부 염기서열은 포획항체태그의 일부 염기서열과 상보적으로 구성되고, 다른 일부는 검출항체태그의 일부 염기서열과 상보적으로 구성됨으로써, 브릿지 스트랜드의 일부가 검출항체태그 및 포획항체태그와 각각 상보적으로 결합하여 서로 다른 두 개의 이중가닥 핵산을 형성하게 된다. 이러한 구조는 도 18과 같이 나타낼 수 있다.
바이오마커를 구분하는 데 필요한 전체 FRET 쌍 중 일부는 검출항체태그와 브릿지 스트랜드가 상보적으로 결합해야 형성되며, 나머지 FRET 쌍은 포획항체태그와 브릿지 스트랜드가 상보적으로 결합해야 형성된다. 따라서 바이오마커 검출 과정에서 전체 FRET 쌍이 관측되었다는 것은 브릿지 스트랜드가 검출항체태그 및 포획항체태그 모두와 상보적 결합을 하고 있음을 의미하고, 이는 바이오마커가 포획항체 및 검출항체와 결합하고 있음을 의미한다. 반면, 복수의 FRET 쌍 중 어느 일부만 관측되는 경우, 검출항체가 바이오마커가 아닌 기판 등에 비특이적(non-specific)으로 결합하고 있음을 의미하고, 이는 위양성(false positive) 신호이며 측정 오차임을 확인할 수 있다. 즉, 검출항체태그 및 포획항체태그와 상보적으로 결합하는 브릿지 스트랜드를 사용함으로써 위양성 신호를 제거하여 분석 결과의 정확도를 향상시킬 수 있다.
일 구현예에서, 상기 브릿지 스트랜드는 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에 도너 또는 억셉터가 표지되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 도너 또는 억셉터로 작용하는 형광 물질을 브릿지 스트랜드의 특정 염기 상에 표지하여 FRET 효율을 측정하는 것일 수 있다.
포획항체태그, 검출항체태그 및 브릿지 스트랜드가 결합하여 FRET 효율을 측정하기 위해 도너 또는 억셉터는 아래의 경우와 같이 표지될 수 있다.
1) 검출항체태그와 브릿지 스트랜드가 상보적으로 결합하여 하나 이상의 FRET 쌍을 형성하도록 제작되는 경우
a) 검출항체태그에 도너만 표지되고, 브릿지 스트랜드에 억셉터가 표지되는 경우
b) 검출항체태그에 억셉터만 표지되고, 브릿지 스트랜드에 도너가 표지되는 경우
c) 검출항체태그에 도너 및 억셉터 중 하나 이상 표지되고, 브릿지 스트랜드에 도너 및 억셉터 중 하나 이상 표지되는 경우
2) 포획항체태그와 브릿지 스트랜드가 상보적으로 결합하여 하나 이상의 FRET 쌍을 형성하도록 제작되는 경우
a) 포획항체태그에 도너만 표지되고, 브릿지 스트랜드에 억셉터가 표지되는 경우
b) 포획항체태그에 억셉터만 표지되고, 브릿지 스트랜드에 도너가 표지되는 경우
c) 포획항체태그에 도너 및 억셉터 중 하나 이상 표지되고, 브릿지 스트랜드에 도너 및 억셉터 중 하나 이상 표지되는 경우
상기 1) 및 2)의 경우에도, 전술한 원리가 적용될 수 있다. 이때, 동일 종으로 표지되는 FRET쌍의 경우에는, 제 1FRET쌍과 제 2FRET쌍의 FRET 효율이 각각 i) a, b인 경우와 ii) b, a인 경우를 서로 구분할 수 없으므로, 상기 i) 또는 ii) 중 어느 하나만 사용할 수 있도록 포획항체태그, 검출항체태그, 브릿지 스트랜드를 제작함이 바람직하고, 구체적으로는 FRET 효율의 측정값이 구분 가능한 정도의 간격으로 각각의 포획항체태그, 검출항체태그 및 브릿지 스트랜드에 표지함이 바람직하다.
또, 상기 1) 및 2)의 경우, 도너와 억셉터는 서로 상이한 형광 물질로 표지됨이 바람직하다. 이때, 복수의 도너 또는 억셉터가 표지되는 경우, 포획항체태그, 검출항체태그 또는 브릿지 스트랜드에 표지되는 도너의 종류는 서로 같거나 다를 수 있고, 포획항체태그, 검출항체태그 또는 브릿지 스트랜드에 표지되는 억셉터의 종류 역시 서로 같거나 다를 수 있다.
예를 들어, 바이오마커1을 검출하기 위한 키트인 경우, 바이오마커1을 검출하기 위해 포획항체1, 검출항체1및 브릿지 스트랜드1을 사용하고, 브릿지 스트랜드1과 결합하는 태그는 포획항체태그1 및 검출항체태그1이라고 가정한다. 이 경우, 포획항체태그1의 어느 하나의 염기에 도너1이 표지가 되면, 원하는 FRET 효율이 되도록 브릿지 스트랜드1의 포획항체태그1과 결합하는 부위 중 어느 하나의 염기에는 억셉터1이 표지가 된다. 동시에, 검출항체태그1 및 브릿지 스트랜드1의 검출항체태그1과 결합하는 부위도 동일한 방식으로 원하는 FRET 효율이 되도록 도너1 및 억셉터1이 표지가 되거나, 전혀 다른 형광 물질인 도너2 및 억셉터2가 표지가 될 수도 있다. 또는, 도너1 및 억셉터2가 표지되거나, 도너2 및 억셉터1이 표지가 될 수도 있으나, 도너1 및 억셉터1은 서로 다른 형광 물질이며, 도너2 및 억셉터2 역시 서로 다른 형광 물질이어야 한다.
본 명세서에 개시된 또 다른 측면에 의하면, 형광 물질로 표지된 태그 스트랜드(tagged strand)가 구비된 검출 프로브를 이용한 타겟 물질 검출방법이 제공된다. 상기 타겟 물질 검출방법은 a) 기판에 타겟 생체물질을 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 타겟 생체물질에 태그 스트랜드가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계; c) 상기 태그 스트랜드는 1종 이상의 상기 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 상기 억셉터 형광 물질을 포함하는 단계; 및 d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 태그 스트랜드는 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 간에 인접하여 형성된 프렛쌍들을 2종 이상 구비할 수 있다.
상기 프렛에 의한 형광 신호의 측정은 FRET 효율을 측정하는 방식일 수 있다. 이때 상기 FRET 효율의 측정은 상기 도너 또는 상기 억셉터의 광표백 전후의 빛의 밝기를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 프렛쌍들 사이의 간격은 각 프렛쌍의 FRET 효율에 영향을 미치지 않도록 조절된 것일 수 있다. 이때 상기 프렛쌍들 사이의 간격은 적어도 5nm인 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 다중 바이오마커를 동시에 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 기판에 2종 이상의 바이오마커가 부착되는 단계; 형광 물질이 표지된 태그 스트랜드(검출항체태그)가 결합된 2종 이상의 검출항체가 상기 2종 이상의 바이오마커에 각각 결합하는 단계; 및 상기 결합에 의해 생성되는 형광신호로부터 FRET 효율을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 형광 물질에 의한 FRET 효율을 이용하여 상기 바이오마커의 종류를 동시에 판별한 후 단위 면적 당 바이오마커 개수로부터 시료 중의 바이오마커 농도를 측정할 수 있다.
상기 형광 물질은 상기 태그 스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너 또는 억셉터로 작용하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 도너 또는 억셉터로 작용하는 형광 물질을 태그 스트랜드의 특정 염기 상에 표지하여 FRET 효율을 측정하는 것일 수 있다.
상기 다중 바이오마커 동시 검출 방법은 전술한 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 이용하는 검출 방법일 수 있으며, 후술하는 내용을 포함하는 방법일 수 있다.
상기 검출 방법을 이용함에 있어서, 후술하는 FRET 효율 데이터베이스를 제작하는 단계가 선행될 수 있다. 예를 들어 구별 가능한 FRET 효율 기준값을 미리 측정하여 데이터베이스화하고, 이를 기준으로 반응 후 측정되는 FRET 효율 측정값을 비교함으로써 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
FRET 효율 데이터베이스는 다음과 같은 과정을 통해 제작될 수 있다.
먼저 각기 다른 형광 물질 A, B를 각각 도너, 억셉터로 이용하여, DNA 기본골격에 A와 B를 특정 염기 상에 표지하고, 필요한 종류만큼 이종의 DNA를 제작한다. 가령, 데이터베이스 상에 필요한 종류가 50종이면, 표지된 A, B 사이의 거리가 모두 상이하게 표지된 50 종의 DNA를 준비한다. 이때, 각각의 DNA 한 쪽 끝에는 기판에 도포된 물질과 결합친화적인 물질을 부착함으로써, 기판에 고정할 수 있도록 한다. 필요에 따라서, 사용하는 도너 및 억셉터가 시판되는 형광 물질인 경우, 이러한 제작과정을 생략하고 도너 및 억셉터가 부착된 상태로 시판되는 DNA를 사용할 수도 있다. 다만, 도너 및 억셉터로 사용되는 형광 물질을 결정함에 있어서, 도너로 사용하는 형광 물질의 발광스펙트럼의 최대값의 파장이 억셉터로 사용되는 형광 물질의 흡광스펙트럼의 최대값의 파장보다 짧은 것이 바람직하다.
2 종 이상의 DNA가 준비되면, 거리가 1인 DNA를 기판에 고정하고 해당 거리의 FRET 효율을 측정한다. 이후, 거리가 2인 DNA부터 차례로 전술한 내용과 동일한 과정을 반복하여 FRET 효율 기준값을 획득하고, 이를 거리별로 데이터베이스화 한다.
이후, 바이오마커 검출과정에서 측정되는 FRET 효율 측정값과 상기 FRET 효율 기준값을 비교하면, 검출에 사용된 태그 스트랜드의 도너와 억셉터 사이의 거리를 알 수 있으며, 이로부터 검출한 바이오마커의 종류를 바로 알 수 있다.
그러나, FRET 효율 측정에는 노이즈에 의한 오차가 있을 수 있어 모든 거리의 FRET 효율이 구분가능한 것이 아닐 수 있다. 예를 들면, 거리가 1일 때의 FRET 효율이 0.95(평균) ± 0.05(오차)이고, 거리가 2일 때의 FRET 효율이 0.94 ± 0.05이라면, FRET 효율로는 거리 1과 2를 구분할 수 없다. 따라서, 실제 바이오마커를 검출시에는 데이터베이스의 값 중 FRET 효율이 명확히 구분되는 거리만 이용함이 바람직하다.
FRET 효율 기준값이 확보되면 바이오마커를 검출하기 위해 바이오마커가 포함된 시료를 주입하고, 바이오마커를 기판에 부착하는 단계가 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출방법은 기판에 포획항체를 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 포획항체는 태그 스트랜드(포획항체태그)가 결합된 것일 수 있다.
포획항체를 기판에 흡착시키는 방법은, 예를 들면, pH 9.5인 0.06M의 탄산염 완충용액 또는 중탄산염 완충용액으로 상기 포획항체를 희석시키고, 그 희석액을 일정 온도에서 기판에 소정의 시간동안 접촉시킴으로써 흡착시키는 것일 수 있다. 또는 기판 표면을 바이오틴(biotin)이 결합된 PEG(polyethylene glycol) 또는 BSA(bovine serum albumin)로 코팅하고, 스트렙타비딘(streptavidin)을 결합시킨 후 여기에 바이오틴이 결합된 포획항체를 결합시킴으로써 흡착시키는 것일 수 있다. 이후, 기판에 흡착된 포획항체는 기판에 시료 또는 가공된 시료를 처리하게 되면, 시료에 포함된 바이오마커와 결합체를 형성하게 된다. 추가적으로, 결합체의 형성 이후에는 비특이적으로 결합된 항체를 제거하거나 오염물질 등을 제거하기 위한 목적으로 TWEEN 20, TritonX-100 등이 포함된 세척 완충액으로 세척함이 바람직할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 검출 방법은 상기 포획항체태그와 브릿지 스트랜드가 결합하는 단계; 및 검출항체태그와 상기 브릿지 스트랜드가 결합하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
이때, 브릿지 스트랜드는 태그 스트랜드 및 포획항체태그의 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 브릿지 스트랜드가 단일가닥 핵산인 경우, 일부 염기서열은 태그 스트랜드의 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하고, 다른 일부는 포획항체태그와 상보적인 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이때, 상보적 결합의 범위가 특별히 한정되는 것은 아니다.
전술한 검출항체태그와 관련한 모든 설명은 포획항체태그에도 동일하게 적용될 수 있는 것이며, 포획항체를 포함하는 키트 및 검출 방법에도 동일 또는 유사하게 적용될 수 있다.
상술한 방법과 키트를 이용하면 FRET 효율을 이용하여 2 종 이상의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있고, 적은 양의 시료에 포함된 낮은 농도의 바이오마커 종류를 구별할 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에 따른 기술의 일 구현예에 따른 바이오마커 검출 방법을 이용하면 1fg/ml 수준의 극히 미량 존재하는 바이오마커를 포함하여 최대 1000여 개의 바이오마커를 동시에 검출하는 효과가 있으며, 검출 및 분석에 소요되는 시간이 매우 짧다는 장점이 있다.
이 후, 본 개시된 기술의 일 구현예에 따른 타겟 물질 검출 방법을 이용한 2 종 이상의 바이오마커의 검출은 후술할 실시예를 통해 과정을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
한편 본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 형광 물질에 의한 프렛효율을 이용하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는 다중 바이오마커 동시 검출용 키트 및 검출방법이 제공된다.
상기 키트는 도너 스트랜드; 및 서로 프렛쌍을 형성하는 상기 억셉터 형광 물질들을 2종 이상 구비한 억셉터 스트랜드를 포함할 수 있으며, 이때 상기 억셉터 스트랜드 내에서 두 억셉터 형광 물질은 서로 간에 도너와 억셉터 역할을 한다. 그리하여 이 경우의 상기 억셉터 스트랜드를 '프렛 스트랜드'라고 명명하기로 한다.
구체적으로, 도킹 스트랜드 또는 프렛 스트랜드에 표지되는 2종 이상의 형광 물질과 도너 스트랜드에 표지되는 도너(Donor)에 의해 측정되는 프렛효율의 측정값을 이용함으로써 N종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있는 키트 및 검출방법이 제공된다.
상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 기판; N종의 검출항체에 부착되는 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 및 상기 N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드(Donor strand)를 포함한다. 상기 도킹 스트랜드 또는 도너 스트랜드는 형광 물질을 포함한다. 상기 형광 물질에 의한 프렛효율을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 형광 물질이 표지된 프렛 스트랜드(FRET strand)를 더 포함할 수 있다. 상기 프렛 스트랜드는 N종의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
상기 형광 물질은 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 또는 프렛 스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(Donor) 또는 억셉터(Acceptor)로 작용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 포획항체를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출방법은 기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계; 도너 스트랜드(Donor strand)가 상기 N종의 도킹 스트랜드에 각각 결합하는 단계; 및 상기 도킹 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드에 포함되는 형광 물질에 의해 생성되는 프렛효율을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 프렛효율을 이용하여 상기 N종의 바이오마커의 종류를 판별한 후 단위 면적 당 바이오마커 개수로부터 바이오마커 농도를 측정한다.
일 구현예에서, 상기 검출방법은 형광 물질이 표지된 프렛 스트랜드(FRET strand)가 상기 N종의 도킹 스트랜드에 결합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한 상기 프렛 스트랜드는 상기 N종의 도킹 스트랜드에 상보적일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 검출방법은 상기 기판에 포획항체를 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다.
FRET 효율을 이용한 타겟 물질의 검출은 예를 들어 하기와 같은 방식으로 이루어질 수 있다. 도너와 억셉터 사이에 존재하는 염기의 수가 1개라고 할 때 간격을 1이라고 한다면, 도너와 억셉터 사이 간격을 1, 2, 3, … n으로 하는 2종 이상의 프렛쌍(FRET pair)을 제작한다. 상기 제작된 n종의 프렛쌍에 대한 프렛효율을 측정하여 간격에 대한 프렛효율을 데이터베이스화한다. 같은 종류의 검출항체에는 같은 종류의 도킹 스트랜드를 부착하고, 다른 종류의 검출항체에는 다른 종류의 도킹 스트랜드를 부착한다. N종의 프렛쌍은 도킹스트랜드에 직접 표지될 수도 있다. 이후, 바이오마커가 포함된 시료와 반응을 진행하면, 특정 바이오마커는 특정 검출항체와 결합하게 되는데, 이때, 각 분자의 도너와 억셉터가 내는 빛의 세기를 측정하여 프렛효율을 계산한다. 일례로, 도너 1로 작용하는 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드가 상기 도킹 스트랜드에 결합하면, 여기된 도너 1로부터 빛을 흡수한 도너 2와 억셉터로 구성된 프렛쌍에 의해 프렛효율을 측정할 수 있다.
추가적으로, 프렛 스트랜드를 더 포함하는 경우, 프렛쌍은 프렛 스트랜드에 표지되고 도킹 스트랜드에는 표지되지 않는다. 이 경우, 상기 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드가 모두 결합하는 순간에 프렛효율의 측정이 가능하다. 데이터베이스화된 값과 측정한 값을 비교하여, 검출에 사용된 검출항체의 종류를 확인할 수 있으므로, 최종적으로 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
도 19 내지 도 21는 본 명세서에 개시된 기술의 다양한 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
먼저, 도 19를 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드 및 N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질이 표지되어 있고, 도킹 스트랜드에는 도너 2 및 억셉터 형광 물질로 구성된 프렛쌍이 표지되어 있다. 이 경우, 상기 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합하는 순간에 프렛효율의 측정이 가능하다.
일 구현예에서, 상기 키트는 프렛 스트랜드(FRET strand)를 더 포함할 수 있다. 프렛 스트랜드를 사용하는 경우, 일부 형광 물질이 광표백되더라도 광표백되지 않은 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합과 분리를 반복하는 과정을 통해 프렛효율을 측정할 수 있는 장점이 있다.
도 20을 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드, N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드, 특정 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질로, 프렛 스트랜드에는 도너 2 및 억셉터 형광 물질로 구성된 프렛쌍이 표지되어 있다. 이 경우, 상기 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드가 모두 결합하는 순간에 프렛효율의 측정이 가능하다.
도 21을 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드, N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드, 특정 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질이, 프렛 스트랜드에는 도너 2, 도너 3 및 억셉터 형광 물질로 구성된 프렛쌍이 표지되어 있다. 프렛 스트랜드에 2개 이상의 형광 물질을 표지함으로써 최소한의 형광 물질 종류를 이용하여 다종의 바이오마커를 검출할 수 있다.
도 22는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 N종의 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 22를 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드 및 N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 도시되어 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질로, 도킹 스트랜드에는 도너 2 및 억셉터 형광 물질로 구성된 프렛쌍이 표지되어 있다. 검출항체 1에 부착된 도킹 스트랜드에는 낮은 프렛효율을 갖도록 도너 2와 억셉터가 멀게 표지되어 있고, 검출항체 N에 부착된 도킹 스트랜드에는 높은 프렛효율을 갖도록 도너 2와 억셉터 가깝게 표지되어 있다.
상기 키트가 이와 같이 구성되는 이유는, N종의 바이오마커와 결합한 N종의 검출항체의 도킹 스트랜드로부터 동일한 프렛효율이 측정된다면, 검출된 바이오마커의 종류를 특정할 수 없기 때문이다.
따라서, 구분이 가능할 정도의 프렛효율의 측정값을 획득하기 위해서는, 검출하고자 하는 바이오마커의 수만큼 상이한 N종의 도킹 스트랜드 및 N종의 프렛쌍을 이용하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 N종의 도킹 스트랜드에 결합하는 도너 스트랜드는 모두 동일한 종을 이용함이 바람직하다.
구체적으로, 도킹 스트랜드 각각에 직접 2종 이상의 형광 물질이 표지되는 경우, N종의 도킹 스트랜드는, 표지되는 2종 이상의 형광 물질 사이에 존재하는 염기의 수가 상이한 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, N종의 도킹 스트랜드는, 서로 상이한 프렛효율을 가지는 프렛쌍이 표지되는 것일 수 있다. 프렛 스트랜드에 2종 이상의 형광 물질이 표지되는 경우, N종의 프렛 스트랜드는 표지되는 2종 이상의 형광 물질 사이에 존재하는 염기의 수가 상이한 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, N종의 프렛 스트랜드는, 서로 상이한 프렛효율을 가지는 프렛쌍이 표지되는 것일 수 있다. 이때, 상기 도킹 스트랜드 또는 프렛 스트랜드에 표지되는 2종 이상의 형광 물질은 도너 또는 억셉터로 작용할 수 있다.
도 23은 본 명세서에 개시된 기술의 다른 일 구현예에 따른 N종의 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다. 도 23을 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드, N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드, 특정 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질이, 검출항체 1에 부착된 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드 1에는 낮은 프렛효율을 갖도록 도너 2와 억셉터가 멀게 표지되어 있고, 검출항체 N에 부착된 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드 N에는 높은 프렛효율을 갖도록 도너 2와 억셉터가 가깝게 표지되어 있다. 프렛쌍이 도킹 스트랜드가 아닌 프렛 스트랜드에 표지되어 있는 점을 제외하면 도 2와 구성 및 원리는 동일유사하다.
도 24는 본 명세서에 개시된 기술의 다른 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다. 도 24를 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드, N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드, 특정 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 2개의 프렛 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 상기 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질이 표지되어 있고, 검출항체 1에 부착된 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드 1-1및 1-2에는 각각 도너 2와 억셉터 프렛쌍이 표지되어 있으나, 이때, 각각의 프렛쌍은 프렛효율이 상이하도록 표지함이 바람직하다.
또한, 동일한 프렛효율을 갖는 프렛 스트랜드는 동일한 염기서열을 가질 수 있다. 따라서 하나의 프렛 스트랜드는 여러 종의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합할 수 있다. 일례로, 프렛효율 0.25, 0.5, 0.75를 갖는 3종의 프렛 스트랜드를 디자인하고, 바이오마커 1은 프렛효율 0.25와 0.5를 갖고, 바이오마커 2는 프렛효율 0.25와 0.75를 갖고, 바이오마커 3은 프렛효율 0.5와 0.75를 갖도록 디자인할 경우, 프렛효율 0.25의 프렛 스트랜드는 바이오마커 1과 바이오마커 2의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합할 수 있으며, 프렛효율 0.5의 프렛 스트랜드는 바이오마커 1과 바이오마커 3의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합할 수 있고, 프렛효율 0.75의 프렛 스트랜드는 바이오마커 2와 바이오마커 3의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합할 수 있다. 이 경우, N종의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드는 N종 이하일 수 있다.
도 25는 본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다. 도 25를 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드, N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드, 특정 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질이 표지되어 있고, 검출항체 1에 부착된 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드 1에는 도너 2와 억셉터 프렛쌍이 표지되어 있다. 이때, 상기 도킹 스트랜드에는 동일한 도너 스트랜드와 프렛 스트랜드가 상보적으로 결합할 수 있는 결합부위가 2 이상 존재하도록 구성함으로써, 최소 1 이상의 결합부위에 상기 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드가 동시에 결합하는 경우, 프렛효율을 측정할 수 있으므로, 전술한 도 23과 같은 구성에 비해 2배 이상 빠른 분석이 가능하다.
한편, 프렛쌍이 프렛 스트랜드가 아닌 도킹 스트랜드에 표지되는 경우에도 동일한 효과를 얻을 수 있다.
또, 상기 도킹 스트랜드 또는 프렛 스트랜드는 복수의 도너 또는 억셉터가 표지되는 것일 수 있다. 이 경우, 2 이상의 도너는 억셉터와 상이한 종류의 형광 물질이고, 2 이상의 도너는 서로 다른 종류의 형광 물질일 수 있다. 또 다른 경우, 2 이상의 억셉터는 도너와는 상이한 종류의 형광 물질이고, 2 이상의 억셉터는 서로 다른 종류의 형광 물질일 수 있다.
일례로, 하나의 검출항체에 복수의 도킹 스트랜드가 부착될 수 있다. 이때, 부착되는 도킹 스트랜드는 동일종으로서, 각 도킹 스트랜드에 결합하는 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드도 동일하다. 이러한 구성은 도 26에 개략적으로 도시한 바와 같다.
도 26을 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드, N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드, 특정 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 도시되어 있다. 구체적으로는, 하나의 검출항체에는 2 이상의 도킹 스트랜드가 부착될 수 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질이, 검출항체 1에 부착된 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드 1에는 도너 2와 억셉터 프렛쌍이 표지되어 있고, 2 이상의 도킹 스트랜드 중 어느 하나에 도너 스트랜드와 프렛 스트랜드가 동시에 결합하는 경우, 프렛효율을 관측할 수 있어, 전술한 도 23과 같은 구성에 비해 2배 이상 빠른 분석이 가능하다. 즉, 도 26과 같이 구성되는 키트를 이용하는 경우, 도 25와 유사한 효과를 얻을 수 있다. 또한 프렛쌍이 프렛 스트랜드가 아닌 도킹 스트랜드에 표지되는 경우에도 동일한 효과를 얻을 수 있다.
다른 일례로, 도 25 내지 도 26에 나타낸 구성 중 둘 이상을 조합하여 이루어지는 다중 바이오마커 동시 검출용 키트일 수 있으며, 이를 다중 바이오마커 동시 검출에 이용할 수 있다.
또 다른 일례로, 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 도 27에 도시된 바와 같이, 마이크로 RNA를 검출하는 용도로 이용될 수도 있다. 도 27을 보면, 마이크로 RNA를 포함한 DNA, RNA 등의 핵산을 검출하기 위한 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 검출하고자 하는 N종의 핵산의 한쪽 끝에 기판의 코팅물질과 결합친화적인 물질을 부착하거나 각 핵산의 일부분과 상보적인 핵산을 미리 기판에 코팅하여 검출하고자 하는 N종의 핵산을 기판에 고정한다. 검출하고자 하는 N종의 핵산의 염기서열은 정해져 있으므로 이에 상보적인 N종의 도너 스트랜드와 프렛 스트랜드를 이용하여 각 핵산을 판별할 수 있다.
도 28은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 도너 1(Alexa Fluor 488), 도너 2(Cy5) 및 억셉터 (Cy7)의 흡광 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 측정한 데이터를 나타낸 것이다. 도 28의 (a)는 형광 물질들의 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이다. 일례로, (a)의 검은색 세로 점선은 도너 1을 여기하는 데 사용되는 488 nm 파장을 나타낸 것으로서, 이때, 도너 1은 여기되지만, 도너 2와 억셉터는 여기되지 않는다. 이 경우, 도너 2 및 억셉터는 프렛에 의해 도너 1로부터 에너지를 전달받아야만 빛을 낼 수 있으므로, 도너 1이 표지된 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합해야만 프렛쌍의 프렛효율을 측정할 수 있다. 프렛 스트랜드가 이용되는 경우에는 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드가 동시에 도킹 스트랜드에 결합해야 프렛쌍의 프렛효율을 측정할 수 있다.
도 28의 (b)는 형광 물질들의 발광 스펙트럼을 나타낸 것이다. 일례로, (b)의 검은색 세로 점선으로 표시된 파장을 기준으로 광학필터(dichroic mirror)를 이용해 왼쪽 점선과 오른쪽 점선 사이 파장대의 빛의 세기를 합해 도너 2의 밝기를 측정하고, 오른쪽 점선보다 긴 파장대의 빛의 세기를 합해 억셉터의 밝기를 측정함으로써 프렛쌍의 프렛효율을 계산할 수 있다. 이 경우, 도너 1과 도너 2 사이의 프렛효율을 1에 가깝도록 하고 광학필터로 도너 1의 신호를 제거한 후 도너 2와 억셉터의 빛을 세기만을 측정함이 바람직하다.
또한, 추가로 도너 스트랜드에 표지되는 도너 1과 프렛 스트랜드에 표지되는 도너 2 사이의 거리를 조절함으로써, 도너 1과 도너 2 사이의 프렛효율을 조절하고, 도너 1과 도너 2의 빛을 세기를 측정하여 프렛효율을 계산함으로써 다중 바이오마커를 검출할 수 있다.
도 29는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출 원리를 개략적으로 나타낸 것이다.
기판을 바닥으로 하는 웰에 N종의 바이오마커를 부착하고, N종의 도킹 스트랜드가 각각 부착된 N종의 검출항체를 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합시킨 후 도너 스트랜드가 포함된 버퍼(buffer)로 웰을 채우면 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합한다. 이때 발생하는 프렛쌍의 빛의 세기를 측정함으로써 프렛효율을 측정하고, 다중 바이오마커를 판별할 수 있다. 이때, 프렛효율은 광학필터(dichroic mirror)를 이용해 파장대별 빛의 세기를 측정하거나 프리즘(prism)이나 격자(grating)를 이용해 형광 물질들의 상대적인 스펙트럼 크기를 측정함으로써 계산할 수 있다.
도 29는 광학필터(dichroic mirror)를 이용해 도너 2와 억셉터가 방출하는 빛의 세기를 측정하는 방법을 나타낸다.
도 29를 보면, (a)는 기판에 2종의 바이오마커 1과 2가 고정된 상태를 나타낸다. 바이오마커 1에는 도킹 스트랜드 1이 부착된 검출항체 1이 결합해 있으며, 바이오마커 2에는 도킹 스트랜드 2가 부착된 검출항체 2가 결합해 있다. (b)는 도킹 스트랜드 2에 도너 스트랜드가 결합하여 프렛쌍이 빛을 내는 상태를 나타낸다. 이때, 도너 2와 억셉터의 밝기를 측정함으로써 바이오마커 2의 프렛효율을 계산한다. 또, (c)는 도킹 스트랜드 2에서 도너 스트랜드가 분리되어 프렛쌍이 빛을 내지 않는 상태를 나타내며, (d)는 도킹 스트랜드 1에 도너 스트랜드가 결합하여 프렛쌍이 빛을 내는 상태를 나타낸다. 이때, 도너 2와 억셉터의 밝기를 측정함으로써 바이오마커 1의 프렛효율을 계산한다. 이후, (e)는 도킹 스트랜드 1에서 도너 스트랜드가 분리되어 프렛쌍이 빛을 내지 않는 상태를 나타내며, (f)는 도킹 스트랜드 1에 도너 스트랜드가 다시 결합하여 프렛쌍이 빛을 내는 상태를 나타낸다. 이 경우 역시, 도너 2와 억셉터의 밝기를 측정함으로써 바이오마커 1의 프렛효율을 계산한다. 관측영역 내의 모든 바이오마커의 프렛효율을 1회 이상 측정할 때까지 지속한 후 상기 프렛효율을 이용하여 바이오마커의 종류를 판별한 후 단위 면적 당 바이오마커 개수로부터 바이오마커 농도를 측정한다.
도너 스트랜드의 종류(DNA, RNA, PNA 등) 또는 도킹 스트랜드와 결합하는 도너 스트랜드의 길이, 버퍼의 이온 농도 등을 조절함으로써 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합한 후 분리되는 데 걸리는 시간을 제어할 수 있다. 이 시간을 길게함으로써 대부분의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합되어 있도록 함으로써 측정 시간을 줄일 수 있다. 또는 이 시간을 짧게 함으로써 대부분의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합되어 있지 않도록 할 수 있다. 만일, 어느 하나의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 일시적으로 결합해 프렛쌍이 빛을 낼 경우, 그 주변에 존재하는 대부분의 도킹 스트랜드는 빛을 내지 않는 상태이므로 다른 프렛쌍의 간섭없이 프렛효율을 측정할 수 있으므로, 프렛쌍의 위치를 10nm 미만의 높은 정밀도 측정할 수 있다. 또, 이로 인해 한 화면에 많은 수의 바이오마커를 동시에 측정할 수 있어 높은 다이나믹 레인지(dynamic range)를 가진다. 이는, 프렛 스트랜드에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다. 이때, 도너 스트랜드가 분리되는 시간은 수 초 이내로 짧게, 프렛 스트랜드가 분리되는 시간은 수 초 이상으로 길게 함이 바람직하다.
아울러, 도너 스트랜드 또는 프렛 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합하는 속도는 도너 스트랜드 또는 프렛 스트랜드의 농도에 비례하므로 농도를 높일수록 분석 속도를 높일 수 있다.
도 30은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따라 도너 스트랜드의 농도를 달리하여 형광 이미지를 측정한 것이다. 전술한 도 28의 (b)와 같이, 도너 1 스펙트럼의 일부는 도너 2 스펙트럼의 일부와 겹치는 구간이 있으며, 이러한 겹치는 구간이 도너 2의 밝기 측정에 영향을 미친다. 도 30은 도너 2의 밝기를 이미징 카메라를 통해 측정한 화면을 도시한 것으로, 버퍼에 존재하는 도너 스트랜드의 농도가 각각 (a)는 100 nM, (b)는 500 nM, (c)는 1000 nM일 때의 이미지이다. 도 30에 도시된 바와 같이, 도너 스트랜드의 농도가 증가할수록 도너 2 이미지의 배경잡음이 증가하며, 이는 도너 2 밝기 측정의 정확도를 떨어뜨린다. 즉, 도너 스트랜드의 농도가 높아질수록 분석 속도는 증가하나 프렛효율 측정의 정확도 낮아지므로 속도와 정확도 모두를 만족시키기 위해서 버퍼에 포함되는 도너 스트랜드의 농도는 1 nM 내지 1 uM 임이 바람직하다.
또 다른 일례로, 1개의 도킹 스트랜드에 복수의 프렛 스트랜드가 결합하는 경우, 도너 스트랜드는 상기 프렛 스트랜드의 수와 동일한 만큼 결합하는 것일 수 있다. 상기 복수의 프렛 스트랜드에 표지되는 억셉터가 동일한 경우, 표지되는 도너는 서로 동일 또는 상이한 종류를 사용할 수 있으나, 상기 억셉터와는 상이한 종류임이 바람직하다.
구체적으로, 1개의 도킹 스트랜드에 복수의 프렛 스트랜드가 결합하는 경우, 상기 프렛 스트랜드에 표지되는 도너 및 억셉터는 아래의 4가지 경우로 조합되는 것일 수 있다.
i) 복수의 프렛 스트랜드에 표지되는 도너는 서로 동일한 형광 물질이고, 억셉터도 서로 동일한 형광 물질일 수 있다
ii) 복수의 프렛 스트랜드에 표지되는 도너는 서로 상이한 형광 물질이고, 억셉터는 서로 동일한 형광 물질일 수 있다.
iii)
복수의 프렛 스트랜드에 표지되는 도너는 서로 동일한 형광 물질이고, 억셉터는 서로 상이한 형광 물질일 수 있다.
iv) 복수의 프렛 스트랜드에 표지되는 도너는 서로 상이한 형광 물질이고, 억셉터도 서로 상이한 형광 물질일 수 있다.
상기 형광 물질은 스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너 또는 억셉터로 작용하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 도너 또는 억셉터로 작용하는 형광 물질을 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 또는 프렛 스트랜드의 특정 염기 상에 표지하여 프렛효율을 측정하는 것일 수 있다.
또, 본 명세서에 개시된 기술에서 이용되는 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 침, 조직액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 진단의 종류 또는 특성에 따라서 검출이 필요한 바이오마커가 포함되는 것이면 될 뿐, 특별히 한정되는 것은 아니다.
2종 이상의 바이오마커를 검출하는 경우에 있어서, 앞서와 같이 억셉터 신호만 관찰하는 FRET-PAINT 방식에서는 도너 스트랜드를 1종씩 넣어주고 이에 상보적인 도킹 스트랜드를 찾은 후 씻어내는 과정을 N회 반복하므로 전체 측정 시간이 N분 내외로 장시간(1종당 1분 내외, N은 수백~수천) 소요될 수 있다. 또한 수백 nM 농도의 도너 스트랜드를 N회 사용하므로 경제성이 떨어질 수 있다.
하지만 상술한 방법과 같이 염기서열이 아닌 억셉터 스트랜드의 프렛 효율을 이용하여 타겟 물질을 구분하는 방식을 이용할 경우에 동일한 도너 스트랜드를 사용할 수 있어서, 새로운 도너 스트랜드를 넣고 씻어내는 과정이 불필요하여 전체 측정시간이 1분 내외로 감소할 수 있으며, 수백 nM 농도의 도너 스트랜드도 단 1회만 소모하는 장점이 있다.
하나의 억셉터 스트랜드로 구분 가능한 프렛 효율은 10개 내외이므로 구분하고자 하는 타겟의 수에 맞춰 억셉터 스트랜드의 개수를 늘릴 수 있다. 하지만 하나의 억셉터 스트랜드로 구분 가능한 타겟 수가 10개라면, 두 개의 억셉터 스트랜드로 구분 가능한 수는 100개가 아닌 55개가 된다. 이런 식으로 억셉터 스트랜드의 개수가 세 개면 1,000이 아닌 220개, 네 개면 10,000이 아닌 715개가 된다. 그 이유는, 가령 프렛효율 0.1과 0.2로 구성된 타겟1과 프렛효율 0.1과 0.3으로 구성된 타겟2는 서로 구분할 수 있으나, 프렛효율 0.1과 0.2로 구성된 타겟1과 프렛효율 0.2와 0.1으로 구성된 타겟2는 서로 구분할 수 없기 때문이다.
하지만 이 경우에는 공통 도너 스트랜드를 N종 사용함으로써 위의 문제를 해결할 수 있다. 예를 들어 공통 도너 스트랜드를 사용할 경우 프렛 효율 0.1과 0.2로 구성된 타겟1과 프렛 효율 0.2와 0.1로 구성된 타겟2를 구분할 수 없으나, 1차 도너 스트랜드를 넣을 경우 타겟1은 0.1, 타겟2는 0.2가 측정되고, 2차 도너 스트랜드를 넣을 경우 타겟1은 0.2, 타겟2는 0.1이 측정되어 구분 가능할 수 있다. 즉, N종의 공통 도너 스트랜드를 사용하고 단 N회 도너 스트랜드를 넣고 측정 후 세척하는 과정을 반복함으로써 10N개의 타겟 물질을 구분할 수 있다. 예를 들어 N=2일 경우 100, N=3일 경우 1,000, N=4일 경우 10,000 가지 타겟 물질을 구분할 수 있다.
상술한 바에 따르면, 프렛효율을 이용하여 2 종 이상의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있고 적은 양의 시료에 포함된 낮은 농도의 바이오마커 종류를 구별할 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에 개시된 기술은 형광 물질이 표지된 스트랜드가 일시적으로 결합되는 특징이 있다. 그러므로 도너 또는 억셉터로 작용하는 형광 물질이 광표백이 되는 경우에도 결합과 분리를 반복하는 과정에서 광표백 되지 않은 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드 또는 프렛 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합하여 프렛효율을 측정할 수 있어 광표백 현상과 관계없이 N종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있다.
또, 프렛 스트랜드를 이용하는 경우, 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드가 동시에 결합하는 순간에만 프렛 스트랜드 상의 형광 물질이 빛을 내고, 프렛 스트랜드를 이용하지 않는 경우, 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합하는 순간에만 도킹 스트랜드 상의 형광 물질이 빛을 낸다. 그러므로 일시적으로 빛을 내는 형광 물질을 주변 형광 물질의 간섭없이 측정할 수 있어, 해당 형광 물질의 위치를 10nm 미만의 높은 정밀도로 측정할 수 있으며, 이로 인해 한 화면에 많은 수의 바이오마커를 동시에 측정할 수 있는 높은 다이나믹 레인지(dynamic range)를 가진다.
이 후, 일 구현예에 따른 타겟 물질 검출 방법을 이용한 N종의 바이오마커의 검출은 후술할 실시예를 통해 과정을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
한편 본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 서로 다른 종류의 형광 물질 간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별할 수 있는 다중 바이오마커 동시 검출용 키트 및 검출방법이 제공된다.
앞의 기술에 따르면, 서로 다른 억셉터 스트랜드는 동일한 조합의 억셉터 형광물질로 구성되나 억셉터 사이의 거리가 다르므로 각 억셉터 스트랜드의 프렛 효율을 파악함으로써 타겟을 구별한다.
반면 본 측면에 따른 기술에서는 서로 다른 억셉터 스트랜드는 서로 다른 조합의 억셉터 형광물질로 구성되며, 각 억셉터의 종류를 파악함으로써 타겟을 판별할 수 있다. 가령 타겟1이 억셉터1과 억셉터2로 구성되어 있고, 타겟2가 억셉터1과 억셉터5로 구성되어 있으면 타겟1과 타겟2의 각 스펙트럼은 구별되어 관찰된다. 따라서 서로 다른 억셉터들이 동시에 빛을 내도 무방하므로 모든 도너와 억셉터를 도킹 스트랜드상에 표지할 수 있고, 도너를 여기하는 순간 모든 억셉터가 형광신호를 내므로 전체 측정 시간은 수 초에 불과할 정도로 매우 단축될 수 있으며, 도너 스트랜드를 사용하지 않으므로 경제성도 높다.
일 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 기판; 2종 이상의 형광 물질이 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 및 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체를 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 기판; 1종 이상의 형광 물질이 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체; 및 1종 이상의 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드(Donor strand)를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 기판; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체; 1종 이상의 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드(Donor strand); 및 1종 이상의 형광 물질이 표지된 억셉터 스트랜드(Acceptor strand)를 포함한다.
상기 각 구현예에서 상기 형광 물질은 상기 도킹 스트랜드, 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용할 수 있다.
상기 다양한 구현예에 따른 키트를 이용하면 서로 다른 종류의 형광 물질 간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별할 수 있다.
상기 도킹 스트랜드는 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 포획항체를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출방법은 기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계; 및 상기 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함한다. 이때 서로 다른 종류의 형광 물질간 발생하는 프렛(FRET)으로 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별한 후 단위 면적당 바이오마커의 개수로부터 시료 중의 바이오마커의 농도를 측정한다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출 방법은 기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계; 및 상기 N종의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 상보적으로 결합하는 단계; 및 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함한다. 이때 서로 다른 종류의 형광 물질간 발생하는 프렛(FRET)으로 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별한 후 단위 면적당 바이오마커의 개수로부터 시료 중의 바이오마커의 농도를 측정한다.
일 구현예에서, 상기 검출 방법은 도킹 스트랜드에 형광 물질이 표지된 억셉터 스트랜드가 상보적으로 결합하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 검출 방법은 상기 기판에 포획항체를 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상술한 키트 및 검출 방법에 따르면, 도킹 스트랜드에 표지되거나, 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드에 표지되는 2종 이상의 형광 물질의 공명에 의한 프렛을 이용하여 발광 스펙트럼을 측정함으로써 다종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있다.
상기 검출항체는 바이오마커를 항원-항체반응을 이용하여 검출하기 위한 것으로서, 검출대상인 바이오마커의 종류만큼 이종의 것을 사용함이 바람직하다. 또, 검출용 키트의 구성의 간단함을 위해서는 N종의 도킹 스트랜드는 표지되는 도너 또는 억셉터 중 어느 하나는 모두 동일한 것을 이용함이 바람직하다. 구체적으로는, 상기 N종의 도킹 스트랜드에 표지되는 도너가 모두 동일한 경우, 하나의 광원만을 이용하여 추가적인 광원과 광학필터 없이도 각각의 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커 종류를 판별할 수 있다. 보다 구체적으로는, 프렛이 발생하기 위한 조건으로, 도너의 발광 스펙트럼과 억셉터의 흡광 스펙트럼 사이에 겹침(Overlap)현상이 일어날 수 있도록, 억셉터로 작용하는 형광 물질의 흡광 스펙트럼과 소정의 파장범위가 겹치는 발광 스펙트럼을 가지는 형광 물질을 도너로 이용함이 바람직하다.
일례로, 도 31에 도시된 바와 같이, 검출항체1 내지 N에는 각각 동일한 도너가 표지된 도킹 스트랜드가 결합되고, 각각의 도킹 스트랜드에는 각각 억셉터1 내지 N이 표지되는 경우, 광원을 여기시키는 도너는 모두 동일하므로 최초에 조사되는 광원은 1종류만 필요하고, 억셉터로 작용하는 형광 물질의 종류에 따라 방출하는 빛의 스펙트럼이 각기 다르게 측정되므로, 측정된 빛의 스펙트럼을 확인함으로써 억셉터의 종류를 확인할 수 있다. 검출항체N에 결합된 도킹 스트랜드N에는 억셉터N을 표지함으로써 확인된 억셉터가 표지된 검출항체 및 이와 친화적으로 결합하는 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
또, 도 32에 도시된 바와 같이, 검출항체 1 내지 N 각각에 결합하는 도킹 스트랜드에 동일한 도너 및 동일한 억셉터가 표지될 수 있다. 이때, 각각의 도너와 억셉터 사이의 거리는 도 32의 (a), (b), (c)와 같이 상이한 것을 이용함으로써, 오른쪽 그래프와 같이 프렛효율에 따른 스펙트럼의 차이를 이용하여 다중 바이오마커를 동시에 검출할 수도 있다.
또는, 도 33에 도시된 바와 같이, 검출항체 각각에 결합하는 도킹 스트랜드에 동일한 억셉터와 2종 이상의 도너가 각각 표지될 수도 있다. 이 경우, 도 33의 오른쪽 그래프와 같이, 도너로 작용하는 2종의 형광 물질의 흡광 스펙트럼(점선)이 겹치고 있으므로, 하나의 광원으로 2종의 형광 물질을 모두 여기시키는 동시에 발광 스펙트럼(실선)이 명확하게 구분될 수 있으므로, 모두 동일한 도너를 이용한 도 31 또는 도 32의 경우에 비해, 검출 가능한 바이오마커의 종류가 더 많아지는 장점이 있다.
다른 일례로, 도 34a 내지 도 34c에 도시된 바와 같이, 검출항체 각각에 결합하는 도킹 스트랜드에 동일한 도너가 표지되고, 2종 이상의 억셉터가 표지될 수도 있다.
이때, 표지되는 2종 이상의 억셉터는 도 34a와 같이, 억셉터끼리 인접하여 억셉터-억셉터 프렛쌍을 형성할 수 있으며, 혹은, 도 34b와 같이, 각각 도너와 인접하여 도너-억셉터 프렛쌍을 형성할 수도 있다. 억셉터-억셉터 프렛쌍을 형성하는 경우, 표지되는 억셉터 사이의 거리를 조절하여 바이오마커의 종류를 판별할 수도 있다. 도 34c는 1종의 도너와 5종의 억셉터를 이용하여, 도 34a와 같이 도킹 스트랜드 상에 억셉터-억셉터 프렛쌍을 표지하여 다중 검출을 실시한 결과를 나타낸 것으로 아래쪽부터 (억셉터1, 억셉터2), (억셉터1, 억셉터3), (억셉터1, 억셉터4), (억셉터1, 억셉터5), (억셉터2, 억셉터3), (억셉터2, 억셉터4), (억셉터2, 억셉터5), (억셉터3, 억셉터4), (억셉터3, 억셉터5), (억셉터4, 억셉터5)로 프렛쌍이 구성된 도킹 스트랜드로부터 방출된 빛의 스펙트럼을 측정한 것을 그래프로 나타낸 것이다. 즉, 측정된 스펙트럼을 이용하여 도킹 스트랜드의 종류를 명확히 구분할 수 있으므로, 각각의 도킹 스트랜드에 이용된 억셉터-억셉터 프렛쌍의 종류를 확인함으로써 검출된 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
전술한 바와 같이 구성되는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트의 구성 중 어느 하나 또는 적어도 2 이상을 조합한 구성을 이용하여 다중 검출함으로써 약 1,000여종 이상의 바이오마커 종류를 판별할 수 있다.
또한, 하나의 도킹 스트랜드 상에 구성이 동일한 형광 물질 조합을 2 이상 반복함으로써 검출되는 신호의 강도를 증가시킬 수 있다.
도 35a 및 도 35b는 본 명세서에 개시된 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출 방법을 예시적으로 나타낸 것으로, 검출하고자 하는 N종의 바이오마커와 특이적으로 결합하는 N종의 검출항체 각각에 상이한 발광 스펙트럼을 갖는 N종의 도킹 스트랜드를 결합시켜, 상기 발광 스펙트럼을 측정함으로써 바이오마커의 종류를 판별할 수 있다.
먼저, 기판에 바이오마커를 고정한 뒤, 각 바이오마커와 검출항체를 결합시킨다. 이때, 기판에는 포획항체가 부착되는 단계가 먼저 수행될 수 있으며, 이 경우, N종의 포획항체 각각은 N종의 바이오마커와 특이적으로 결합하는 것을 이용함이 바람직하다. 그러나, 이는 하나의 예일 뿐, 상황에 따라서 바이오마커는 기판에 직접 부착될 수도 있다. 이는 측정 과정의 속도, 경제성 및 편의성을 위한 것이며, 필요에 따라, 측정 결과의 정확성을 높이기 위해 기판에 부착된 포획항체와의 항원-항체 반응을 통해 바이오마커를 검출할 수도 있다.
따라서, 상기 키트에 포함된 기판은, 바이오마커 검출시에, 바이오마커가 직접 기판의 표면에 부착되거나 바이오마커를 포획할 수 있는 포획항체를 부착할 수 있도록 표면이 처리가 된 것일 수 있다. 검출과정에 부착되는 경우, 기판으로서 포획항체와 결합특이적인 물질이 코팅된 것을 이용함이 바람직하다. 구체적으로는, 포획항체에는 특이적이면서, 검출항체 또는 스트랜드와는 비특이적인 물질을 도포하여 기판에 코팅함이 바람직하다.
포획항체를 기판에 흡착시키는 방법은, 예를 들면, pH 9.5인 0.06M의 탄산염 완충용액 또는 중탄산염 완충용액으로 상기 포획항체를 희석시키고, 그 희석액을 일정 온도에서 기판에 소정의 시간동안 접촉시킴으로써 흡착시키는 것일 수 있다. 또는 기판 표면을 바이오틴(biotin)이 결합된 PEG(polyethylene glycol) 또는 BSA(bovine serum albumin)로 코팅하고, 스트렙타비딘(streptavidin)을 결합시킨 후 여기에 바이오틴이 결합된 포획항체를 결합시킴으로써 흡착시키는 것일 수 있다. 이후, 기판에 흡착된 포획항체는 기판에 시료 또는 가공된 시료를 처리하게 되면, 시료에 포함된 바이오마커와 결합체를 형성하게 된다. 추가적으로, 결합체의 형성 이후에는, 비특이적으로 결합된 항체를 제거하거나 오염물질 등을 제거하기 위한 목적으로 TWEEN 20, Triton X-100 등이 포함된 세척 완충액으로 세척함이 바람직할 수 있다.
전술한 바와 같이, 포획항체 또는 기판에 도포된 물질에 의해 N종의 바이오마커를 기판에 고정시킨 뒤, 상기 바이오마커에 검출항체를 결합시킨다. 이후, 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하고 기 측정한 발광 스펙트럼 데이터베이스를 비교하여 해당 바이오마커를 판별한 뒤, 화면에 나타난 단위 면적당 바이오마커의 개수를 기 측정한 농도별 단위 면적당 개수와 비교함으로써 바이오마커의 농도를 측정할 수 있다. 가령, 광원을 조사하여 도너를 여기시키면, 도 35a와 같이 화면에 각 분자의 발광 스펙트럼이 나타나게 되는데, 이를 기 측정한 발광 스펙트럼 데이터베이스(A, B, C 등)와 비교하여 화면에 나타난 각 분자가 어떤 바이오마커인지 판별할 수 있다(ex: 스펙트럼의 형태가 A면 바이오마커 1, B면 바이오마커 2, C면 바이오마커 3). 이후, 각 바이오마커별 단위 면적당 개수를 측정하고 기 측정한 농도별 단위 면적당 개수와 비교함으로써 시료에 포함된 각 바이오마커의 농도를 측정할 수 있다. 일례로 바이오마커 1의 경우 기 측정한 농도별 단위 면적당 개수가 1 ng/ml당 10이고, 측정 결과 단위 면적당 개수가 5라면 시료에 포함된 바이오마커 1의 농도는 0.5 ng/ml임을 알 수 있다.
도 35b는 발광 스펙트럼을 측정하는 다양한 방법 중 하나를 예시적으로 나타낸 것이다. 일례로, 통상의 현미경을 이용해 다양한 종류의 형광 물질을 관측하는 경우, 발광 스펙트럼과 무관하게 왼쪽 그림과 같이 원형의 점 확산 함수(point spread function; PSF)을 갖는다. 하지만 광로(optical path) 상에 프리즘(prism)이나 격자(grating) 등 파장에 따른 광로 차를 유발하는 광학부품을 사용함으로써 각 형광 물질의 점 확산 함수를 원에서 타원 형태로 바꿀 수 있으며, 본래 원의 중심과 타원의 중심을 비교하고, 타원의 장축 방향의 프로파일을 분석함으로써 발광 스펙트럼을 측정할 수 있고, 이를 기 측정한 발광 스펙트럼 데이터베이스와 비교함으로써 해당 분자가 어떤 형광 물질로 구성되어 있는지 알아낼 수 있다("Ultrahigh-throughput single-molecule spectroscopy and spectrally resolved super-resolution microscopy", Zhengyang Zhang, Samuel J Kenny, Margaret Hauser, Wan Li & Ke Xu, Nature Methods volume 12(2015), pages 935-938 참조).
일 구현예에서, 검출항체에 부착된 도킹 스트랜드는 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합할 수도 있다.
이 경우, 상기 도너 스트랜드에는 도너가 표지되며, 억셉터 스트랜드는 1종 이상의 억셉터 또는 억셉터-억셉터 프렛쌍이 표지된다. 이때, 도 36a에 도시된 바와 같이 상기 도킹 스트랜드에 직접 2종 이상의 억셉터가 표지되는 경우, 표지된 부분에 인접한 부위에 도너 스트랜드가 상보적으로 결합할 수 있으며, 결합하는 순간, 프렛이 발생하여 억셉터가 발광할 수 있다. 만일, 도 36b와 같이 도킹 스트랜드에 별도의 형광 물질이 표지되지 않는 경우라면, 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드는 상기 도킹 스트랜드에 결합과 분리를 반복하므로, 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드가 동시에 결합하는 순간에만 억셉터가 발광함으로써 발광 스펙트럼을 측정할 수 있다. 이러한 이유로, 광표백되는 형광 물질이 발생하는 경우라도 소정의 반응시간이 주어진다면 광표백되지 않은 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합하는 순간에 발광 스펙트럼을 측정할 수 있다는 장점이 있다. 또, 동시에 결합하는 순간에 측정하여 기록할 수 있으므로, 검출대상인 바이오마커의 종류가 많아질수록 하나의 화면에 여러 종류의 이미지가 동시에 출력되어 분별이 어려워지는 문제점을 해결할 수 있다.
도 37은 상기 도 36b와 같이 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 포함되는 검출용 키트를 이용하여 바이오마커의 종류를 판별하는 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
먼저, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류가 N종이라면, N종의 도킹 스트랜드와 이에 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 디자인하고 각각의 발광 스펙트럼을 미리 측정하여 데이터베이스를 제작한다. 이때, 바이오마커 1 내지 N에는 검출항체1 내지 N이 각각 결합하고, 검출항체 1 내지 N 각각에는 도킹 스트랜드 1내지 N이 부착된다.
데이터베이스의 기록이 끝나면, 기판에 바이오마커를 고정시킨 뒤, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류에 적합한 도킹스트랜드를 이용하여 다음과 같이 바이오마커의 판별을 수행한다. 각각의 바이오마커에 검출항체를 결합시킨 뒤, 미리 제작된 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 넣고 소정시간동안 결합과 분리가 반복되도록 한다. 이때, 1개의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 동시에 결합할 경우, 도 37과 같이 화면상에 신호가 나타되고, 해당 신호의 스펙트럼을 분석하여 앞서 기록된 데이터베이스와 비교함으로써 바이오마커 종류를 판별할 수 있다. 매 화면마다 신호가 검출된 위치를 누적하여 표시하고, 하나의 바이오마커 분자에 의해 중복하여 발생하는 신호는 특정 위치를 중심으로 가우스 함수(Gaussian function) 형태의 군집을 이루게 되고, 하나의 군집을 하나의 바이오마커 분자로 간주하여 단위 면적당 바이오마커의 개수를 산출하고, 기 측정된 농도별 단위 면적당 개수와 비교함으로써 시료에 포함된 바이오마커의 농도를 측정할 수 있다.
또한, 도 31 내지 도 34에 도시된 구성 중 어느 하나 또는 적어도 2 이상을 조합한 구성에 대하여, 도너를 도너 스트랜드에 표지하고, 억셉터를 도킹 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드에 표지함으로써 상기와 같은 방법으로 약 1,000여종 이상의 바이오마커 종류를 판별할 수 있다. 가령, 도 38a와 같이 하나의 도킹 스트랜드에 복수의 도너 스트랜드 및 복수의 억셉터 스트랜드가 상보적으로 결합할 수도 있다. 이러한 조합은, 도 36b와 같은 구성으로 검출하는 바이오마커의 종류는 동일하나, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합하는 부위가 2 이상 존재하고 있어, 어느 하나의 부위라도 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합하면 발광 스펙트럼을 측정할 수 있다. 따라서, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 결합과 분리가 반복되는 동안 결합이 되는 확률을 높일 수 있어, 검출속도가 2배 이상 빨라진다는 장점이 있다.
이 경우, 상기 복수의 도너 스트랜드는 서로 상이한 도너가 표지되어 있을 수 있다. 이때, 상기 복수의 도너 스트랜드 각각은 서로 상이한 프렛효율을 갖기위해, 인접하는 억셉터 또는 억셉터-억셉터 프렛쌍과의 거리가 상이하도록 도너가 표지된 것일 수 있으며, 상기 억셉터 또는 억셉터-억셉터 프렛쌍은 서로 상이한 형광 물질로 구성될 수 있다. 또, 상기 복수의 억셉터 또는 억셉터-억셉터 프렛쌍은 도너와 서로 상이한 프렛효율을 갖도록 상기 도너와의 거리가 상이하도록 표지될 수 있으며, 상기 억셉터-억셉터 프렛쌍은 서로 상이한 프렛효율을 갖도록 억셉터간 거리가 상이하도록 표지되어 있을 수 있다.
도 38a와 유사한 효과를 야기시키는 방안으로, 도 38b 와 같이 하나의 검출항체에 동일한 구성을 가지는 도킹 스트랜드를 부착시켜 바이오마커의 검출속도를 높일 수도 있다.
또, 도 38a와 도 38b의 구성을 조합하여, 복수의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 상보적으로 결합할 수 있는 도킹 스트랜드를 하나의 검출항체에 2이상 부착시켜 바이오마커의 검출속도를 더 높일 수도 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 도 39에 도시된 바와 같이, 마이크로 RNA를 검출하는 용도로 이용될 수도 있다.
도 39를 보면, 마이크로 RNA를 포함한 DNA, RNA 등의 핵산을 검출하기 위한 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 검출하고자 하는 N종의 핵산의 한쪽 끝에 기판의 코팅물질과 결합친화적인 물질을 부착하거나 각 핵산의 일부분과 상보적인 핵산을 미리 기판에 코팅하여 검출하고자 하는 N종의 핵산을 기판에 고정한다. 검출하고자 하는 N종의 핵산의 염기서열은 정해져 있으므로 이에 상보적인 N종의 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용하여 각 핵산을 판별할 수 있다.
앞서 언급한, 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드로서, 바람직하게는, DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA, TNA와 같은 핵산 또는 이의 유사체를 이용할 수 있다. 추가적으로, 도 31 내지 도 34와 같이 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 별도로 사용하지 않는 경우, 상기 도킹 스트랜드는 폴리펩티드 또는 탄수화물일 수도 있다.
이때, 도너 또는 억셉터의 빛의 세기는 도너와 억셉터 간의 거리에 따라 영향을 받을 수도 있으나, 도너와 억셉터를 원하는 특정 염기, 3'- 또는 5'-말단, 또는 기본골격 상에 표지하여 도너와 억셉터 혹은 억셉터와 억셉터 사이의 거리를 조절함으로써, 다른 프렛효율을 가지는 도킹 스트랜드를 제작할 수 있다.
예를 들어, N종의 도킹 스트랜드에 서로 다른 프렛효율을 가지는 형광 물질을 표지하고, 각 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 미리 측정하여 데이터베이스를 측정한 뒤, 바이오마커 검출을 위한 반응 시에 생성되는 발광 스펙트럼과 비교함으로써, 반응한 바이오마커의 종류를 검출할 수 있다. 이때, 서로 다른 프렛효율을 가지는 형광 물질은 (도너1, 억셉터1), (도너1, 억셉터2), …, (도너1, 억셉터N)과 같이 구성될 수 있고, (도너1, 억셉터1), (도너2, 억셉터1), …, (도너 N, 억셉터1)과 같이 구성될 수 있다. 혹은, 동일한 도너가 표지된 도킹 스트랜드에 (억셉터1, 억셉터2), (억셉터1, 억셉터3), (억셉터2, 억셉터3), … 등과 같이 2종 이상의 상이한 억셉터로 구성될 수도 있다.
상술한 서로 다른 프렛효율을 가지는 형광 물질의 구성은 일부를 예시적으로 나타낸 것으로, 검출시 판별이 가능한 정도의 프렛효율의 차이가 있는 구성이면 특별히 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 타겟 물질 검출 방법은, N종의 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하여 데이터베이스를 제작하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 검출을 위한 반응을 진행하기 전 단계로, 전술한 구성 중 어느 하나 이상을 포함하는 도킹 스트랜드를 디자인하여 각 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하여 데이터베이스로 기록함으로써 반응시 측정되는 값과 비교하여, 검출에 사용된 검출항체의 종류를 확인할 수 있으므로, 최종적으로 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
N종의 바이오마커를 검출함에 있어서, 발광 스펙트럼은 동시 또는 순차적으로 측정할 수 있다. 가령, 3종의 바이오마커를 검출하는 경우, 검출항체 1, 2, 3에 부착되는 도킹 스트랜드 1, 2, 3에 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드는 도킹 스트랜드 1, 2, 3에 동시에 결합할 수도 있고, 순차적으로 결합할 수도 있다. 도킹 스트랜드에 직접 억셉터가 표지되는 경우라면, 도너 스트랜드가 일시적으로 결합하는 순간에만 발광 스펙트럼을 측정할 수 있다. 만일, 억셉터 스트랜드 1, 2, 3을 추가로 이용하는 경우라면, 상기 도킹 스트랜드 1, 2, 3에 억셉터 스트랜드 1, 2, 3이 각기 동시 또는 순차적으로 결합과 분리를 반복하는 동안, 상기 도너 스트랜드가 어느 하나의 도킹 스트랜드에 동시에 결합하는 순간에만 발광 스펙트럼이 측정 가능하다. 다시 말하면, 도킹 스트랜드 1에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드 1이 동시에 결합하는 순간에는 도킹 스트랜드 1의 발광 스펙트럼을 측정할 수 있으나, 도킹 스트랜드 1에 억셉터 스트랜드1이 결합하는 순간, 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드 2 또는 3에만 결합하는 경우라면 도킹 스트랜드 1의 발광 스펙트럼은 측정할 수 없다. 즉, N종의 바이오마커를 검출하기 위한 발광 스펙트럼의 측정은 동시 또는 순차적으로 가능하며, 측정된 값들을 기측정된 데이터베이스와 비교함으로써, 최종적으로는 N종의 바이오마커를 동시에 판별할 수 있다.
상술한 바에 따르면, 프렛을 이용하여 N 종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있고, 적은 양의 시료에 포함된 낮은 농도의 바이오마커 종류를 구별할 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에 개시된 기술은 인접한 2종 이상의 형광 물질 간에 발생하는 에너지 공명현상을 이용하여 형광 물질이 표지된 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정함으로써 바이오마커의 종류를 판별할 수 있다. 또, 도너로 작용하는 형광 물질을 모두 동일하게 표지하여 하나의 광원으로 다수 개의 바이오마커 종류를 판별할 수 있어, 추가적인 광원과 광학필터를 요하지 않아 간단한 구성을 가지며, 추가적인 광학필터에 의한 측정에 필요한 발광 스펙트럼의 손실이 방지되는 장점이 있다.
더욱이, 도너 및 억셉터가 표지된 스트랜드가 일시적으로 결합되는 특징이 있으므로, 도너 또는 억셉터로 작용하는 형광 물질이 광표백이 되는 경우에도, 결합과 분리를 반복하는 과정에서 광표백되지 않은 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드(Donor strand) 또는 억셉터 스트랜드(Acceptor strand)가 도킹 스트랜드(Docking strand)에 결합하는 순간에 발광 스펙트럼을 측정함으로써 광표백 현상과 관계없이 N종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있다. 또한, 일시적으로 빛을 내는 형광 물질을 주변 형광 물질의 간섭 없이 측정할 수 있어, 해당 형광 물질의 위치를 10nm 미만의 높은 정밀도 측정할 수 있어 높은 다이나믹 레인지(dynamic range)를 가진다.
이 후, 일 구현예에 따른 타겟 물질 검출 방법을 이용한 N종의 바이오마커의 검출은 후술할 실시예를 통해 과정을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
[실시예]
1. 서로 다른 염기서열을 갖는 도너 스트랜드를 이용한 바이오마커 다중검출
실험방법
1) 시약 및 재료의 준비
변형된 DNA 올리고뉴클레오티드(Modified DNA oligonucleotides)는 Integrated DNA Technologies에서 구입하였고, Alexa 488(Alexa Fluor 488 NHS Ester, catalog number: A20000)은 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였다. Cy3(Cy3 NHS Ester, catalog number: PA13101) 및 Cy5(Cy5 NHS Ester, catalog number: PA15101)는 GE Healthcare Life Sciences에서 구입하였고, COS-7 세포는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)에서 구입하였다. 항-튜블린 항체(Anti-tubulin antibody; catalog number: ab6160)는 Abcam에서 구입하였고, 항-Tom20 항체(Anti-Tom20 antibody; sc-11415)는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였으며, 당나귀 항-토끼 IgG 항체(Donkey anti-rabbit IgG antibody; catalog number: 711-005-152) 및 당나귀 항-랫 IgG 항체(donkey anti-rat IgG antibody; catalog number: 712-005-153)는 Jackson ImmunoResearch Laboratories에서 구입하였다. 카르복실 라텍스 비드(Carboxyl latex beads; catalog number: C37281)는 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였고, 파라포름알데히드(Paraformaldehyde; catalog number: 1.04005.1000)는 Merck에서 구입하였고, 글루타알데히드(Glutaraldehyde; catalog number: G5882), 트리톤 X-100(Triton X-100; catalog number: T9284) 및 BSA(Bovine Serum Albumin; catalog number: A4919)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 여기서 사용한 도킹 스트랜드는 항체-올리고뉴클레오티드 올인원 접합 키트(Antibody-Oligonucleotide All-in-One Conjugation Kit; catalog number: A-9202-001)를 사용하여 2차 항체에 접합하였으며, 상기 키트는 Solulink에서 구입하였다.
2) DNA 형광표지
아민으로 변형된 DNA 올리고뉴클레오티드는 NHS 에스테르 화학 그룹을 갖는 형광 물질로 표지하였다. 먼저 1 mM DNA 5 ㎕를 100 mM 소듐 테트라 보레이트 완충액(pH 8.5) 25 ㎕와 혼합하였고, DMSO에 용해된 20 mM 형광 물질 5 ㎕를 첨가한 뒤, 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 그 다음 265 ㎕의 증류수, 900㎕의 에탄올 및 30㎕의 3M 아세트산나트륨 pH 5.2)을 첨가하여 혼합하였다. 혼합물을 -20℃에서 1 시간 동안 배양한 뒤, 2시간 동안 원심분리하였다. 그 다음, 상층액을 버리고 DNA 펠릿을 차가운 에탄올로 세척하였다. 에탄올이 완전히 건조시킨 후, DNA 펠릿을 50 ㎕의 증류수에 재현탁 시키고 형광 표지 효율을 측정하였다.
3) 세포배양 및 고정
DNA-PAINT 이미징의 표류 보정을 위해 유리 커버 슬립을 카복시 라텍스 비즈로 코팅하였다.
커버 슬립을 비드 용액 1:10으로 증류수로 희석하고, 100℃의 핫 플레이트에서 10 분동안 가열한 후 증류수로 씻어준 다음, N2 가스를 이용하여 건조시켰다. COS-7 세포를 비드로 코팅된 커버 슬립에서 성장시킨 다음 10분 동안 고정시켰다. 그 다음 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 이용하여 미세소관(microtubule)을 관찰하였고, 3% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)와 0.1% 글루타르알데히드를 PBS 버퍼에 용해시킨 혼합물을 사용하여 미세소관과 미토콘드리아를 관찰하였다. 그 다음 고정 샘플은 사용전까지 PBS 버퍼에 4℃에서 보관하였다.
4) 면역염색법
커버 슬립에서 세포를 배양하여 고정한 뒤, 미세소관을 차단 용액(PBS 버퍼에 5% BSA 및 0.25 % Triton X-100 함유)에 1:100으로 희석시킨 항-미세소관 항체(anti-tubulin antibody)를 처리한 뒤. 4℃에서 밤새 배양한 다음. 면역염색을 실시하였다. PBS 버퍼로 자유 항-미세소관 항체(free anti-tubulin antibody)을 완전히 세척하였고, 세포에 도킹 스트랜드(Docking_P1)가 접합된 100 nM 2차 항체를 처리하여 1 시간 동안 항온 배양하였다. 미토콘드리아는 1:100으로 희석된 항-Tom20 항체를 처리한 뒤, 4℃에서 밤새 배양한 다음 면역 염색을 실시하였다, 그 다음 PBS 버퍼로 자유 항-Tom20 항체(free anti-Tom20 antibody)를 세척하였고, 세포를 도킹 스트랜드(Docking_P2)가 접합된 100 nM 2차 항체를 처리하여 1 시간 동안 항온 배양하였다.
5) 단일-분자 이미징
단일-분자 이미징의 경우, 프리즘-형 TIRF(total internal reflection fluorescence) 현미경 검사법과 고도로 경사지고 적층 된 광학 시트 (HILO) 현미경 검사법을 사용하였다. 상기 현미경은 상업용의 거꾸로 된 현미경(IX71, Olympus)을 수정하고 100X 1.4 NA 유면 대물 렌즈(UPlanSApo, Olympus)를 장착하여 제작하였다.
스트렙타비딘(streptavidin)-비오틴(biotin) 상호작용을 이용하여 중합체-코팅된 석영 슬라이드(polymer-coated quartz slide) 표면에 도킹 스트랜드를 고정시키고, 도너 및 억셉터 스트랜드를 이미징 채널에 첨가하였다. Alexa488, Cy3 및 Cy5는 각각 청색 레이저(473nm, 100mW, MBL-III-473-100 mW, CNI), 녹색 레이저(532nm, 50mW, Compass 215M-50, Coherent) 및 적색 레이저 (642nm, 60mW, Excelsior-642-60, Spectra-Physics)를 사용하여 확인하였다. Cy3 신호는 640dcxr 다이크로익 미러(dichroic mirror; Chroma)를 사용하여 필터링하였고, Cy5 신호는 740dcxr 다이크로익 미러(Chroma)를 사용하여 필터링하였다. 단일분자 이미지는 EMCCD(electron multiplying charge coupled device) 카메라 (iXon Ultra DU-897U-CS0-#BV, Andor)를 사용하여 10Hz의 프레임 속도로 기록하였다.
6) FRET 쌍 특성
도 1d에서 프레임 당 검출된 광자(photon)를 평가하기 위하여, 2nt, 4nt, 6nt 및 11nt Cy3-Cy5(Alexa488-Cy5) FRET 쌍(FRET pair)에 대하여 각각 13997(8096), 11021(5100), 11208(3451), 및 17051(3980) 단일분자 스팟(single-molecule spot)을 수득하였다. 도 1j-1k에서 SNR을 특징짓기 위하여, Cy3, Cy3-Cy5 쌍 및 Alexa 488-Cy5 쌍은 각각 795, 2322 및 742 단일분자 스팟(single-molecule spot)을 수득하였다
7) 드리프트 보정(Drift correction)
DNA-PAINT를 이용한 초 고해상도 이미징을 위해 이미지 상관법을 기반으로 하는 자동 집계 및 드리프트 보정 시스템을 사용하였다. 촬영 전, 하나의 in-focus 밝은 필드 이미지 및 두 개의 out-of-focus 이미지를 촬영하였다. 이 세 개의 참조 이미지는 x, y 및 z 축 드리프트를 추적하는 데 사용되었다. 피에조 스테이지(piezo stage; PZ-2000, Applied Scientific Instrumentation)를 사용하여 z 방향의 드리프트를 실시간으로 보정한 반면, xy 평면의 드리프트는 이미지 분석하는 동안에 보정하였다.
실시예 1-1: FRET-PAINT 특성 확인
표면에 고정된 DNA 스트랜드 및 TIRF 현미경을 사용하여 FRET-PAINT가 현미경으로 검사가 가능한지 여부를 확인하였다.
도 1a 내지 도 1k는 FRET-PAINT의 원리와 특성을 나타낸 것이다.
도 1a는 FRET-PAINT의 특성화에 사용된 도킹 스트랜드(검정), 도너 스트랜드(파랑) 및 억셉터 스트랜드(빨강)를 나타낸 것이고, 도 1b는 FRET-PAINT의 모식도를 나타낸 것이다. 도 1c는 대표적인 Cy5 형광 신호 강도를 시간에 따라 나타낸 것이다(1000 nM Donor_P1_Alexa488 및 100 nM Acceptor_P11_Cy5). 도 1d는 Cy3-Cy5 및 Alexa488-Cy5 쌍에 대한 도너(donor)-억셉터(acceptor) 거리에 따른 억셉터의 밝기를 나타낸 것이다.
도 1e는 억셉터_P11_Cy3의 표시된 농도에서 표면을 고정시킨 도킹 스트랜드(Docking_P0)의 DNA-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 1f는 10nM에서 고정된 Acceptor_P6_Cy5와 Donor_P1_Cy3의 표시된 농도에서 도킹_P0(Docking_P0)의FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 1g는 10nM에서 고정된 Donor_P1_Cy3와 함께 Acceptor_P6_Cy5의 표시된 농도에서 도킹_P0(Docking_P0)의 FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 1h는 10nM에서 고정된 Acceptor_P2_Cy5와 함께 Donor_P1_Alexa488의 표시된 농도에서 도킹_P0(Docking_P0)의 FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 1i는 10nM에서 고정된 Donor_P1_Alexa488과 함께 Acceptor_P2_Cy5의 표시된 농도에서 도킹_P0(Docking_P0)의 FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다(Scale bar: 1㎛).
도 1j는 Cy3 이미저(Cy3 imager) 스트랜드를 사용한 DNA-PAINT, Cy3 도너(Cy3 donor) 스트랜드를 사용한 FRET-PAINT 및 Cy3 억셉터(Cy3 acceptor) 스트랜드를 사용한 FRET-PAINT의 각 스트랜드 농도별 SNR 값을 비교한 것이다. 도 1k는 Cy3 이미저(Cy3 imager) 스트랜드를 사용한 DNA-PAINT, Alexa488 도너(donor) 스트랜드를 사용한 FRET-PAINT 및 Cy5 억셉터(acceptor) 스트랜드를 사용한 FRET-PAINT의 각 스트랜드 농도별 SNR 값을 비교한 것이다.
도 1a에 나타난 바와 같이, FRET-PAINT는 3개의 DNA 스트랜드(도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드)를 사용하였다. 도킹 스트랜드(Docking_P0)에는 5'말단에 바이오틴(biotin)이 붙어있고, 각각 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드인 두 개의 도킹 사이트가 있다. 여기서는 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합시 도킹 스트랜드에 억셉터 스트랜드가 이미 결합해 있어 도너에서 억셉터로 FRET이 일어날 확률을 증가시키기 위해 상대적으로 긴 억셉터 스트랜드를 사용한 반면, 억셉터 스트랜드보다 짧은 길이의 도너 스트랜드를 선택하였다. 또한, 도너 스트랜드는 3' 말단에 Alexa488(Donor_P1_Alexa488)을 표지한 반면, 억셉터 스트랜드는 3' 말단에 Cy5(Acceptor_P11_Cy5)로 표지하였다.
각 스트랜드의 염기서열은 다음과 같다.
Docking_P0 = 5'-Biotin-TTGATCTACATATTCTTCATTA-3'(서열번호 1)
Donor_P1_Cy3 = 5'-TAATGAAGA-Cy3-3'(서열번호 2)
Donor_P1_Alexa488 = 5'-TAATGAAGA-Alexa488-3'(서열번호 2)
Acceptor_P2_Cy5 = 5'-Cy5-TATGTAGATC-3'(서열번호 3)
Acceptor_P6_Cy5 = 5'-TATG-Cy5-TAGATC-3' (서열번호 3)
Acceptor_P11_Cy5 = 5'-TATGTAGATC-Cy5-3'(서열번호 3)
그 다음, 스트렙타비딘-바이오틴(streptavidin - biotin) 상호작용을 이용하여 중합체-코팅된 석영(quartz) 표면에 도킹 스트랜드를 고정시켰다. 그 다음 도너 스트랜드(1000 nM) 및 억셉터 스트랜드(100 nM)를 주입 한 후, 블루 레이저를 사용하여 반응시킨 Alexa488에 의해 Cy5의 단일 분자 이미지를 촬영하였다(도 1b).
그 결과 도 1c에 나타난 바와 같이, 높은 도너 및 억셉터 농도에서 시간에 따른 Cy5 형광 강도가 명확하게 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 2개의 FRET 쌍(Cy3-Cy5 및 Alexa488-Cy5)에 대하여 최대의 FRET 신호를 주는 FRET 프로브의 위치를 찾기 위하여 Cy3 (Donor_P1_Cy3)가 3'말단에 표지된 억셉터 스트랜드, Alex488 (Donor_P1_Alexa488)이 3'말단에 표지된 억셉터 스트랜드 및 다양한 위치에 Cy5가 표지된 억셉터 스트랜드(Acceptor_P2_Cy5, P4_Cy5, P6_Cy5 및 P11_Cy5)로 상기와 동일한 방법의 실험을 실시하였다.
그 결과 도 1d에 나타난 바와 같이, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 갭이 2nt일 때, Alexa488-Cy5 FRET 쌍(FRET pair)이 가장 높은 Cy5 신호를 나타내는 반면, Cy3-Cy5 FRET 쌍은 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 갭이 6 nt일 때 가장 높은 Cy5 신호를 나타내는 것을 확인하였다.
그 다음, HILO(Highly Inclined and Laminated Optical sheet) 현미경을 사용하여 초고해상도 형광 이미징을 측정하였고, 다양한 DNA 농도에서 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 신호에 대한 노이즈 비율(signal-to-noise ratio, SNR)을 비교하였다.
그 결과 도 1e 내지 도 1i에 나타난 바와 같이, DNA-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 5nM 이상일 때 단일-분자 이미지에 노이즈가 생기는 것을 확인하였다(도 1e). 반면, Cy3-Cy5 쌍 FRET-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 100nM 이상인 경우에 노이즈가 생기는 것을 확인하였고(도 1f, 도 1g), Alexa488-Cy5 쌍 FRET-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 150nM 이상인 경우에 노이즈가 생기는 것을 확인하였다(도 1h, 도 1i).
이에 DNA-PAINT에 비해 FRET-PAINT의 경우 더 높은 이미저 농도에서 동일한 SNR을 얻을 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 예를 들어, 도 1j 및 도 1k에 나타난 바와 같이, 3.3 SNR을 얻기 위해, DNA-PAINT의 경우는 5nM 이미저 농도를 사용하였으며, 동일한 SNR을 얻기 위해, Cy3-Cy5 쌍 FRET-PAINT의 경우는 180nM 도너 및 120nM 억셉터 농도를 사용하였고, Alexa488-Cy5 쌍 FRET-PAINT의 경우에는 250nM 도너 및 90nM 억셉터 농도를 사용하였다.
실시예 1-2: DNA-PAINT 및 FRET-PAINT 초고해상도 이미지 확인
기존의 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 초고해상도 이미징 속도를 비교하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다
먼저 상기 기재된 실험방법에 따라, COS-7 세포의 미세소관을 Docking_P1이 결합되어 있는 항-튜블린(anti-tubulin) 항체를 사용하여 면역 염색하였다.
그 다음 DNA-PAINT의 경우, 1nM Cy5-표지된 이미저 스트랜드(imager strand; (Acceptor_P2'_Cy5)를 주입한 후 미세소관을 이미지화하였다. 또한, FRET-PAINT의 경우, 30nM 도너 스트랜드(Donor_P1_Alexa488) 및 20nM 억셉터 스트랜드(Acceptor_P2_Cy5)를 주입한 후, 동일한 부위의 미세소관을 이미지화하였다. 단일-분자 이미지는 도너 및 억셉터 스트랜드의 결합을 감지할 수 있는 속도인 10Hz 프레임 속도로 기록하였다.
또한 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 이미징 속도를 정량적으로 비교하기 위하여, 도 2a 및 도 2b에 나타난 스폿 수를 측정하였고, 9개의 부위에서 동일하게 측정하여 평균적인 속도를 비교하였다. 또한 다음의 식 6을 이용하여, 컨볼루션된 해상도(convolved resolutions)를 정량화하여 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 이미징 속도를 비교하였다. DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 국소화 정밀도는 각각 6.9 nm와 11.1 nm이다.
(식 6)
[(국소화 정확도(localization precision))2 + (나이퀴스트 해상도(Nyquist resolution))2]1/2
그 결과를 도 2a 내지 도 2e에 나타내었다. 도 2a 내지 도 2e는 DNA-PAINT 및 FRET-PAINT의 이미징 속도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 표시된 획득 시간에 재구성된 DNA-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 2b는 표시된 획득 시간에 재구성된 도 2a와 동일한 영역의 FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 2c는 도 2a의 DNA-PAINT 이미지에 대한 시간의 함수 및 도 2b의 FRET-PAINT 이미지에 대한 시간의 함수로서 국소성 스팟(localized spot)의 누적 개수를 나타낸 것이다. 도 2d는 FRET-PAINT와 DNA-PAINT의 초당 국소 단일 분자 스팟 개수를 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 2e는 이미징 시간에 대하여 DNA-PAINT 및 FRET-PAINT의 공간 해상도를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 오차막대는 표준편차를 나타낸 것이다.
DNA-PAINT는 10Hz의 속도로 총 18,000개의 프레임이 기록되어 총 30분 동안 촬영한 반면(도 2a), FRET-PAINT는 10Hz의 속도로 총 600개의 프레임이 기록되어 총 60초 동안 촬영한 것으로 나타났다(도 2b). 또한 DNA-PAINT에 비하여 FRET-PAINT의 이미징 속도가 29배 증가하는 것으로 나타났고(도 2c), 각기 다른 부위에 대하여 측정한 평균 값으로도 이미징 속도가 32배 증가하는 것으로 나타났다(도 2d). 또한 상기 컨볼루션 해상도로 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 이미징 속도를 비교한 결과, FRET-PAINT의 이미징 속도가 36배 증가하는 것을 확인하였다(도 2e).
실시예 1-3: FRET-PAINT 다중화된 이미지(Multiplexed imaging)
FRET-PAINT 현미경의 다중화 능력을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
COS-7 세포의 미세소관과 미토콘드리아를 각각 Docking_P1이 결합되어 있는 항-튜블린(anti-tubulin) 항체 및 Docking_P2가 결합되어 있는 항-Tom20(anti-Tom20) 항체를 사용하여 면역 염색하였다. 여기서는 두 가지 접근법을 사용하여 다중화된 이미지를 획득하였다.
그 결과를 도 3a 내지 도 3h에 나타내었다.
도 3a 내지 도 3h는 FRET-PAINT의 다중화 성능을 나타낸 것이다. 도 3a는 도너 및 억셉터 스트랜드 교환 체계를 사용하는 FRET-PAINT의 다중화된 이미지를 모식도로 나타낸 것이다. 도 3b 내지 도 3d는 도 3a의 방법을 사용하여 획득한 미세소관(microtubule, b) 및 미토콘드리아(mitochondria, c)의 FRET-PAINT 이미지 및 이들을 중첩한 이미지(d)를 나타낸 것이다. 도 3e는 버퍼 교환 없이 다중화된 이미지를 모식도로 나타낸 것이다. 도 3f 내지 도 3h는 도 3e의 방법을 사용하여 획득한 미세소관(f) 및 미토콘드리아(g)의 FRET-PAINT 이미지 및 이들을 중첩한 이미지(h)를 나타낸 것이다(MT: 미세소관(microtubule), MC: 미토콘드리아(mitochondria), DS: 도너 스트랜드(donor strand), AS: 억셉터 스트랜드(acceptor strand), Scale bars: 5㎛).
도 3a에 따른 접근법(도너 및 억셉터 스트랜드 순차적으로 처리하는 방법)에 따라 20nM Donor_P1_Alexa488과 10nM Acceptor_P2_Cy5를 주입하여 미세소관을 관찰하였고(도 3b), 10nM Donor_P2_Alexa499과 10nM Acceptor_P2_Cy5를 주입하여 미토콘드리아를 관찰하였다(도 3c). 또한, 도 3e에 따른 또 다른 접근법(도너 및 억셉터 스트랜드 동시에 처리하는 방법)은 미세소관에 10nM Donor_P1_Cy3를 주입하고, 미토콘드리아에 20nM Donor_P2_Alexa488을 주입하였고, 10nM Acceptor_P2'_Cy5를 주입하는 방법으로 모든 DNA 프로브롤 동시에 주입한 다음, Cy3 여기(excitation)와 함께 처음으로 미세소관을 관찰(도 3f)한 다음, Alexa488 여기로 미토콘드리아를 관찰(도 3g)하였다.
이를 통해, 두 가지 접근법은 이미징 시간에서 차이가 없었으나, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 동시에 처리하는 경우에는 미세소관과 미토콘드리아 이미지 사이에 혼선이 발생하는 것을 확인하였고, 이에, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 순차적으로 처리하는 경우가 다중화 이미징에 더 효과적이라는 것을 확인하였다.
실시예 1-4: 넓은 농도 범위의 바이오마커 측정
넓은 농도 범위의 바이오마커 측정능력을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
도 4a 내지 도 4c는 다양한 농도 범위의 바이오마커를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 10, 40, 100, 400, 1000, 10000 pg/ml 농도의 바이오마커를 각각 서로 다른 웰에 고정하고 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용해 바이오마커를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 4b는 1000 pg/ml과 10000 pg/ml 농도의 바이오마커를 각각 1/10과 1/100으로 희석하여 사용한 경우 바이오마커를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 4c는 도 4a 및 4b의 각각의 농도에서 측정한 점의 개수를 그래프로 나타낸 것이다. 1000 pg/ml는 1/10로 희석해 센 점의 수에 10을 곱했고, 10000 pg/ml는 1/100로 희석해 센 점의 수에 100을 곱하여 측정하였다.
도 4a는 10, 40, 100, 400, 1000, 10000 pg/ml 농도의 바이오마커를 각각 서로 다른 웰에 고정하고 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용해 화면에 나타난 점(개별 바이오마커 분자)의 수를 측정한 결과이다. 농도에 비례하여 화면에 나타나는 점의 수가 늘어남을 확인할 수 있고, 1000 pg/ml 이상의 농도에서는 점이 겹치기 시작해 정확한 수를 셀 수 없음을 확인하였다.
도 4b는 1000과 10000 pg/ml 농도의 바이오마커를 각각 1/10과 1/100로 희석하여 서로 다른 웰에 고정하고 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용해 화면에 나타난 점의 수를 측정한 결과이다.
도 4c는 도 4a 및 도 4b의 각각의 농도에서 점의 개수를 세어 그래프로 나타낸 것이다. 1000 pg/ml의 농도의 바이오마커인 경우에는 1/10로 희석해 센 점의 수에 10을 곱했고, 10000 pg/ml의 농도의 바이오마커인 경우에는 1/100로 희석해 센 점의 개수에 100을 곱하였다.
측정 결과를 선형으로 피팅하였을 때 상관 계수가 0.99997로 계산되었고 이로부터 고농도의 바이오마커를 희석 후 측정해도 정확한 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
2. 2종 이상의 도너 형광물질 또는 억셉터 형광물질로 표지된 태그 스트랜드를 이용한 바이오마커 다중검출
실시예 2-1: FRET 효율 데이터베이스 제작
앞서, 설명한 방법으로 FRET 효율 데이터베이스를 구축하기 위해, 도너로는 Cy3를, 억셉터로는 Cy5 를 DNA가닥에 표지하여 태그 스트랜드를 제작하였다. 상기 DNA의 한쪽 끝에는 바이오틴이 부착되어 있고, 특정 염기 상에는 도너 및 억셉터가 부착되어 있으며, 도너와 억셉터 사이의 거리가 1 내지 50이 되도록 표지하여, 총 50종의 태그 스트랜드를 준비하였다.
이때, 바이오틴을 부착하는 이유는 스트렙타비딘과 바이오틴 사이의 결합을 이용하여 기판에 DNA를 고정하기 위함이며, 유사한 역할을 수행하기 위해, 디곡시게닌(digoxigenin) 및 이의 항체 또는 SNAP-tag, CLIP-tag, FLAG-tag, His-tag 등의 태그와 각각의 리간드(ligand) 사이의 결합을 이용하여 기판에 고정하는 방법을 이용할 수도 있다.
기판을 스트렙타비딘으로 코팅한 후, 도너와 억셉터 사이의 거리가 1인 DNA를 고정하고, 거리가 1일 때의 FRET 효율을 측정하여 기준값을 확보하였다. 이때, FRET 효율은 1) 도너를 여기하기 위한 빛에 의해 억셉터가 여기되며 내는 빛, 2) 도너와 억셉터가 내는 빛을 분리하기 위해 사용하는 광학부품(dichroic mirror)에 의해 완벽하게 분리되지 않은 도너와 억셉터가 내는 빛의 일부 및 3) 도너와 억셉터가 내는 빛의 파장 차이에 따른 이미지 센서의 검출 효율 차를 보정한 값일 수 있다.
나머지 거리 2 내지 50의 경우도, 동일한 방법으로 측정하여 각각의 기준값을 확보하였으며, 측정시 발생하는 노이즈에 의한 오차를 계산하여 실제 명확히 구분이 되는 FRET 효율의 거리만을 이용하기로 하였다. 이후, 후술하는 실시예에서는 거리 1 내지 50의 FRET 효율 기준값 중 명확히 구분이 가능한 값은 10개라고 가정하고, 검출예를 설명하도록 한다.
실시예 2-2: 태그 스트랜드 제작
태그 스트랜드는 실제 검출하고자 하는 바이오마커 종류의 수만큼 제작하였다. 실시예 2-1에서 사용되는 DNA와 동일한 것을 이용할 수 있으나, 실시예 2-1에서 사용된 DNA의 한쪽 끝에 부착되었던 바이오틴 대신 검출항체에 붙일 수 있는 작용기를 부착한 것을 사용하였다. 이때, 부착하는 방법은 DNA에 형광 물질을 부착하는 것과 동일한 방법을 사용할 수 있다.
실시예 2-1을 통해 도너-억셉터 1쌍으로 명확히 구분 가능한 FRET 효율은 10개라고 가정한 바 있으므로, 만일 검출하고자 하는 바이오마커의 종류가 10개라면 도너-억셉터 1쌍만으로도 충분히 검출이 가능한 것이다.
만일, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류가 10개를 초과한다면, 도너-억셉터 2쌍 이상이 사용될 수 있다. 만일, 도너-억셉터 2쌍을 이용한다면, 명확하게 구분이 가능한 FRET 효율은 최대 55개가 될 것이고, 3 쌍을 이용한다면, 최대 205개가 될 것이다. 이론적으로 계산한다면, 도너-억셉터 1쌍으로 구분이 가능한 FRET 효율이 최대 10개라면, 2쌍으로 구분이 가능한 FRET 효율은 100개일 것으로 계산될 수 있다. 그러나, FRET쌍 1과 FRET쌍 2의 FRET 효율이 각각 i) a, b 인 경우와 ii) b, a 인 경우가 존재한다면, 상기 i) 및 ii)의 경우를 서로 구분할 수 없으므로, 상기 i) 또는 ii) 중 어느 하나만 태그 스트랜드로 사용한다면 실질적으로는 FRET 효율을 구분할 수 있는 경우는 총 55가지 존재할 수 있다. FRET쌍 1과 FRET 쌍 2의 도너 또는 억셉터 또는 모두의 형광 물질의 종류가 다르다면 두 쌍으로 구분 가능한 FRET 효율은 100가지, 세 쌍은 1000가지가 된다.
실시예 2-3: 광표백 전후 FRET 효율 변화
도너1-억셉터1 및 도너2-억셉터2를 일정거리 이격하여 표지한 DNA를 이용하여 광표백 전의 도너 및 억셉터 각각의 밝기와 도너-억셉터 쌍의 FRET 효율을 측정하였다(표 1). 이때, FRET 효율은 1) 도너를 여기하기 위한 빛에 의해 억셉터가 여기되며 내는 빛, 2) 도너와 억셉터가 내는 빛을 분리하기 위해 사용하는 광학부품(dichroic mirror)에 의해 완벽하게 분리되지 않은 도너와 억셉터가 내는 빛의 일부 및 3) 도너와 억셉터가 내는 빛의 파장 차이에 따른 이미지 센서의 검출 효율 차를 보정한 값일 수 있다.
가령, FRET쌍 1의 FRET 효율은 0.5이고 FRET쌍 2의 FRET 효율은 0.7이지만, 이 상태에서 관측되는 FRET 효율은 두 FRET쌍의 평균인 0.6이며 이러한 상태에서의 관측 결과로는 두 FRET쌍 각각의 FRET 효율은 알 수 없다.
| 도너1-억셉터1 | 도너2-억셉터2 | ||
| 도너1 | 억셉터1 | 도너2 | 억셉터2 |
| 50 | 50 | 30 | 70 |
| FRET 효율 0.5 | FRET 효율 0.7 | ||
표 1과 같은 구성으로부터 4가지의 광표백 경우가 발생할 수 있으며, 상기와 같이 보정한 FRET 효율의 경우 광표백 전과 후 FRET 쌍을 이루는 도너와 억셉터 밝기의 합은 일정하며, 본 실시예의 경우 합은 100이다. 각각의 경우의 FRET 효율은 다음과 같이 측정될 수 있었다.
1) 도너1이 광표백되는 경우
도너1과 억셉터1이 모두 빛을 방출하지 않으므로, 도너의 밝기 합이 80에서 30이 되고, 억셉터의 밝기 합이 120에서 70이되므로, 광표백 전후의 밝기의 변화량은 도너가 50, 억셉터가 50이 된다. 즉, 광표백 전후의 밝기 차이로부터 측정되는 FRET 효율은 0.5이고, 광표백 이후 관측되는 밝기로부터 측정되는 FRET 효율은 0.7임을 확인할 수 있다. 따라서 해당 태그 스트랜드의 FRET 효율이 0.5와 0.7로 구성됨을 알 수 있다.
2) 도너2가 광표백되는 경우
도너2와 억셉터2가 모두 빛을 방출하지 않으므로, 도너의 밝기 합이 80에서 50이 되고, 억셉터의 밝기 합이 120에서 50이 되므로, 광표백 전후의 밝기의 변화량은 도너가 30, 억셉터가 70이 된다. 즉, 광표백 전후의 밝기 차이로부터 측정되는 FRET 효율은 0.7이고, 광표백 이후 관측되는 밝기로부터 측정되는 FRET 효율은 0.5임을 확인할 수 있었다. 따라서 해당 태그 스트랜드의 FRET 효율이 0.5와 0.7로 구성됨을 알 수 있었다.
3) 억셉터1이 광표백되는 경우
억셉터1이 내던 빛을 도너1이 방출하게 되므로, 도너의 밝기 합이 80에서 130이 되고, 억셉터의 밝기 합이 120에서 70이 되므로, 광표백 전후의 밝기의 변화량은 도너가 50, 억셉터가 50이 된다. 광표백 전과 후 FRET 쌍을 이루는 도너와 억셉터 밝기의 합은 100으로 일정하므로 억셉터의 변화량 50으로부터 FRET 효율은 0.5임을 알 수 있다. 광표백 후 도너의 밝기 합 130 중 도너1이 방출하는 100을 제외한 밝기로부터 측정되는 FRET 효율은 0.7임을 확인할 수 있었다. 따라서 해당 태그 스트랜드의 FRET 효율이 0.5와 0.7로 구성됨을 알 수 있었다.
4) 억셉터2가 광표백되는 경우
억셉터2가 내던 빛을 도너2가 방출하게 되므로, 도너의 밝기 합이 80에서 150이 되고, 억셉터의 밝기 합이 120에서 50이되므로, 광표백 전후의 밝기의 변화량은 도너가 70, 억셉터가 70이 된다. 광표백 전과 후 FRET 쌍을 이루는 도너와 억셉터 밝기의 합은 100으로 일정하므로 억셉터의 변화량 70으로부터 FRET 효율은 0.7임을 알 수 있다. 광표백 후 도너의 밝기 합 150 중 도너2가 방출하는 100을 제외한 밝기로부터 측정되는 FRET 효율은 0.5임을 확인할 수 있다. 따라서 해당 태그 스트랜드의 FRET 효율이 0.5와 0.7로 구성됨을 알 수 있다.
위와 같이, 하나의 형광 물질이 광표백되기까지 밝기를 측정하고, 각 형광 물질 별로 동일한 방법으로 반복하여 측정함으로써, 해당 태그 스트랜드의 FRET 효율이 0.5와 0.7로 구성됨을 확인할 수 있다.
실시예 2-4: FRET 효율의 측정 및 바이오마커 종류 판별
바이오마커 1 또는 2를 검출하기 위해 다음과 같이 키트를 제작하였다.
바이오마커1에 결합하는 검출항체1에는 태그 스트랜드1을 부착하고, 바이오마커 2에 결합하는 검출항체 2에는 태그 스트랜드2를 부착하였다. 상기 태그 스트랜드1 및 2는 도너-억셉터 FRET쌍이 각각 2쌍이 표지되었다. 검출항체 1의 FRET 효율 기준값은 FRET쌍1= 0.1, FRET쌍2= 0.5였고, 검출항체 2의 FRET 효율 기준값은 FRET쌍1= 0.2, FRET쌍2= 0.4였다.
이후, 실시예 2-3과 같이 광표백 전후의 밝기 차이를 측정함으로써 FRET 효율을 분석하였다. 밝기를 관찰하는 이미징 카메라에 분자 A 및 B가 나타나고, 분자 A의 FRET 효율이 0.1, 0.5로 측정되어, 분자 A는 바이오마커 1임을 알 수 있었다. 동일한 원리로, 분자 B의 FRET 효율이 0.2, 0.4로 측정되어, 분자 B는 바이오마커 2임을 알 수 있었다(도 15).
시료에 포함된 바이오마커들은 그 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 넓은 농도 범위를 갖는다. 지나치게 높은 농도의 바이오마커를 기판에 고정할 경우 한 화면에 나타나는 점의 수가 너무 많아 점들 사이에 겹침이 발생하고 이로 인해 개별 분자의 FRET 효율을 측정할 수 없게 되므로, 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 시료를 희석할 수 있다.
만일, 비슷한 농도 범위를 갖는 바이오마커들을 검출하는 경우라면, 바이오마커들을 동일한 비율로 희석한 후 상기 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, 통상 1ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들을 1:100으로 희석할 경우 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출된다면, 통상 100ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들은 1:10000으로 희석한 후 분석을 수행할 수 있다.
3. N종의 도킹 스트랜드 및 N종의 프렛 스트랜드를 이용한 바이오마커 다중검출
실시예 3-1: 프렛효율 데이터베이스 제작
각기 다른 형광 물질 A, B, C를 각각 도너 1, 도너 2, 억셉터로 하여, 도너 1은 도너 스트랜드에, 도너 2와 억셉터는 프렛 스트랜드에 표지하였다. 도너 1과 도너 2 사이의 프렛효율이 최대가 되도록 두 형광 물질 A, B 사이의 거리를 정하였다. B와 C를 각각 도너 2, 억셉터로 프렛쌍을 구성하여, 프렛 스트랜드에 표지하고, 필요한 종류만큼 이종의 프렛쌍이 표지된 프렛 스트랜드를 제작하였다.
가령, 데이터베이스 상에 필요한 종류가 50종이면, 표지된 B, C 사이의 거리가 모두 상이하게 표지된 50 종의 프렛 스트랜드를 준비하였다. 필요에 따라서, 사용하는 도너 1, 도너 2 및 억셉터가 시판되는 형광 물질인 경우, 이러한 제작과정을 생략하고 도너 1, 도너 2 및 억셉터가 부착된 상태로 시판되는 프렛 스트랜드를 사용할 수도 있다.
다만, 도너1, 도너 2 및 억셉터로 사용되는 형광 물질을 결정함에 있어서, 각 형광 물질의 발광스펙트럼의 최대값의 파장이 도너 1이 가장 짧고, 억셉터가 가장 긴 것이 바람직하다.
2 종 이상의 프렛 스트랜드가 준비되면, 도너 2-억셉터 사이의 거리가 1인 프렛 스트랜드 및 도너 스트랜드를 도킹 스트랜드에 결합시킨 후 해당 거리의 프렛효율을 측정하였다. 이후, 도너 2-억셉터 프렛쌍 사이의 거리가 2인 프렛 스트랜드부터 차례로 전술한 내용과 동일한 과정을 반복하여 프렛효율 기준값을 획득하고, 이를 거리별로 데이터베이스화하였다.
이후, 바이오마커 검출과정에서 측정되는 프렛효율 측정값과 상기 프렛효율 기준값을 비교하면 검출에 사용된 프렛쌍의 도너 2-억셉터 사이의 거리를 알 수 있으며, 이로부터 검출한 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
그러나, 프렛효율 측정에는 노이즈에 의한 오차가 있을 수 있어, 모든 거리의 프렛효율이 구분가능한 것이 아닐 수 있다. 예를 들면, 거리가 1일 때의 프렛효율이 0.95(평균) ± 0.05(오차)이고, 거리가 2일 때의 프렛효율이 0.94 ± 0.05이라면, 프렛효율로는 거리 1과 2를 구분할 수 없다. 따라서, 실제 바이오마커를 검출시에는 데이터베이스의 값 중 프렛효율이 명확히 구분되는 거리만 이용함이 바람직하다. 이후, 후술하는 실시예에서는 거리 1 내지 50의 프렛효율 기준값 중 명확히 구분이 가능한 값은 10개라고 가정하고, 검출예를 설명하도록 한다.
실시예 3-2: N종의 도킹 스트랜드 및 N종의 프렛 스트랜드 제작
도킹 스트랜드는 실제 검출하고자 하는 바이오마커 종류의 수만큼 제작하였다.
실시예 3-1을 통해 도너 2-억셉터 프렛쌍 1쌍으로 명확히 구분 가능한 프렛효율은 10개라고 가정한 바 있으므로, 만일 검출하고자 하는 바이오마커의 종류가 10개라면 도너 2-억셉터 프렛쌍 1쌍만으로도 충분히 검출이 가능하다. 따라서 도킹 스트랜드에 1개의 프렛 스트랜드가 결합할 수 있도록 제작하였다.
만일, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류가 10개를 초과하는 경우, 도너 2-억셉터로 구성되는 프렛쌍이 2 이상 사용될 수 있다. 따라서, 도킹 스트랜드에 2 이상의 프렛 스트랜드가 결합할 수 있도록 제작하였다. 만일, 2개의 프렛쌍을 사용한다면, 명확하게 구분이 가능한 프렛효율은 최대 55개가 될 것이고, 3개의 프렛쌍을 이용한다면, 명확하게 구분이 가능한 프렛효율은 최대 205개가 될 것이다. 이론적으로 계산한다면, 1개의 프렛쌍으로 구분이 가능한 프렛효율이 최대 10개라면, 2개의 프렛쌍으로 구분이 가능한 프렛효율은 100개일 것으로 계산될 수 있다고 판단할 수도 있으나, 프렛쌍 1과 프렛쌍 2의 프렛효율이 각각 i) a, b 인 경우와 ii) b, a 인 경우가 존재한다면, 상기 i) 및 ii) 의 경우를 서로 구분할 수 없으므로, 상기 i) 또는 ii) 중 어느 하나만 도킹 스트랜드로 사용한다면 실질적으로는 프렛효율을 구분할 수 있는 경우는 총 55가지 존재할 수 있다. 단, 프렛쌍 1과 프렛쌍 2의 도너 2 또는 억셉터 또는 모두의 형광 물질의 종류가 다르다면 두 쌍으로 구분 가능한 프렛효율은 100가지, 세 쌍은 1000가지가 될 수도 있다.
실시예 3-3: 프렛효율의 측정 및 바이오마커 판별
2종의 바이오마커인 바이오마커 1 또는 2를 검출하기 위해 다음과 같이 키트를 제작하였다.
바이오마커1에 결합하는 검출항체1에는 도킹 스트랜드 1을 부착하고, 바이오마커 2에 결합하는 검출항체 2에는 도킹 스트랜드 2를 부착하였다. 상기 도킹 스트랜드 1 및 2는 각각 2종의 프렛 스트랜드가 결합할 수 있도록 제작되었다. 도킹 스트랜드 1에는 프렛효율이 각각 0.2, 0.4인 프렛 스트랜드가 결합할 수 있고, 도킹 스트랜드 2에는 프렛효율이 각각 0.6, 0.8인 프렛 스트랜드가 결합할 수 있도록 제작하였다.
기판에 바이오마커 1과 2를 고정하고, 각각에 검출항체 1과 2를 결합시켰다. 도너 스트랜드, 프렛효율이 각각 0.2, 0.4, 0.6, 0.8인 프렛 스트랜드 4종이 포함된 버퍼를 웰에 주입한 후, 도킹 스트랜드에 결합한 프렛 스트랜드의 프렛효율을 측정하였다. 전술한 도 29에 대한 설명과 같이, 도너 2와 억셉터의 밝기를 관찰하는 이미징 카메라에 분자 1 및 분자 2의 위치가 간헐적인 형광신호로 관측되고, 도너 2와 억셉터의 밝기를 측정하여 프렛효율을 분석하였다. 측정한 결과, 분자 1의 위치에서는 프렛효율 0.2와 0.4가 측정되었으므로, 분자 1은 바이오마커 1임을 확인할 수 있었다. 이와 동일한 원리로, 분자 2의 위치에서는 프렛효율 0.6과 0.8이 측정되어, 분자 2는 바이오마커 2임을 확인할 수 있었다.
시료에 포함된 바이오마커들은 그 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 넓은 농도 범위를 갖는다. 지나치게 높은 농도의 바이오마커를 기판에 고정할 경우 한 화면에 나타나는 점의 수가 너무 많아 점들 사이에 겹침이 발생하고 이로 인해 개별 분자의 프렛효율을 측정할 수 없게 되므로, 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 시료를 희석할 수 있다.
만일, 비슷한 농도 범위를 갖는 바이오마커들을 검출하는 경우라면, 바이오마커들을 동일한 비율로 희석한 후 상기 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, 통상 1ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들을 1:100으로 희석할 경우 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출된다면, 통상 100ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들은 1:10000으로 희석한 후 분석을 수행할 수 있다.
4. N종의 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 이용한 바이오마커 다중검출
실시예 4-1: 발광 스펙트럼 데이터베이스 제작
하나의 광원으로 여기 가능한 A 종의 도너로 각각 표지된 A 종의 도너 스트랜드를 제작하였다. 상기 A 종의 도너와 프렛이 일어나는 B종의 억셉터로 각각 표지된 B종의 억셉터 스트랜드를 제작하였다. 상기 A종의 도너 스트랜드 및 B종의 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합하는 총 A x B종의 도킹 스트랜드를 제작하였다(단, A, B 각각은 1 이상의 정수임).
도너 스트랜드 1과 억셉터 스트랜드 1 및 이에 상보적인 도킹 스트랜드1을 이용하여 도너 및 억셉터의 발광 스펙트럼을 측정하였다. 나머지 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드에 대해서도 동일한 방식으로 발광 스펙트럼을 측정하였다.
측정된 총 A x B 개의 발광 스펙트럼 중, 측정 노이즈에 의한 오차를 감안하는 경우에도 명확히 구분 가능한 발광 스펙트럼만을 데이터베이스로 제작하고, 해당 발광 스펙트럼을 제공하는 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 조합만을 바이오마커를 검출에 이용하였다.
상기 실시예의 방법은 도 31 및 도 33의 방법을 조합하여 도 36b와 같이 구성한 과정을 설명한 것으로, 데이터베이스화된 발광 스펙트럼의 개수가 검출할 바이오마커의 개수보다 작을 경우, 도 32와 같이 도너와 억셉터 사이의 프렛효율이 상이하도록 구성하여 추가적으로 적용하거나, 도 36b와 같이 하나의 억셉터 스트랜드에 두 종류 이상의 억셉터를 표지할 수도 있고, 또는 하나의 도킹 스트랜드에 두 개 이상의 서로 상이한 억셉터 스트랜드가 결합하도록 함으로써 검출할 바이오마커 개수보다 많은 수의 발광 스펙트럼 데이터베이스를 만들 수 있다.
실시예 4-2: N종의 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드 제작
N 종 바이오마커를 검출하기 위해 N 종의 도킹 스트랜드를 제작하였다. 상기 데이터베이스화 된 발광 스펙트럼을 제공하는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 결합할 수 있도록 이에 상보적인 염기서열을 갖는 N종의 도킹 스트랜드를 제작하였다.
실시예 4-3: 발광 스펙트럼의 측정 및 바이오마커 판별
2 종의 바이오마커를 검출하기 위해 다음과 같이 키트를 제작했다.
바이오마커1에 결합하는 검출항체1에는 도킹 스트랜드 1을 부착하고, 바이오마커 2에 결합하는 검출항체 2에는 도킹 스트랜드 2를 부착했다. 상기 도킹 스트랜드 1에는 도너 스트랜드 1 및 억셉터 스트랜드 1이 결합하고, 상기 도킹 스트랜드 2에는 도너 스트랜드 2 및 억셉터 스트랜드 2가 결합할 수 있도록 제작했다.
기판에 바이오마커 1과 2를 고정하고, 각각에 검출항체 1과 2를 결합시켰다. 도너 스트랜드 1, 억셉터 스트랜드 1, 도너 스트랜드 2 및 억셉터 스트랜드 2가 포함된 버퍼를 웰에 주입한 후, 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 동시에 결합했을 때 방출하는 빛의 스펙트럼을 관찰했다. 도 37과 같이, 이미징 카메라 화면의 분자 1 및 분자 2의 위치에서 간헐적인 형광신호가 관측되고, 해당 위치에서의 방출 스펙트럼을 데이터베이스와 비교함으로써 바이오마커 종류를 판별할 수 있었다.
시료에 포함된 바이오마커들은 그 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 넓은 농도 범위를 갖는다. 그러나 지나치게 높은 농도의 바이오마커를 기판에 고정할 경우 한 화면에 나타나는 점의 수가 너무 많아 점들 사이에 겹침이 발생하고 이로 인해 개별 분자의 프렛효율을 측정할 수 없게 되므로, 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 시료를 희석하여 검출에 이용할 수 있다.
만일, 비슷한 농도 범위를 갖는 바이오마커들을 검출하는 경우라면 바이오마커들을 동일한 비율로 희석한 후 상기 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, 통상 1ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들을 1:100으로 희석할 경우 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출된다면 통상 100ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들은 1:10000으로 희석한 후 분석을 수행할 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
<110> JL MEDILABS, INC.
<120> Method and kit for detecting target material
<130> SDP2019-1052
<150> KR 10-2018-0101453
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<151> 2018-10-16
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ttgatctaca tattcttcat ta 22
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<223> Donor strand
<400> 2
taatgaaga 9
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Acceptor strand
<400> 3
tatgtagatc 10
Claims (38)
- a) 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입하는 단계;
b) 상기 타겟 물질에 도킹 스트랜드(docking strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계;
c) 상기 도킹 스트랜드에 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및
d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법. - 제1 항에 있어서,
상기 도너 형광 물질의 흡광도가 최대인 파장이 상기 억셉터 형광 물질의 흡광도가 최대인 파장보다 짧고, 상기 도너 형광 물질의 발광도가 최대인 파장이 상기 억셉터 형광 물질의 발광도가 최대인 파장보다 짧은 것인 타겟 물질 검출방법. - 제1 항에 있어서,
상기 도너 형광 물질을 여기시키기 위한 여기광의 파장에서 상기 도너 형광 물질의 흡광계수(extinction coefficient)가 상기 억셉터 형광 물질의 흡광계수보다 3배 이상 큰 것인 타겟 물질 검출방법. - 제1 항에 있어서,
상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질의 포스터(Forster) 반경은 0.208 nm 이상인 것인 타겟 물질 검출방법. - 제1 항에 있어서,
상기 도너 형광 물질 및 상기 억셉터 형광 물질은 링커에 의해 상기 도킹 스트랜드 또는 상기 별도 스트랜드와 결합된 것인 타겟 물질 검출방법. - 제5 항에 있어서,
상기 링커의 길이는 10nm 이하인 것인 타겟 물질 검출방법. - 제1 항에 있어서,
상기 형광 신호의 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 2 이상이 되도록 광학필터의 파장을 제어하는 단계를 더 포함하는 것인 타겟 물질 검출방법. - 제1 항에 있어서,
상기 별도 스트랜드는 상기 도너 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 도너 스트랜드; 및 상기 억셉터 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 억셉터 스트랜드를 포함하는 것인 타겟 물질 검출방법. - 제8 항에 있어서,
상기 타겟 물질이 2종 이상이고, 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드 중 적어도 하나는 검출하고자 하는 상기 타겟 물질들의 종류에 따라 서로 다른 염기서열을 갖거나, 종류 또는 부착 위치가 서로 다른 형광 물질을 갖는 것인 타겟 물질 검출방법. - 제9 항에 있어서,
상기 타겟 물질의 판독 후 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드 중 적어도 하나 이상을 제거한 다음 제거한 것과 상이한 도너 스트랜드 또는 상이한 억셉터 스트랜드를 적용하여 상기 d) 단계를 수행함으로써 타겟 물질들을 종류별로 판독하는 단계를 더 포함하는 타겟 물질 검출방법. - 제8 항에 있어서,
상기 도킹 스트랜드에 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드가 동시에 결합했을 때 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드 사이의 갭의 간격은 상기 도킹 스트랜드의 지속길이(persistence length)보다 짧은 것인 타겟 물질 검출방법. - 제8 항에 있어서,
상기 형광 신호의 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 2 이상을 유지하면서, 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드가 상기 도킹 스트랜드에 결합하는 데 필요한 시간이 10분 이내가 되도록 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드의 농도를 조절하는 단계를 더 포함하는 타겟 물질 검출방법. - 제12 항에 있어서,
상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드의 농도가 10nM 내지 10uM인 것인 타겟 물질 검출방법. - 제8 항에 있어서,
상기 도킹 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드가 핵산일 경우, 상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 억셉터 스트랜드의 염기서열 개수는 8 이상인 것인 타겟 물질 검출방법. - 제14 항에 있어서,
상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 도너 스트랜드의 염기서열 개수는 6 내지 12인 것인 타겟 물질 검출방법. - 제8 항에 있어서,
상기 도킹 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드가 핵산 유사체일 경우, 상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 억셉터 스트랜드의 염기서열 개수는 5 이상인 것인 타겟 물질 검출방법. - 제16 항에 있어서,
상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 도너 스트랜드의 염기서열 개수는 3 내지 9인 것인 타겟 물질 검출방법. - a) 기판에 핵산 또는 핵산 유사체를 타겟 물질로서 함유한 시료를 도입하는 단계;
b) 상기 기판에 도입된 상기 타겟 물질의 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 타겟 물질의 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및
c) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법. - 제8 항에 있어서,
상기 억셉터 스트랜드 또는 상기 도킹 스트랜드는 서로 프렛쌍을 형성하는 형광 물질들을 2종 이상 구비하는 것인 타겟 물질 검출방법. - 제19 항에 있어서,
상기 프렛쌍으로부터 발생하는 형광 신호로부터 하기 식으로 정의되는 FRET 효율을 측정하는 것인 타겟 물질 검출방법.
FRET 효율 = (억셉터가 내는 빛의 세기)/(도너와 억셉터가 내는 빛의 세기 합) - 제1 항에 있어서,
상기 별도 스트랜드는 도너 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 도너 스트랜드를 포함하고, 상기 도킹 스트랜드는 1종 이상의 억셉터 형광 물질을 포함하는 것인 타겟 물질 검출방법. - 제1 항에 있어서,
상기 별도 스트랜드는 상기 억셉터 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 억셉터 스트랜드를 포함하고, 상기 도킹 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질을 포함하는 것인 타겟 검출방법. - a) 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입하는 단계;
b) 상기 타겟 물질에 태그 스트랜드(tagged strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계;
c) 상기 태그 스트랜드는 1종 이상의 상기 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 상기 억셉터 형광 물질을 포함하는 단계; 및
d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법. - 제23 항에 있어서,
상기 태그 스트랜드는 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 간에 인접하여 형성된 프렛쌍들을 2종 이상 구비한 것인 타겟 물질 검출방법. - 제23 항에 있어서,
상기 프렛에 의한 형광 신호의 측정은 하기 식으로 정의되는 FRET 효율을 측정하는 것인 타겟 물질 검출방법.
FRET 효율 = (억셉터가 내는 빛의 세기)/(도너와 억셉터가 내는 빛의 세기 합) - 제25 항에 있어서,
상기 FRET 효율의 측정은 상기 도너 또는 상기 억셉터의 광표백 전후의 빛의 밝기를 측정하는 단계를 포함하는 것인 타겟 물질 검출방법. - 제24 항에 있어서,
상기 프렛쌍들 사이의 간격은 각 프렛쌍의 FRET 효율에 영향을 미치지 않도록 간격이 조절된 것인 타겟 물질 검출방법. - 제27 항에 있어서,
상기 프렛쌍들 사이의 간격은 적어도 5nm인 것인 타겟 물질 검출방법. - 제1 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 판독 단계는 형광 물질들 간 거리에 따라 서로 구분되는 프렛(FRET) 효율의 차이를 측정하여 2종 이상의 타겟 물질들을 동시에 판독하는 것인 타겟 물질 검출방법. - 제1 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 판독 단계는 서로 다른 종류의 형광 물질 간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼의 차이를 측정하여 2종 이상의 타겟 물질들을 동시에 판독하는 것인 타겟 물질 검출방법. - 제1 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형광 신호를 이미징하는 영역의 단위 면적당 상기 타겟 물질들의 개수로부터 상기 시료 중의 상기 타겟 물질의 농도를 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 타겟 물질 검출방법. - a) 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 도킹 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브; 및
b) 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 포함하되,
상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비되며, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트. - 타겟 물질인 핵산 또는 핵산 유사체의 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 포함하되, 상기 별도 스트랜드는 적어도 하나의 도너 형광 물질을 구비한 도너 스트랜드; 및 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비한 억셉터 스트랜드를 포함하며, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트.
- 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 태그 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브를 포함하되,
상기 태그 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 억셉터 형광 물질을 포함하고, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트. - 제32 항 내지 제34 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 타겟 물질을 부착하기 위한 기판을 더 포함하는 것인 타겟 물질 검출용 키트. - 제35 항에 있어서,
상기 기판에 상기 타겟 물질을 포획하기 위한 1종 이상의 포획 프로브가 고정된 것인 타겟 물질 검출용 키트. - 제36 항에 있어서,
상기 포획 프로브는 태그 스트랜드를 구비한 것인 타겟 물질 검출용 키트. - 제37 항에 있어서,
상기 검출 프로브의 태그 스트랜드 및 상기 포획 프로브의 태그 스트랜드와 상보적으로 결합함으로써 프렛쌍을 형성할 수 있는 브릿지 스트랜드를 더 포함하는 타겟 물질 검출용 키트.
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