WO2023191539A1 - 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트 - Google Patents

위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an antigen detection method and kit in which false positive signals are eliminated, and more specifically, to a false positive signal that can easily detect a biomarker using a fluorescent molecule attached to a capture antibody and a fluorescent molecule attached to a detection antibody. It relates to an antigen detection method and kit from which .
  • an antigen is immobilized on the surface of a substrate using a capture antibody, and a detection antibody labeled with horseradish peroxidase (HRP) or a fluorescent substance is bound to the antigen and then bound to the HRP.
  • HRP horseradish peroxidase
  • detection antibodies bind specifically to the biomarker used as an antigen, but some detection antibodies may not be completely removed from the substrate by washing or may bind to places other than the antigen, such as the substrate surface, due to non-specific binding. This may result in a false positive signal, making the measured amount of antigen inaccurate.
  • FIG. 1 is a diagram showing false positive problems that may occur in conventional immunoassays. In particular, such false positive signals can act as a factor in reducing the accuracy of diagnosis when diagnosing diseases with extremely small amounts of antigen, such as viral diseases or cancer diagnosis.
  • the present invention provides an antigen detection method and kit in which false positive signals are eliminated that can easily detect a biomarker using a fluorescent molecule attached to a capture antibody and a fluorescent molecule attached to a detection antibody. I want to do it.
  • the present invention provides a substrate; A capture antibody that can be attached to the substrate and is labeled with a first fluorescent substance; and a detection antibody capable of binding to an antigen attached to the capture antibody and labeled with a second fluorescent substance, wherein the first fluorescent substance and the second fluorescent substance emit fluorescence having different peak wavelengths.
  • a kit for detecting antigens from which false positive signals are eliminated is provided.
  • the first fluorescent material and the second fluorescent material may emit light simultaneously by one or more excitation lights.
  • part of the emission spectrum of the first fluorescent material and the second fluorescent material may overlap.
  • the present invention also provides a kit for detecting the above antigen; and a fluorescence microscope that analyzes fluorescence emitted from the antigen detection kit.
  • the present invention provides an antigen detection system in which false positive signals are eliminated.
  • the fluorescence microscope includes an objective unit where the antigen detection kit is installed; a light source unit supplying excitation light to the objective unit; And it may include a detection unit that analyzes fluorescence emitted by the excitation light.
  • the detection unit may include a spectroscopic means for spectralizing fluorescence emitted from the antigen detection kit.
  • the detector may detect the location of the antigen by comparing the shape or relative length of the spectralized fluorescence.
  • the detection unit includes one or more dichroic mirrors; And it may include one or more detection means to provide images according to the color of fluorescence, respectively.
  • the detector may detect the location of the antigen by comparing the location of each fluorescence in the image according to the color of the fluorescence.
  • the present invention also includes the steps of (a) preparing a capture antibody labeled with a first fluorescent substance; (b) preparing a detection antibody labeled with a second fluorescent substance having a different peak wavelength than the first fluorescent substance; (c) introducing a sample containing an antigen and inducing an antigen-antibody reaction between the antigen, the capture antibody, and the detection antibody; (d) supplying excitation light to cause the first and second fluorescent substances to emit light; and (e) analyzing the fluorescence generated from the first fluorescent material and the second fluorescent material to read the location and type of the antigen.
  • the step of reading the location and type of the antigen includes: spectralizing the fluorescence to read the shape or relative length of each fluorescence;
  • the method may include separating the fluorescence according to color to form an image for each color, and comparing and reading the position of each fluorescence in the image.
  • the capture antibody may be attached to the substrate before or after binding to the antigen.
  • the antigen detection kit from which false positive signals are eliminated according to the present invention attaches a fluorescent substance directly to the capture antibody and detection antibody, so it is possible to provide an antigen detection kit that is simple to handle and easy to manufacture.
  • false positives can be read more quickly and accurately than existing methods by distinguishing false positives using a spectroscopic analysis method of the generated fluorescence.
  • Figure 1 shows false positive cases that may occur in conventional immunoassays.
  • Figure 2 shows a case where a false positive may occur in an immunoassay using an antibody to which a fluorescent substance is attached.
  • Figure 3 shows the absorption spectrum and emission spectrum of a fluorescent material according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 shows the configuration of an antigen detection system according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 shows the fluorescence of a sample observed using spectroscopic means according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 shows the principle of blocking a portion of the spectrum using an identification filter according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 shows the fluorescence of a sample according to an embodiment of the present invention, (a) before spectrometry and (b) after passing through a food wall filter and spectroscopy.
  • Figure 8 shows another configuration of an antigen detection system according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows fluorescence observed according to an embodiment of the present invention, and shows images taken by different cameras according to each color.
  • Figure 10 shows the emission spectrum of CF532 and Alexa Fluor 594, which are phosphors used in an example of the present invention.
  • Figure 11 shows a sample observation image using spectroscopy according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 12 shows a sample observation image according to fluorescence color according to an embodiment of the present invention.
  • each process forming the method may occur differently from the specified order unless a specific order is clearly stated in the context. That is, each process may occur in the same order as specified, may be performed substantially simultaneously, or may be performed in the opposite order.
  • 'and/or' includes a combination of a plurality of listed items or any of a plurality of listed items.
  • 'A or B' may include 'A', 'B', or 'both A and B'.
  • biomarker includes all biological substances that can confirm the normal or pathological state of a living organism.
  • donor refers to a fluorescent material that transfers energy when excited by receiving light, and when two or more fluorescent materials are adjacent to each other, it refers to a fluorescent material that absorbs or emits light of a relatively short wavelength.
  • acceptor refers to a fluorescent material that receives energy from a donor in an excited state, and when two or more fluorescent materials are adjacent to each other, it refers to a fluorescent material that absorbs or emits light of a relatively long wavelength.
  • the sensitivity increases by about 1000 times to fg/ml compared to the existing method, but the types of biomarkers that can be detected are still limited to about 3 to 4 types.
  • FRET-PAINT technology a DNA-PAINT technology based on FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) is provided as a method to simultaneously detect various target substances while maintaining the high sensitivity of single-molecule fluorescence microscopy.
  • FRET refers to the phenomenon in which the energy of the initially excited state of the donor is transferred to the acceptor.
  • the donor material generally emits light with a shorter wavelength than the acceptor material, and the emission wavelength in this case overlaps the absorption wavelength of the acceptor (spectral overlap).
  • the rate and efficiency of energy transfer depend on the degree of overlap between the emission wavelength of the donor and the absorption wavelength of the acceptor, the quantum efficiency of the donor, the relative degree of arrangement of the transition dipoles of the donor and acceptor, and the distance between the donor and acceptor. .
  • the docking strand can have two DNA binding sites, one for the donor strand and the other for the acceptor strand, respectively.
  • the FRET signal of the acceptor is used.
  • the acceptor is not excited directly but is excited by FRET, thereby increasing the imager (donor and acceptor) concentration tens to hundreds of times, so imaging speed can be improved tens to hundreds of times compared to DNA-PAINT. You can. (Republic of Korea Patent No. 2195625))
  • the antibody in the case of this technology using FRET, the antibody must be processed to have a specific shape to form a FRET pair, so high costs may be incurred in producing the antibody.
  • antibodies processed as described above may have reduced stability, which may lead to difficulties in storage and transportation.
  • the inclusion of a fluorescent substance directly in the antibody not only facilitates the production of the antibody, but also improves the stability of the antibody.
  • a fluorescent substance is included in an antibody, a method is needed to distinguish between the antigen and the attached antibody, and in the case of the present invention, it is possible to identify only the antigen and the attached antibody using a spectroscopic analysis method.
  • the detection antibody is labeled with a fluorescent substance
  • the detection antibody attached to the antigen can be identified by emitting fluorescence.
  • the detection antibody not only binds specifically to the antigen, but may also bind non-specifically to the substrate, resulting in false positive results (see Figure 1).
  • both the detection antibody and the capture antibody can be labeled with a fluorescent substance for analysis.
  • both the detection antibody and the capture antibody may bind non-specifically to the substrate.
  • a true positive can be identified only when the first fluorescent substance labeled with the detection antibody and the second fluorescent substance labeled with the capture antibody are simultaneously detected at the same location (see Figure 2).
  • the present invention can provide a kit for antigen detection that can eliminate false positives due to non-specific binding by identifying antibodies attached to antigens using a spectroscopic method.
  • the present invention includes a substrate; A capture antibody that can be attached to the substrate and is labeled with a first fluorescent substance; and a detection antibody capable of binding to an antigen attached to the capture antibody and labeled with a second fluorescent substance, wherein the first fluorescent substance and the second fluorescent substance emit fluorescence having different peak wavelengths.
  • This relates to a kit for detecting antigens from which false positive signals are eliminated.
  • the substrate is an area for capturing and observing target antigens, and its shape is not particularly limited, but may have the form of a plate, spherical particle, rod-shaped structure, or other atypical structure, and may be made of glass, quartz, plastic, etc. It can be done.
  • the substrate may be a flat glass slide or a coverslip usually made of glass. Preferably, the substrate may be a #1 or #1.5 coverslip.
  • the substrate may be surface-treated with an organic material such as polyethylene glycol-biotin (PEG-Biotin) to enable attachment of the capture antibody.
  • PEG-Biotin polyethylene glycol-biotin
  • the substrate may be treated to prevent non-specific binding but allow the capture antibody to bind specifically.
  • the surface of the substrate may be coated with polyethylene glycol, BSA, etc. to prevent non-specific binding, and the specific binding of the capture antibody may be performed.
  • biotin-polyetheline glycol, biotin-BSA, anti-DIG antibody, etc. can be coated.
  • the capture antibody is an antibody that can capture antigens such as viruses or biomarkers by specifically binding to them. Biotin is introduced to the surface of the capture antibody, and avidin, which binds to biotin, is added to the substrate. The capture antibody can be attached to the substrate by introducing neutravidin or strepavidin.
  • the detection antibody is an antibody that can specifically bind to the antigen bound to the capture antibody.
  • the 'antibodies' used as the capture antibodies and detection antibodies specifically include monoclonal antibodies (including monoclonal antibodies and full-length monoclonal antibodies), polyclonal antibodies (polyclonal antibodies), and multispecific antibodies (e.g. (e.g., bispecific antibodies), and antibody fragments (e.g., variable regions and other parts of the antibody that exhibit the desired biological activity). Additionally, antibodies in this specification include both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, and may include chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies.
  • antibody includes, in addition to immunoglobulins, aptamers composed of nucleic acids, nucleic acid analogs, and peptides that can specifically bind to a target substance and thus perform the same function as the antibody.
  • the fluorescent material is a material that is excited by external energy such as ultraviolet rays, electrical energy, or thermal energy and changes the energy into light, and may include an organic phosphor or an inorganic phosphor.
  • organic fluorescent substance include Rhodamine, Alexa Fluor dye, fluorescein, FITC (fluorescein isothiocyanate), FAM (5-carboxy fluorescein), ATTO dye, BODIPY, CF dye, Cyanine ( It may be Cy) dye, DyLight Fluor, and Texas Red
  • examples of the inorganic phosphor include quantum dots.
  • the fluorescent substance of the present invention it may be included in the capture antibody and the detection antibody. That is, the capture antibody may be labeled with a first fluorescent substance, and the detection antibody may be labeled with a second fluorescent substance.
  • the first fluorescent material and the second fluorescent material have different peak wavelengths.
  • the fluorescent material may have its own emission spectrum according to the type of each fluorescent material. At this time, the part showing the highest amount of light in the emission spectrum is called the peak wavelength. Therefore, in order to distinguish between the fluorescent materials, it is preferable that the first fluorescent material and the second fluorescent material have different peak wavelengths (see FIG. 3).
  • the first fluorescent material and the second fluorescent material it is preferable that part of the emission spectrum overlaps. Excitation light is required to excite the first fluorescent material and the second fluorescent material. At this time, when the emission peaks of the first fluorescent material and the second fluorescent material are separated from each other, the absorption spectra of the first fluorescent material and the second fluorescent material may also not overlap. In this case, two excitation lights must be used to simultaneously emit light from the first fluorescent material and the second fluorescent material.
  • the first fluorescent material and the second fluorescent material overlap. It is possible to emit two fluorescent substances simultaneously. However, if it is necessary to observe each fluorescence independently or if the fluorescent material used for each antibody is designated, it is also possible to emit light using two excitation lights (see Figure 3).
  • the first fluorescent substance and the second fluorescent substance emit light simultaneously using one excitation light as described above, an antibody attached to the antigen (specific binding) and an antibody not attached to the antigen (non-specific binding) It may be difficult to distinguish (see Figure 2).
  • the capture antibody since it is an antibody attached to the substrate, it can attach to the substrate and emit light even in the absence of the antigen.
  • the capture antibody non-specifically bound to the substrate also emits light, so it has the disadvantage of being unable to distinguish between false positives (see Figure 2).
  • the present invention provides a system and method for distinguishing only antibodies to which the antigen is attached by spectroscopically analyzing fluorescence generated from the first fluorescent material and the second fluorescent material.
  • the kit for detecting the antigen and a fluorescence microscope that analyzes fluorescence emitted from the antigen detection kit.
  • the present invention provides an antigen detection system in which false positive signals are eliminated.
  • the fluorescence microscope includes an objective section where the antigen detection kit is installed; a light source unit supplying excitation light to the objective unit; And it may include a detection unit that analyzes fluorescence emitted by the excitation light.
  • the objective part 100 is a part where the antigen detection kit 110 is seated and fixed for easy observation, and includes a fixing means for fixing the antigen detection kit 110.
  • An objective lens 120 may be installed to supply excitation light to 110 and simultaneously collect/enlarge fluorescence emitted from the antigen detection kit 110.
  • a dichroic mirror 130 is installed to reflect the excitation light supplied from the light source unit 200 and supply it toward the antigen detection kit, and at the same time transmit the fluorescence generated from the antigen detection kit 110 to the antigen detection kit 110. It can be delivered to the detection unit (see Figure 4).
  • the dichroic mirror 130 is a type of mirror that reflects light in a specific wavelength band and transmits light in the remaining wavelength bands.
  • the dichroic mirror 130 reflects the excitation light and transmits the fluorescence. Reflection of the excitation light and transmission of the fluorescence can be performed simultaneously using a wing mirror.
  • the light source unit 200 is a part that generates excitation light to excite the phosphor of the sample, and an excitation light filter 220 may be installed to supply only the excitation light necessary for the sample.
  • the excitation light filter 220 may be a filter that transmits only light of a wavelength capable of exciting the phosphor attached to the sample among the light supplied from the light source 210 of the light source unit.
  • the excitation light filter 220 is preferably attached in a replaceable manner so as to form excitation light of various wavelengths.
  • the light source 210 may be used without limitation as long as it is light that can include the wavelength of the excitation light, but a white light emitting device with high color rendering may be preferably used.
  • the high-color rendering white light-emitting device has a smooth emission spectrum distributed throughout visible light, and also emits light so that this spectrum extends to the ultraviolet region, which is commonly used as excitation light, so it has an emission pattern similar to sunlight.
  • this high color rendering light emitting device light is emitted by mixing various light emitters and phosphors, so the excitation light of a desired spectrum can be formed using the excitation light filter 220.
  • the light source In particular, in the case of existing light sources, only light with a narrow spectrum is supplied, so if excitation light other than the spectrum supplied by the light source is required, the light source itself must be replaced. However, when a high color rendering white light emitting device is used as described above, the light source The desired excitation light can be formed simply by replacing the excitation light filter 220 without replacement.
  • a laser emitting monochromatic light may be used as a light source.
  • the monochromatic light emitted by the laser can simultaneously excite the phosphor.
  • the laser can have a higher luminous intensity compared to a light source using the light emitting device and can emit monochromatic light with a narrow spectral band. Therefore, since the phosphor can be excited more brightly, this laser light source can be used if the phosphor can use the same excitation light.
  • the high color rendering white light-emitting device it is preferable to use the high color rendering white light-emitting device, so it is desirable to select and use an appropriate light source according to the conditions of each experiment.
  • the detection unit 300 is a part installed to observe fluorescence generated from the sample and includes a tube lens (330) to facilitate observation of the fluorescence.
  • the type of fluorescence is determined by simply measuring the peak wavelength of fluorescence, so additional spectroscopic analysis must be performed, and the results also have the problem of not being displayed at a glance.
  • a spectroscopic method is used, and the type of fluorescence can be immediately confirmed using the detection unit 300, so that the type of fluorescence, especially the fluorescent substance attached to the antigen, can be located without additional spectroscopic analysis. It is possible to check quickly.
  • the detection unit can identify the fluorescent substance in two main ways.
  • the detection unit may include a spectroscopic means 320 that specifies the fluorescence emitted from the antigen detection kit.
  • the spectroscopic means 320 refers to a means for spectralizing the fluorescence incident on the detection unit. It can be used without limitation as long as it can spectralize the fluorescence, but is preferably a prism or a diffraction grating.
  • a spectrometer including:
  • the fluorescence can be observed by being split according to the wavelength.
  • the antigen is attached to the capture antibody, and the detection antibody is also attached to the antigen, so a spectrum that is longer than the point where the detection antibody and capture antibody exist (b in Figure 5) can be observed.
  • the length of the spectral spectrum is determined by the difference between the capture antibody and the detection antibody in the antigen. When attached, the length can be observed to be longer than when each exists independently.
  • the detection unit can detect the location of the antigen by comparing the shape or relative length of the spectralized fluorescence (see FIG. 5).
  • an identification filter may be installed in the detection unit to make it easier to compare shapes or relative lengths.
  • the identification filter 310 may be installed on the front or rear part of the spectroscopic means 320. In the case of fluorescence passing through the spectroscopic means 320, as seen above, it is divided according to the wavelength and can be observed in an oval shape, and some wavelengths of the fluorescence are blocked using the identification filter 310.
  • red fluorescence which has a spectral distribution of 470 nm to 670 nm and an emission peak of 530 nm
  • oval-shaped fluorescence with a portion of the left side cut off can be observed (short Specifies the wavelength of light to the left).
  • an identification filter that blocks wavelengths of 600 nm or more the right side of the oval may be observed to be cut off. That is, when an appropriate identification filter is used, an ellipse with a different cutoff portion can be observed depending on the type of fluorescence, which means that identification of the fluorescence is possible simply by appropriately selecting and using the identification filter.
  • the two types of fluorescence can be identified by the relative shape difference of the oval fluorescence remaining from the cut portion. This is when multiple fluorescent substances with close emission peaks are used simultaneously. This means that it can also be identified (see Figure 7).
  • the identification filter 310 includes a portion of the fluorescence spectrum having an emission peak of a short wavelength among the fluorescence emitted from the sample; Among the fluorescence emitted from the sample, at least one part of the fluorescence spectrum having a long wavelength emission peak can be blocked.
  • the brightest fluorescence is observed in the emission peak band, so it is preferable that the above blocking covers a part of the emission spectrum excluding the peak band.
  • the part including the emission peak band is blocked, fluorescence can be observed due to the remaining part, so it is desirable to use an identification filter that can cover a part of the fluorescence spectrum as described above.
  • the identification filter 310 includes a wavelength below the peak wavelength of the fluorescence spectrum having an emission peak of a short wavelength among the fluorescence emitted from the sample; And among the fluorescence emitted from the sample, a wavelength greater than the peak wavelength of the fluorescence spectrum having a long wavelength emission peak can be blocked. At this time, the fluorescence spectrum with the short-wavelength emission peak and the fluorescence spectrum with the long-wavelength emission peak are observed with wavelengths below or above the peak wavelength removed, and in the case of the remaining fluorescence, the peak wavelength is located between the two fluorescence. do.
  • the fluorescence spectrum with the short-wavelength emission peak and the fluorescence spectrum with the long-wavelength emission peak can serve as a kind of reference point, and based on this, the shape of the ellipse and the relative position difference with the blocking portion are measured to determine the fluorescence. can be identified.
  • the fluorescence having the emission peak of the short wavelength may preferably be the fluorescence having the emission peak of the shortest wavelength
  • the fluorescence having the emission peak of the long wavelength may preferably be the fluorescence having the emission peak of the longest wavelength. It is preferable that it is fluorescent.
  • the effect of the above identification filter can be maximized by blocking wavelengths below or above the peak wavelength of fluorescence having the shortest emission peak or the longest emission peak.
  • the identification filter 310 may be composed of one or more long-pass filters, short-pass filters, band-pass filters, or a combination thereof.
  • the long-wavelength pass filter is a filter that passes a relatively long-wavelength band, and when used, the short-wavelength portion can be blocked.
  • the short-wavelength pass filter is a filter that passes a relatively short-wavelength band, and when used, the filter can block the long-wavelength portion. Therefore, in the case of the present invention, by using a combination of such a long-wavelength pass filter and a short-wavelength pass filter, it can be used as an identification filter that passes only a certain band. Separately, it is also possible to use a band-pass filter that passes only wavelengths of a certain band.
  • the detection unit includes one or more dichroic mirrors; and one or more detection means to provide images according to the color of fluorescence, respectively.
  • each fluorescence can be separated and observed according to color.
  • the dichroic mirror 410 installed in the detection unit 400 it can be used to reflect only the fluorescence of the first fluorescent material or the fluorescence of the second fluorescent material, through which the first fluorescent material
  • the fluorescence (first image, (a) of FIG. 9) and the fluorescence of the second fluorescent material (second image, (b) of FIG. 9) can be separated and observed independently.
  • fluorescence is observed at a common location by comparing the first image and the second image, it can be identified as the area where the antigen is present, and if fluorescence is observed only in either the first image or the second image, It may be read as a false positive with no antigen present.
  • fluorescence according to the present invention can be separated into each color in the detection unit and observed independently.
  • the fluorescence indicated by the four upper dots is observed at a common location, but the lower dots are observed at different locations.
  • the four upper dots represent true positives in which the capture antibody and detection antibody are attached, respectively, and the lower dots represent false positives in which only the detection antibody or capture antibody is attached.
  • the present invention also includes the steps of (a) preparing a capture antibody labeled with a first fluorescent substance; (b) preparing a detection antibody labeled with a second fluorescent substance having a different peak wavelength than the first fluorescent substance; (c) introducing a sample containing an antigen and inducing an antigen-antibody reaction between the antigen, the capture antibody, and the detection antibody; (d) supplying excitation light to cause the first and second fluorescent substances to emit light; and (e) analyzing the fluorescence generated from the first fluorescent material and the second fluorescent material to read the location and type of the antigen.
  • the 'antibodies' used as the capture antibodies and detection antibodies specifically include monoclonal antibodies (including monoclonal antibodies and full-length monoclonal antibodies), polyclonal antibodies (polyclonal antibodies), and multispecific antibodies (e.g. (e.g., bispecific antibodies), and antibody fragments (e.g., variable regions and other parts of the antibody that exhibit the desired biological activity). Additionally, antibodies in this specification include both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, and may include chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies.
  • antibody includes, in addition to immunoglobulins, aptamers composed of nucleic acids, nucleic acid analogs, and peptides that can specifically bind to a target substance and thus perform the same function as the antibody.
  • the fluorescent material is a material that is excited by external energy such as ultraviolet rays, electrical energy, or thermal energy and changes the energy into light, and may include an organic phosphor or an inorganic phosphor.
  • organic fluorescent substance include Rhodamine, Alexa Fluor dye, fluorescein, FITC (fluorescein isothiocyanate), FAM (5-carboxy fluorescein), ATTO dye, BODIPY, CF dye, Cyanine ( It may be Cy) dye, DyLight Fluor, and Texas Red
  • examples of the inorganic phosphor include quantum dots.
  • the type of the sample is not particularly limited as long as it contains a target substance to be detected, but may be tissue, blood, serum, plasma, saliva, mucosal fluid, urine, etc., for example, an animal or human subject suspected of having a disease. It may have been obtained separately from.
  • the antigen may be a virus, bacteria, nucleic acid, peptide, protein, endoplasmic reticulum, miRNA, exosome, circulating tumor cell, biomarker, etc.
  • the antigen may be a biomarker.
  • the technology disclosed herein can be used to observe cells, tissues, organs, etc.
  • the technology disclosed herein can be very useful for detecting biomarkers in that it can detect multiple types of biological substances in a single test and quickly diagnose diseases at an early stage.
  • biomarkers can be used without limitation as long as they are used in general scientific or medical fields such as biological processing processes, pathogenic processes, and measurement or evaluation of pharmacological processes for treatment, and are not particularly limited.
  • the biomarker may be, for example, a polypeptide, peptide, nucleic acid, protein, or metabolite that can be detected in biological fluids such as blood, saliva, and urine, and specifically, alpha fetoprotein (AFP), CA15-3, CA27- 29, CA19-9, CA-125, calcitonin, calretinin, CEA (carcinoembryonic antigen), CD34, CD99, MIC-2, CD117, chromogranin, cytokeratin, various types: TPA, TPS, Cyfra21-1), desmin, EMA (epithelial membrane antigen), Factor VIII, CD31, FL1, GFAP (glial fibrillary acidic protein), GCDFP-15 (gross cystic disease fluid protein) , HMB-45, hCG (human chorionic gonadotropin), immunoglobulin, inhibin, keratin, various types of keratin, leukocyte marker, MART-1 (Melan-A), Myo D
  • the sample may be diluted with a solution that does not contain the biomarker, and the concentration of the biomarker contained in the sample may vary greatly from fg/ml to mg/ml depending on the type.
  • it can be diluted at various ratios so that an appropriate number of biomarker molecules can be detected by the image sensor.
  • it can be performed on the same sample diluted at different ratios, and most preferably, it can be diluted several times at a weight ratio of 1:10 to 1,000.
  • a complex of capture antibody-antigen-detection antibody can be formed through an antigen-antibody reaction.
  • the capture antibody may be attached to the substrate before binding to the antigen or may be attached to the substrate after binding to the antigen. That is, the antigen and the detection antibody can be attached to the capture antibody attached to the substrate, and separately, it is also possible to form a complex of capture antibody-antigen-detection antibody and then attach it to the substrate.
  • the substrate may be washed 1 to 10 times to remove the unbound capture antibody and detection antibody.
  • the washing solution used at this time may be a solution containing water or a buffer.
  • the buffer may be a PBS buffer or Tris buffer as a substance added to facilitate mixing of the capture antibody and the detection antibody as well as to facilitate storage of the antibodies.
  • the sample prepared as above is placed in the objective section of a fluorescence microscope, and then excitation light can be supplied to the sample using a light source.
  • the sample may be provided in kit form as discussed above.
  • the excitation light refers to light that supplies energy that can cause the phosphor contained in the sample to emit light. Using the excitation light, some electrons of the phosphor are excited, and the electrons in this excited state are in a normal state. As it returns, it emits fluorescence of a certain wavelength. Therefore, it is desirable to excite the phosphor using an appropriate excitation light depending on its type. In addition, as seen above, in the case of the present invention, since the absorption spectra of the fluorescent substances overlap, the same excitation light can be used even in the case of samples containing fluorescent substances with different emission peaks.
  • the fluorescence When fluorescence is emitted by excitation light as described above, the fluorescence may be incident on the detection unit. At this time, the detection unit can determine the presence or absence of the antigen using a spectroscopic method, as discussed above.
  • the step of reading the location and type of the antigen includes the step of analyzing the fluorescence and reading the shape or relative length of each fluorescence;
  • the method may include separating the fluorescence according to color to form an image for each color, and comparing and reading the position of each fluorescence in the image.
  • Example 1 Composition of capture antibody and detection antibody
  • the capture antibody was labeled with biotin and the fluorescent substance CF532, and the detection antibody was labeled with the fluorescent substance Alexa Fluor 594.
  • the capture antibodies were labeled with an average of 2 biotin and 3 CF532 per antibody, and the detection antibodies were labeled with an average of 5 Alexa Fluor 594 per antibody. Labeling the capture antibody with biotin is to immobilize it on the substrate, and attaching an average of 3 to 5 fluorescent substances is to increase the size of the signal and reduce the possibility of the presence of antibodies that are not observed because not a single fluorescent substance is labeled.
  • CF532 and Alexa Fluor 594 were selected so that they commonly absorb the 532 nm wavelength laser well but have distinct emission spectra (see Figure 10).
  • a microscope was configured as shown in Figure 4.
  • a 532 nm laser was used as the light source 210. Since a short-wavelength light source was used, a separate excitation light filter 220 was not used.
  • the objective lens (120) a lens with NA of 1.2, magnification of 60, and infinity-corrected water-immersion was used.
  • a long-pass dichroic mirror 130 was used to reflect the light source 210 but pass the light emitted from CF532 and Alexa Fluor 594, and an identification filter 310 with the same transmission characteristics was used.
  • a quartz wedge prism with an angle of 7 degrees and 41 minutes was used as a spectroscopic means (320) to observe the spectral form of light emitted from CF532 and Alexa Fluor 594.
  • An infinity-corrected objective lens was used, and since it images a wide wavelength range, a tube lens (330) with a focal length of 180 mm and chromatic aberration corrected was used.
  • 1 pM capture antibody, 1 pM detection antibody, and 100 fM antigen were mixed to induce an immune reaction between the capture antibody, antigen, and detection antibody to create a complex, and then injected into the substrate to immobilize the capture antibody. Since the capture antibody is fixed to the substrate by biotin, most of the capture antibody is fixed to the substrate. When an antigen is bound to a capture antibody, the detection antibody binds to the antigen and can be immobilized on the substrate. Since some may be immobilized on the substrate non-specifically, only a relatively small number of detection antibodies can be immobilized on the substrate.
  • Figure 11 (a) shows fluorescence observed at low magnification
  • Figure 11 (b) shows the white square portion observed at high magnification.
  • the capture antibody and detection antibody immobilized on the substrate regardless of the antigen appear in the shape of an oval due to a prism
  • the capture antibody-antigen-detection antibody complex appears in the form of two ovals connected.
  • a false positive signal simple ellipse
  • a true positive signal two connected ovals
  • a microscope was configured as shown in Figure 8 to observe samples according to the color of fluorescence.
  • a 532 nm laser was used as the light source 210. Since a short-wavelength light source was used, a separate excitation light filter 220 was not used.
  • the objective lens (120) a lens with NA of 1.2, magnification of 60, and infinity-corrected water-immersion was used.
  • a long-pass dichroic mirror 130 was used to reflect the light source 210 but pass the light emitted from CF532 and Alexa Fluor 594.
  • an identification filter 410 with a 600 nm cut-on wavelength was used.
  • An infinity-corrected objective lens was used, and since it images a wide wavelength range, the focal length was 180 mm, and the first tube lens (420) and second tube lens (421) with chromatic aberration corrected were used.
  • 1 pM capture antibody, 1 pM detection antibody, and 100 fM antigen were mixed to induce an immune reaction between the capture antibody, antigen, and detection antibody to create a complex, and then injected into the substrate to immobilize the capture antibody. Since the capture antibody is fixed to the substrate by biotin, most of the capture antibody is fixed to the substrate. When an antigen is bound to a capture antibody, the detection antibody binds to the antigen and can be immobilized on the substrate. Since some may be immobilized on the substrate non-specifically, only a relatively small number of detection antibodies can be immobilized on the substrate.
  • Figure 12 (a) shows CF532 labeled on the capture antibody observed with the second camera
  • Figure 12 (b) shows Alexa Fluor 594 labeled on the detection antibody observed with the first camera.
  • the area marked with a circle is where signals commonly appear in both cameras, meaning that the capture antibody and detection antibody are present at the same location. This can be considered a true positive signal because it means that the two antibodies are binding to the antigen.
  • the part indicated by the arrow is where the signal appears only from the first camera. Since there is no capture antibody and only the detection antibody, the detection antibody is non-specifically immobilized on the substrate and can be considered a false positive signal from the existing method. In this way, by labeling the capture antibody and the detection antibody with different fluorescent molecules and detecting both at the same time, false positive signals, which are a problem with existing methods, can be eliminated.

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Abstract

본 발명은 포획항체에 부착되는 형광분자와 검출항체에 부착되는 형광분자를 이용하여 바이오마커를 용이하게 검출할 수 있는 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 기판; 상기 기판 위에 부착될 수 있으며, 제1 형광물질이 표지된 포획항체; 및 상기 포획항체에 부착되는 항원과 결합할 수 있으며, 제2 형광물질이 표지된 검출항체를 포함하되, 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 상이한 피크파장을 가지는 형광을 발산하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트를 제공한다.

Description

위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트
본 발명은 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 포획항체에 부착되는 형광분자와 검출항체에 부착되는 형광분자를 이용하여 바이오마커를 용이하게 검출할 수 있는 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트에 관한 것이다.
종래 면역분석(immunoassay)에 있어서, 포획항체를 이용하여 항원을 기판 표면에 고정하고, 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP) 또는 형광물질 등이 표지되어 있는 검출항체를 항원과 결합시킨 후 HRP에 의한 버퍼의 색깔 변화 또는 형광물질의 밝기 등을 이용해 항원의 양을 측정하는 방법이 자주 사용되어 왔다.
하지만 검출항체는 항원으로 사용되는 바이오마커에 특이적으로 결합하는 것이 대부분이지만, 일부 검출항체의 경우 세척에 의하여 완전히 기판에서 제거되지 않거나 비특이적 결합에 의해 기판 표면과 같이 항원이 아닌 다른 곳에 결합할 수 있으며, 그 결과 위양성(false positive) 신호로 나타나 측정된 항원의 양을 부정확하게 만들 수 있다.
이런 위양성 신호는 시료 내에 항원(바이오마커)의 양이 많은 경우는 무시할 수 있지만, 바이러스 항원 검출 등 항원의 양이 적은 경우에는 큰 오차를 발생시킬 수 있는 문제가 있다. 도 1은 종래 면역분석에 있어서 발생할 수 있는 위양성 문제를 나타내는 도면이다. 특히 이러한 위양성 신호의 경우 바이러스성 질환 또는 암진단과 같이 항원의 양이 극히 적은 질병을 진단할 때 진단의 정확도를 떨어트리는 요인으로 작용할 수 있다.
따라서 항원의 양이 적을 경우 다량의 채혈에 따른 피검자의 심리적, 신체적 부담을 줄이고 진단의 정확성을 높이기 위해 높은 민감도를 가지면서 위양성 신호가 없는 신규한 기술의 개발이 요구된다.
전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 포획항체에 부착되는 형광분자와 검출항체에 부착되는 형광분자를 이용하여 바이오마커를 용이하게 검출할 수 있는 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트를 제공하고자 한다.
상술한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 기판; 상기 기판 위에 부착될 수 있으며, 제1 형광물질이 표지된 포획항체; 및 상기 포획항체에 부착되는 항원과 결합할 수 있으며, 제2 형광물질이 표지된 검출항체를 포함하되, 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 상이한 피크파장을 가지는 형광을 발산하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트를 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 하나 이상의 여기광에 의하여 동시에 발광되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 발광스펙트럼의 일부가 오버랩되어 있는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항원 검출용 키트; 및 상기 항원 검출용 키트에서 발산되는 형광을 분석하는 형광현미경을 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 형광현미경은, 상기 항원 검출용 키트가 설치되는 대물부; 상기 대물부에 여기광을 공급하는 광원부; 및 상기 여기광에 의하여 발산되는 형광을 분석하는 검출부를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 검출부는 상기 항원 검출용 키트에서 발산되는 형광을 분광시키는 분광수단을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 검출부는 상기 분광된 형광의 형태 또는 상대적인 길이를 비교하여 항원의 위치를 검출할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 검출부는, 1개 이상의 다이크로익 미러; 및 1개 이상의 검출수단을 포함하여 형광의 색상에 따른 화상을 각각 제공하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 검출부는 상기 형광의 색상에 따른 화상에서 각 형광의 위치를 비교하여 항원의 위치를 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 제1 형광물질이 표지된 포획항체를 준비하는 단계; (b) 상기 제1 형광물질과 상이한 피크파장을 가지는 제2 형광물질이 표지된 검출항체를 준비하는 단계; (c) 항원을 포함하는 시료를 도입하여, 상기 항원, 상기 포획항체 및 상기 검출항체 간에 항원-항체 반응을 유도하는 단계; (d) 여기광을 공급하여 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질을 발광시키는 단계; 및 (e) 상기 제1형광물질 및 상기 제2 형광물질에서 발생되는 형광을 분석하여 항원의 위치 및 종류를 판독하는 단계를 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 항원의 위치 및 종류를 판독하는 단계는, 상기 형광을 분광시켜 각 형광의 형태 또는 상대적인 길이를 판독하는 단계; 또는 상기 형광을 색상에 따라 분리하여 각 색상에 따른 화상을 형성하며, 상기 화상에서 각 형광의 위치를 비교하여 판독하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 포획항체는 상기 항원과 결합되기 이전 또는 상기 항원과 결합된 이후 기판에 부착되는 것일 수 있다.
본 발명에 의한 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트는 포획항체 및 검출항체에 형광물질을 직접 부착하고 있으므로, 취급이 간편하고 제작이 용이한 항원 검출용 키트를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 경우 발생되는 형광을 분광학적 분석방법을 이용하여 위양성을 구분함에 따라 기존의 방법에 비하여 빠르고 정확하게 위양성을 판독할 수 있다.
도 1은 종래의 면역 분석에 있어서 발생할 수 있는 위양성 분제를 나타낸 것이다.
도 2는 형광물질이 부착된 항체를 이용한 면역 분석에 있어서 위양성이 발생할 수 있는 경우를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광물질의 흡수스펙트럼과 발광스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 항원 검출 시스템의 구성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 분광수단을 이용하여 관찰된 시료의 형광을 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 식별필터를 이용하여 스펙트럼의 일부가 차단되는 원리를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 시료의 형광을 나타낸 것으로 (a)는 분광되기이전, (b)는 식벽필터를 통과하고 분광된 이후를 각각 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 항원 검출 시스템의 다른 구성을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광이 관찰된 것을 나타낸 것으로 각각의 색상에 따라 상이한 카메라에서 촬영된 것을 각각 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 사용된 형광체인 CF532와 Alexa Fluor 594의 발광스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의한 분광을 이용한 시료관찰이미지를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광색상에 따른 시료관찰이미지를 나타낸 것이다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
본 명세서에서, '및/또는' 이라는 용어는 복수의 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다. 본 명세서에서, 'A 또는 B'는, 'A', 'B', 또는 'A와 B 모두'를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "바이오마커"는 생명체의 정상 또는 병리적인 상태를 확인할 수 있는 생체물질을 모두 포함한다.
본 명세서에서 "도너"는 빛을 받아 여기되면 에너지를 전달하는 형광물질을 의미하고, 2 이상의 형광물질이 인접하는 경우, 상대적으로 짧은 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 형광물질을 의미한다.
본 명세서에서 "억셉터"는 여기상태의 도너로부터 에너지를 전달받는 형광물질을 의미하고, 2 이상의 형광물질이 인접하는 경우, 상대적으로 긴 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 형광물질을 의미한다.
최근 단분자 형광현미경 기술의 개발로 분자를 하나씩 관찰할 수 있게 되었고 이를 바이오마커 검출에 적용함으로써 민감도는 fg/ml 수준으로 1000배 가량 증가하게 되었다(Nature 473, 484-488, 2011). 통상적으로 사용하는 형광 이미징에서는 관찰하려는 분자에 형광물질을 고정하여, 서로 다른 종류의 바이오마커를 형광신호를 이용해 구분하는 방법을 사용한다. 이때 각각 서로 다른 색의 형광물질을 고정하고 색깔 차이를 이용해 바이오마커의 종류를 구분하는 방법을 사용하나, 통상의 이미지 센서로 구분하여 관찰할 수 있는 형광물질의 종류는 3~4가지 정도이다.
따라서, 단분자 형광현미경 기술을 사용할 경우, 민감도는 fg/ml로 기존 방법에 비해 1000배 가량 증가하나 검출할 수 있는 바이오마커의 종류는 여전히 3~4 가지 정도로 제한된다.
한편, 단분자 형광현미경의 높은 민감도를 유지하면서 다양한 타겟 물질을 동시에 검출하는 방법으로서, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)에 기초한 DNA-PAINT 기술인 FRET-PAINT 기술이 제공된다. FRET이란 최초에 여기된 도너(donor)의 여기된 상태의 에너지가 억셉터(acceptor)로 전달되는 현상을 의미한다. 도너 물질은 일반적으로 억셉터 물질에 비해 더 짧은 파장의 빛을 방출하게 되는데, 이때의 방출 파장은 억셉터의 흡수 파장과 중첩(spectral overlap)된다. 에너지 전달 속도와 효율은 도너의 방출 파장과 억셉터의 흡수 파장의 중첩의 정도, 도너의 양자 효율, 도너와 억셉터의 전이 쌍극자의 상대적인 배열 정도, 그리고 도너와 억셉터 사이의 거리 등에 의존하게 된다.
예를 들어 FRET-PAINT 기술에 따르면, 도킹스트랜드에 두 가지 DNA 결합 자리들을 가질 수 있으며, 각각 도너스트랜드 및 억셉터스트랜드를 위한 자리가 될 수 있다. 단일 분자 국지화(single-molecule localization)를 위해서 억셉터의 FRET 신호가 사용된다. FRET-PAINT 기술을 사용하면 억셉터가 직접 여기되지 않고 FRET에 의해 여기되어 이미저(도너 및 억셉터) 농도를 수십~수백배 높일 수 있으므로 DNA-PAINT에 비해 이미징 스피드가 수십~수백 배 향상될 수 있다. (대한민국 등록특허 제2195625호))
하지만 이러한 FRET를 이용한 기술의 경우 FRET쌍을 형성하기 위하여 항체를 특정한 형상을 가지도록 가공해야 하므로 항체의 제조에 많은 비용이 발생될 수 있다. 또한 상기와 같이 가공된 항체의 경우 그 안정성이 떨어질 수 있으며, 이에 따라 보관 및 운반에 어려움을 가질 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 경우 항체에 직접 형광물질을 포함시킴에 따라 항체의 제조가 용이할 뿐만 아니라 항체의 안정성 까지 향상되는 효과를 가져올 수 있다. 다만 항체에 형광체를 포함시키는 경우 항원과 부착된 항체를 구분하는 방법이 필요하며 본 발명의 경우 분광학적인 분석방법을 이용하여 상기 항원과 부착된 항체만을 식별하는 것이 가능하다.
이를 상세히 살펴보면 검출항체에 형광물질이 표지된 경우 항원에 부착된 검출항체가 형광을 발산하여 식별될 수 있다. 하지만 상기 검출항체는 상기 항원에 특이적으로 결합될 뿐만 아니라 기판에도 비특이적으로 결합될 수 있어 위양성을 나타내는 경우가 발생한다(도 1 참조).
이를 개선하기 위하여 검출항체 뿐 아니라 포획항체에도 형광물질을 표지하여 분석할 수 있다. 이 경우 검출항체와 포획항체 모두 기판에 비특이적으로 결합할 수 있다. 동일한 위치에서 검출항체에 표지된 제1 형광물질과 포획항체에 표지된 제2 형광물질이 동시에 검출되는 경우에만 진양성임을 알 수 있다(도 2 참조).
이에 본 발명의 경우 분광학적인 방법을 이용하여 항원에 부착된 항체를 식별하는 것으로 비특이적 결합에 의한 위양성을 제거할 수 있는 항원 검출용 키트를 제공할 수 있다.
따라서 본 발명은 기판; 상기 기판 위에 부착될 수 있으며, 제1 형광물질이 표지된 포획항체; 및 상기 포획항체에 부착되는 항원과 결합할 수 있으며, 제2 형광물질이 표지된 검출항체를 포함하되, 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 상이한 피크파장을 가지는 형광을 발산하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 기판은 타겟 항원을 포획하고 관찰하기 위한 영역으로 그 형태는 특별히 제한되지 않으나, 평판, 구형 입자, 막대형 구조, 및 기타 비정형 구조의 형태를 가질 수 있으며 그 재질도 유리, 석영, 플라스틱 등으로 이루어질 수 있다. 상기 기판은 통상 유리 재질로 된 평판 형태의 슬라이드 글라스나 커버슬립일 수 있다. 바람직하게는 상기 기판은 #1 또는 #1.5 커버슬립일 수 있다. 상기 기판은 상기 포획항체를 부착할 수 있도록 폴리에틸렌글리콜-비오틴(PEG-Biotin)과 같은 유기물로 표면처리된 것일 수 있다.
상기 기판은 비특이적 결합은 방지하되 포획항체는 특이적으로 결합할 수 있도록 처리되어 있을 수 있다, 이때 비특이적 결합 방지를 위하여 상기 기판의 표면은 폴리에틸렌글리콜, BSA 등이 코팅될 수 있으며, 포획항체의 특이적 결합 유도하기 위하여 비오틴-폴리에텔린글리콜, 비오틴-BSA, Anti-DIG 항체 등을 코팅할 수 있다.
상기 포획항체는 바이러스나 바이오마커와 같은 항원을 특이적으로 결합하여 포획할 수 있는 항체로서, 상기 포획항체의 표면에 비오틴(biotin)을 도입하고 상기 기판에는 비오틴과 결합하는 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 스트렙타비딘(strepavidin)을 도입하여 상기 포획항체를 상기 기판에 부착시킬 수 있다. 상기 검출항체는 상기 포획항체에 결합되어 있는 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다.
본 명세서에서 상기 포획항체와 검출항체로서 사용되는 '항체'는 구체적으로 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어, 가변 영역 및 목적하는 생물 활성을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에서의 항체는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하고, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), 나노바디(nanobody) 또는 scFv를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 scFv, Fab, 나노바디(nanobody) 및 면역글로불린 분자일 수 있다. 본 명세서에서 “항체”는 면역글로불린 외에도 타겟 물질과 특이적 결합을 할 수 있어 상기 항체와 동일한 기능을 할 수 있는 핵산, 핵산 유사체, 펩타이드로 구성된 압타머(aptamer)를 포함한다.
상기 형광물질은 자외선, 전기에너지, 열에너지 등의 외부 에너지에 의해 여기되어 그 에너지를 빛으로 바꾸는 물질로서, 유기 형광체 또는 무기 형광체를 포함할 수 있다. 상기 유기 형광체의 예는 로다민(Rhodamine), 알렉사(Alexa) Fluor dye, 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), FAM(5-carboxy fluorescein), ATTO dye, BODIPY, CF dye, Cyanine(Cy) dye, DyLight Fluor 및 텍사스 레드(Texas Red)일 수 있고, 상기 무기 형광체의 예는 양자점을 들 수 있다.
본 발명의 형광물질의 경우 상기 포획항체 및 상기 검출항체에 포함될 수 있다. 즉 상기 포획항체에는 제1 형광물질이 표지될 수 있으며, 상기 검출항체에는 제2 형광물질이 표지될 수 있다.
이때 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질을 상이한 피크파장을 가지는 것이 바람직하다. 형광물질은 여기광이 공급되는 경우 각 형광물질의 종류에 따른 각각의 발광스펙트럼을 가질 수 있다. 이때 상기 발광스펙트럼 중 가장 높은 광량을 보이는 부분을 피크파장이라 한다. 따라서 상기 형광물질을 구분하기 위하여 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질은 상이한 피크파장을 가지는 것이 바람직하다(도 3참조).
다만 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질의 경우 발광스펙트럼의 일부가 오버랩되어 있는 것이 바람직하다. 상기 제1형광물질 및 상기 제2 형광물질을 여기시키기 위해서는 여기광을 필요로 한다. 이때 상기 제1형광물질과 상기 제2 형광물질의 발광피크가 떨어져 있는 경우 상기 제1형광물질과 상기 제2형광물질의 흡수 스펙트럼 역시 오버랩되는 부분이 없을 수 있다. 이 경우에는 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질을 동시에 발광시키기 위해서는 2개의 여기광을 사용해야만 한다.
하지만 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질의 발광스펙트럼 일부가 오버랩되어 있는 경우 일반적으로는 각각의 흡수스펙트럼 역시 오버랩되어 있으며, 따라서 1개의 여기광을 이용하는 경우에도 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질을 동시에 발광시키는 것이 가능하다. 다만 각각의 형광을 독립적으로 관찰하는 것이 필요하거나 각각의 항체에 사용되는 형광물질이 지정되어 있는 경우 2개의 여기광을 이용하여 발광시키는 것도 가능하다(도 3 참조).
상기와 같이 1개의 여기광을 이용하여 상기 제1 형광물질과 상기 제2 형광물질을 동시에 발광시키는 경우 상기 항원에 부착되어 있는 항체(특이적 결합)와 항원에 부착되어 있지 않은 항체(비특이적 결합)의 구별이 어려울 수 있다(도 2 참조). 특히 상기 포획항체의 경우 상기 기판에 부착되는 항체이므로 상기 항원이 없는 경우에도 상기 기판에 부착되어 발광을 수행할 수 있다. 아울러 상기 기판에 비특이적으로 결합된 포획항체 역시 발광을 수행하게 되므로 위양성을 구분할 수 없다는 단점을 가지고 있다(도 2 참조).
이에 본 발명의 경우 상기 제1 형광물질 및 상기 제2형광물질에서 발생되는 형광을 분광학적으로 분석하여 상기 항원이 부착된 항체만을 구분하는 시스템 및 방법을 제공한다.
따라서 본 발명의 다른 관점에서 상기 항원 검출용 키트; 및 상기 항원 검출용 키트에서 발산되는 형광을 분석하는 형광현미경을 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템을 제공한다.
상기 형광현미경은, 상기 항원 검출용 키트가 설치되는 대물부; 상기 대물부에 여기광을 공급하는 광원부; 및 상기 여기광에 의하여 발산되는 형광을 분석하는 검출부를 포함할 수 있다.
상기 대물부(100)는 상기 항원검출용 키트(110)가 안착되어 관찰이 용이하도록 고정되는 부분으로, 상기 항원검출용 키트(110)를 고정하기 위한 고정 수단을 포함하고 있으며 상기 항원검출용 키트(110)에 여기광을 공급함과 동시에 상기 항원검출용 키트(110)에서 발광되는 형광을 수집/확대하기 위한 대물렌즈(120)가 설치될 수 있다. 또한 다이크로익 미러(130)가 설치되어 상기 광원부(200)에서 공급되는 여기광을 반사하여 상기 항원검출용 키트방향으로 공급함과 동시에 상기 항원검출용 키트(110)에서 발생되는 형광을 투과하여 상기 검출부로 전달할 수 있다(도 4 참조).
상기 다이크로익(Dichroic mirror) 미러(130)는 특정 파장대역의 빛을 반사하고 나머지 파장대역의 빛은 투과시키는 거울의 일종으로 본 발명의 경우 상기 여기광을 반사하면서도 상기 형광을 투과시키는 다이크로익 미러를 이용하여 상기 여기광의 반사와 상기 형광의 투과를 동시에 수행할 수 있다.
상기 광원부(200)는 상기 시료의 형광체를 여기시키기 위한 여기광을 발생시키는 부분으로, 상기 시료에 필요한 여기광만을 공급하기 위하여 여기광 필터(220)가 설치될 수 있다. 상기 여기광 필터(220)는 상기 광원부의 광원(210)에서 공급되는 빛 중 상기 시료에 부착되어 있는 형광체를 여기 시킬 수 있는 파장의 빛만을 투과시키는 필터일 수 있다. 또한 상기 여기광 필터(220)는 다양한 파장의 여기광을 형성할 수 있도록 교체식으로 부착되는 것이 바람직하다.
상기 광원(210)은 상기 여기광의 파장을 포함할 수 있는 빛이라면 제한 없이 사용될 수 있지만, 바람직하게는 연색성이 높은 백색 발광소자가 사용될 수 있다. 상기 고연색 백색 발광소자는 가시광 전역에 걸쳐 매끄러운 발광 스펙트럼이 분포되어 있으며, 또한 여기광으로 많이 사용되는 자외선 영역까지 이러한 스펙트럼이 이어지도록 발광되고 있어 태양광과 유사한 발광 패턴을 가지고 있다. 이 고연색 발광소자의 경우 다양한 발광체와 형광체를 혼합하여 발광을 수행하고 있으므로 상기 여기광 필터(220)를 이용하여 원하는 스펙트럼의 여기광을 형성할 수 있다. 특히 기존에 사용되는 광원의 경우 좁은 영역의 스펙트럼을 가지는 빛 만을 공급하고 있어 광원에서 공급되는 스펙트럼 외의 여기광이 필요한 경우 광원 자체를 교환하여야 하지만, 상기와 같이 고연색성 백색 발광소자를 사용하는 경우 광원의 교체 없이 상기 여기광 필터(220)를 교환하는 것만으로도 원하는 여기광을 형성할 수 있다.
또한 상기 백색발광소자 이외에도 단색광을 발산하는 레이저를 광원으로 사용될 수 있으며, 이 경우 상기 레이저가 발산하는 단색광은 상기 형광체를 동시에 여기시킬 수 있는 것이 바람직하다. 상기 레이저의 경우 상기 발광소자를 사용한 광원에 비하여 높은 광도를 가질 수 있으며, 스펙트럼 대역이 좁은 단색광을 발산할 수 있다. 따라서 상기 형광체를 더욱 밝게 여기시킬 수 있으므로, 상기 형광체들이 동일한 여기광을 사용할 수 있는 경우라면 이러한 레이저 광원을 사용할 수 있다. 다만 상기 형광체를 여기시키기 위하여 넓은 스펙트럼이 필요한 경우에는 상기 고연색의 백색 발광소자를 사용하는 것이 바람직하므로 각 실험의 조건에 따라 적절한 광원을 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 형광체가 여기된 이후 상기 형광체에서 발생된 형광은 상기 검출부에서 관찰될 수 있다. 상기 검출부(300)는 상기 시료에서 발생되는 형광을 관찰하기 위하여 설치되는 부분으로 튜브렌즈(tube lens, 330)를 포함하고 있어 상기 형광의 관찰을 용이하게 할 수 있다.
기존에 사용되는 형광현미경의 경우 단순히 형광의 피크파장을 측정하여 형광의 종류를 판별하고 있으므로, 분광분석을 추가로 수행해야 하며, 그 결과 역시 한눈에 표시되지 않는 문제점을 가지고 있다.
하지만 본 발명의 경우 분광학적인 방법을 이용하되, 상기 검출부(300)를 이용하여 상기 형광의 종류를 바로 확인할 수 있도록 하는 것으로 추가적인 분광분석 없이도 형광의 종류 특히 상기 항원에 부착되어 있는 형광물질을 위치를 신속하게 확인하는 것이 가능하다.
이를 위하여 상기 검출부는 크게 두 가지 방법으로 상기 형광물질을 확인할 수 있다.
그 첫 번째로 상기 검출부는 상기 항원 검출용 키트에서 발산되는 형광을 분광시키는 분광수단(320)을 포함할 수 있다.
상기 분광수단(320)은 상기 검출부에 입사되는 형광을 분광시키는 수단을 의미하는 것으로 상기 형광을 분광시킬 수 있는 것이라면 제한없이 사용될 수 있지만, 바람직하게는 프리즘(prism) 또는 회절격자(diffraction grating)를 포함하는 분광기를 사용할 수 있다.
이를 이용하는 경우 상기 형광은 파장에 따라 분광되어 관찰될 수 있다. 이때 상기 항원은 상기 포획항체에 부착되어 있으며, 상기 항원에는 또한 상기 검출항체가 부착되어 있으므로, 검출항체 및 포획항체가 각각 존재하는 지점(도 5의 b)에 비하여 길이가 긴 스펙트럼이 관측될 수 있다(도 5의 a). 특히 본 발명의 포획항체 및 검출항체에 부착되는 제1 형광체 및 제2 형광체의 경우 상이한 피크파장을 가짐에 따라(도 3참조) 상기 분광된 스펙트럼의 길이는 항원에 상기 포획항체 및 상기 검출항체가 부착되어 있는 경우 각각 독립적으로 존재하는 것에 비하여 길이가 길게 관측될 수 있다.
즉 상기 검출부는 상기 분광된 형광의 형태 또는 상대적인 길이를 비교하여 항원의 위치를 검출할 수 있다(도 5 참조).
또한 이러한 형태 또는 상대적인 길이의 비교를 더욱 용이하도록 상기 검출부에는 식별필터가 설치될 수 있다.
상기 식별필터(310)는 상기 분광수단(320)의 전면부에 또는 후면부에 설치될 수 있다. 상기 분광수단(320)을 통과하는 형광의 경우 위에서 살펴본 바와 같이 파장에 따라 분광되어 타원형으로 관측될 수 있으며, 상기 형광의 일부 파장을 상기 식별필터(310)를 이용하여 차단하고 있다.
따라서 일정한 파장을 차단하는 식별필터를 통과시키는 경우 상기 형광을 분광하였을 때 타원형의 일부가 절단되어 있는 형상으로 관찰될 수 있으며(도 6 참조), 이러한 절단의 위치는 상기 형광의 스펙트럼 분포 및 식별필터의 차단 파장과의 상대적인 조합에 의하여 결정될 수 있다.
예를 들어 470nm~670nm의 스펙트럼 분포를 가지며, 530nm의 발광피크를 가지는 적색 형광의 경우 500nm이하의 파장을 차단하는 식별필터를 통과하게 되면 좌측 일부가 절단된 타원형의 형광을 관찰할 수 있다(짧은 파장의 빛이 좌측으로 가도록 분광). 또한 600nm이상의 파장을 차단하는 식별필터를 사용하는 경우 상기 타원의 우측이 잘려있는 형상으로 관찰될 수 있다. 즉 적절한 식별필터를 사용하는 경우 상기 형광의 종류에 따라 다른 차단부를 가지는 타원이 관측될 수 있으며, 이는 상기 식별필터를 적절히 선택하여 사용하는 것만으로도 상기 형광의 식별이 가능한 것을 의미한다.
또한 상기 형광의 스펙트럼 피크가 근접하여 있는 경우에는 상기 잘려있는 부분으로부터 남아있는 타원형 형광의 상대적인 형상 차이에 의하여 두 가지 형광을 식별할 수 있으며, 이는 발광피크가 근접하는 다수개의 형광체를 동시에 사용하는 경우에도 이를 식별할 수 있음을 의미한다(도 7 참조).
또한 상기와 같은 식별을 용이하게 할 수 있도록 상기 식별필터(310)는, 상기 시료에서 발산되는 형광 중 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 일부; 상기 시료에서 발산되는 형광 중 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 일부 중 적어도 하나 이상을 차단할 수 있다.
일반적으로 발광 스펙트럼의 경우 발광 피크대역에서 가장 밝은 형광이 관찰되기 때문에 상기와 같은 차단은 상기 발광 스펙트럼의 피크대역을 제외한 일부를 가리는 것이 바람직하다. 하지만 상기 발광 피크 대역을 포함하는 부분을 차단하는 경우에도 남아 있는 부분으로 인하여 형광이 관찰될 수 있으므로, 상기와 같이 형광 스펙트럼의 일부를 가릴 수 있는 식별필터를 사용하는 것이 바람직하다.
또한 상기와 같은 식별을 용이하게 할 수 있도록 상기 식별필터(310)는, 상기 시료에서 발산되는 형광 중 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 피크 파장 이하의 파장; 및 상기 시료에서 발산되는 형광 중 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 피크 파장 이상의 파장을 차단할 수 있다. 이때 상기 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼 및 상기 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼은 피크 파장 이하 또는 이상의 파장이 제거되어 관찰되며, 나머지 형광의 경우 상기 두 형광의 사이에 피크 파장이 위치하게 된다. 따라서 상기 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼 및 상기 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼은 일종의 기준점으로 작용할 수 있으며, 이를 기준으로 하여 타원의 형상 및 차단부와의 상대적인 위치차이를 측정하여 상기 형광을 식별할 수 있다.
또한 이 경우 상기 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광은 바람직하게는 가장 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광일 수 있으며, 상기 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광은 바람직하게는 가장 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광인 것이 바람직하다. 가장 짧은 발광피크 또는 가장 긴 발광피크를 가지는 형광의 피크 파장 이하 또는 이상의 파장을 차단하는 것으로 상기와 같은 식별필터의 효과를 최대화 할 수 있다.
상기 식별필터(310)는 한 개 이상의 장파장통과필터(long-pass filter), 단파장통과필터(short-pass filter), 대역통과필터(band-pass filter) 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 상기 장파장통과필터는 상대적으로 장파장의 대역을 통과시키는 필터로 상기 필터를 사용하는 경우 단파장 부분을 차단할 수 있다. 또한 이와는 반대로 상기 단파장통과필터는 상대적으로 단파장의 대역을 통과시키는 필터로 상기 필터는 사용하는 경우 장파장 부분을 차단할 수 있다. 따라서 본 발명의 경우 이러한 장파장통과필터와 단파장통과필터를 조합하여 사용하는 것으로 일정대역대만을 통과시키는 식별필터로서 사용할 수 있다. 이와는 별도로 일정한 대역의 파장만을 통과시키는 대역통과필터를 사용하는 것도 가능하다.
상기 형광물질을 확인하기 위한 두 번째 방법으로는 상기 검출부는, 1개 이상의 다이크로익 미러; 및 1개 이상의 검출수단을 포함하여 형광의 색상에 따른 화상을 각각 제공할 수 있다.
두 번째 방법에서는 상기 검출부(400)에 다이크로익 미러(410)를 설치하여 각 형광을 색상에 따라 분해하여 관측할 수 있다. 이때 상기 검출부(400)에 설치되는 다이크로익 미러(410)의 경우 상기 제1 형광물질의 형광 또는 상기 제2 형광물질의 형광중 하나만을 반사하는 것을 사용할 수 있으며, 이를 통하여 상기 제1 형광물질의 형광(제1 화상, 도 9의 (a))과 상기 제2 형광물질의 형광(제2 화상, 도 9의 (b))이 각각 분리되어 독립적으로 관측될 수 있다.
이때 상기 제1 화상과 제2 화상을 비교하게 되면 상기 항원에 상기 포획항체 및 상기 검출항체가 부착되어 있는 경우 상기 제1 화상과 상기 제2 화상에 공동되는 지점에서 발광에 수행되며, 상기 검출항체 또는 상기 포획항체가 독립적으로 존재하는 경우에는 상기 제1 화상 또는 상기 제2 화상 중 하나에서만 형광이 관찰될 수 있다.
즉 상기 제1 화상 및 상기 제2 화상을 비교하여 공통되는 위치에서 형광이 관측되는 경우 상기 항원이 존재하는 부분으로 확인할 수 있으며, 상기 제1화상 또는 상기 제2화상 중 하나에서만 형광이 관측되는 경우 항원이 없는 위양성으로 판독될 수 있다.
이를 상세히 살펴보면 도 9에 나타난 바와 같이 본 발명에 의한 형광은 상기 검출부에서 각각의 색상으로 분리되어 독립적으로 관찰될 수 잇다. 이때 상기 도 9의 (a)과 (b)를 비교하면 상부의 4개의 점으로 표시된 형광을 공통된 위치에서 관측되고 있지만, 하부의 점은 각각 상이한 위치에서 관측되고 있다. 이는 상기 상부의 4개의 점은 2종의 형광체가 존재한다는 것이며, 하부의 점은 각각 하나의 형광체가 존재하는 것을 알 수 있다. 즉, 상기 상부의 4개의 점은 포획항체 및 검출항체가 각각 부착된 진양성을 나타내고 있으며, 하부의 점은 검출항체 또는 포획항체만으로 구성되어 있는 위양성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 제1 형광물질이 표지된 포획항체를 준비하는 단계; (b) 상기 제1 형광물질과 상이한 피크파장을 가지는 제2 형광물질이 표지된 검출항체를 준비하는 단계; (c) 항원을 포함하는 시료를 도입하여, 상기 항원, 상기 포획항체 및 상기 검출항체 간에 항원-항체 반응을 유도하는 단계; (d) 여기광을 공급하여 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질을 발광시키는 단계; 및 (e) 상기 제1형광물질 및 상기 제2 형광물질에서 발생되는 형광을 분석하여 항원의 위치 및 종류를 판독하는 단계를 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 상기 포획항체와 검출항체로서 사용되는 '항체'는 구체적으로 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어, 가변 영역 및 목적하는 생물 활성을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에서의 항체는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하고, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), 나노바디(nanobody) 또는 scFv를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 scFv, Fab, 나노바디(nanobody) 및 면역글로불린 분자일 수 있다. 본 명세서에서 “항체”는 면역글로불린 외에도 타겟 물질과 특이적 결합을 할 수 있어 상기 항체와 동일한 기능을 할 수 있는 핵산, 핵산 유사체, 펩타이드로 구성된 압타머(aptamer)를 포함한다.
상기 형광물질은 자외선, 전기에너지, 열에너지 등의 외부 에너지에 의해 여기되어 그 에너지를 빛으로 바꾸는 물질로서, 유기 형광체 또는 무기 형광체를 포함할 수 있다. 상기 유기 형광체의 예는 로다민(Rhodamine), 알렉사(Alexa) Fluor dye, 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), FAM(5-carboxy fluorescein), ATTO dye, BODIPY, CF dye, Cyanine(Cy) dye, DyLight Fluor 및 텍사스 레드(Texas Red)일 수 있고, 상기 무기 형광체의 예는 양자점을 들 수 있다.
상기 시료는 검출 대상이 되는 타겟 물질을 함유한 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 점막액, 뇨 등일 수 있으며, 예를 들어 질환이 의심되는 동물 또는 인간 개체로부터 분리 수득된 것일 수 있다.
상기 항원은 바이러스, 박테리아, 핵산, 펩타이드, 단백질, 소포체, miRNA, 엑소좀, 순환종양세포, 바이오마커 등일 수 있다. 바람직하게는 상기 항원은 바이오마커일 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술은 세포, 조직 및 기관 등을 관찰하는 데 사용될 수 있다. 특히 본 명세서에 개시된 기술이 한 번의 검사에서 여러 종의 생체물질을 검출하여 신속하게 질병을 조기진단할 수 있다는 점에서 바이오마커 검출용으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 바이오마커는 생물처리과정, 병원성을 일으키는 과정, 치료를 위한 약리학적 과정의 측정 또는 평가 등의 통상적인 과학 또는 의료분야에서 사용되는 것이면 제한 없이 이용가능하고, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 바이오마커는 예를 들어 혈액, 타액, 소변 등의 생체액에서 검출할 수 있는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 단백질 또는 대사물질일 수 있으며, 구체적으로는 AFP(alpha fetoprotein), CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, 칼시토닌(calcitonin), 칼레티닌(calretinin), CEA(carcinoembryonic antigen), CD34, CD99, MIC-2, CD117, 크라모그라닌(chromogranin), 사이토케라틴(cytokeratin, various types: TPA, TPS, Cyfra21-1), 데스민(desmin), EMA(epithelial membrane antigen), Factor VIII, CD31, FL1, GFAP(glial fibrillary acidic protein), GCDFP-15(gross cystic disease fluid protein), HMB-45, hCG(human chorionic gonadotropin), 면역글로불린(immunoglobulin), 인히빈(inhibin), 케라틴(keratin, various types of keratin), 백혈구 마커(lymphocyte marker), MART-1(Melan-A), Myo D1, MSA (muscle-specific actin), 뉴로필라멘트(neurofilament), NSE(neuron-specific enolase), PLAP(placental alkaline phosphatase), PSA(prostate-specific antigen), PTPRC(CD45), S100 protein, SMA(smooth muscle actin), 시냅토파이신(synaptophysin), TK(thymidine kinase), Tg(thyroglobulin), TTF-1(thyroid transcription factor-1), M2-PK, 바이멘틴(vimentin), 인터루킨(interleukin), CD24, CD40, 인테그린(integrin), 시스타틴(cystatin), 인터페론(interferon), TNF(tumor necrosis factor), MCP, VEGF, GLP, ICA, HLA-DR, ICAM, EGFR, FGF, BRAF, GFEB, FRS, LZTS, CCN, 뮤신(mucin), 렉틴(lectin), 아포리포단백질, 티로신, 신경세포 접착분자 유사 단백질, 파이브로넥틴, 포도당, 요산, 탄산탈수효소 또는 콜레스테롤 등일 수 있다.
또한 상기 시료는 상기 바이오마커가 포함되지 않은 용액으로 희석될 수 있으며, 상기 시료에 포함된 상기 바이오마커의 농도는 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 크게 차이가 날 수 있다. 바람직하게는 이미지 센서에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 희석될 수 있다. 바람직하게는 서로 다른 비율로 희석된 동일한 시료에 대해서 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1:10 내지 1,000의 중량비로 수 차례 희석하여 사용할 수 있다.
상기와 같이 항원이 공급되면 항원-항체반응을 통하여 포획항체-항원-검출항체의 복합체를 구성할 수 있다. 이때 상기 포획항체는 상기 항원과 결합되기 이전 상기 기판에 부착되어 있거나 상기 항원과 결합된 이후 상기 기판에 부착될 수 있다. 즉 상기 기판에 부착된 상기 포획항체에 상기 항원 및 상기 검출항체가 부착될 수 있으며, 이와는 별도로 포획항체-항원-검출항체의 복합체를 구성한 다음 상기 기판에 부착되는 것도 가능하다.
상기 포획항체-항원-검출항체의 복합체가 상기 기판상에 형성된 이후 미결합된 포획항체 및 검출항체를 제거하기 위하여 상기 기판은 1~10회 세척될 수 있다. 이때 사용되는 세척액으로는 물 또는 버퍼를 함유하는 용액일 수 있다.
상기 버퍼는 상기 포획항체 및 상기 검출항체의 혼합을 용이하도록 할 뿐만 아니라 상기 항체들의 보관을 용이하게 할 수 있도록 첨가되는 물질로서 PBS버퍼 또는 트리스(Tris)버퍼를 사용할 수 있다.
상기와 같이 준비된 시료는 형광 현미경의 대물부에 위치된 다음, 상기 시료에 광원을 이용하여 여기광을 공급할 수 있다. 이때 상기 시료는 위에서 살펴본 바와 같이 키트형태로 제공될 수 있다.
상기 여기광은 상기 시료에 포함되어 있는 형광체를 발광시킬 수 있는 에너지를 공급하는 광을 의미하는 것으로 상기 여기광을 이용하여 상기 형광체의 일부 전자가 들뜬 상태로 되며, 이러한 들뜬 상태의 전자가 정상 상태로 돌아오면서 일정한 파장의 형광을 발산하게 된다. 따라서 상기 형광체는 그 종류에 따라 적절한 여기광을 사용하여 여기시키는 것이 바람직하다. 아울러 본 발명의 경우 상기 형광물질의 흡수스펙트럼이 오버랩되어 있으므로 상이한 발광피크를 가지는 형광물질을 포함하는 시료의 경우에도 동일한 여기광을 사용할 수 있음은 위에서 살펴본 바와 같다.
상기와 같이 여기광에 의하여 형광이 발산되면 상기 형광은 검출부에 입사될 수 있다. 이때 상기 검출부는 위에서 살펴본 바와 같이 분광학적인 방법을 이용하여 상기 항원의 존재여부를 판별할 수 있다.
이때 상기 항원의 위치 및 종류를 판독하는 단계는, 상기 형광을 분광시켜 각 형광의 형태 또는 상대적인 길이를 판독하는 단계; 또는 상기 형광을 색상에 따라 분리하여 각 색상에 따른 화상을 형성하며, 상기 화상에서 각 형광의 위치를 비교하여 판독하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
실시예 1. 포획항체 및 검출항체 구성
CEA(암태아성항원, Carcino-Embryonic Antigen)을 검출하기 위해 포획항체에는 비오틴(biotin)과 형광물질 CF532를 표지하였고, 검출항체에는 형광물질 Alexa Fluor 594를 표지하였다. 포획항체에는 항체당 평균 2개의 비오틴과 평균 3개의 CF532를 표지하였고, 검출항체에는 항체당 평균 5개의 Alexa Fluor 594를 표지하였다. 포획항체에 비오틴을 표지하는 것은 기판에 고정하기 위함이고, 평균 3~5개의 형광물질을 붙이는 것은 신호의 크기를 키우고, 단 하나의 형광물질도 표지되지 않아 관찰되는 않는 항체의 존재 가능성을 낮추기 위함이다. 공통적으로 532 nm 파장의 레이저를 잘 흡수하되 발광스펙트럼은 서로 구분될 수 있도록 CF532와 Alexa Fluor 594를 선택했다(도 10 참조).
실시예 2. 분광을 이용한 시료 관찰
분광을 이용한 시료 관찰을 위해 도4와 같이 현미경을 구성했다. 포획항체에 표지한 CF532와 검출항체에 표지한 Alexa Fluor 594를 동시에 여기하기 위해 광원(210)으로 532 nm 레이저를 사용했고, 단파장 광원을 사용했으므로 별도의 여기광 필터(220)는 사용하지 않았다. 대물렌즈(120)로는 NA가 1.2이고, 배율은 60이며, infinity-corrected water-immersion인 렌즈를 사용했다. 광원(210)은 반사하되 CF532와 Alexa Fluor 594에서 방출된 빛은 통과하도록 장파장 통과(long-pass) 다이크로익 미러(130)를 사용했고, 동일한 투과 특성의 식별 필터(310)을 사용했다. CF532와 Alexa Fluor 594에서 방출된 빛의 스펙트럼 형태를 관찰하기 위한 분광수단(320)으로 각도 7도 41분의 석영 웨지(wedge) 프리즘을 사용했다. Infinity-corrected 대물렌즈를 사용했고, 넓은 파장 범위를 이미징 하므로 초점거리가 180 mm이고, 색수차가 보정된 튜브렌즈(330)를 사용했다.
1 pM 포획항체, 1pM 검출항체, 100 fM 항원을 혼합하여 포획항체-항원-검출항체 사이의 면역반응을 유도하여 복합체를 만든 후 기판에 주입하여 포획항체를 고정했다. 포획항체는 비오틴에 의해 기판에 고정되므로 대부분의 포획항체는 기판에 고정된다. 검출항체는 포획항체에 항원이 결합되어 있는 경우 항원에 결합하며 기판에 고정될 수 있고, 일부는 비특이적으로 기판에 고정될 수 있으므로 상대적으로 소수의 검출항체만이 기판에 고정될 수 있다.
도 11의 (a)는 저배율로 형광을 관찰한 것이며, 도 11의 (b)는 흰색 사각형 부분을 고배율로 관찰한 것이다. 도 11의 (b)에 나타난 바와 같이 항원과 무관하게 기판에 고정된 포획항체와 검출항체는 프리즘에 의해 타원형태로 나타나고, 포획항체-항원-검출항체 복합체는 두 개의 타원이 이어진 형태로 나타난다. 즉 두 개의 타원이 이어진 형태로 나타난 부분에만 포획항체와 검출항체가 동시에 존재한다는 것을 확인할 수 있으며, 이를 통하여 위양성 신호(단순타원)와 진양성 신호(두개의 이어진 타원)를 구분할 수 있다. 이처럼 이미지를 분석하여 위양성 신호(검출항체 단독, 포획항체 단독)를 제거하고 진양성 신호(포획항체-항원-검출항체 복합체)만을 정확히 검출할 수 있다.
실시예 3. 형광의 색상에 따른 시료 관찰
형광의 색상에 따른 시료 관찰을 위해 도 8과 같이 현미경을 구성했다. 포획항체에 표지한 CF532와 검출항체에 표지한 Alexa Fluor 594를 동시에 여기하기 위해 광원(210)으로 532 nm 레이저를 사용했고, 단파장 광원을 사용했으므로 별도의 여기광 필터(220)는 사용하지 않았다. 대물렌즈(120)로는 NA가 1.2이고, 배율은 60이며, infinity-corrected water-immersion인 렌즈를 사용했다. 광원(210)은 반사하되 CF532와 Alexa Fluor 594에서 방출된 빛은 통과하도록 장파장 통과(long-pass) 다이크로익 미러(130)를 사용했다. 상대적으로 짧은 파장의 빛을 방출하는 CF532의 신호는 반사해 제2 카메라(431)에서 관측되도록 하고, 상대적으로 긴 파장의 빛을 방출하는 Alexa Fluor 594의 신호는 투과해 제1 카메라(430)에서 관측되도록 하기 위해 600 nm cut-on 파장의 식별 필터(410)를 사용했다. Infinity-corrected 대물렌즈를 사용했고, 넓은 파장 범위를 이미징 하므로 초점거리가 180 mm이고, 색수차가 보정된 제1 튜브렌즈(420)와 제2 튜브렌즈(421)를 사용했다.
1 pM 포획항체, 1pM 검출항체, 100 fM 항원을 혼합하여 포획항체-항원-검출항체 사이의 면역반응을 유도하여 복합체를 만든 후 기판에 주입하여 포획항체를 고정했다. 포획항체는 비오틴에 의해 기판에 고정되므로 대부분의 포획항체는 기판에 고정된다. 검출항체는 포획항체에 항원이 결합되어 있는 경우 항원에 결합하며 기판에 고정될 수 있고, 일부는 비특이적으로 기판에 고정될 수 있으므로 상대적으로 소수의 검출항체만이 기판에 고정될 수 있다. 도 12의 (a)는 포획항체에 표지되어 있는 CF532를 제2 카메라로 관찰한 것이고, 도 12의 (b)는 검출항체에 표지되어 있는 Alexa Fluor 594를 제1 카메라로 관찰한 것이다. 원으로 표시한 부분은 두 카메라에 공통적으로 신호가 나타난 곳이며, 동일한 위치에 포획항체와 검출항체가 동시에 존재함을 의미한다. 이는 두 항체가 항원에 의해 결합하고 있음을 의미하므로 진양성 신호라 할 수 있다. 화살표로 표시한 부분은 제1 카메라에만 신호가 나타난 곳으로, 포획항체는 존재하지 않고, 검출항체만 존재하므로 검출항체가 비특이적으로 기판에 고정된 것이며, 기존 방법의 위양성 신호라 할 수 있다. 이처럼 포획항체와 검출항체에 서로 다른 형광분자를 표지하고, 이 둘을 동시에 검출함으로써 기존 방법의 문제점인 위양성 신호를 제거할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 기판;
    상기 기판 위에 부착될 수 있으며, 제1 형광물질이 표지된 포획항체; 및
    상기 포획항체에 부착되는 항원과 결합할 수 있으며, 제2 형광물질이 표지된 검출항체;
    를 포함하되,
    상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 상이한 피크파장을 가지는 형광을 발산하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 하나 이상의 여기광에 의하여 동시에 발광되는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질은 발광스펙트럼의 일부가 오버랩되어 있는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항원 검출용 키트; 및
    상기 항원 검출용 키트에서 발산되는 형광을 분석하는 형광현미경;
    을 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 형광현미경은,
    상기 항원 검출용 키트가 설치되는 대물부;
    상기 대물부에 여기광을 공급하는 광원부; 및
    상기 여기광에 의하여 발산되는 형광을 분석하는 검출부;
    를 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 검출부는 상기 항원 검출용 키트에서 발산되는 형광을 분광시키는 분광수단을 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 검출부는 상기 분광된 형광의 형태 또는 상대적인 길이를 비교하여 항원의 위치를 검출하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 검출부는,
    1개 이상의 다이크로익 미러; 및
    1개 이상의 검출수단;
    을 포함하여 형광의 색상에 따른 화상을 각각 제공하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 검출부는 상기 형광의 색상에 따른 화상에서 각 형광의 위치를 비교하여 항원의 위치를 검출하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 시스템.
  10. (a) 제1 형광물질이 표지된 포획항체를 준비하는 단계;
    (b) 상기 제1 형광물질과 상이한 피크파장을 가지는 제2 형광물질이 표지된 검출항체를 준비하는 단계;
    (c) 항원을 포함하는 시료를 도입하여, 상기 항원, 상기 포획항체 및 상기 검출항체 간에 항원-항체 반응을 유도하는 단계;
    (d) 여기광을 공급하여 상기 제1 형광물질 및 상기 제2 형광물질을 발광시키는 단계; 및
    (e) 상기 제1형광물질 및 상기 제2 형광물질에서 발생되는 형광을 분석하여 항원의 위치 및 종류를 판독하는 단계;
    를 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 항원의 위치 및 종류를 판독하는 단계는,
    상기 형광을 분광시켜 각 형광의 형태 또는 상대적인 길이를 판독하는 단계; 또는
    상기 형광을 색상에 따라 분리하여 각 색상에 따른 화상을 형성하며, 상기 화상에서 각 형광의 위치를 비교하여 판독하는 단계;
    를 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 포획항체는 상기 항원과 결합되기 이전 또는 상기 항원과 결합된 이후 기판에 부착되는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법.
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