KR20200042844A - 다중 바이오마커 동시 검출용 키트 및 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

기판, 2종 이상의 형광분자가 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand) 및 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체를 포함하고, 상기 형광분자는 상기 도킹 스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는, 다중 바이오마커 동시 검출용 키트 및 검출 방법을 제공한다.

Description

다중 바이오마커 동시 검출용 키트 및 검출 방법 {Kit for detecting multiple biomarkers and detection method}
기판, 2종 이상의 형광분자가 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand) 및 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체를 포함하고, 상기 형광분자는 상기 도킹 스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는, 다중 바이오마커 동시 검출용 키트 및 검출 방법이 개시된다.
바이오마커는 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용하여 몸 속의 변화를 알아낼 수 있는 생물학적인 지표를 말한다. 생명체로부터 유래된 특정 시료에 포함되어 있는 바이오마커를 검출하는 방법으로, 생명체의 정상 또는 병리적인 상태를 확인 할 수 있고, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정 가능하다. 최근에는 암을 비롯해 심장질환, 뇌졸중, 치매 등 각종 난치병을 진단하기 위한 효과적인 방법이라는 점에서 의료계의 각광을 받고 있다.
통상적으로 사용되는 바이오마커 검출 기술은 주로 ELISA 기반의 기술로서, 최대 수-수십pg/ml 수준의 민감도를 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 바이오마커를 검출하기 위해서는 민감도에 비례하는 일정량 이상의 생체시료를 필요로 한다.
바이오마커를 이용하여 종양의 발생 유무를 판별하는 경우, 한 번의 검사에서 한 가지의 바이오마커를 판별하여 여러 번 검사를 반복하는 경우가 대부분이다. 그러나, 종양이 발생하게 되면, 하나의 바이오마커의 수치만 변하는 것이 아니라 2 이상의 바이오마커의 수치가 변하게 된다. 따라서, 종양의 발생 여부를 확인하기 위해서는 여러 종의 바이오마커를 동시에 검출하는 것이 발병 여부 판별의 정확도를 높일 수 있다.
현재의 기술로 다수의 바이오마커를 검출하기 위해서는, 검출하고자 하는 바이오마커의 수에 비례하는 혈액의 양과 키트가 요구된다. 이는 다량의 채혈에 따른 피검자의 심리적, 신체적 부담 및 다수의 검출용 키트 사용에 따른 경제적 부담을 유발할 뿐만 아니라, 질병의 조기 진단에도 어려움을 가져올 수 있어 N종의 바이오마커를 동시에 진단할 필요가 있다.
미량의 생체 시료를 이용하여 N종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있도록, 높은 민감도와 다중 진단이 가능한 기술이 요구되는 실정이다.
한국등록특허 제1431062호, "유방암 진단용 다중 바이오마커 세트, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트" (공개일: 2013.09.23) 한국공개특허 제20170096619호, "3차원 단백질 나노입자 프로브 기반 복수 질환의 동시검출 방법 및 키트"(공개일: 2017.08.24)
본 발명의 목적은 기판, 2종 이상의 형광분자가 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand) 및 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체를 포함하고, 상기 형광분자는 상기 도킹 스트랜드의 특정 염기(base), 3’- 또는 5’-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는, 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다중 바이오마커를 동시에 검출하는 방법에 관한 것으로, 기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계, N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계 및 상기 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)으로 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별한 후 단위 면적당 바이오마커의 개수로부터 바이오마커의 농도를 측정하는, 다중 바이오마커 동시 검출 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 기판; 2종 이상의 형광분자가 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 및 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체를 포함하고, 상기 형광분자는 상기 도킹 스트랜드의 특정 염기(base), 3’- 또는 5’-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는, 다중 바이오마커 동시 검출용 키트가 제공된다.
기판; 1종 이상의 형광분자가 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체; 및 1종 이상의 형광분자가 표지된 도너 스트랜드(Donor strand)를 포함하고, 상기 형광분자는 상기 도킹 스트랜드 또는 도너 스트랜드의 특정 염기(base), 3’- 또는 5’-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는, 다중 바이오마커 동시 검출용 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 기판; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체;
1종 이상의 형광분자가 표지된 도너 스트랜드(Donor strand); 및 1종 이상의 형광분자가 표지된 억셉터 스트랜드(Acceptor strand); 를 포함하고, 상기 형광분자는 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드의 특정 염기(base), 3’- 또는 5’-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는, 다중 바이오마커 동시 검출용 키트가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 도킹 스트랜드는, 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 키트는, 포획항체를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 다중 바이오마커를 동시에 검출하는 방법에 관한 것으로, 기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계; 및 상기 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계; 를 포함하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)으로 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별한 후 단위 면적당 바이오마커의 개수로부터 바이오마커의 농도를 측정하는, 다중 바이오마커 동시 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 다중 바이오마커를 동시에 검출하는 방법에 관한 것으로, 기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계; 및 상기 N종의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 상보적으로 결합하는 단계; 및 발광 스펙트럼을 측정하는 단계; 를 포함하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)으로 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별한 후 단위 면적당 바이오마커의 개수로부터 바이오마커의 농도를 측정하는, 다중 바이오마커 동시 검출 방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 검출 방법은, 도킹 스트랜드에 형광분자가 표지된 억셉터 스트랜드가 상보적으로 결합하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 형광분자는, 상기 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드의 특정 염기(base), 3’- 또는 5’-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 검출 방법은, 상기 기판에 포획항체를 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 프렛을 이용하여 N 종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있고, 적은 양의 시료에 포함된 낮은 농도의 바이오마커 종류를 구별할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 인접한 2종 이상의 형광분자간에 발생하는 에너지 공명현상을 이용하여 형광분자가 표지된 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정함으로써 바이오마커의 종류를 판별할 수 있다. 또, 도너로 작용하는 형광분자를 모두 동일하게 표지하여 하나의 광원으로 다수 개의 바이오마커 종류를 판별할 수 있어, 추가적인 광원과 광학필터를 요하지 않아 간단한 구성을 가지며, 추가적인 광학필터에 의한 측정에 필요한 발광 스펙트럼의 손실이 방지되는 장점이 있다.
더욱이, 도너 및 억셉터가 표지된 스트랜드가 일시적으로 결합되는 특징이 있으므로, 도너 또는 억셉터로 작용하는 형광분자가 광표백이 되는 경우에도, 결합과 분리를 반복하는 과정에서 광표백 되지 않은 형광분자가 표지된 도너 스트랜드(Donor strand) 또는 억셉터 스트랜드(Acceptor strand)가 도킹 스트랜드(Docking strand)에 결합하는 순간에 발광 스펙트럼을 측정함으로써 광표백 현상과 관계없이 N종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있다. 또한, 일시적으로 빛을 내는 형광분자를 주변 형광분자의 간섭 없이 측정할 수 있어, 해당 형광분자의 위치를 10nm 미만의 높은 정밀도 측정할 수 있어 높은 다이나믹 레인지(dynamic range)를 가진다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 2는 도너와 억셉터 간의 거리에 따른 발광스펙트럼의 차이를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 4는 2종 이상의 억셉터가 표지되는 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 바이오마커 검출 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 RNA 검출용 키트를 예시적으로 도시한 것이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 용어에 대하여 간단히 설명한다.
본 명세서에서 “바이오마커”는 생명체의 정상 또는 병리적인 상태를 확인 할 수 있는 생체물질을 모두 포함한다.
본 명세서에서 “항체”는 “검출항체”를 포함하는 광의의 의미로 사용되며, 구체적으로는 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어, 가변 영역 및 목적하는 생물 활성을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하고, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함한다. 바람직하게는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), 나노바디(nanobody) 또는 scFv를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 scFv, Fab, 나노바디 및 면역글로불린 분자일 수 있다.
본 명세서에서 “스트랜드”는 특정 염기의 상에 형광분자를 부착할 수 있는 상태의 핵산 또는 이미 형광분자가 부착된 상태의 단일가닥 또는 이중가닥 핵산을 의미한다.
본 명세서에서 “형광분자”는 상기 스트랜드에 표지되어 검출이 가능한 형광 색소 화합물을 의미한다.
본 명세서에서 “프렛”은 인접한 2개의 형광분자의 공명에 의해 에너지가 전달되는 메커니즘을 의미한다. 구체적으로는, 빛에 의해 여기(excited)된 형광분자의 에너지가 인접한 다른 형광분자에 전달되는 현상을 일컫는 용어로, 당업자가 인식하는 통상적인 프렛의 의미를 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 “도너”는 빛을 받아 여기되면 에너지를 전달하는 형광분자를 의미하고, 2 이상의 형광분자가 인접하는 경우, 상대적으로 짧은 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 형광분자를 의미한다.
본 명세서에서 “억셉터”는 여기상태의 도너로부터 에너지를 전달받는 형광분자를 의미하고, 2 이상의 형광분자가 인접하는 경우, 상대적으로 긴 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 형광분자를 의미한다.
본 명세서에서 “포획항체”는 전술한 용어 “항체”에 포함되는 어느 하나일 수 있으며, 구체적으로는 바이오마커를 기판에 고정시키는 역할을 수행하는 항체를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 기판; 2종 이상의 형광분자가 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 및 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체를 포함하고, 상기 형광분자는 상기 도킹 스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는, 다중 바이오마커 동시 검출용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 기판; 1종 이상의 형광분자가 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체; 및 1종 이상의 형광분자가 표지된 도너 스트랜드(Donor strand)를 포함하고, 상기 형광분자는 상기 도킹 스트랜드 또는 도너 스트랜드의 특정 염기(base), 3’- 또는 5’-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는, 다중 바이오마커 동시 검출용 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 기판; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체; 1종 이상의 형광분자가 표지된 도너 스트랜드(Donor strand); 및 1종 이상의 형광분자가 표지된 억셉터 스트랜드(Acceptor strand); 를 포함하고, 상기 형광분자는 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드의 특정 염기(base), 3’- 또는 5’-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는, 다중 바이오마커 동시 검출용 키트가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 도킹 스트랜드는, 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 키트는, 포획항체를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 다중 바이오마커를 동시에 검출하는 방법에 관한 것으로, 기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계; 및 상기 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계; 를 포함하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)으로 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별한 후 단위 면적당 바이오마커의 개수로부터 바이오마커의 농도를 측정하는, 다중 바이오마커 동시 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 다중 바이오마커를 동시에 검출하는 방법에 관한 것으로, 기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계; 및 상기 N종의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 상보적으로 결합하는 단계; 및 발광 스펙트럼을 측정하는 단계; 를 포함하고, 서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)으로 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별한 후 단위 면적당 바이오마커의 개수로부터 바이오마커의 농도를 측정하는, 다중 바이오마커 동시 검출 방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 검출 방법은, 도킹 스트랜드에 형광분자가 표지된 억셉터 스트랜드가 상보적으로 결합하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 형광분자는, 상기 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드의 특정 염기(base), 3’- 또는 5’-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 검출 방법은, 상기 기판에 포획항체를 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바이오마커는 혈액, 타액, 소변 등의 생체액에서 검출할 수 있는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 단백질 또는 대사물질일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, AFP(alpha fetoprotein), CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, 칼시토닌(calcitonin), 칼레티닌(calretinin), CEA(carcinoembryonic antigen), CD34, CD99, MIC-2, CD117, 크라모그라닌(chromogranin), 사이토케라틴(cytokeratin, various types: TPA, TPS, Cyfra21-1), 데스민(desmin), EMA(epithelial membrane antigen), Factor VIII,　CD31,　FL1, GFAP(glial fibrillary acidic protein), GCDFP-15(gross cystic disease fluid protein), HMB-45, hCG(human chorionic gonadotropin), 면역글로불린(immunoglobulin), 인히빈(inhibin), 케라틴(keratin, various types of keratin), 백혈구 마커(lymphocyte marker), MART-1(Melan-A), Myo D1, MSA (muscle-specific actin), 뉴로필라멘트(neurofilament), NSE(neuron-specific enolase), PLAP(placental alkaline phosphatase), PSA(prostate-specific antigen), PTPRC(CD45), S100 protein, SMA(smooth muscle actin), 시냅토파이신(synaptophysin), TK(thymidine kinase), Tg(thyroglobulin), TTF-1(thyroid transcription factor-1), M2-PK, 바이멘틴(vimentin), 인터루킨(interleukin), CD24, CD40, 인테그린(integrin), 시스타틴(cystatin), 인터페론(interferon), TNF(tumor necrosis factor), MCP, VEGF, GLP, ICA, HLA-DR, ICAM, EGFR, FGF, BRAF, GFEB, FRS, LZTS, CCN, 뮤신(mucine), 렉틴(lectin), 아포리포단백질, 티로신, 신경세포 접착분자 유사 단백질, 파이브로넥틴, 포도당, 요산, 탄산탈수효소 또는 콜레스테롤 등일 수 있다.
본 발명에서 검출하고자 하는 바이오마커는, 생물처리과정, 병원성을 일으키는 과정, 치료를 위한 약리학적 과정의 측정 또는 평가 등의 통상적인 과학 또는 의료분야에서 사용되는 것이면 이용이 가능하고, 특별히 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명은, 도킹 스트랜드에 표지되거나, 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드에 표지되는 2종 이상의 형광분자의 공명에 의한 프렛을 이용하여 발광 스펙트럼을 측정함으로써 다종의 바이오마커를 동시에 검출하는 키트 및 검출방법에 관한 것이다.
상기 검출항체는 바이오마커를 항원-항체반응을 이용하여 검출하기 위한 것으로서, 검출대상인 바이오마커의 종류만큼 이종의 것을 사용함이 바람직하다. 또, 검출용 키트의 구성의 간단함을 위해서는 N종의 도킹 스트랜드는 표지되는 도너 또는 억셉터 중 어느 하나는 모두 동일한 것을 이용함이 바람직하다. 구체적으로는, 상기 N종의 도킹 스트랜드에 표지되는 도너가 모두 동일한 경우, 하나의 광원만을 이용하여 추가적인 광원과 광학필터 없이도 각각의 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커 종류를 판별할 수 있다. 보다 구체적으로는, 프렛이 발생하기 위한 조건으로, 도너의 발광 스펙트럼과 억셉터의 흡광 스펙트럼 사이에 겹침(Overlap)현상이 일어날 수 있도록, 억셉터로 작용하는 형광분자의 흡광 스펙트럼과 소정의 파장범위가 겹치는 발광 스펙트럼을 가지는 형광분자를 도너로 이용함이 바람직하다.
일례로, 도 1에 도시된 바와 같이, 검출항체1 내지 N에는 각각 동일한 도너가 표지된 도킹 스트랜드가 결합되고, 각각의 도킹 스트랜드에는 각각 억셉터1 내지 N이 표지되는 경우, 광원을 여기시키는 도너는 모두 동일하므로 최초에 조사되는 광원은 1종류만 필요하고, 억셉터로 작용하는 형광분자의 종류에 따라 방출하는 빛의 스펙트럼이 각기 다르게 측정되므로, 측정된 빛의 스펙트럼을 확인함으로써 억셉터의 종류를 확인 할 수 있다. 검출항체N에 결합된 도킹 스트랜드N에는 억셉터N을 표지함으로써 확인된 억셉터가 표지된 검출항체 및 이와 친화적으로 결합하는 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
또, 도 2에 도시된 바와 같이, 검출항체 1 내지 N 각각에 결합하는 도킹 스트랜드에 동일한 도너 및 동일한 억셉터가 표지될 수 있다. 이 때, 각각의 도너와 억셉터 사이의 거리는 도 2의 (a), (b), (c) 와 같이 상이한 것을 이용함으로써, 오른쪽 그래프와 같이 프렛효율에 따른 스펙트럼의 차이를 이용하여 다중 바이오마커를 동시에 검출할 수도 있다.
또는, 도 3에 도시된 바와 같이, 검출항체 각각에 결합하는 도킹 스트랜드에 동일한 억셉터와 2종 이상의 도너가 각각 표지될 수도 있다. 이 경우, 도 3의 오른쪽 그래프와 같이, 도너로 작용하는 2종의 형광분자의 흡광 스펙트럼(점선)이 겹치고 있으므로, 하나의 광원으로 2종의 형광분자를 모두 여기시키는 동시에 발광 스펙트럼(실선)이 명확하게 구분될 수 있으므로, 모두 동일한 도너를 이용한 도1 또는 도2의 경우에 비해, 검출 가능한 바이오마커의 종류가 더 많아지는 장점이 있다.
다른 일례로, 도 4a 내지 4c에 도시된 바와 같이, 검출항체 각각에 결합하는 도킹 스트랜드에 동일한 도너가 표지되고, 2종 이상의 억셉터가 표지될 수도 있다.
이 때, 표지되는 2종 이상의 억셉터는 도 4a와 같이, 억셉터끼리 인접하여 억셉터-억셉터 프렛쌍을 형성할 수 있으며, 혹은, 도 4b와 같이, 각각 도너와 인접하여 도너-억셉터 프렛쌍을 형성할 수도 있다. 억셉터-억셉터 프렛쌍을 형성하는 경우, 표지되는 억셉터 사이의 거리를 조절하여 바이오마커의 종류를 판별할 수도 있다. 도 4c 는 1종의 도너와 5종의 억셉터를 이용하여, 도4a와 같이 도킹 스트랜드 상에 억셉터-억셉터 프렛쌍을 표지하여 다중 검출을 실시한 결과를 나타낸 것으로, 아래쪽부터 (억셉터1, 억셉터2), (억셉터1, 억셉터3), (억셉터1, 억셉터4), (억셉터1, 억셉터5), (억셉터2, 억셉터3), (억셉터2, 억셉터4), (억셉터2, 억셉터5), (억셉터3, 억셉터4), (억셉터3, 억셉터5), (억셉터4, 억셉터5)로 프렛쌍이 구성된 도킹 스트랜드로부터 방출된 빛의 스펙트럼을 측정한 것을 그래프로 나타낸 것이다. 즉, 측정된 스펙트럼을 이용하여 도킹 스트랜드의 종류를 명확히 구분할 수 있으므로, 각각의 도킹 스트랜드에 이용된 억셉터-억셉터 프렛쌍의 종류를 확인함으로써 검출된 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
전술한 바와 같이 구성되는 본 발명의 다중 바이오마커 동시 검출용 키트의 구성 중 어느 하나 또는 적어도 2 이상을 조합한 구성을 이용하여 다중 검출함으로써 약1000여종 이상의 바이오마커 종류를 판별할 수 있다.
또한, 하나의 도킹 스트랜드 상에 구성이 동일한 형광분자 조합을 2 이상 반복함으로써 검출되는 신호의 강도를 증가시킬 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출 방법을 예시적으로 나타낸 것으로, 검출하고자 하는 N종의 바이오마커와 특이적으로 결합하는 N종의 검출항체 각각에 상이한 발광 스펙트럼을 갖는 N종의 도킹 스트랜드를 결합시켜, 상기 발광 스펙트럼을 측정함으로써 바이오마커의 종류를 판별할 수 있다.
먼저, 기판에 바이오마커를 고정한 뒤, 각 바이오마커와 검출항체를 결합시킨다. 이 때, 기판에는 포획항체가 부착되는 단계가 먼저 수행될 수 있으며, 이 경우, N종의 포획항체 각각은 N종의 바이오마커와 특이적으로 결합하는 것을 이용함이 바람직하다. 그러나, 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 상황에 따라서 바이오마커는 기판에 직접 부착될 수도 있다. 이는 측정 과정의 속도, 경제성 및 편의성을 위한 것이며, 필요에 따라, 측정 결과의 정확성을 높이기 위해 기판에 부착된 포획항체와의 항원-항체 반응을 통해 바이오마커를 검출할 수도 있다.
따라서, 본 발명의 키트에 포함된 기판은, 바이오마커 검출시에, 바이오마커가 직접 기판의 표면에 부착되거나 바이오마커를 포획할 수 있는 포획항체를 부착할 수 있도록 표면이 처리가 된 것일 수 있다. 검출과정에 부착되는 경우, 기판은 포획항체와 결합특이적인 물질이 코팅된 것을 이용함이 바람직하다. 구체적으로는, 포획항체에는 특이적이면서, 검출항체 또는 스트랜드와는 비특이적인 물질을 도포하여 코팅함이 바람직하다. 포획항체를 기판에 흡착시키는 방법은, 예를 들면, pH 9.5인 0.06M의 탄산염 완충용액 또는 중탄산염 완충용액으로 상기 포획항체를 희석시키고, 그 희석액을 일정 온도에서 기판에 소정의 시간동안 접촉시킴으로써 흡착시키는 것일 수 있다. 또는 기판 표면을 바이오틴(biotin)이 결합된 PEG(polyethylene glycol) 또는 BSA(bovine serum albumin)로 코팅하고, 스트렙타비딘(streptavidin)을 결합시킨 후 여기에 바이오틴이 결합된 포획항체를 결합시킴으로써 흡착시키는 것일 수 있다. 이후, 기판에 흡착된 포획항체는 기판에 시료 또는 가공된 시료를 처리하게 되면, 시료에 포함된 바이오마커와 결합체를 형성하게 된다. 추가적으로, 결합체의 형성 이후에는, 비특이적으로 결합된 항체를 제거하거나 오염물질 등을 제거하기 위한 목적으로 TWEEN 20, Triton X-100 등이 포함된 세척 완충액으로 세척함이 바람직할 수 있다.
또는, 기판의 표면에 포획항체가 미리 부착되어 있는 것일 수 있다. 이 때, 기판은 슬라이드 글라스, 커버슬립, 석영, 플라스틱 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수도 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 아울러, 본 발명의 키트는, RUO(research use only), IUO(investigational use only)키트 또는 IVD(in vitro diagnostic)일 수도 있다.
전술한 바와 같이, 포획항체 또는 기판에 도포된 물질에 의해 N종의 바이오마커를 기판에 고정시킨 뒤, 상기 바이오마커에 검출항체를 결합시킨다. 이후, 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하고 기 측정한 발광 스펙트럼 데이터베이스를 비교하여 해당 바이오마커를 판별한 뒤, 화면에 나타난 단위 면적당 바이오마커의 개수를 기 측정한 농도별 단위 면적당 개수와 비교함으로써 바이오마커의 농도를 측정할 수 있다. 가령, 광원을 조사하여 도너를 여기시키면, 도 5a와 같이 화면에 각 분자의 발광 스펙트럼이 나타나게 되는데, 이를 기 측정한 발광 스펙트럼 데이터베이스와 비교하여 화면에 나타난 각 분자가 어떤 바이오마커인지 판별할 수 있다(ex: 빨강이면 바이오마커 1, 노랑이면 바이오마커 2, 녹색이면 바이오마커 3). 이후, 각 바이오마커별 단위 면적당 개수를 측정하고 기 측정한 농도별 단위 면적당 개수와 비교함으로써 시료에 포함된 각 바이오마커의 농도를 측정할 수 있다. 일례로 바이오마커 1의 경우 기 측정한 농도별 단위 면적당 개수가 1 ng/ml당 10이고, 측정 결과 단위 면적당 개수가 5라면 시료에 포함된 바이오마커 1의 농도는 0.5 ng/ml임을 알 수 있다.
도 5b는 발광 스펙트럼을 측정하는 다양한 방법 중 하나를 예시적으로 나타낸 것이다. 일례로, 통상의 현미경을 이용해 다양한 종류의 형광분자를 관측하는 경우, 발광 스펙트럼과 무관하게 왼쪽 그림과 같이 원형의 점 확산 함수(point spread function; PSF)을 갖는다. 하지만 광로(optical path) 상에 프리즘(prism)이나 격자(grating) 등 파장에 따른 광로 차를 유발하는 광학부품을 사용함으로써 각 형광분자의 점 확산 함수를 원에서 타원 형태로 바꿀 수 있으며, 본래 원의 중심과 타원의 중심을 비교하고, 타원의 장축 방향의 프로파일을 분석함으로써 발광 스펙트럼을 측정할 수 있고, 이를 기 측정한 발광 스펙트럼 데이터베이스와 비교함으로써 해당 분자가 어떤 형광분자로 구성되어 있는지 알아낼 수 있다(“Ultrahigh-throughput single-molecule spectroscopy and spectrally resolved super-resolution microscopy”, Zhengyang Zhang, Samuel J Kenny, Margaret Hauser, Wan Li & Ke Xu, Nature Methods volume 12(2015), pages 935-938 참조).
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 검출항체에 부착된 도킹 스트랜드는 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합할 수도 있다.
이 경우, 상기 도너 스트랜드는 도너가 표지되며, 억셉터 스트랜드는 1종 이상의 억셉터 또는 억셉터-억셉터 프렛쌍이 표지된다. 이 때, 도 6a에 도시된 바와 같이 상기 도킹 스트랜드에 직접 2종 이상의 억셉터가 표지되는 경우, 표지된 부분에 인접한 부위에 도너 스트랜드가 상보적으로 결합할 수 있으며, 결합하는 순간, 프렛이 발생하여 억셉터가 발광할 수 있다. 만일, 도 6b와 같이 도킹 스트랜드에 별도의 형광분자가 표지되지 않는 경우라면, 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드는 상기 도킹 스트랜드에 결합과 분리를 반복하므로, 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드가 동시에 결합하는 순간에만 억셉터가 발광함으로써 발광 스펙트럼을 측정할 수 있다. 이러한 이유로, 광표백되는 형광분자가 발생하는 경우라도 소정의 반응시간이 주어진다면 광표백되지 않은 형광분자가 표지된 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합하는 순간에 발광 스펙트럼을 측정할 수 있다는 장점이 있다. 또, 동시에 결합하는 순간에 측정하여 기록할 수 있으므로, 검출대상인 바이오마커의 종류가 많아질수록 하나의 화면에 여러 종류의 이미지가 동시에 출력되어 분별이 어려워지는 문제점을 해결할 수 있다.
도 7은 상기 도 6과 같이 구성된 키트를 이용하여 검출하는 경우, 검출 방법을 예시적으로 나타낸 것이다. 구체적으로는 도 6b와 같이 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 포함되는 검출용 키트를 이용하여 바이오마커의 종류를 판별하는 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
먼저, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류가 N종이라면, N종의 도킹 스트랜드와 이에 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 디자인하고 각각의 발광 스펙트럼을 미리 측정하여 데이터베이스를 제작한다. 이 때, 바이오마커 1 내지 N에는 검출항체1 내지 N이 각각 결합하고, 검출항체 1 내지 N 각각에는 도킹 스트랜드 1내지 N이 부착된다.
데이터베이스의 기록이 끝나면, 기판에 바이오마커를 고정시킨 뒤, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류에 적합한 도킹스트랜드를 이용하여 다음과 같이 바이오마커의 판별을 수행한다. 각각의 바이오마커에 검출항체를 결합시킨 뒤, 미리 제작된 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 넣고 소정시간동안 결합과 분리가 반복되도록 한다. 이 때, 1개의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 동시에 결합할 경우, 도 7과 같이 화면상에 신호가 나타되고, 해당 신호의 스펙트럼을 분석하여 앞서 기록된 데이터베이스와 비교함으로써 바이오마커 종류를 판별할 수 있다. 매 화면마다 신호가 검출된 위치를 누적하여 표시하고, 하나의 바이오마커 분자에 의해 중복하여 발생하는 신호는 특정 위치를 중심으로 가우스 함수(Gaussian function) 형태의 군집을 이루게 되고, 하나의 군집을 하나의 바이오마커 분자로 간주하여 단위 면적당 바이오마커의 개수를 산출하고, 기 측정된 농도별 단위 면적당 개수와 비교함으로써 시료에 포함된 바이오마커의 농도를 측정할 수 있다.
또한, 도 1 내지 도 4 에 도시된 구성 중 어느 하나 또는 적어도 2 이상을 조합한 구성에 대하여, 도너를 도너 스트랜드에 표지하고, 억셉터를 도킹 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드에 표지함으로써 상기와 같은 방법으로 약 1000여종 이상의 바이오마커 종류를 판별할 수 있다. 가령, 도 8a와 같이 하나의 도킹 스트랜드에 복수의 도너 스트랜드 및 복수의 억셉터 스트랜드가 상보적으로 결합할 수도 있다. 이러한 조합은, 도 6b와 같은 구성으로 검출하는 바이오마커의 종류는 동일하나, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합하는 부위가 2 이상 존재하고 있어, 어느 하나의 부위라도 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합하면 발광 스펙트럼을 측정할 수 있다. 따라서, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 결합과 분리가 반복되는 동안 결합이 되는 확률을 높일 수 있어, 검출속도가 2배 이상 빨라진다는 장점이 있다.
이 경우, 상기 복수의 도너 스트랜드는 서로 상이한 도너가 표지되어 있을 수 있다. 이 때, 상기 복수의 도너 스트랜드 각각은 서로 상이한 프렛효율을 갖기위해, 인접하는 억셉터 또는 억셉터-억셉터 프렛쌍과의 거리가 상이하도록 도너가 표지된 것일 수 있으며, 상기 억셉터 또는 억셉터-억셉터 프렛쌍은 서로 상이한 형광분자로 구성될 수 있다. 또, 상기 복수의 억셉터 또는 억셉터-억셉터 프렛쌍은 도너와 서로 상이한 프렛효율을 갖도록 상기 도너와의 거리가 상이하도록 표지될 수 있으며, 상기 억셉터-억셉터 프렛쌍은 서로 상이한 프렛효율을 갖도록 억셉터간 거리가 상이하도록 표지되어 있을 수 있다.
도 8a와 유사한 효과를 야기시키는 방안으로, 도 8b 와 같이 하나의 검출항체에 동일한 구성을 가지는 도킹 스트랜드를 부착시켜 바이오마커의 검출속도를 높일 수도 있다.
또, 도 8a와 도 8b의 구성을 조합하여, 복수의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 상보적으로 결합할 수 있는 도킹 스트랜드를 하나의 검출항체에 2이상 부착시켜 바이오마커의 검출속도를 더 높일 수도 있다.
본 발명의 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 도 9에 도시된 바와 같이, 마이크로 RNA를 검출하는 용도로 이용될 수도 있다.
도 9를 보면, 마이크로 RNA를 포함한 DNA, RNA 등의 핵산을 검출하기 위한 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 검출하고자 하는 N종의 핵산의 한쪽 끝에 기판의 코팅물질과 결합친화적인 물질을 부착하거나 각 핵산의 일부분과 상보적인 핵산을 미리 기판에 코팅하여 검출하고자 하는 N종의 핵산을 기판에 고정한다. 검출하고자 하는 N종의 핵산의 염기서열은 정해져 있으므로 이에 상보적인 N종의 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용하여 각 핵산을 판별할 수 있다.
앞서 언급한, 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드는, 바람직하게는, DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA, TNA와 같은 핵산 또는 이의 유사체를 이용할 수 있다. 추가적으로, 도1 내지 도4와 같이 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 별도로 사용하지 않는 경우, 상기 도킹 스트랜드는 폴리펩티드일 수도 있다.
이 때, 도너 또는 억셉터의 빛의 세기는 도너와 억셉터 간의 거리에 따라 영향을 받을 수도 있으나, 도너와 억셉터를 원하는 특정 염기, 3'- 또는 5'-말단, 또는 기본골격 상에 표지하여 도너와 억셉터 혹은 억셉터와 억셉터 사이의 거리를 조절함므로써, 다른 프렛효율을 가지는 도킹 스트랜드를 제작할 수 있다.
예를 들어, N종의 도킹 스트랜드에 서로 다른 프렛효율을 가지는 형광분자를 표지하고, 각 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 미리 측정하여 데이터베이스를 측정한 뒤, 바이오마커 검출을 위한 반응시에 생성되는 발광 스펙트럼과 비교함으로써, 반응한 바이오마커의 종류를 검출할 수 있다. 이 때, 서로 다른 프렛효율을 가지는 형광분자는 (도너1, 억셉터1), (도너1, 억셉터2), …(도너1, 억셉터N)과 같이 구성될 수 있고, (도너1, 억셉터1), (도너2, 억셉터1), …(도너 N, 억셉터1)과 같이 구성될 수 있다. 혹은, 동일한 도너가 표지된 도킹 스트랜드에 (억셉터1, 억셉터2), (억셉터1, 억셉터3), (억셉터2, 억셉터3)… 과 같이 2종 이상의 상이한 억셉터로 구성될 수도 있다.
상술한 서로 다른 프렛효율을 가지는 형광분자의 구성은 일부를 예시적으로 나타낸 것으로, 검출시 판별이 가능한 정도의 프렛효율의 차이가 있는 구성이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 형광분자는, 로다민(rhodamine), 알렉사(Alexa), 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), FAM(5-carboxy fluorescein), Atto, BODIPY, CF, CY, DyLight Fluor 및 텍사스 레드(Texas Red) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 검출 방법은, N종의 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하여 데이터베이스를 제작하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 검출을 위한 반응을 진행하기 전 단계로, 전술한 구성 중 어느 하나 이상을 포함하는 도킹 스트랜드를 디자인하여 각 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하여 데이터베이스로 기록함으로써 반응시 측정되는 값과 비교하여, 검출에 사용된 검출항체의 종류를 확인할 수 있으므로, 최종적으로 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
N종의 바이오마커를 검출함에 있어서, 발광 스펙트럼은 동시 또는 순차적으로 측정할 수 있다. 가령, 3종의 바이오마커를 검출하는 경우, 검출항체 1, 2, 3에 부착되는 도킹 스트랜드 1, 2, 3에 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드는 도킹 스트랜드 1, 2, 3에 동시에 결합할 수도 있고, 순차적으로 결합할 수도 있다. 도킹 스트랜드에 직접 억셉터가 표지되는 경우라면, 도너 스트랜드가 일시적으로 결합하는 순간에만 발광 스펙트럼을 측정할 수 있다. 만일, 억셉터 스트랜드 1, 2, 3을 추가로 이용하는 경우라면, 상기 도킹 스트랜드 1, 2, 3에 억셉터 스트랜드 1, 2, 3이 각기 동시 또는 순차적으로 결합과 분리를 반복하는 동안, 상기 도너 스트랜드가 어느 하나의 도킹 스트랜드에 동시에 결합하는 순간에만 발광 스펙트럼이 측정 가능하다. 다시 말하면, 도킹 스트랜드 1에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드 1이 동시에 결합하는 순간에는 도킹 스트랜드 1의 발광 스펙트럼을 측정할 수 있으나, 도킹 스트랜드 1에 억셉터 스트랜드1이 결합하는 순간, 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드 2 또는 3에만 결합하는 경우라면 도킹 스트랜드 1의 발광 스펙트럼은 측정할 수 없다. 즉, N종의 바이오마커를 검출하기 위한 발광 스펙트럼의 측정은 동시 또는 순차적으로 가능하며, 측정된 값들을 기측정된 데이터베이스와 비교함으로써, 최종적으로는 N종의 바이오마커를 동시에 판별할 수 있다.
이 후, 본 발명의 검출 방법을 이용한 N종의 바이오마커의 검출은 실시예를 통해 과정을 보다 구체적으로 후술하도록 한다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 구체적으로 설명하도록 한다.
실시예 1. 발광 스펙트럼 데이터베이스 제작
하나의 광원으로 여기 가능한 A 종의 도너로 각각 표지된 A 종의 도너 스트랜드를 제작한다. 상기 A 종의 도너와 프렛이 일어나는 B종의 억셉터로 각각 표지된 B종의 억셉터 스트랜드를 제작한다. 상기 A종의 도너 스트랜드 및 B종의 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합하는 총 A x B종의 도킹 스트랜드를 제작한다(단, A, B 각각은 1 이상의 정수임).
도너 스트랜드 1과 억셉터 스트랜드 1 및 이에 상보적인 도킹 스트랜드1을 이용하여 도너 및 억셉터의 발광 스펙트럼을 측정한다. 나머지 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드에 대해서도 동일한 방식으로 발광 스펙트럼을 측정 한다.
측정된 총 A x B 개의 발광 스펙트럼 중, 측정 노이즈에 의한 오차를 감안하는 경우에도 명확히 구분 가능한 발광 스펙트럼만을 데이터베이스로 제작하고, 해당 발광 스펙트럼을 제공하는 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 조합만을 바이오마커를 검출에 이용한다.
상기 실시예의 방법은, 도 1 및 도 3의 방법을 조합하여 도 6b와 같이 구성한 과정을 설명한 것으로, 데이터베이스화된 발광 스펙트럼의 개수가 검출할 바이오마커의 개수보다 작을 경우, 도 2와 같이 도너와 억셉터 사이의 프렛효율이 상이하도록 구성하여 추가적으로 적용하거나, 도 6b와 같이 하나의 억셉터 스트랜드에 두 종류 이상의 억셉터를 표지할 수도 있고, 또는, 하나의 도킹 스트랜드에 두 개 이상의 서로 상이한 억셉터 스트랜드가 결합하도록 함으로써 검출할 바이오마커 개수보다 많은 수의 발광 스펙트럼 데이터베이스를 만들 수 있다.
실시예 2. N종의 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드 제작
N 종 바이오마커를 검출하기 위해 N 종의 도킹 스트랜드를 제작하도록 한다. 상기 데이터베이스화 된 발광 스펙트럼을 제공하는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 결합할 수 있도록 이에 상보적인 염기서열을 갖는 N종의 도킹 스트랜드를 제작한다.
실시예 3. 발광 스펙트럼의 측정 및 바이오마커 판별
2 종의 바이오마커를 검출하기 위해 다음과 같이 키트를 제작했다.
바이오마커1에 결합하는 검출항체1에는 도킹 스트랜드 1을 부착하고, 바이오마커 2에 결합하는 검출항체 2에는 도킹 스트랜드 2를 부착했다. 상기 도킹 스트랜드 1에는 도너 스트랜드 1 및 억셉터 스트랜드 1이 결합하고, 상기 도킹 스트랜드 2에는 도너 스트랜드 2 및 억셉터 스트랜드 2가 결합할 수 있도록 제작했다.
기판에 바이오마커 1과 2를 고정하고, 각각에 검출항체 1과 2를 결합시켰다. 도너 스트랜드 1, 억셉터 스트랜드 1, 도너 스트랜드 2 및 억셉터 스트랜드 2가 포함된 버퍼를 챔버에 주입한 후, 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 동시에 결합했을 때 방출하는 빛의 스펙트럼을 관찰했다. 도 7과 같이, 이미징 카메라 화면의 분자 1 및 분자 2의 위치에서 간헐적인 형광신호가 관측되고, 해당 위치에서의 방출 스펙트럼을 데이터베이스와 비교함으로써 바이오마커 종류를 판별할 수 있었다.
시료에 포함된 바이오마커들은 그 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 넓은 농도 범위를 갖는다. 그러나, 지나치게 높은 농도의 바이오마커를 기판에 고정할 경우 한 화면에 나타나는 점의 수가 너무 많아 점들 사이에 겹침이 발생하고 이로 인해 개별 분자의 프렛효율을 측정할 수 없게 되므로, 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 시료를 희석하여 검출에 이용할 수 있다.
만일, 비슷한 농도 범위를 갖는 바이오마커들을 검출하는 경우라면, 바이오마커들을 동일한 비율로 희석한 후 상기 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, 통상 1ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들을 1:100으로 희석할 경우 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출된다면, 통상 100ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들은 1:10000으로 희석한 후 분석을 수행할 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (11)

  1. 기판;
    2종 이상의 형광분자가 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 및
    상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체를 포함하고,
    상기 형광분자는 상기 도킹 스트랜드 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하고,
    서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는 다중 바이오마커 동시 검출용 키트.
  2. 기판;
    1종 이상의 형광분자가 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand);
    상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체; 및
    1종 이상의 형광분자가 표지된 도너 스트랜드(Donor strand)를 포함하고,
    상기 형광분자는 상기 도킹 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하고,
    서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는 다중 바이오마커 동시 검출용 키트.
  3. 기판;
    N종의 도킹 스트랜드(Docking strand);
    상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체;
    1종 이상의 형광분자가 표지된 도너 스트랜드(Donor strand); 및
    1종 이상의 형광분자가 표지된 억셉터 스트랜드(Acceptor strand);
    를 포함하고,
    상기 형광분자는 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하고,
    서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는 다중 바이오마커 동시 검출용 키트.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 도킹 스트랜드는 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합하는 것인 다중 바이오마커 동시 검출용 키트.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키트는 포획항체를 더 포함하는 다중 바이오마커 동시 검출용 키트.
  6. 시료 중의 다중 바이오마커를 동시에 검출하는 방법에 관한 것으로,
    기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계;
    N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계; 및
    상기 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계;
    를 포함하고,
    서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)으로 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는 다중 바이오마커 동시 검출 방법.
  7. 시료 중의 다중 바이오마커를 동시에 검출하는 방법에 관한 것으로,
    기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계;
    N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계;
    상기 N종의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 상보적으로 결합하는 단계; 및
    발광 스펙트럼을 측정하는 단계;
    를 포함하고,
    서로 다른 종류의 형광분자간 발생하는 프렛(FRET)으로 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는 다중 바이오마커 동시 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 도킹 스트랜드에 형광분자가 표지된 억셉터 스트랜드(Acceptor strand)가 상보적으로 결합하는 단계;
    를 더 포함하는 다중 바이오마커 동시 검출 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형광분자는 상기 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하는 다중 바이오마커 동시 검출 방법.
  10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기판에 포획항체를 부착하는 단계를 더 포함하는 다중 바이오마커 동시 검출 방법.
  11. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    단위 면적 당 상기 바이오마커 개수로부터 상기 시료 중의 상기 바이오마커 농도를 측정하는 단계를 더 포함하는 다중 바이오마커 동시 검출 방법.
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