KR102573998B1 - 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트 - Google Patents

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Abstract

기판; 상기 기판 위에 부착될 수 있으며, 형광물질이 표지된 포획스트랜드를 구비한 포획항체; 상기 포획스트랜드의 염기서열 일부 또는 전부와 상보적이며, 형광물질이 표지된 검출스트랜드를 구비한 검출항체; 및 상기 포획스트랜드 또는 상기 검출스트랜드와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 구비함으로써, 상기 검출스트랜드와 상기 포획스트랜드가 서로 상보적인 결합을 할 수 없도록 방해하는 차단스트랜드를 포함하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트가 제공된다.

Description

위양성 신호가 제거된 항원 검출방법 및 키트{Antigen detection method and kit with false positive signal removed}
본 명세서에 개시된 기술은 일반적으로 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법및 키트에 관한 것이다.
종래 면역분석(immunoassay)에 있어서, 포획항체를 이용하여 항원을 기판 표면에 고정하고, 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP) 또는 형광물질 등이 표지되어 있는 검출항체를 항원과 결합시킨 후 HRP에 의한 버퍼의 색깔 변화 또는 형광물질의 밝기 등을 이용해 항원의 양을 측정하는 방법이 자주 사용되어 왔다. 그런데 검출항체는 비특이적 결합에 의해 기판 표면과 같이 항원이 아닌 다른 곳에 결합할 수 있으며, 그 결과 위양성(false positive) 신호로 나타나 측정된 항원의 양을 부정확하게 만들 수 있다. 이런 위양성 신호는 시료 내에 항원의 양이 많은 경우는 무시할 수 있지만, 바이러스 항원 검출 등 항원의 양이 적은 경우에는 큰 오차를 발생시킬 수 있는 문제가 있다. 도 1은 종래 면역분석에 있어서 발생할 수 있는 위양성 문제를 나타내는 도면이다.
따라서 항원의 양이 적을 경우 다량의 채혈에 따른 피검자의 심리적, 신체적 부담을 줄이고 진단의 정확성을 높이기 위해 높은 민감도를 가지면서 위양성 신호가 없는 신규한 기술의 개발이 요구된다.
미국공개특허 제20030190760호, "Reducing non-specific binding in immunoassays performed on polymeric solid phases" (공개일: 2003.10.9) 미국등록특허 제8445293호, "Method to increase specificity and/or accuracy of lateral flow immunoassays" (등록일: 2013.05.21)
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 기판; 상기 기판 위에 부착될 수 있으며, 형광물질이 표지된 포획스트랜드를 구비한 포획항체; 상기 포획스트랜드의 염기서열 일부 또는 전부와 상보적이며, 형광물질이 표지된 검출스트랜드를 구비한 검출항체; 및 상기 포획스트랜드 또는 상기 검출스트랜드와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 구비함으로써, 상기 검출스트랜드와 상기 포획스트랜드가 서로 상보적인 결합을 할 수 없도록 방해하는 차단스트랜드를 포함하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트가 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, (a) 형광물질이 표지된 포획스트랜드를 구비한 포획항체를 준비하는 단계; (b) 상기 포획스트랜드의 염기서열 일부 또는 전부와 상보적이며, 형광물질이 표지된 검출스트랜드를 구비한 검출항체를 준비하는 단계; (c) 상기 포획스트랜드 또는 상기 검출스트랜드 중 하나 이상에 차단스트랜드를 상보적으로 결합시키는 단계; (e) 상기 포획항체를 기판 위에 부착하는 단계; (f) 항원을 포함하는 시료를 도입하여, 상기 항원, 상기 포획항체 및 상기 검출항체 간에 항원-항체 반응을 유도하는 단계; (g) 상기 차단스트랜드를 제거하여 상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드를 상보적으로 결합시키는 단계; 및 (h) 상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드의 결합에 의해 생성되는 형광 신호를 측정하는 단계를 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법이 제공된다.
도 1은 종래 면역분석에 있어서 발생할 수 있는 위양성 문제를 나타내는 도면이다.
도 2는 FRET-PAINT 기술을 사용하여 항원을 검출하는 과정에서 위양성 문제가 발생하는 경우를 나타낸다.
도 3은 차단스트랜드의 도입에 의해 상보적 서열을 갖는 포획스트랜드와 검출스트랜드의 결합이 방해받는 상태를 나타낸다.
도 4는 제거스트랜드를 이용하여 차단스트랜드를 제거하는 과정을 나타낸다.
도 5는 검출스트랜드와 상보적 결합을 하는 다양한 차단스트랜드들을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어에 대하여 간단히 설명한다.
본 명세서에서 "바이오마커"는 생명체의 정상 또는 병리적인 상태를 확인할 수 있는 생체물질을 모두 포함한다.
본 명세서에서 "프렛"은 인접한 2개의 형광물질의 공명에 의해 에너지가 전달되는 메커니즘을 의미한다. 구체적으로는, 빛에 의해 여기(excited)된 형광물질의 에너지가 인접한 다른 형광물질에 전달되는 현상을 일컫는 용어로, 당업자가 인식하는 통상적인 프렛의 의미를 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "프렛 효율"은 빛에 의해 여기(excited)된 형광물질의 에너지가 인접한 다른 형광물질에 전달되는 현상을 이용하여, 형광물질 사이의 거리에 따라 상이한 에너지 전달 효율을 값으로 나타낸 것을 의미하고, 당업자가 인식하는 통상적인 프렛 효율의 의미를 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "도너"는 빛을 받아 여기되면 에너지를 전달하는 형광물질을 의미하고, 2 이상의 형광물질이 인접하는 경우, 상대적으로 짧은 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 형광물질을 의미한다.
본 명세서에서 "억셉터"는 여기상태의 도너로부터 에너지를 전달받는 형광물질을 의미하고, 2 이상의 형광물질이 인접하는 경우, 상대적으로 긴 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 형광물질을 의미한다.
본 명세서에서 "스트랜드"는 생체고분자의 사슬 또는 생체고분자를 모사하여 합성한 고분자의 사슬로서, 상기 생체고분자는 단일가닥 또는 이중가닥 구조를 가질 수 있으며, 핵산 또는 핵산 유사체를 포함한다. 상기 핵산은 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함하고, 상기 핵산 유사체는 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모폴리노 핵산(MNA), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA)을 포함한다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 다양한 구현예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 구현예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 구현예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 구현예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한 일 구성요소가 다른 구성요소 "위에" 있다고 할 때, 이는 다른 구성요소 "바로 위에" 있는 경우 뿐 아니라, 그 중간에 또 다른 구성요소가 있는 경우도 포함한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 다양한 구현예들을 설명함에 있어, 동일한 구성 요소는 달리 설명되지 않는 한 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
최근 단분자 형광현미경 기술의 개발로 분자를 하나씩 관찰할 수 있게 되었고 이를 바이오마커 검출에 적용함으로써 민감도는 fg/ml 수준으로 1000배 가량 증가하게 되었다(Nature 473, 484-488, 2011). 통상적으로 사용하는 형광 이미징에서는 관찰하려는 분자에 형광물질을 고정하여, 서로 다른 종류의 바이오마커를 형광신호를 이용해 구분하는 방법을 사용한다. 이때 각각 서로 다른 색의 형광물질을 고정하고 색깔 차이를 이용해 바이오마커의 종류를 구분하는 방법을 사용하나, 통상의 이미지 센서로 구분하여 관찰할 수 있는 형광물질의 종류는 3~4가지 정도이다. 따라서, 단분자 형광현미경 기술을 사용할 경우, 민감도는 fg/ml로 기존 방법에 비해 1000배 가량 증가하나 검출할 수 있는 바이오마커의 종류는 여전히 3~4 가지 정도로 제한된다.
한편, 단분자 형광현미경의 높은 민감도를 유지하면서 다양한 타겟 물질을 동시에 검출하는 방법으로서, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)에 기초한 DNA-PAINT 기술인 FRET-PAINT 기술이 제공된다. FRET이란 최초에 여기된 도너(donor)의 여기된 상태의 에너지가 억셉터(acceptor)로 전달되는 현상을 의미한다. 도너 물질은 일반적으로 억셉터 물질에 비해 더 짧은 파장의 빛을 방출하게 되는데, 이때의 방출 파장은 억셉터의 흡수 파장과 중첩(spectral overlap)된다. 에너지 전달 속도와 효율은 도너의 방출 파장과 억셉터의 흡수 파장의 중첩의 정도, 도너의 양자 효율, 도너와 억셉터의 전이 쌍극자의 상대적인 배열 정도, 그리고 도너와 억셉터 사이의 거리 등에 의존하게 된다.
예를 들어 FRET-PAINT 기술에 따르면, 도킹 스트랜드에 두 가지 DNA 결합 자리들을 가질 수 있으며, 각각 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 위한 자리가 될 수 있다. 단일 분자 국지화(single-molecule localization)를 위해서 억셉터의 FRET 신호가 사용된다. FRET-PAINT 기술을 사용하면 억셉터가 직접 여기되지 않고 FRET에 의해 여기되어 이미저(도너 및 억셉터) 농도를 수십~수백배 높일 수 있으므로 DNA-PAINT에 비해 이미징 스피드가 수십~수백 배 향상될 수 있다. (대한민국 등록특허 제2195625호))
본 명세서에 개시된 기술 역시 FRET-PAINT 기술을 기반으로 하여 높은 민감도와 정확도를 갖는 항원 검출방법 및 키트를 제공하고자 한다. 하지만 배경기술에서 소개한 바와 같이 FRET-PAINT 기술을 사용하여 항원을 검출할 경우에도 위양성 신호의 문제는 여전히 존재할 수 있으므로 이러한 문제를 개선하기 위해 예를 들어 포획항체와 검출항체 각각에 서로 프렛쌍(FRET pair)을 형성할 수 있는 형광물질이 도입된 스트랜드를 결합시키는 방법을 사용할 수 있다. 즉 항원과 결합된 위치에 검출항체와 포획항체가 둘다 있어야 프렛이 검출될 수 있어 위양성 신호가 발생하지 않는다고 기대할 수 있다. 하지만 이 경우에도 또 다른 위양성 문제가 발생할 수 있다.
도 2는 FRET-PAINT 기술을 사용하여 항원을 검출하는 과정에서 위양성 문제가 발생하는 경우를 나타낸다. 도 2의 (a)에서, 검출항체에는 한 종 이상의 형광물질이 한 개 이상 표지되어 있는 한 개 이상의 검출스트랜드가 결합되어 있고, 포획항체에는 한 종 이상의 형광물질이 한 개 이상 표지되어 있는 한 개 이상의 포획스트랜드가 결합되어 있다. 검출스트랜드와 포획스트랜드의 염기서열 일부 또는 전부는 상보적이며, 검출스트랜드와 포획스트랜드가 상보적으로 결합할 경우 검출스트랜드에 표지되어 있는 형광물질과 포획스트랜드에 표지되어 있는 형광물질은 한 개 이상의 프렛쌍(FRET pair)을 형성한다. 따라서 프렛 신호가 검출될 경우 해당 위치에는 검출항체와 포획항체가 모두 존재함을 알 수 있다. 도 2의 (b) 및 (c)는 검출스트랜드와 포획스트랜드가 상보적으로 결합함으로써 형성되는 프렛쌍의 예들을 나타낸다. 도 2의 (b) 및 (c)와 같이 검출스트랜드에는 도너 형광물질이 표지되고 포획스트랜드에는 억셉터 형광물질이 표지되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 한편 도 2의 (b)와 같이 도너와 억셉터로 각각 한 종의 형광물질이 사용될 수도 있지만, 도 2의 (c)와 같이 도너와 억셉터로 각각 2종 이상의 형광물질이 사용될 수도 있다.
하지만 포획스트랜드와 검출스트랜드 간의 프렛 신호를 관찰하여 항원을 검출하는 방법을 사용할 경우에도 도 2의 (d)와 같이 검출스트랜드와 포획스트랜드의 염기서열은 상보적이므로 검출항체와 포획항체 사이에 항원이 존재하지 않아도 자발적 결합이 가능하며, 이는 위양성 신호의 원인이 될 수 있다.
따라서, 본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 차단스트랜드를 도입함으로써 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트가 제공된다.
상기 항원 검출용 키트는 기판; 상기 기판 위에 부착될 수 있으며, 형광물질이 표지된 포획스트랜드를 구비한 포획항체; 상기 포획스트랜드의 염기서열 일부 또는 전부와 상보적이며, 형광물질이 표지된 검출스트랜드를 구비한 검출항체; 및 차단스트랜드를 포함한다.
상기 기판은 타겟 항원을 포획하고 관찰하기 위한 영역으로 그 형태는 특별히 제한되지 않으나, 평판, 구형 입자, 막대형 구조, 및 기타 비정형 구조의 형태를 가질 수 있으며 그 재질도 유리, 석영, 플라스틱 등으로 이루어질 수 있다. 상기 기판은 통상 유리 재질로 된 평판 형태의 슬라이드 글라스나 커버슬립일 수 있다. 바람직하게는 상기 기판은 #1 또는 #1.5 커버슬립일 수 있다. 상기 기판은 상기 포획항체를 부착할 수 있도록 폴리에틸렌글리콜-비오틴(PEG-Biotin)과 같은 유기물로 표면처리된 것일 수 있다.
상기 포획항체는 바이러스나 바이오마커와 같은 항원을 특이적으로 결합하여 포획할 수 있는 항체로서, 상기 포획항체의 표면에 비오틴(biotin)을 도입하고 상기 기판에는 비오틴과 결합하는 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 스트렙타비딘(strepavidin)을 도입하여 상기 포획항체를 상기 기판에 부착시킬 수 있다. 상기 검출항체는 상기 포획항체에 결합되어 있는 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다.
본 명세서에서 상기 포획항체와 검출항체로서 사용되는 '항체'는 구체적으로 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어, 가변 영역 및 목적하는 생물 활성을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에서의 항체는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하고, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), 나노바디(nanobody) 또는 scFv를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 scFv, Fab, 나노바디(nanobody) 및 면역글로불린 분자일 수 있다. 본 명세서에서 “항체”는 면역글로불린 외에도 타겟 물질과 특이적 결합을 할 수 있어 상기 항체와 동일한 기능을 할 수 있는 핵산, 핵산 유사체, 펩타이드로 구성된 압타머(aptamer)를 포함한다.
본 명세서에서, "스트랜드"는 일반적인 형태, 형광물질 부착이 가능하도록 기능기가 도입된 형태, 또는 형광물질이 이미 부착된 형태 등 다양한 형태를 가질 수 있다. 상기 스트랜드에 기능기를 도입하면 원하는 위치에 원하는 형광물질을 부착할 수 있으며 하나의 스트랜드에 동일 또는 상이한 기능기를 여러 개 부착시킬 수도 있다. 스트랜드의 어느 위치에 도너와 억셉터를 부착하느냐에 따라 도너와 억셉터 사이의 거리가 달라지고 FRET 효율 또한 달라질 수 있다. 이러한 성질을 이용하면 타겟 항원의 다중 검출이 가능하다.
상기 형광물질은 자외선, 전기에너지, 열에너지 등의 외부 에너지에 의해 여기되어 그 에너지를 빛으로 바꾸는 물질로서, 유기 형광체 또는 무기 형광체를 포함할 수 있다. 상기 유기 형광체의 예는 로다민(Rhodamine), 알렉사(Alexa) Fluor dye, 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), FAM(5-carboxy fluorescein), ATTO dye, BODIPY, CF dye, Cyanine(Cy) dye, DyLight Fluor 및 텍사스 레드(Texas Red)일 수 있고, 상기 무기 형광체의 예는 양자점을 들 수 있다.
상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드가 상보적으로 결합할 때 상기 포획스트랜드의 형광물질과 상기 검출스트랜드의 형광물질이 서로 프렛쌍(FRET pair)을 형성하게 된다. 상기 포획스트랜드의 형광물질과 상기 검출스트랜드의 형광물질은 상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 서로 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용할 수 있다. 이때 상기 프렛쌍으로부터 발생하는 형광 신호로부터 하기 식으로 정의되는 FRET 효율을 측정할 수 있다.
FRET 효율 = (억셉터가 내는 빛의 세기)/(도너와 억셉터가 내는 빛의 세기 합)
한편 상기 포획스트랜드, 검출스트랜드 및 차단스트랜드는 바람직하게는, DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA, TNA와 같은 핵산 또는 이의 유사체일 수 있다.
상기 차단스트랜드는 상기 포획스트랜드 또는 상기 검출스트랜드와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 구비한다. 바람직하게는 상기 차단스트랜드는 상기 포획스트랜드 및 상기 검출스트랜드 중 어느 것에도 상보적이지 않은 추가 염기서열을 구비할 수 있다. 상기 차단스트랜드의 존재에 의해 상기 검출스트랜드와 상기 포획스트랜드가 서로 상보적인 결합을 할 수 없도록 방해할 수 있다. 이때 상기 차단스트랜드는 상기 포획스트랜드 또는 상기 검출스트랜드 또는 상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드 모두에 미리 결합되어 있을 수 있다.
도 3은 차단스트랜드의 도입에 의해 상보적 서열을 갖는 포획스트랜드와 검출스트랜드의 결합이 방해받는 상태를 나타낸다. 도 3에 따르면, 상기 차단스트랜드는 검출스트랜드 또는 포획스트랜드 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 각각 하나 이상 부착될 수 있다.
상기 차단스트랜드를 이용한 기본적인 분석 절차는 1) 기판 표면에 포획항체를 고정한 후 잔여 포획항체를 씻어내는 과정, 2) 항원을 포획항체에 결합시키는 과정, 및 3) 검출항체를 항원에 결합시킨 후 잔여 검출항체를 씻어내는 과정 등을 포함할 수 있다.
도 3과 같이 검출스트랜드 또는 포획스트랜드 중 적어도 하나의 스트랜드가 별도의 상보적인 스트랜드와 전체 또는 일부 결합하고 있을 경우 검출스트랜드와 포획스트랜드는 안정적으로 상보적인 결합을 할 수 없게 된다. 이와 같이 검출스트랜드와 포획스트랜드가 상보적인 결합을 할 수 없도록 하는 별도의 추가 스트랜드를 차단스트랜드(blocking strand)라 할 수 있다. 한편 상기 차단스트랜드의 일부는 상기 검출스트랜드 또는 상기 포획스트랜드 중 어느 스트랜드와도 상보적이지 않은 염기서열을 포함할 수 있으며, 이러한 염기서열은 이들 스트랜드와 결합하고 있지 않고 추후 차단스트랜드를 제거하는 데 사용될 수 있다. 상기 차단스트랜드를 도입한 상태를 만듦으로써 위양성 문제가 발생하지 않을 수 있으며, 이후 상기 차단스트랜드를 제거하면 검출스트랜드와 포획스트랜드가 상보적으로 결합하며 프렛쌍을 형성할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 항원 검출용 키트는 제거스트랜드를 더 포함할 수 있다. 상기 제거스트랜드는 상기 차단스트랜드에 대해 상보적이며, 상기 차단스트랜드와 결합에 의해 상기 차단스트랜드를 상기 포획스트랜드로부터 제거하는 역할을 한다.
도 4는 제거스트랜드를 이용하여 차단스트랜드를 제거하는 과정을 나타낸다. 도 4는 포획스트랜드에 차단스트랜드가 결합되어 있는 경우를 예로 든 것으로서, 먼저 차단스트랜드와 상보적인 제거스트랜드(removal strand, 점선으로 표시)를 주입한다. 이때 상기 차단스트랜드의 드러난 부분이 충분히 길어 제거스트랜드와 충분히 많은 수의 염기쌍이 상보적으로 결합하므로 상기 차단스트랜드와 상기 제거스트랜드 사이의 결합은 안정적이다(도 4의 (a)).
상보적인 두 가닥의 염기서열은 염기 사이의 수소결합에 의해 결합이 유지되는데 수소결합은 매우 약한 결합이어서 상기 포획스트랜드의 끝부분과 상기 차단스트랜드 사이의 결합이 간헐적으로 깨어질 수 있다. 이 순간 상기 제거스트랜드가 상기 차단스트랜드와 결합을 할 수있게 된다(도 4의 (b)).
이어 상기 제거스트랜드 전체가 상기 차단스트랜드와 결합을 하게 되면, 결과적으로 상기 차단스트랜드의 일부만 상기 포획스트랜드와 결합을 유지할 수 있다. 이때 상기 차단스트랜드와 상기 포획스트랜드 간에 상보적으로 결합하고 있는 염기쌍의 수가 충분하지 않아 결합이 불안정해질 수 있다(도 4의 (c)).
결과적으로 상기 차단스트랜드가 상기 포획스트랜드로부터 떨어져나가 상기 검출스트랜드와 상보적인 상기 포획스트랜드의 부분이 드러나게 되고, 최종적으로 상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드가 상보적인 결합을 한다(도 4의 (d)).
상기 차단스트랜드는 상기 포획스트랜드에 대해 상보적이고, 상기 제거 스트랜드는 상기 차단스트랜드에 대해 상보적이므로 상기 제거스트랜드는 상기 포획스트랜드와 동일한 염기서열을 가진다. 또한 상기 포획스트랜드는 상기 검출스트랜드와 상보적이므로, 상기 제거스트랜드 역시 상기 검출스트랜드와 상보적인 서열을 갖는다. 따라서 상기 제거스트랜드는 상기 차단스트랜드가 아닌 상기 검출스트랜드와 결합을 할 수도 있다.
따라서 바람직하게는 상기 제거스트랜드의 길이는 상기 차단스트랜드의 길이보다 짧은 것일 수 있다. 상보적으로 결합하고 있는 두 스트랜드 사이의 결합력은 길이에 비례한다. 따라서 이 경우 상기 제거스트랜드와 상기 검출스트랜드 사이의 결합이 안정적이지 않아 결합을 하더라도 짧은 시간 내에 떨어져 나오고, 상기 검출스트랜드는 대부분의 시간 동안 단일가닥 상태를 유지하게 된다. 상기 제거스트랜드가 상기 차단스트랜드와 결합하여 상기 차단스트랜드를 상기 포획스트랜드에서 제거함으로써 상기 검출스트랜드와 상기 포획스트랜드가 상보적으로 결합할 수 있다.
상기 제거스트랜드의 길이는 특별히 제한되지 않고, 스트랜드를 구성하는 물질의 종류, 염기서열, 염기서열 중 구아닌(G) 또는 사이토신(C)의 비율, 버퍼의 종류 및 온도, pH, 양이온 농도 등에 따라 달라질 수 있으며, 상기 제거스트랜드의 길이는 예를 들어 5 내지 100 bp일 수 있다.
한편 앞의 예에서는 버퍼 교환 없이 제거스트랜드만 추가함으로써 차단스트랜드를 제거하고 검출스트랜드와 포획스트랜드의 상보적 결합을 유도했으나, 다른 구현예에 따르면, 버퍼를 이용함으로써 제거스트랜드를 사용하지 않고 차단스트랜드를 제거할 수 있다.
도 5는 검출스트랜드와 상보적 결합을 하는 다양한 차단스트랜드들을 나타낸다. 도 5와 같이, 검출스트랜드 또는 포획스트랜드 중 적어도 하나의 스트랜드의 일부 또는 전부를 차단스트랜드와 결합시킨 후 항원-항체 반응을 완료한다. 이후 기존 버퍼를 상보적 결합을 파괴하는 버퍼로 교체함으로써 제거스트랜드 없이 차단스트랜드를 제거할 수 있다. 다음 다시 기존 버퍼로 교체함으로써 검출스트랜드와 포획스트랜드의 상보적으로 결합하게 할 수 있다. 이때 상기 차단스트랜드에는 상기 검출스트랜드와 상기 포획스트랜드 모두와 상보적이지 않은 추가 염기서열이 있어도 좋고 없어도 무방하다.
본 명세서의 다른 측면에 의하면, 차단스트랜드를 도입함으로써 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법이 제공된다. 상기 항원 검출방법은 (a) 형광물질이 표지된 포획스트랜드를 구비한 포획항체를 준비하는 단계; (b) 상기 포획스트랜드의 염기서열 일부 또는 전부와 상보적이며, 형광물질이 표지된 검출스트랜드를 구비한 검출항체를 준비하는 단계; (c) 상기 포획스트랜드 또는 상기 검출스트랜드 중 하나 이상에 차단스트랜드를 상보적으로 결합시키는 단계; (e) 상기 포획항체를 기판 위에 부착하는 단계; (f) 항원을 포함하는 시료를 도입하여, 상기 항원, 상기 포획항체 및 상기 검출항체 간에 항원-항체 반응을 유도하는 단계; (g) 상기 차단스트랜드를 제거하여 상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드를 상보적으로 결합시키는 단계; 및 (h) 상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드의 결합에 의해 생성되는 형광 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 (c) 단계의 상기 차단스트랜드의 결합은 상기 (e) 단계의 상기 포획항체를 기판에 부착하는 단계 이전 또는 이후에 수행될 수 있다.
상기 포획항체를 상기 기판에 부착시켜 사용할 경우 이러한 부착은 예컨대 pH 9.5인 0.06M 탄산염 완충용액 또는 중탄산염 완충용액으로 상기 포획항체를 희석시키고 그 희석액을 기판에 일정 온도에서 일정 시간 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다.
상기 기판에 부착된 포획항체는 이후 검체 시료 중의 항원과 결합체를 형성하게 되며, 결합체가 형성된 후에는 비특이적으로 결합된 항체를 제거하거나 오염물질 등을 제거하기 위한 목적으로 Tween 20과 같은 세척 완충액이나 증류수 등의 세척제로 세척하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 시료는 검출 대상이 되는 타겟 물질을 함유한 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 점막액, 뇨 등일 수 있으며, 예를 들어 질환이 의심되는 동물 또는 인간 개체로부터 분리 수득된 것일 수 있다.
상기 항원은 바이러스, 박테리아, 핵산, 펩타이드, 단백질, 소포체, miRNA, 엑소좀, 순환종양세포, 바이오마커 등일 수 있다. 바람직하게는 상기 항원은 바이오마커일 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술은 세포, 조직 및 기관 등을 관찰하는 데 사용될 수 있다. 특히 본 명세서에 개시된 기술이 한 번의 검사에서 여러 종의 생체물질을 검출하여 신속하게 질병을 조기진단할 수 있다는 점에서 바이오마커 검출용으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 바이오마커는 생물처리과정, 병원성을 일으키는 과정, 치료를 위한 약리학적 과정의 측정 또는 평가 등의 통상적인 과학 또는 의료분야에서 사용되는 것이면 제한 없이 이용가능하고, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 바이오마커는 예를 들어 혈액, 타액, 소변 등의 생체액에서 검출할 수 있는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 단백질 또는 대사물질일 수 있으며, 구체적으로는 AFP(alpha fetoprotein), CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, 칼시토닌(calcitonin), 칼레티닌(calretinin), CEA(carcinoembryonic antigen), CD34, CD99, MIC-2, CD117, 크라모그라닌(chromogranin), 사이토케라틴(cytokeratin, various types: TPA, TPS, Cyfra21-1), 데스민(desmin), EMA(epithelial membrane antigen), Factor VIII, CD31, FL1, GFAP(glial fibrillary acidic protein), GCDFP-15(gross cystic disease fluid protein), HMB-45, hCG(human chorionic gonadotropin), 면역글로불린(immunoglobulin), 인히빈(inhibin), 케라틴(keratin, various types of keratin), 백혈구 마커(lymphocyte marker), MART-1(Melan-A), Myo D1, MSA (muscle-specific actin), 뉴로필라멘트(neurofilament), NSE(neuron-specific enolase), PLAP(placental alkaline phosphatase), PSA(prostate-specific antigen), PTPRC(CD45), S100 protein, SMA(smooth muscle actin), 시냅토파이신(synaptophysin), TK(thymidine kinase), Tg(thyroglobulin), TTF-1(thyroid transcription factor-1), M2-PK, 바이멘틴(vimentin), 인터루킨(interleukin), CD24, CD40, 인테그린(integrin), 시스타틴(cystatin), 인터페론(interferon), TNF(tumor necrosis factor), MCP, VEGF, GLP, ICA, HLA-DR, ICAM, EGFR, FGF, BRAF, GFEB, FRS, LZTS, CCN, 뮤신(mucin), 렉틴(lectin), 아포리포단백질, 티로신, 신경세포 접착분자 유사 단백질, 파이브로넥틴, 포도당, 요산, 탄산탈수효소 또는 콜레스테롤 등일 수 있다.
또한 상기 시료는 상기 바이오마커가 포함되지 않은 용액으로 희석될 수 있으며, 상기 시료에 포함된 상기 바이오마커의 농도는 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 크게 차이가 날 수 있다. 바람직하게는 이미지 센서에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 희석될 수 있다. 바람직하게는 서로 다른 비율로 희석된 동일한 시료에 대해서 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1:10 내지 1,000의 중량비로 수 차례 희석하여 사용할 수 있다.
포획항체나 검출항체에 스트랜드를 부착하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 단백질 분자와 핵산 분자를 결합시키는 방법에 의해서 수행될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 서로 다른 반응기를 동시에 가지고 있는 화합물을 사용하여 핵산 분자와 단백질 분자 간의 결합 반응을 수행하여 부착할 수 있다. 일례로 SMCC (succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)는 아민(amine)에 반응하는 NHS-ester와 싸이올(thiol)에 반응하는 말레이미드(maleimide) 그룹을 가지고 있는데, 싸이올기가 부착되어 있는 스트랜드를 SMCC와 반응시킨 후 그 결과물을 검출항체와 반응시키면 검출항체의 N-말단 또는 라이신에 있는 아민기와 반응하여 검출항체에 스트랜드를 붙일 수 있다.
한편 차단스트랜드는 앞서 상술한 바와 같이 검출스트랜드와 포획스트랜드가 상보적인 결합을 할 수 없도록 하는 별도의 추가 스트랜드로서, 상기 차단스트랜드가 상기 검출스트랜드 또는 상기 포획스트랜드와 결합한 이후 상기 차단스트랜드의 제거에 의해 검출스트랜드와 포획스트랜드가 상보적으로 결합하여 프렛쌍을 형성할 수 있다. 상기 차단스트랜드의 길이는 상기 검출스트랜드 또는 상기 포획스트랜드와의 상보적인 결합을 유지하기 위해 적절히 제어될 수 있다.
상기 검출스트랜드 또는 상기 포획스트랜드의 길이는 특별히 제한되지 않지만 스트랜드를 구성하는 물질의 종류, 염기서열, 염기서열 중 구아닌(G) 또는 사이토신(C)의 비율, 버퍼의 종류 및 온도, pH, 이온농도 등 결합력에 영향을 주는 요소들과 표지하고자 하는 형광물질의 수를 고려하여, 예를 들어 10 내지 300 bp일 수 있으며, 상기 차단스트랜드의 길이는 5 내지 150 bp일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 차단스트랜드의 제거를 위해 상기 차단스트랜드와 상보적인 제거스트랜드를 도입할 수 있다. 여기서 상기 제거스트랜드가 너무 길면 검출스트랜드와 안정적으로 상보적 결합할 수 있으며, 반대로 상기 제거스트랜드의 길이가 너무 짧으면 상기 차단스트랜드와 상보적으로 결합하고 있더라도 상기 차단스트랜드가 상기 포획스트랜드와 상보적으로 결합하고 있는 길이가 너무 길어 상기 차단스트랜드가 상기 포획스트랜드로부터 떨어져나오지 못할 수 있다. 적절한 제거스트랜드의 길이는 스트랜드를 구성하는 물질의 종류, 염기서열, 염기서열 중 구아닌(G) 또는 사이토신(C)의 비율, 버퍼의 종류 및 온도, pH, 이온농도 등에 의해 적절히 결정될 수 있으며, 바람직하게는 상기 제거스트랜드가 상기 검출스트랜드나 상기 포획스트랜드와 안정적 결합이 되지 않도록 상기 제거스트랜드의 길이는 상기 차단스트랜드의 길이보다 짧은 것이 좋다.
다른 구현예에서, 상기 상기 차단스트랜드의 제거를 위해 상보적 결합을 파괴하는 버퍼를 이용할 수 있다.
한편, 상기 형광 신호의 측정은 단일분자 현미경을 이용하여 이미징함으로써 수행될 수 있다. 서로 다른 두 종류의 형광물질이 매우 가까이 위치할 때 한 형광물질(도너)의 에너지가 다른 형광물질(억셉터)로 전달되는 현상을 FRET이라 하는데, 상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드가 상보적으로 결합할 때 상기 포획스트랜드의 형광물질과 상기 검출스트랜드의 형광물질이 서로 프렛쌍(FRET pair)을 형성할 수 있다. 따라서 상술한 프렛쌍의 형성에 의해 형광 신호가 나타나는 곳에 타겟 항원이 위치함을 알 수 있다.
결론적으로 상술한 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트 및 항원검출방법에 따르면, 다중진단이 용이하고 민감도가 높은 FRET-PAINT 기술을 이용하면서도 차단스트랜드의 도입과 함께 제거스트랜드 또는 버퍼의 교환에 의해 용이하게 위양성 신호를 제거할 수 있어 검체 내 미량의 각종 바이오마커나 바이러스 등의 항원을 검출할 경우에 발생할 수 있는 오차가 대폭 감소된다.
이상과 같이 다양한 구현예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (11)

  1. 기판 위에 부착될 수 있으며, 형광물질이 표지된 포획스트랜드를 구비한 포획항체;
    상기 포획스트랜드의 염기서열 일부 또는 전부와 상보적이며, 형광물질이 표지된 검출스트랜드를 구비한 검출항체; 및
    상기 포획스트랜드 또는 상기 검출스트랜드와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 구비함으로써, 상기 검출스트랜드와 상기 포획스트랜드가 서로 상보적인 결합을 할 수 없도록 방해하는 차단스트랜드를 포함하며,
    상기 차단스트랜드가 제거된 이후, 상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드는 상보적으로 결합하여 상기 포획스트랜드의 형광물질과 상기 검출스트랜드의 형광물질이 서로 프렛쌍(FRET pair)을 형성하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 차단스트랜드에 대해 상보적이며, 상기 차단스트랜드와의 결합에 의해 상기 차단스트랜드를 상기 포획스트랜드로부터 제거할 수 있는 제거스트랜드를 더 포함하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 제거스트랜드의 길이는 상기 차단스트랜드의 길이보다 짧은 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 차단스트랜드는 상기 포획스트랜드 및 상기 검출스트랜드 모두와 상보적이지 않은 추가 염기서열을 더 포함하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트.
  5. 삭제
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 포획스트랜드의 형광물질과 상기 검출스트랜드의 형광물질은 상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 서로 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 프렛쌍으로부터 발생하는 형광 신호로부터 하기 식으로 정의되는 FRET 효율을 측정하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출용 키트.
    FRET 효율 = (억셉터가 내는 빛의 세기)/(도너와 억셉터가 내는 빛의 세기 합)
  8. (a) 형광물질이 표지된 포획스트랜드를 구비한 포획항체를 준비하는 단계;
    (b) 상기 포획스트랜드의 염기서열 일부 또는 전부와 상보적이며, 형광물질이 표지된 검출스트랜드를 구비한 검출항체를 준비하는 단계;
    (c) 상기 포획스트랜드 또는 상기 검출스트랜드 중 하나 이상에 차단스트랜드를 상보적으로 결합시키는 단계;
    (d) 상기 포획항체를 기판 위에 부착하는 단계;
    (e) 항원을 포함하는 시료를 도입하여, 상기 항원, 상기 포획항체 및 상기 검출항체 간에 항원-항체 반응을 유도하는 단계;
    (f) 상기 차단스트랜드를 제거하여 상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드를 상보적으로 결합시켜 상기 포획스트랜드의 형광물질과 상기 검출스트랜드의 형광물질이 서로 프렛쌍(FRET pair)을 형성하는 단계; 및
    (g) 상기 포획스트랜드와 상기 검출스트랜드의 결합에 의해 생성되는 형광신호를 측정하는 단계를 포함하는 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법.
  9. 삭제
  10. 제8 항에 있어서,
    상기 차단스트랜드의 제거를 위해 상기 차단스트랜드와 상보적인 제거스트랜드를 도입하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법.
  11. 제8 항에 있어서,
    상기 차단스트랜드의 제거를 위해 상보적 결합을 파괴하는 버퍼를 이용하는 것인 위양성 신호가 제거된 항원 검출방법.
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