KR20230126863A - Dna 압타머를 이용한 c-반응성 단백질 (crp) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트 - Google Patents
Dna 압타머를 이용한 c-반응성 단백질 (crp) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 본 발명은 형광 염료를 이용한 정량 분석 체외진단 키트에 관한 것으로 상세하게는 기존 분석 방법과 달리 테스트 항체를 DNA 압타머로 대체하여 분석하는 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트에 관한 것으로, 특히 테스트 항체로 생명체에서 유래되지 않고 인공적인 합성을 통해 만들어져 항체를 대체할 수 있는 DNA 압타머를 사용함에 따라 저렴하고 항체 배치간의 안정성을 개선하였을 뿐만 아니라, 재현성과 감도를 포함하는 성능을 향상시킨 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 형광 염료를 이용한 정량 분석 체외진단 키트에 관한 것으로 상세하게는 기존 분석 방법과 달리 테스트 항체를 DNA 압타머로 대체하여 분석하는 DNA 압타머 기반 형광 진단 키트에 관한 것이다.
특히 본 발명은 테스트 항체로 생명체에서 유래되지 않고 인공적인 합성을 통해 만들어져 항체를 대체할 수 있는 DNA 압타머를 사용함에 따라 저렴하고 항체 배치간의 안정성을 개선하였을 뿐만 아니라, 재현성과 감도를 포함하는 성능을 향상시킨 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트에 관한 것이다.
체외 정량 진단 키트는 인체 내 질환유무를 판단할 수 있는 바이오마커를 측정하기 위해 널리 사용되고 있는 것으로, 항원-항체 반응을 이용하여 인체 내 존재하는 미량의 표적물질을 정량하며, 전체적으로 측면 유동 면역 크로마토그래피 분석법 (Lateral flow immunochromatographic assay, LFIA)을 기반으로 만들어진다.
지금까지 제작된 측면 유동 면역 크로마토그래피 분석법을 이용한 체외 정량 진단 키트의 경우 크게 두 가지 구성요소로 이루어져 있는데, 첫 번째로 표적 물질에 특이적으로 반응하는 항체를 포함하는 진단 키트 카트리지와, 두 번째로 표적물질에 특이적으로 반응하며 표지물질 (유기 형광 물질)과 결합된 항체를 포함하는 반응 용액으로 이루어져 있다.
그러나 종래의 생명체로부터 얻어진 항체는 항원간의 반응성이 좋은 반면, 생산 시 배치간의 성능 차이(variation)가 있어 키트 제품의 성능이 생산 때마다 일정하지 않은 단점이 있다.
또한, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로뷸린 기반 테스트 항체의 경우 가격이 비싸, 면역진단키트 제조단가가 올라가는 단점이 있다.
또한, 표지물질이 결합된 항체를 포함한 반응 용액 성능을 유지하기 위해서는 일정 온도를 유지해야하며, 이로 인해 운송, 보관상에 들어가는 많은 비용과 온도 유지에 필요한 설비 구축에 어려움을 겪는 지역이 있다는 것을 감안할 때, 체외 정량 진단 키트의 수요를 늘리려면 해당 문제점을 해결해야할 필요성이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 다양한 체외 정량 진단 키트가 개발되고 있고, 그 예로 본 출원인이 출원하여 특허받은 한국등록특허 제10-2281805호(특허문헌 1)가 있다.
특허문헌 1의 기술은 표적물질 반응 항체를 포함한 최소 2개의 항체 용액이 분주된 다공성 멤브레인 다공성 멤브레인 일측에 접하여 검체가 점적되는 샘플 패드; 다공성 멤브레인 타측에 접하여 다공성 멤브레인을 흘러간 용액을 흡수하는 흡수 패드 다공성 맴브레인, 샘플패드, 흡수패드를 상부에 부착 지지하는 지지체; 및 지지체를 내장하고, 형광정량분석장치에 인터페이스 가능하도록 형성되는 플라스틱 카트리지를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하며, 다공성 멤브레인은, 유기 형광 염료와 결합된 컨트롤 항체와 유기 형광 염료가 결합된 분석물질 반응항체를 컨트롤 항체를 포획하기 위한 항체와 표적물질 반응항체가 분주된 지점과 샘플패드 사이에 분주하여, 분석물질이 다공성 멤브레인에 분주된 항체들과 반응하기 이전에 유기 형광 염료와 결합된 컨트롤 항체와 먼저 반응하도록 하고, 다공성 멤브레인은, 유기형광염료와 결합된 컨트롤 항체와, 유기형광염료와 결합된 분석물질 반응항체를 1X PBS에 1~3 % Bovine Serum Albumin, 0.1 ~ 0.5 % Sodium azide를 녹인 액에 희석하여 항체용액을 제조한 후, Tween 20 0.5%와 아자이드화 나트륨 1%, 그리고 소 혈청 알부민 1%를 포함한 용액을 미리 다공성 멤브레인에 분주하고, 유기 형광 염료가 결합된 항체 용액을 기존 반응용액에 포함된 항체의 3배~ 5배 농도로 준비하여 실온에서 완전히 건조하여 형성하되, 항체용액에는 인체 검체와 섞여도 일정한 pH를 유지하게 해주는 완충 용액 표지물질과 결합되어 있으며, 표적물질과 반응하여 정량을 가능하게 하는 항체 다공성 멤브레인에서 용액의 흐름을 조절하며, 항체의 비특이 반응을 제거하여 정량을 가능하게 하는 Triton x, Tween 20로부터 선택된 계면활성제 용액의 보존성을 향상시키기 위한 아자이드화 나트륨(NaN3) 보존제를 포함하는 형광염료를 이용한 건식 타입 형광 정량분석 체외 진단키트이다.
특허문헌 1에 사용된 다공성 멤브레인에 유기 형광 염료와 결합된 컨트롤 항체와 유기 형광 염료가 결합된 분석물질 반응항체를 컨트롤 항체를 포획하기 위한 항체와 표적물질 반응항체가 분주된 지점과 샘플패드 사이에 분주하여, 분석물질이 다공성 멤브레인에 분주된 항체들과 반응하기 이전에 유기 형광염료와 결합된 분석물질 특이항체 그리고 컨트롤 항체와 먼저 반응하도록 한 내용이 포함되어 있다.
그러나, 상기 특허문헌 1의 기술의 경우 항체가 포함된 반응용액을 사용하거나 유기 형광염료가 콘쥬게이트된 분석물질 특이 항체용액을 이용해 콘쥬게이트패드를 따로 제조하는데, 제조된 항체의 배치 간 성능이 일정하지 않을 경우, 정확도 및 재현성 문제가 도출되어 기존 개발 당시 성능과 다른 결과를 도출하는 경우가 있었다.
한편 생명체에서 유래된 항체를 이용할 때의 단점을 개선하기 위해 다양한 기술이 개발되고 있고, 그, 예로 특허문헌 2내지 3이 있다.
특허문헌 2는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 염기서열을 가지는, 온전한 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하고, 둘 이상의 앱타머가 고정화되어 있는 기판을 포함하고, 앱타머는, 발색효소, 양자점, 방사능 동위원소, 금 나노입자 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 검출체에 부착되고, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 H1N1 바이러스 및 인플루엔자 H1N1 바이러스의 점 돌연변이인 인플루엔자 바이러스를 검출하거나 진단하기 위한 키트이고,
특허문헌 3은 복수의 급성 열성 질환들을 구별하기 위한 현장 진단 시스템에 있어서, 압타머 기반으로 표적 항원을 검출하기 위한 진단 시약; 라만 분석 기법을 통해 라만 신호를 검출하는 진단 기기; 및 진단 기기에 안착되고 측방 유동 방식 기반으로 동작하는 진단 키트를 포함하되, 진단 기기는, 진단 키트가 배치되는 것을 감지하는 진단 키트 안착부; 진단 키트가 배치되면 진단 키트에 투입된 혈액과 진단 시약을 반응시키고, 발생하는 라만 신호를 증폭하여 검출하는 라만 분석 수행부; 검출된 라만 신호에 따라 피검자가 감염된 급성 열성 질환의 종류를 분석하는 질병 분석부; 및 분석된 질환에 대한 정보를 출력하는 출력부를 포함하고, 진단 키트 안착부는 진단 키트가 배치되는 것을 감지하기 위한 압력 센서, 광 센서 및 전기적 신호 송수신 수단 중 적어도 하나를 포함하며, 서로 다른 형태의 진단 키트의 구별 및 감지가 가능한 현장 진단 시스템이다.
이와 같이 압타머를 이용한 다양한 진단 기술이 개발되고 있으나, 이러한 종래의 압타머를 이용한 진단 기술은 멤브레인에 분주하는 물질도 항체가 아닌 압타머를 사용한 기술은 없었다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 개발된 것으로, 멤브레인에 분주하는 물질도 항체가 아닌 항체를 DNA 압타머를 사용한 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
특히 본 발명은 테스트 항체로 생명체에서 유래되지 않고 인공적인 합성을 통해 만들어져 항체를 대체할 수 있는 DNA 압타머를 사용함에 따라 저렴하고 항체 배치간의 안정성을 개선하였을 뿐만 아니라, 재현성과 감도를 포함하는 성능을 향상시킨 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
더욱이 본 발명은 진단키트를 구성하는 구성 요소 중 측정하고자 하는 특정 항원(C 반응성 단백질, CRP) 과 결합하는 테스트 항체를 니트로셀룰로즈 다공성 멤브레인에 분주하는 대신, 버퍼 내에서 항체 대신 압타머로 분석 물질과 반응하여 형광 정량 분석이 가능하게 함으로써, 사용되는 원료의 양을 대폭 줄이는 동시에 상온에 장기간 노출 시 도출되는 카트리지의 불안정성을 해결하고, 성능면에서 기존 항체를 사용할 시 도출된 성능과 유사하게 도출할 수 있게 한 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 해결하기 위한 본 발명에 따른 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트는 표적물질 반응 항체를 포함한 항체 용액이 분주된 다공성 멤브레인; 상기 다공성 멤브레인 일측에 접하여 검체가 점적되는 샘플 패드; 상기 다공성 멤브레인 타측에 접하여 상기 다공성 멤브레인을 흘러간 용액을 흡수하는 흡수 패드; 상기 다공성 맴브레인, 샘플패드, 흡수패드를 상부에 부착 지지하는 지지체; 및 상기 지지체를 내장하고, 형광정량분석장치에 인터페이스 가능하도록 형성되는 플라스틱 카트리지를 포함하여 구성되는 진단 키트에 있어서, 상기 멤브레인은 컨트롤 항체와 표적물질-DNA 압타머 복합체를 포획하기 위해 당단백질인 스트렙타비딘 (Streptavidin) 혹은 뉴트라비딘 (Neutravidin)이 분주된 니트로셀룰로스 다공성 멤브레인이고, 반응용액은 표적물질을 포획하는 DNA 압타머가 포함된 것을 특징으로 한다.
상기 니트로셀룰로스 다공성 멤브레인은 컨트롤 포획용 항체와, 표적물질-압타머 복합체를 포획하기 위해 3차 증류수로 희석된 스트렙타비딘 혹은 뉴트라비딘이 분주된 것이 바람직하다.
상기 반응용액은 형광염료(Alexa 647)가 접합된 컨트롤 포획용 항체(0.1 ug/mL 희석)와, 표적물질을 포획하기 위한 바이오티닐화된 압타머와 형광염료가 접합된 압타머가 40 mM HEPES, 100 mM NaCl, 8 mM MgCl2, 5 mM KCl을 3차 증류수에 희석하여 pH를 7.5로 맞춘 후 10% sucrose와 계면활성제 역할을 하는 Tween 4%를 첨가된 버퍼에 각각 10 uM 씩 희석된 것이 바람직하다.
상기 반응용액은 사용하고자 하는 DNA 압타머를 활성화 용액에 1:1 부피비율로 분산시킨 후 안정화를 위해 95 oC의 온도에서 10분 간 가열한 후 상온에 15분 이상 식혀준 뒤, 사용 직전 37 oC의 온도로 맞춰주며, 이 때, 활성화 용액은 기본적으로 1X PBS에 1~3 mM Calcium Chloride, 0.5~ 1.0 mM Magnesium Chloride를 녹인 용액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트는 진단키트를 구성하는 구성 요소 중 니트로셀룰로스 다공성 멤브레인에 컨트롤 항체와 압타머-표적물질 복합체를 포획하기 위한 당단백질인 스트렙타비딘 혹은 뉴트라비딘을 분주하여 건조시켜 준 뒤 검체가 DNA기반 CRP 압타머와 바이오티닐화 된 압타머가 있는 반응용액(버퍼)과 반응하여 카트리지의 샘플패드에 점적 후 멤브레인을 지나면서 분석 물질과 반응하여 형광 정량 분석이 가능하게 함에 따라 항체의 배치 간 안정성을 극복하고 성능 안정성을 확보할 수 있는 효과가 있다.
특히, 본 발명은 기존에 사용한 항체를 대체한 압타머를 사용함으로써 항체의 배치 간 불안정성을 극복하여 정확도와 생산 배치 간 성능 안정성을 확보할 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명은 표적물질과 결합하는 항체의 경우, 비교적 저렴한 컨트롤 항체에 비하여 생산 원가가 상당히 비싸, 대량 생산이 가능한 압타머로 대체함으로써 진단키트 제조 단가를 상당히 낮출 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명은 표적물질과 특이적으로 결합하는 항체와 동일한 역할을 할 수 있는 압타머를 이용하여 정량 진단 키트의 제조가 가능하며, 단순 샌드위치 정량 분석법을 벗어나 표적물질에 특이적인 압타머와 결합하는 반응을 이용한 체외 정량 키트 제조에도 적용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트의 실시예의 모식도
도 2는 기존 진단 키트 스트립의 기본 구성 요소의 모식도
도 3은 기존 진단 키트를 이용한 표준물질 측정 결과 그래프
도 4는 본 발명에 따른 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트를 이용한 표준물질 측정 결과 그래프
도 2는 기존 진단 키트 스트립의 기본 구성 요소의 모식도
도 3은 기존 진단 키트를 이용한 표준물질 측정 결과 그래프
도 4는 본 발명에 따른 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트를 이용한 표준물질 측정 결과 그래프
본 발명은 다양한 변경을 가하여 실시할 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고, 상세한 설명을 통해 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은 저렴하고 항체 배치간의 안정성을 개선하였을 뿐만 아니라, 재현성과 감도를 포함하는 성능을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트는 도 2에 도시한 기존의 진단 키트와 유사하게 표적물질 반응 항체를 포함한 항체 용액이 분주된 다공성 멤브레인; 상기 다공성 멤브레인 일측에 접하여 검체가 점적되는 샘플 패드; 상기 다공성 멤브레인 타측에 접하여 상기 다공성 멤브레인을 흘러간 용액을 흡수하는 흡수 패드; 상기 다공성 맴브레인, 샘플패드, 흡수패드를 상부에 부착 지지하는 지지체; 및 상기 지지체를 내장하고, 형광정량분석장치에 인터페이스 가능하도록 형성되는 플라스틱 카트리지를 포함하여 구성되되, 도 1에 도시한 바와 같이, 상기 멤브레인은 컨트롤 항체와 표적물질-DNA 압타머 복합체를 포획하기 위해 당단백질인 스트렙타비딘 (Streptavidin) 혹은 뉴트라비딘 (Neutravidin)이 분주된 니트로셀룰로스 다공성 멤브레인으로 이루어진다.
본 발명의 진단 키트의 반응용액은 표적물질을 포획하는 DNA 압타머를 포함하고 있다.
상기 니트로셀룰로스 다공성 멤브레인에는 면역글로뷸린-형광염료접합 컨트롤 항체를 포획하는 컨트롤 항체와, 표적물질-형광염료접합 비오틴 결합 압타머를 포획하는 스트렙타비딘 혹은 뉴트라비딘이 분주된 지점이 반응하도록 하는 것이 바람직하다.
또한 상기 니트로 셀룰로스 다공성 멤브레인의 컨트롤 포획 라인의 경우, 컨트롤 항체를 1X PBS에 1~3 % Bovine Serum Albumin, 0.1~0.5 % Sodium azide를 녹인 용액에 희석하여 항체용액을 제조한 후, 상기 다공성 멤브레인에 상기 항체용액을 분주하고 실온에서 완전히 건조하여 형성하였다.
상기 컨트롤 항체를 포획하기 위한 항체는 anti-rat IgG를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 항체용액에는 인체 검체와 섞여도 일정한 pH를 유지하게 해주는 완충 용액; 표적물질과 결합되어 있으며, 표적물질과 반응하여 정량을 가능하게 하는 항체와; 상기 니트로셀룰로스 다공성 멤브레인에서 용액의 흐름을 조절하며, 용액의 보존성을 향상시키기 위한 보존제;를 포함한다.
상기 보존제는 아자이드화 나트륨(NaN3)을 사용하였다.
상기 니트로 셀룰로스 다공성 멤브레인의 테스트 표적물질 포획 라인의 경우, 상기 당단백질인 스트렙타비딘 혹은 뉴트라비딘을 3~5 mg/mL 농도로 3차 증류수에 희석하여 항체용액을 제조한 후, 상기 다공성 멤브레인에 상기 용액을 분주하고 실온에서 완전히 건조하여 형성한다.
상기 샘플패드는 Glass Fiber 재질을 사용하고, 상기 흡수 패드는 Glass Micro fiber 재질의 Fliter paper를 사용하였다.
상기 표적물질(CRP)을 포획하는 DNA 압타머가 있는 버퍼는, 40mM HEPES, 100 mM NaCl, 8 mM MgCl2, 5 mM KCl을 3차 증류수에 희석하여 pH를 7.5로 맞춘 후 10% sucrose와 계면활성제 역할을 하는 Tween 4%를 첨가하였다.
상기 표적물질(CRP)을 포획하기 위한 DNA 압타머는 바이오티닐화된 CRP압타머와 DNA CRP압타머 총 2개를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 표적물질 (CRP)을 포획하기 위한 DNA 압타머는 제조 전 활성화 과정이 필요하며, 사용하고자 하는 DNA 압타머를 활성화 용액에 1:1 부피비율로 분산시킨 후, 안정화를 위해 95 oC의 온도에서 10분 간 가열한 후 상온에 15분 이상 식혀준 뒤, 사용 직전 37 oC의 온도로 맞춰준다. 이 때, 활성화 용액은 기본적으로 1X PBS에 1~3 mM Calcium Chloride, 0.5~1 mM Magnesium Chloride를 녹인 용액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 표적물질(CRP)을 포획하기 위한 DNA 압타머는 감도 측정을 위해 형광 물질 (Alexa-647 등)을 접합하였다.
상기 표적물질(CRP)을 포획하기 위한 DNA 압타머는 활성화 단계 후, 바이오티닐화 된 CRP 압타머와 DNA기반 CRP 압타머를 버퍼에 각각 10 ~ 50 uM 농도로 희석하였다.
<실시 예>
1) 도 1은 본 발명의 진단키드를 이용하여 DNA 압타머를 활성화시키는 과정으로, 사용하고자 하는 DNA 압타머를 활성화 용액에 1:1 부피비율로 분산시킨 후 안정화를 위해 95 oC의 온도에서 10분 간 가열한 후 상온에 15분 이상 식혀준 뒤, 사용 직전 37 oC의 온도로 맞춰준다.
이때, 활성화 용액은 기본적으로 1X PBS에 1~3 mM Calcium Chloride, 0.5~ 1.0 mM Magnesium Chloride를 녹인 용액을 사용한다.
2) 도 1의 모식도에서, 컨트롤 항체 포획용 항체(5)를 니트로셀룰로즈 다공성 멤브레인에 고정시킨다. DISPENSER SYSTEM (ZETA corporation 한국)에 지지체(9)에 고정시킨 멤브레인을 두고, 준비된 컨트롤 항체 포획용 항체(5)를 분주한 후 건조한 환경에 방치하여 고정시킨다. 컨트롤 항체 포획용 항체(5)에는 Rat IgG 등을 사용할 수 있다.
3) 도 1의 모식도에서 CRP 표적물질을 포획하는 DNA 압타머가 있는 반응용액(버퍼)를 제조한다. 40 mM HEPES, 100 mM NaCl, 8 mM MgCl2, 5 mM KCl을 3차 증류수에 희석하여 pH를 7.5로 맞춘 후 10% sucrose와 계면활성제 역할을 하는 Tween 4%를 첨가한다.
4) 도 1의 모식도에서 표적물질 검출라인(6)에 스트렙타비딘 혹은 뉴트라비딘을 니트로셀룰로스 다공성 멤브레인에 고정시킨다. DISPENSER SYSTEM(ZETA corporation 한국)에 지지체(9)에 고정시킨 멤브레인을 두고, 1 ~ 5 mg/mL 농도로 준비된 건출라인(6)(스트렙타비딘 혹은 뉴트라비딘)을 분주한 후 건조한 환경에 방치하여 고정시킨다.
5) 도 1의 모식도에서 반응용액(버퍼)에 DNA 압타머(2, 3)와 형광염료(4)가 접합된 컨트롤 항체를 첨가한다. 활성화 용액에 희석된 DNA 압타머(2, 3)는 각각 10 uM, 형광염료(4)가 접합된 컨트롤 항체는 0.1 ug/mL 의 농도로 버퍼에 희석하여 사용한다.
6) 도 1의 모식도 전체를 의미하는 카트리지를 조립하는 과정은 상기의 2)와 4)의 과정에서 제조했던, 스트렙타비딘 혹은 뉴트라비딘과 컨트롤 항체가 고정된 멤브레인에 샘플패드(1)와, 흡수패드(8)를 부착하여 카트리지 조립을 완성한다.
이 때, 샘플패드(1)는 유리재질의 grade 8964, 흡수패드(8)는 grade 121을 사용한다.
[DNA 압타머 형광면역 진단 키트의 정량분석 형태 - C-반응성 단백질 정량 키트]
반응 용액이 필요한 종래의 체외 진단 키트와 동일한 효과의 정량 분석이 본 발명의 DNA 압타머 형광면역 체외 진단 키트를 이용하여 C-반응성 단백질 (CRP) 정량 분석에도 적용이 가능하다.
본 발명을 이용하여 제작한 진단 키트의 경우 진단 스트립의 구성은 종래 체외 진단 키트와 동일한 구조를 가지고 있다. 실시 예에 사용한 C-반응성 단백질 (C-reactive Protein, CRP) 진단 스트립이다. 표적물질 검출 라인에는 스트렙타비딘 (Invitrogen, Streptavidin 434302) 1 ~ 5 mg/mL 농도의 용액을 만들어 고정시킨다. 대조라인에는 Chicken IgY 항체 (Arista Biologicals) 1.0 mg/mL 농도의 용액을 만들어 고정시킨다.
표적물질은 CRP calibrator (RANDOX)를 사용하였다. 물질의 Lv별 농도는 Lv 1: 0.1 mg/L (저 농도), Lv 2: 10 mg/L (고 농도)의 물질을 사용하였다. 각 표적물질은 바이오티닐화 된 CRP 압타머 (Biotin Modified Anti-C-Reactive Protein Aptamer, CTApt-M-1593, Creative Biolabs) 와 형광염료 (Alexa 647)와 접합된 CRP 압타머 (CTApt-156, Creative Biolabs) 가 있는 버퍼와 1:1 비율로 섞은 후 샘플패드에 100 uL를 점적하여 8분 반응 후 정량을 실행하였다.
DNA 압타머 형광 진단 키트에 각 농도별로 점적한 뒤, 표적물질 검출 라인과 대조라인의 표지물질(유기 형광 염료)의 형광 신호 세기(Intensity)는 자사 형광 측정기기(Zet-biotech, AnyLab F1)을 이용하여 측정하였다. 먼저 650 nm 파장의 레이저를 이용해 표지물질(유기 형광 염료)를 여기(Excitation) 시킨 뒤, 발현되는 665 nm 파장의 형광을 측정하여 표적물질과 결합한 형광 표지물질과 콘쥬게이트된 항체 내 표지 물질의 형광 신호 세기 (intensity)를 측정하여 도면 4과 같은 결과를 도출하였다.
도 4의 결과 그래프의 x축은 측정기기의 진단 키트 판독 구간을 나누어 step 수로 표시한 값으로 수치가 클수록 검체 점적 부분에서 가까운 구간으로, 첫 번째 peak는 대조라인, 두 번째 peak는 표적물질 검출라인이다.
도 3과 도 4에 도시된 바와 같이 표적물질 검출라인 형광 세기 변화 경향을 비교해 보았을 때, 기존 형광 진단 키트의 표준물질 농도별 표적물질 검출라인 형광 세기의 변화 경향과 DNA 압타머 형광 진단 키트의 표적물질 검출라인 세기의 변화 경향이 크게 다르지 않음을 확인 하였고, 그 경향은 대단히 유사함을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 통해 본 발명의 실시 예에 따른 DNA 압타머 형광 면역 정량진단 키트의 경우, 농도 증가에 따른 감도 증가 경향성이 기존 형광 진단 키트의 그것과 동일하게 적용되며, 그로 인해 본 발명 방식으로도 정확한 정량이 가능한 것을 확인할 수 있다.
1: 샘플패드
2: 바이오티닐화된 CRP 압타머
3: 형광염료가 접합된 CRP압타머
4: 형광염료가 접합된 컨트롤 항체
5: 대조라인(유기형광염료 결합된 컨트롤 항체 포획용 항체)
6: 표적물질 검출라인(맴브레인에 고정된 스트렙타비딘 또는 뉴트라바딘)
7: 표적물질(바이오티닐화 CRP압타머-형광염료 접합 압타머 복합체)
8: 흡수패드
9: 지지체
10: 표적물질(CRP)
2: 바이오티닐화된 CRP 압타머
3: 형광염료가 접합된 CRP압타머
4: 형광염료가 접합된 컨트롤 항체
5: 대조라인(유기형광염료 결합된 컨트롤 항체 포획용 항체)
6: 표적물질 검출라인(맴브레인에 고정된 스트렙타비딘 또는 뉴트라바딘)
7: 표적물질(바이오티닐화 CRP압타머-형광염료 접합 압타머 복합체)
8: 흡수패드
9: 지지체
10: 표적물질(CRP)
Claims (4)
- 표적물질 반응 항체를 포함한 항체 용액이 분주된 다공성 멤브레인; 상기 다공성 멤브레인 일측에 접하여 검체가 점적되는 샘플 패드; 상기 다공성 멤브레인 타측에 접하여 상기 다공성 멤브레인을 흘러간 용액을 흡수하는 흡수 패드; 상기 다공성 맴브레인, 샘플패드, 흡수패드를 상부에 부착 지지하는 지지체; 및 상기 지지체를 내장하고, 형광정량분석장치에 인터페이스 가능하도록 형성되는 플라스틱 카트리지를 포함하여 구성되는 진단 키트에 있어서,
상기 멤브레인은 컨트롤 항체와 표적물질-DNA 압타머 복합체를 포획하기 위해 당단백질인 스트렙타비딘 (Streptavidin) 혹은 뉴트라비딘 (Neutravidin)이 분주된 니트로셀룰로스 다공성 멤브레인이고,
반응용액은 표적물질을 포획하는 DNA 압타머가 포함된 것을 특징으로 하는 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트. - 제1항에 있어서,
상기 니트로셀룰로스 다공성 멤브레인은 컨트롤 포획용 항체와, 표적물질-압타머 복합체를 포획하기 위해 3차 증류수로 희석된 스트렙타비딘 혹은 뉴트라비딘이 분주된 것을 특징으로 하는 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트. - 제1항에 있어서,
상기 반응용액은 형광염료(Alexa 647)가 접합된 컨트롤 포획용 항체(0.1 ug/mL 희석)와, 표적물질을 포획하기 위한 바이오티닐화된 압타머와 형광염료가 접합된 압타머가 40 mM HEPES, 100 mM NaCl, 8 mM MgCl2, 5 mM KCl을 3차 증류수에 희석하여 pH를 7.5로 맞춘 후 10% sucrose와 계면활성제 역할을 하는 Tween 4%를 첨가된 버퍼에 각각 10 uM 씩 희석된 것을 특징으로 하는 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트. - 제1항에 있어서,
상기 반응용액은 사용하고자 하는 DNA 압타머를 활성화 용액에 1:1 부피비율로 분산시킨 후 안정화를 위해 95 oC의 온도에서 10분 간 가열한 후 상온에 15분 이상 식혀준 뒤, 사용 직전 37 oC의 온도로 맞춰주며, 이 때, 활성화 용액은 기본적으로 1X PBS에 1~3 mM Calcium Chloride, 0.5~ 1.0 mM Magnesium Chloride를 녹인 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 DNA 압타머를 이용한 C-반응성 단백질 (CRP) 형광 면역정량분석 체외 진단 키트.
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| KR20180090742A (ko) | 2017-02-03 | 2018-08-13 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 급성 열성 질환을 진단하기 위한 현장 진단 시스템 및 방법 |
| KR20190021733A (ko) | 2017-08-23 | 2019-03-06 | 울산과학기술원 | 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 앱타머, 이를 포함하는 약학 조성물 및 키트 |
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