CN112074740A - 成像测定法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于检测液体样品、优选生物样品中的分析物分子的测定法和系统。特别地，本发明涉及一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，该方法包括使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第一邻位探针接触并孵育，其中第一邻位探针通过改变所观察到的性质的聚合物或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物。

Description

成像测定法
本申请涉及用于检测液体样品、优选生物样品中的分析物分子的测定法和系统。
基于抗体的分析技术是流行的且众所周知的分析技术，其已在生物化学和医学中广泛用于定性和定量检测液体样品中的分析物。最常见的基于抗体的测定法类型是酶联免疫吸附测定法或“ELISA”。已知多种不同的ELISA技术，所有这些从根本上都依赖于酶标记的抗体与抗原的特异性结合。
由于抗体-抗原相互作用的高度特异性，ELISA技术以其高灵敏度和低浓度检测抗原的能力而闻名。这种灵敏度导致ELISA被广泛用于诸如检测血清样品中抗体的存在以确定患者是否存在某种疾病；分析食物样品以确定是否存在过敏原；毒理学筛查；以及检测表明存在特定类型肿瘤的生物标志物(例如蛋白质)等应用中。
虽然如此，仍希望进一步提高基于ELISA的技术的灵敏度，以便提高其在疾病的早期诊断中的效用。在疾病的非常早期阶段，体液样品中存在的生物标志物的水平可能低于当前测定技术的检测水平(LOD)，因此可能无法检测到此类生物标志物，或者只能检测到低水平，而不允许做出确信的诊断。在一些非早期阶段疾病的情况下，也可能存在低水平的生物标志物，从而引起相同的检测和诊断问题。但是，希望能够尽可能早地且尽可能确信地做出诊断，特别是在诸如癌症、神经退行性疾病和感染等疾病的情况下，其中通过早期检测和治疗可以显著改善预后。
例如，体积为约1mm3的早期癌症小肿瘤通常由大约100万个细胞组成。成年人平均血液量约为5升。假设肿瘤中的每个细胞向5升循环血液分泌约5000个蛋白质分子作为癌症生物标志物，则血液中癌症生物标志物分子的浓度大约为2×10-15mol dm-3(即大约2飞摩尔)。这低于许多当前测定技术的灵敏度，如ELISA或表面等离子共振(灵敏度通常约为pM–nM级)。
LOD可以正式定义为当信号外推至背景水平时(分析物浓度为零时)的分析物浓度，加上背景水平的3个标准偏差。为了获得较低的LOD，很明显，必须同时降低背景水平及其变化。
LOD也可以定义为与信号水平相对应的浓度，该信号水平是空白样品的平均信号水平加上3乘以空白样品的标准偏差。定义如下所示，其中“f”是将原始信号电平转换为浓度的校准函数。使用含有已知浓度的目标分析物的标准溶液通过实验确定校准函数。LOD＝f(空白平均值+3×空白标准偏差)
近来，基于ELISA的技术已被引入市场，其被广告宣传为具有飞摩尔级或亚飞摩尔级的LOD。例如，可从Quanterix Corporation(Lexington，Massachusetts，USA)获得的“Simoa”
Figure BDA0002760436800000021
测定法和仪器广告宣传的LOD为亚飞摩尔级。可从Singulex,Inc.(Alameda，California，USA)获得的SMCTM/
Figure BDA0002760436800000022
测定技术广告宣传的LOD也为亚飞摩尔级。然而，这些技术仍然具有希望克服的缺点。例如，“Simoa”技术具有有限的动态范围，并且在高于约10-14M的分析物浓度下不能给出定量结果。“SMC”/”Erenna”技术检测与抗原分离的单个扩散的荧光团标记的报告抗体。抗体-抗原结合的化学计量的变化、抗体粘附在反应室中以及扩散分子的固有随机性为使用这些技术检测到的抗原定量带来了很大的不确定性。Simoa技术和SMC/Erenna技术均采用昂贵的大型仪器(～1.5–3m3)，需要很大的实验室空间。此外，尽管ELISA方案通常使用封闭缓冲液旨在防止报告抗体与固体支持物的非特异性结合这一事实，但即使在诸如Simoa、SMC或Erenna分析测定法等高灵敏度测定法中也将不可避免地发生一定程度的非特异性结合。这种非特异性结合产生了背景信号，该背景信号与从特异性结合至目标分析物的抗体获得的信号无法区分。这些背景信号限制了LOD，并限制了常规的基于ELISA的技术准确定量分析物浓度的能力。
限制基于ELISA的技术尤其是在医学诊断领域中的适用性的另一个因素是所需的样品的体积可能为约毫升级。如果待分析的样品是体液样品(例如血液或脑脊髓液样品)，则可能需要从患者身上抽取较大体积的量，这可能是不愉快的经历。因此，希望开发需要较少样品体积的测定技术。
常规的基于ELISA的技术的另一个特点是进行测定和分析结果所花费的时间通常在2-3小时或更长时间内。因此，希望开发具有少于1小时运行时间的测定技术。这不仅将提高进行大批量样品分析的周转率，而且还将为采用基于ELISA的测定法进行名副其实的即时检测开辟道路。
作为基于荧光的测定法的替代方法，使用光散射的测量也已用于检测生物分子的存在。例如干涉散射显微镜检查(iSCAT)是一种光学显微镜技术，它依赖于照射散射物体并收集由散射物体散射的光场与参考光场之间的干涉，该干涉是由在散射物体所在位置附近的界面处照射的反射所提供的。在没有散射物体的情况下，在相机上检测到的光场纯粹来自于反射光场。在存在散射物体的情况下，反射光的强度由于来自物体的散射光与反射光之间的干涉而衰减。iSCAT已被应用到许多生物分子检测应用中，其中生物分子的质量足够大，以至于自身无法产生足够强的散射光场，或者其中生物分子被质量更高的纳米颗粒标记。
本申请发明人现已出乎意料地发现，本发明的测定法能够区分报告抗体的特异性结合和非特异性结合，从而改善LOD至10-15M或更低的典型水平，并且在至少一些情况下可实现10-18M或更低的水平。可以在10μl或更少的样品体积上进行本发明的测定法，该样品体积与通过“扎手指”皮肤穿刺法获得的血液样品的体积相配。本发明的测定法能够以高精确度定量分析物的分子数量，甚至是在样品体积中仅存在几十个分析物分子时。本发明的测定法的运行时间通常小于1小时。
发明内容
本发明涉及单独标志物分子的成像，以及使用栓链分子(tether molecule)将单个标志物连接至固体支持物。栓链分子足够长，以使通过栓链连接的材料相对于不经栓链非特异性连接至表面的材料具有不同的特征，如运动范围和运动速度。因此，可以将正确拴系的材料与不是通过栓链固定或未被固定的潜在较高水平的背景信号区分开。
本申请发明人已出乎意料地发现，通过将第一邻位探针(proximity probe)栓系于支持物，使得第一邻位探针和支持物之间存在空间间隔关系，可以区分背景或“假阳性”信号与由第一邻位探针和溶液中荧光标记的产物之间的相互作用产生的真实信号。由于栓链的长度，与仅随机粘附在表面上的分子相比，通过栓链连接的荧光探针似乎具有更大的运动面积(即更大的扩散)。
因此，本发明提供了一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，该方法包括以下步骤：
(i)将样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第一邻位探针接触并孵育，其中第一邻位探针通过聚合物或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物，从而使所述目标分析物栓系于支持物；
(ii)对被栓系的目标分析物具有特异性的单独分子生成信号；和
(iii)通过观察固体支持物上信号的运动来检测被栓系的目标分析物。
该测定法检测来自连接于单独栓链的分子的信号及其运动。尽管任选地可以将多于一种目标分析物连接于每个栓链，并且每种目标分析物可以选择性地用多个荧光团或其他标志物标记，但该技术依据单独信号生成种类的运动。单个信号生成种类通常由单独目标分析物组成，可以对其进行多重标记。
信号可以是荧光信号。可以在固定之前或之后通过结合探针如荧光标记的抗体或核酸探针标记目标分析物。或者，可以将结合探针与酶偶联，所述酶引发生成荧光产物的反应。栓链的性质影响观察到的荧光信号。
可以通过光散射生成信号，其中目标分析物可以是未被标记的。可以用结合探针标记目标分析物，该结合探针又与一种或多种纳米颗粒偶联，以便增加标志物种类的质量，从而增加散射光。
栓链分子任选地具有在含水溶液中约50nm至约1000nm的平均端对端距离。与直接结合至表面的信号生成器相比，栓链的存在允许信号生成分子在表面上在栓链的锚定点周围更大范围内移动。可以通过使用一系列图像随时间跟踪运动来进行检测，也可以通过拍摄单个图像来进行检测，所述单个图像显示了信号可以经过的表面区域。
发明详述
本发明使用结合至固体支持物的分子栓链来捕获分析物用于单个分子成像和检测。分析物在栓链上的结合点距离表面足够远，以使所连接的生物分子具有明显的运动特征，在用适当的产生荧光信号或散射信号的结合探针标记分析物后，使用多种方法(如荧光显微镜成像或iSCAT)来测量所述运动特征。
因此，本发明提供了一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第一邻位探针接触并孵育，其中所述第一邻位探针通过聚合物或生物聚合物分子被栓系于固体支持物；
(ii)将样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第二邻位探针接触并孵育，其中
a.所述第二邻位探针包括荧光团；或
b.在接触样品之前，使第二邻位探针与报告酶缀合；或
c.在接触样品的同时或之后，使第二邻位探针与报告酶缀合；或
d.第二邻位探针包含用于荧光原位杂交(FISH)的寡核苷酸序列；或
e.第二邻位探针与纳米颗粒缀合。
(iii)a.如果第二邻位探针与报告酶缀合，则向样品中添加报告酶的荧光底物以生成荧光反应产物；或
b.如果第二邻位探针包含用于荧光原位杂交(FISH)的寡核苷酸序列，则使第二邻位探针与FISH探针杂交，所述FISH探针包含荧光团和与第二邻位探针的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列；
(iv)照射样品以使荧光团或荧光反应产物发荧光或使纳米颗粒散射光；和
(v)通过观察来自荧光团或荧光反应产物或纳米颗粒的荧光或散射信号的运动来检测目标分析物。
在本发明的所有实施方案中，使样品与第一邻位探针接触并孵育以及使样品与第二邻位探针接触并孵育的步骤可以依次进行(在步骤(i)之后进行步骤(ii)或者在步骤(ii)之后进行步骤(i))或同时进行。然而，优选地，它们是依次进行，并且特别优选在步骤(i)之后进行步骤(ii)。任选地，依次进行步骤(i)和(ii)，并且在步骤(i)和步骤(ii)之间进行洗涤步骤。可以采用任何合适的洗涤缓冲液进行洗涤步骤。洗涤步骤有助于从样品中除去未被第一邻位探针结合或非特异性结合至支持物的分子，从而有助于使任何背景荧光或光散射最小化。
在步骤(i)和(ii)之后进行步骤(iii)(在存在的情况下)以及步骤(iv)和(v)。任选地，在步骤(ii)和(iii)之间(在存在(iii)的情况下)或在步骤(ii)和(iv)之间(在不存在步骤(iii)的情况下)进行另一洗涤步骤，以除去第二邻位探针的任何未结合的分子。在步骤(iii)(在存在的情况下)之后或在步骤(ii)(在没有步骤(iii)的情况下)之后进行步骤(iv)和(v)。步骤(iv)和(v)彼此同时进行。
如本文所用，术语“检测”包括目标分析物的定性和定量测量。一方面，本发明的方法仅用于鉴定液体样品中分析物的存在。在另一方面，本发明的方法用于测试分析物是否处于可检测水平。在又一方面，本发明的方法用于定量样品中存在的分析物的量。在另一方面，本发明的方法用于定量样品中分析物的量，并进一步比较不同样品中分析物的量。
在本发明的某些实施方案中，液体样品包含来自人类或非人类动物受试者、优选来自人类受试者的体液，基本上由其组成或由其组成。优选的体液包括唾液、脑脊髓液、玻璃体液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊水、乳汁、汗液、眼泪、尿液和血液。优选地，液体样品是来自人类受试者的血液样品。血液样品可以是全血样品、血浆样品或血清样品。
在本发明的其他实施方案中，液体样品包含来自植物的流体，例如木质部汁液、韧皮部汁液、细胞液或细胞溶质，基本上由其组成或由其组成。因此，本发明可以用于诸如检测植物病害、植物激素等的应用。
目标分析物优选是指示疾病如癌症或神经退行性疾病的存在或指示感染的存在的生物标志物。典型的生物标志物可以例如是激素、(多)肽(例如蛋白质或酶)、碳水化合物、抗体或寡核苷酸或小分子生物标志物如叶酸。优选地，分析物(例如，如上所述的生物标志物)是抗原和/或核酸序列。
第一邻位探针在本文中也可以被称为“捕获探针”，第二邻位探针在本文中也可以被称为“报告探针”。
第一邻位探针可以包含蛋白质、抗体、凝集素、可溶性细胞表面受体、来自噬菌体展示或核糖体展示的组合衍生的蛋白质、碳水化合物、适体、affimer、亲和体(affibody)、affilin、affitin、α体(alphabody)、anticalin、avimer、DARPin、单功能抗体(monobody)、寡核苷酸或多核苷酸或它们的组合，或由其组成。优选地，第一邻位探针包含抗体或由抗体组成。
如本文所用，术语“抗体”以最广义的常规含义使用，包括完整的单克隆抗体、完整的多克隆抗体、由至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体，单结构域抗体(也称为“纳米抗体”)和抗体片段，只要它们对目标分析物表现出所需的亲和力即可。“完整的抗体”是包含重链和轻链可变结构域以及Fc区的抗体。“抗体片段”包含完整的抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双功能抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。
将第一邻位探针拴系于固体支持物。在使样品与第一邻位探针接触并孵育之前、同时或之后，将第一邻位探针栓系于支持物。在添加和孵育第二邻位探针的同时或之后，或者在缀合报告酶的同时或之后，将第一邻位探针栓系于支持物。在将第一邻位探针拴系于支持物之后，在该方法的所有后续步骤中，第一邻位探针都保持拴系于支持物。
将第一邻位探针拴系于支持物的栓链分子(其可以称为“栓链”或“栓链分子”)可以是聚合物或生物聚合物。优选地，栓链分子在含水溶液中的平均端对端距离应为约50nm至约1500nm，如约150nm至约1360nm，约250nm至约650nm，约350nm至约550nm或约450至约550nm。对于荧光测量，优选地，栓链分子在含水溶液中的平均端到端距离应为约50nm至约250nm，例如约50nm至约175nm，约75nm至约150nm或约100nm至约200nm。对于散射测量，栓链可以更长。
合适的栓链分子包括表面活性剂、脂质、肽、蛋白质、寡糖、多糖、寡核苷酸和多核苷酸，如DNA或RNA。当采用DNA或RNA时，它可以是双链的(dsDNA或dsRNA或DNA-RNA双链杂交体)或单链的，并且可以是天然存在的或合成的。DNA折纸结构(origami structure)也可以用作栓链分子。在采用DNA折纸结构的情况下，这些可以具有用于邻位探针的多个结合位点。因此，在本发明的某些实施方案中，栓链分子是dsDNA或dsRNA，其在含水溶液中的平均端对端距离为约50nm至约250nm，例如约50nm至约175nm，约75nm至约150nm或约100nm至约200nm。在实践中，通常将采用多个栓链分子。这些通常彼此相同，并且彼此具有相同的平均端到端距离。然而，在一些实施方案中，可以同时采用多个栓链分子种类，其彼此之间具有不同的平均端对端距离。每个栓链种类都可以与捕获探针的不同种类偶联，检测不同的分析物种类，从而通过测量不同大小的栓链上分析物的运动实现同时多重分析物检测。
在采用双链DNA或RNA作为栓链的情况下，特别优选其长度应在约450至约4000个碱基对之间，优选在约500至3000个碱基对之间，在约500至约2000个碱基对之间，在约750至约1600个碱基对之间，特别是在约800至约1300个碱基对之间，在约800至约1000个碱基对之间，或在约900至约1100个碱基对之间，如约1000±100个碱基对或约1000个碱基对。
优选将双链DNA用作栓链，因为dsDNA的机械性质和动力学是很好理解的，如例如以下文献中所述：Yin等人,“Tethered Particle Motion Method for StudyingTranscript Elongation by a Single RNA Polymerase Molecule”,Biophys.J.1994,Dec1；67(6):2468-78，或May等人,“Tethered fluorophore motion:studying large DNAconformational changes by single-fluorophore imaging”,Biophys.J.2014Sep 2；107(5):1205-1216。
在一些实施方案中，栓链和第一邻位探针均可以各自包含寡核苷酸或多核苷酸或由寡核苷酸或多核苷酸组成。在这样的实施方案中，栓链和第一邻位探针可以任选地一起合成。
在本发明的某些实施方案中，固体支持物涂覆有金属膜(例如蒸发到固体支持物上的20nm的金)，该金属膜淬灭来自金属膜约50nm内的荧光团的荧光。自目标分析物分子或在接近表面处非特异性结合的邻位探针产生的荧光信号被有效淬灭，而来自栓链上进一步远离表面的那些分子的荧光则不受影响。
在本发明的某些实施方案中，固体支持物被钝化。表面的钝化有助于减少分析物、邻位探针和荧光分子与支持物表面的非特异性结合，这可能对检测的准确性或灵敏度产生负面影响。钝化可以在栓链分子结合至固体支持物之前进行。例如，可以使用技术人员已知的用于ELISA测定法或单分子TIRF实验的任何常规封闭缓冲液进行钝化。来自封闭缓冲液的分子(钝化分子)吸附到支持物上，并减少了可用非特异性结合位点的数量。
使栓链分子连接于(栓系于)固体支持物。栓链分子可以直接(例如通过共价键)结合至固体支持物。然而，优选地，栓链分子可以通过将栓链分子与被吸附至支持物或与支持物缀合的分子特异性地结合而间接地结合至固体支持物。优选地，栓链分子特异性结合的分子是来自封闭缓冲液的分子，其被吸附至支持物的表面或与支持物的表面缀合，并为栓链提供特异性结合位点。
支持物优选用包含以下物质的含水溶液钝化：蛋白质(例如牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA))、非离子表面活性剂(如聚山梨酯20(例如
Figure BDA0002760436800000091
)、Triton X-100或泊洛沙姆407(例如PluronicTM F127))、聚乙二醇(PEG)(任选地为酯形式)或它们的任何混合物。这样的蛋白质、表面活性剂、PEG及其混合物可以被称为“钝化/钝化分子(passivation/passivating molecules)”或“钝化/钝化剂(passivation/passivatingagents)”。使用钝化剂是特别优选的，因为然后可以使栓链分子特异性地结合至吸附的钝化剂，以便使栓链连接至固体支持物。任选地，这些钝化分子中的一些或全部可以与生物素基团或异硫氰酸荧光素(FITC)基团或异羟基洋地黄毒苷元(digoxigenin)(DIG)基团或本领域技术人员已知的常用分子相互作用工具包一部分中的其他分子缀合。
栓链分子可以结合至被吸附的钝化分子或者通过共价或非共价相互作用，例如借助于栓链分子上的部分与表面上的钝化分子之间的互补相互作用，或借助于栓链分子上的部分与表面自身之间的相互作用，直接结合至表面。用于此目的的合适的相互作用包括生物素-链霉亲和素相互作用、生物素-亲和素相互作用、streptag-strep-tactin相互作用、异硫氰酸荧光素(FITC)-抗FITC ab相互作用、异羟基洋地黄毒苷元(DIG)-抗DIG ab相互作用、镍-NTA相互作用、铜-NTA相互作用、马来酰亚胺基团-巯基相互作用、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯-胺相互作用、硫醇-硫醇相互作用或炔-叠氮化物相互作用(包括但不限于铜催化的炔-叠氮化物环加成(CuAAC)、钌催化的炔-叠氮化物环加成(RuAAC)、应变促进的炔-叠氮化物环加成(SPAAC))、醛-胺相互作用(任选地，随后进行胺还原)、醛-肼相互作用、胺-四嗪相互作用、施陶丁格连接。也可以采用生物素-亲和素-生物素或生物素-链霉亲和素-生物素相互作用，其中栓链和钝化分子均带有生物素部分，而亲和素或链霉亲和素用于将两个生物素部分桥接在一起。
一些分子可以同时充当钝化剂和栓链分子。长链表面活性剂分子，如泊洛沙姆(例如Pluronic F-127)特别适合用于此类目的。在一些情况下，此类表面活性剂分子需要官能化以改善其与支持物的结合能力。用于此目的的合适的官能化可以由技术人员容易地确定。当采用具有先天钝化能力的栓链分子时，通常不需要在连接栓链分子之前将支持物钝化。因此，在这种情况下，优选表面除了被栓链分子钝化以外不被钝化。
第一邻位探针可以通过共价或非共价相互作用结合至栓链分子。用于此目的的合适的相互作用包括生物素-链霉亲和素相互作用、生物素-亲和素相互作用、streptag-strep-tactin相互作用、异硫氰酸荧光素(FITC)-抗FITC ab相互作用、异羟基洋地黄毒苷元(DIG)-抗DIG ab相互作用、镍-NTA相互作用、铜-NTA相互作用、马来酰亚胺基团-巯基相互作用、硫醇-硫醇相互作用、NHS-酯-胺相互作用或炔-叠氮化物相互作用(包括但不限于铜催化的炔-叠氮化物环加成(CuAAC)、钌催化的炔-叠氮化物环加成(RuAAC)、应变促进的炔-叠氮化物环加成(SPAAC))、醛-胺相互作用(任选地，随后进行亚胺还原)、醛-肼相互作用、胺-四嗪相互作用、施陶丁格连接。也可以采用生物素-亲和素-生物素或生物素-链霉亲和素-生物素相互作用，其中栓链和钝化分子均带有生物素部分，而亲和素或链霉亲和素用于将两个生物素部分桥接在一起。
在一个实施方案中，使第一邻位探针和栓链分子都进行生物素化，并且第一邻位探针通过生物素-链霉亲和素、生物素-亲和素、生物素-链霉亲和素-生物素或生物素-亲和素-生物素相互作用结合至栓链分子，并且栓链分子通过生物素-链霉亲和素、生物素-亲和素、生物素-链霉亲和素-生物素或生物素-亲和素-生物素相互作用结合至钝化分子。
优选地，(直接或间接地)将栓链分子结合至表面，并且将栓链分子结合至第一邻位探针的相互作用各自独立地选自生物素-链霉亲和素相互作用、生物素-亲和素相互作用、生物素-链霉亲和素-生物素相互作用、生物素-亲和素-生物素相互作用、streptag-strep-tactin相互作用、异硫氰酸荧光素(FITC)-抗FITC ab相互作用、异羟基洋地黄毒苷元(DIG)-抗DIG ab相互作用、镍-NTA相互作用、铜-NTA相互作用、马来酰亚胺基团-巯基基团相互作用、硫醇-二硫化物相互作用、NHS-酯-胺相互作用或炔-叠氮化物相互作用，条件是将栓链分子结合至表面的相互作用类型不同于将栓链分子结合至第一邻位探针的相互作用类型。在这样的实施方案中，栓链分子优选是dsDNA。
第二邻位探针可以(不依赖于第一邻位探针的性质)包含如上定义的抗体、凝集素、可溶性细胞表面受体、来自噬菌体展示或核糖体展示的组合衍生的蛋白质、碳水化合物、适体、affimer、亲和体、affilin、affitin、α体、anticalin、avimer、DARPin、单功能抗体、酶或寡核苷酸，或由其组成。
在本发明的一些实施方案中，第二邻位探针包含荧光团。例如，第二邻位探针可以包含荧光团标记的抗体、凝集素、可溶性细胞表面受体、来自噬菌体展示或核糖体展示的组合衍生的蛋白质、碳水化合物、适体、affimer、亲和体、affilin、affitin、α体、anticalin、avimer、DARPin、单功能抗体、酶或寡核苷酸，或由其组成。优选地，第二邻位探针包含荧光团标记的抗体、酶或寡核苷酸，或由荧光团标记的抗体、酶或寡核苷酸组成。在一个特别优选的实施方案中，第二邻位探针是荧光原位杂交探针(FISH探针)，其包含荧光团和分析物结合域，该分析物结合域是与目标分析物的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列。在这样的实施方案中，当第二邻位探针与样品接触并孵育时，FISH探针与靶分析物杂交。
任选地，第二邻位探针的任何实施方案中的荧光团可以是量子点、金属纳米颗粒或聚合物纳米颗粒，或其具有荧光性质的复合材料。
任选地，第二邻位探针可以携带增加散射光的纳米颗粒。纳米颗粒可以是量子点、金属纳米颗粒或聚合物纳米颗粒或其具有或不具有荧光性质的复合材料。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第一邻位探针接触并孵育，其中第一邻位探针通过聚合物或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物；
(ii)使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第二邻位探针接触并孵育，其中第二邻位探针包含荧光团；
(iii)照射样品以使荧光团发荧光；和
(iv)通过观察来自荧光团的荧光来检测目标分析物。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第一邻位探针接触并孵育，其中第一邻位探针通过聚合物或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物；
(ii)使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第二邻位探针接触并孵育，其中第二邻位探针包含纳米颗粒；
(iii)照射样品以引起纳米颗粒的干扰散射(iSCAT)；和
(iv)通过观察纳米颗粒的运动来检测目标分析物。
栓链足够长，以至于如果拍摄长曝光图像，则与未经栓链连接的生物分子相比，连接的生物分子在更大的表面区域上出现。如果拍摄电影或连续的短曝光图像，则可以分析分子的运动，并且可以进行各种测量，如运动范围、运动速度、扩散常数、机器学习模型的输出，其可以用来区分栓系的分子和其他观察到的分子。
在这样的实施方案中，可以依次或同时进行步骤(i)和(ii)。然而，优选地，它们是依次进行。任选地，依次进行步骤(i)和(ii)，并且在步骤(i)和(ii)之间进行洗涤步骤。可以采用任何合适的洗涤缓冲液进行洗涤步骤。洗涤步骤有助于从样品中除去尚未被第一邻位探针结合或与支持物非特异性结合的分子，从而有助于使任何背景荧光或光散射最小化。
在这样的实施方案中，在步骤(i)和(ii)之后进行步骤(iii)和(iv)。优选地，在步骤(ii)和(iii)之间进行另一洗涤步骤，以除去第二邻位探针的任何未结合的分子。在步骤(ii)之后进行步骤(iii)和(iv)。步骤(iii)和(iv)彼此同时进行。
在一些实施方案中，将具有缀合的荧光团的第二邻位探针在含有分析物的样品中孵育，并与第一邻位探针共接触以进行检测。可以将被栓系的分子与未被栓系的分子区分开，而无需在任何洗涤步骤中除去未被栓系的分子。因此，本文描述了一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的“第二”邻位探针接触并孵育，以使第二邻位探针与溶液中的目标分析物结合；
(ii)使具有结合的邻位探针的样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的“第一”邻位探针接触并孵育，其中第一邻位探针通过聚合物或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物；
(iii)照射样品以由被栓系的单独第二邻位探针生成信号；和
(iv)通过观察来自被拴系的第二邻位探针的信号来检测目标分析物。
在这样的实施方案中，可以依次或同时进行步骤(i)和(ii)。然而，优选地，它们是依次进行。特别优选地，依次进行步骤(i)和(ii)，并且在步骤(i)和(ii)之间不进行洗涤步骤。
在这样的实施方案中，在步骤(i)和(ii)之后进行步骤(iii)和(iv)。在步骤(iii)之后进行步骤(iv)。在步骤(ii)和步骤(iii)之间不需要洗涤步骤，但是如果需要可以进行洗涤步骤。
在本发明的一些实施方案中，第二邻位探针与报告酶、纳米颗粒或荧光探针结合。结合可以通过共价相互作用或通过非共价相互作用，如上文关于栓链分子或关于第一邻位探针所讨论的那些。因此，第二邻位探针可以(不依赖于第一邻位探针的性质)包含报告酶缀合的抗体、凝集素、可溶性细胞表面受体、来自噬菌体展示或核糖体展示的组合衍生的蛋白质、碳水化合物、适体、affimer、亲和体、affilin、affitin、α体、anticalin、avimer、DARPin、单功能抗体、酶或寡核苷酸，或由其组成。优选地，第二邻位探针包含与报告酶或荧光团缀合的抗体或由与报告酶或荧光团缀合的抗体组成。
第二邻位探针可以与多种报告酶、纳米颗粒或荧光探针结合，使得每个探针分子被多重标记。多重标记增加了信号，同时仍允许将信号定位到单个探针分子。
在接触样品之前，第二邻位探针可能已经与报告酶或荧光团缀合。或者，第二邻位探针可以在缀合报告酶之前接触样品，并且报告酶可以在接触样品的同时或之后与第二邻位探针缀合。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第一邻位探针接触并孵育，其中第一邻位探针通过聚合物或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物；
(ii)使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第二邻位探针接触并孵育，其中第二邻位探针在接触样品之前与报告酶或荧光团缀合；
(iii)将报告酶的荧光底物添加到样品中以生成荧光反应产物；
(iv)照射样品以引起荧光反应产物发荧光；和
(v)通过观察来自荧光反应产物或荧光团的荧光来检测被栓系的目标分析物的运动。
在这样的实施方案中，可以依次或同时进行步骤(i)和(ii)。然而，优选地，它们是依次进行。任选地，依次进行步骤(i)和(ii)，并且在步骤(i)和(ii)之间进行洗涤步骤。可以采用任何合适的洗涤缓冲液进行洗涤步骤。洗涤步骤有助于从样品中去除未被第一邻位探针结合或与支持物非特异性结合的分子，从而有助于使任何背景荧光最小化。
在这样的实施方案中，在步骤(i)和(ii)之后进行步骤(iii)、(iv)和(v)。优选地，在步骤(ii)和(iii)之间进行另一洗涤步骤，以去除第二邻位探针的任何未结合的分子。在步骤(iii)之后进行步骤(iv)和(v)。步骤(iv)和(v)彼此同时进行。
在一些实施方案中，本发明提供了一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第一邻位探针接触并孵育，其中第一邻位探针通过聚合物或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物；
(ii)使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第二邻位探针接触并孵育，其中第二邻位探针在接触样品的同时或之后与报告酶缀合；
(iii)将报告酶的荧光底物添加到样品中以生成荧光反应产物；
(iv)照射样品以使荧光反应产物发荧光；和
(v)通过观察来自荧光反应产物或荧光团的荧光来检测被栓系的目标分析物的运动。
在这样的实施方案中，可以依次或同时进行步骤(i)和(ii)。然而，优选地，它们是依次进行。特别优选地，依次进行步骤(i)和(ii)，并且在步骤(i)和(ii)之间进行洗涤步骤。可以采用任何合适的洗涤缓冲液进行洗涤步骤。洗涤步骤有助于从样品中除去未被第一邻位探针结合或与支持物非特异性结合的分子，从而有助于使任何背景荧光最小化。
在这样的实施方案中，在步骤(i)和(ii)之后进行步骤(iii)、(iv)和(v)。优选地，在步骤(ii)和(iii)之间进行进一步的洗涤步骤，以除去第二邻位探针的任何未结合的分子。在步骤(iii)之后进行步骤(iv)和(v)。步骤(iv)和(v)彼此同时进行。
在第二邻位探针与报告酶缀合的本发明所有实施方案中，报告酶是一种酶，其可以作用于合适的底物以生成荧光反应产物从而提供指示存在结合至第二邻位探针的分析物的信号。合适的酶包括但不限于碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)和β半乳糖苷酶。合适的荧光底物包括但不限于试卤灵(resorufin)-β-d-吡喃半乳糖苷(RGP)、(10-乙酰基-3,7-二羟基吩
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嗪(ADHP)、4-甲基伞形酮磷酸酯(MUP)、荧光素二磷酸酯(FDP)或可从ThermoFisher Scientific获得的QuantaBluTM或QuantaRedTM。技术人员将能够容易地为本发明的任何给定应用选择适当的报告酶和底物。
在本发明的进一步实施方案中，第二邻位探针包含用于荧光原位杂交(FISH)的寡核苷酸序列或DNA-PAINT探针(可逆地结合荧光标记的寡核苷酸)。在这样的一些实施方案中，第二邻位探针可以由这样的寡核苷酸序列组成，或者第二邻位探针可以包含适合于FISH的寡核苷酸序列以及其他组分。
在第二邻位探针包含用于FISH的寡核苷酸的本发明实施方案中，则必须将第二邻位探针与FISH探针杂交，所述FISH探针包含荧光团和与第二邻位探针的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第一邻位探针接触并孵育，其中第一邻位探针通过聚合物或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物；
(ii)使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第二邻位探针接触并孵育，其中第二邻位探针包含用于荧光原位杂交(FISH)或DNA-PAINT的寡核苷酸序列；
(iii)使第二邻位探针与FISH探针杂交，所述FISH探针包含荧光团和与第二邻位探针的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列；
(iv)照射样品以使荧光团发荧光；和
(v)通过观察来自荧光团的荧光来检测被栓系的目标分析物的运动。
在这样的实施方案中，可以依次或同时进行步骤(i)和(ii)。然而，优选地，它们是依次进行(特别优选在步骤(i)之后进行步骤(ii))。任选地，依次进行步骤(i)和(ii)，并且在步骤(i)和(ii)之间进行洗涤步骤。可以采用任何合适的洗涤缓冲液进行洗涤步骤。洗涤步骤有助于从样品中除去未被第一邻位探针结合或与支持物非特异性结合的分子，从而有助于使任何背景荧光最小化。
在这样的实施方案中，在步骤(i)和(ii)之后进行步骤(iii)、(iv)和(v)。任选地，在步骤(ii)和(iii)之间进行另一洗涤步骤，以除去第二邻位探针的任何未结合的分子。在步骤(iii)之后进行步骤(iv)和(v)。步骤(iv)和(v)彼此同时进行。
可以通过采用多个第二邻位探针来区分多个不同的第二邻位探针，并因此可以区分多个不同的目标分析物，每个第二邻位探针均包含不同的用于FISH的寡核苷酸序列，从而可以采用多个不同FISH探针，其包含与不同的第二邻位探针的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列。然后可以通过携带不同荧光团的多个FISH探针中的每一个来区分不同的分析物，或者如果使用DNA-PAINT，并且将一种荧光团连接到设计为与缀合物动态结合的不同寡核苷酸探针上，则可以依次对许多分析物进行成像(单色成像)。不同的荧光团可以在检测期间进行光谱分离，从而产生有关第二邻位探针身份以及目标分析物身份的信息。或者，可以采用携带相同荧光团但具有与不同的第二邻位探针互补的寡核苷酸序列的多个FISH探针。在这样的实施方案中，可以依次引入多个FISH探针以及其间的洗涤步骤，从而依次鉴定不同的目标分析物。依次方法降低了对检测设备的复杂性的要求。
可以使用多个不同长度的栓链来区分样品中的多种分析物，其中将用于不同分析物的第一邻位探针连接到不同长度的栓链上，以使不同的分析物表现出不同的运动特性，如运动范围，使用所述运动特性来鉴定观察到哪种分析物。例如，如下所示，可以将长度为2kB的DNA栓链与长度为3kB的DNA栓链区分开。
可以通过在空间上分离被栓系的第一邻位探针的不同种类，从而知晓固体支持物的不同区域连接有不同的第一邻位探针，来实现在样品中检测多种分析物。
可以通过使用对每种分析物具有特异性的报告探针，来实现在样品中检测多种分析物。每个报告探针可以被不同标记。例如，不同的报告探针可以携带不同的荧光团。如果iSCAT检测到信号，则不同的报告探针可以携带质量不同的纳米颗粒。
在本发明的所有实施方案中，第一和第二邻位探针应对目标分析物上的不同结合位点具有亲和力。这些结合位点在空间上应是不同的。在一个实施方案中，第一和第二邻位探针可以对抗原上的不同表位具有亲和力。在另一个实施方案中，第一和第二邻位探针可以对多聚体抗原上的相同表位具有亲和力。
固体支持物应(至少部分地)对400nm至1000nm区域或其子区域中的光透明。优选地，固体支持物应对以下波长中的至少一种波长的光至少部分透明：405nm、473nm、488nm、532nm、561nm、638nm、640nm、710nm和/或850nm。固体支持物应优选具有平坦表面或至少一部分为平坦的表面，并且栓链分子结合至该平坦平面或平坦部分。固体支持物可以是盖玻片、玻璃显微镜载片、光纤或棱镜。或者，固体支持物可以是微量滴定板(例如6、24、96、384或1536孔微量滴定板)的表面或其至少一部分，优选其孔的底部。在另一替代方案中，固体支持物可以是微流体腔室(在微流体芯片中)的表面或其至少一部分。优选地，固体支持物包括玻璃或光学透明聚合物，基本上由玻璃或光学透明聚合物组成或由玻璃或光学透明聚合物组成。
在孵育第二邻位探针后(以及在孵育后进行缀合报告酶步骤的情况下，在缀合将报告酶(如果需要的话)之后)，优选使用缓冲溶液进行洗涤步骤。优选地，缓冲溶液包含BSA和清洁剂如Triton X-100在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的混合物。也可以使用本领域技术人员已知的其他标准ELISA洗涤缓冲液。洗涤旨在除去任何未结合的第二邻位探针和/或未缀合的报告酶。
通过检测由荧光团或荧光反应产物产生的荧光或使用FISH探针来检测分析物，所述荧光反应产物是由荧光底物与报告酶相互作用生成的。因此，本发明的方法在原理上是基本上基于常规的“三明治”型ELISA免疫测定法，但是独特之处在于，将第一邻位探针栓系于固体支持物，使得尽管探针被固定至支持物，但是第一邻位探针仍可以在有限的范围内移动。
即使在进行洗涤步骤以除去未结合的报告探针和/或报告酶的情况下，仍将不可避免地存在不可避免程度的分析物、报告酶和/或第二邻位探针与固体支持物的非特异性结合。因此，这种非特异性结合的报告酶和/或第二邻位探针将产生荧光，从而引起背景信号和/或分析物的“假阳性”检测。因此，这种非特异性结合物质限制了常规测定法的准确性，特别是当分析物以非常低的浓度存在时。本申请发明人已出乎意料地发现，通过将第一邻位探针栓系于支持物，使得邻位探针和分析物可以在有限的范围内移动，可以区分一方面这种背景信号或“假阳性”信号与另一方面由第二邻位探针产生的真实信号，所述第二邻位探针与被拴系的第一邻位探针捕获的分析物特异性结合。
本文所指的荧光是检测单个或少量荧光分子(即由单独荧光团发射的光子)，或连接到单独(单个)栓链的几个荧光团，而不是检测来自混合群体的发射，即，由荧光溶液或表面发射的光子。在第二邻位探针非特异性结合至固体支持物或结合至本身非特异性结合至固体支持物的分析物的情况下，探针将不移动，并因此将高度定位由第二邻位探针或由报告酶与底物相互作用生成的报告分子生成的任何荧光。如果计算非特异性结合的分子的检测位置的标准偏差，则该值通常可以约为50nm。相比之下，由于栓链的柔韧性及其在溶液中经历随机(布朗)运动或受控运动的能力，与被栓系的第一邻位探针特异性结合的目标分析物分子将具有更大的运动范围。任选地，通过将磁性材料连接到(一个或多个)被栓系的分子上并使它们经受变化的电磁场或变化的流体速度(速度和方向)，可以实现被栓系的分子的受控移动。
因此，与此类被栓系的分析物分子特异性结合的第二邻位探针的分子也将经历在有限的范围内不同且可检测的运动。结果，当此类第二邻位探针散射或发荧光和/或生成荧光报告分子时，可以进行多种测量以将其与非特异性固定的第二邻位探针以及与非固定的第二邻位探针区分开。可以通过拍摄单帧长曝光图像来实现这种区分，在所述图像中，被栓系的探针似乎会在有限的范围内涂抹，而非特异性固定的探针似乎是一个小点，而未固定的探针几乎是不可见的，因为它具有无限的运动范围。还可通过连续拍摄短时间曝光图像来实现这种区分，其中被栓系的探针表现出有限的运动范围，非特异性固定的探针未表现出运动，超出了实验的不确定性，而未固定的探针则表现出几乎不受限制的运动范围，通常只能短暂观察并从成像的溶液体积中扩散开。
因此，在一个优选的实施方案中，检测目标分析物包括监测由第二邻位探针中的荧光团或由底物与报告酶之间的反应产生的荧光反应产物所发射的光子的空间分布或者使用FISH或DNA-PAINT探针。
在一个替代实施方案中，测量光散射的水平，并随时间追踪目标分析物的运动。
在本发明的一些实施方案中，第一邻位探针本身可以与荧光团缀合。因此，在这样的实施方案中，荧光不仅由与第二邻位探针相关的荧光物质产生，而且还由与第一邻位探针缀合的荧光团产生。为了进一步改善检测特异性结合的目标分析物分子的特异性，可以采用来自第一和第二邻位探针的荧光的共定位。
在本发明的一些实施方案中，第一邻位探针本身可以与荧光团缀合，该荧光团在一个荧光通道(通道1)中充当荧光能量转移(FRET)供体。因此，在这样的实施方案中，荧光不仅由与第二邻位探针相关的荧光物质(FRET受体，通道2中的荧光)产生，而且还由与第一邻位探针缀合的荧光团产生。来自通道2中通过通道1激发而激发的第二邻位探针的荧光发射的存在可以用来测量一个复合物中第一邻位探针和第二邻位探针的存在。为了进一步改善检测特异性结合的目标分析物分子的特异性，不存在FRET发射将指示非特异性结合的第二邻位探针复合物。
在固体支持物的平面中监测荧光光子的空间分布。可以说固体支持物(或其平坦部分)限定了一个xy平面，并因此可以监测光子的空间分布并在xy坐标系中对其作图。
为了产生可用于检测目标分析物的荧光，对样品进行照射。如果照射处于能够激发荧光的波长下，则这使荧光团或荧光反应产物发荧光。
特别优选通过全内反射荧光显微镜法进行照射。使用全内反射(TIR)荧光显微镜法作为检测手段使得进一步提高本发明方法的精确度，从而增强本发明方法检测极低浓度目标分析物以及区分特异性结合和非特异性结合的能力。TIR利用了被称为“消逝波”或“消逝场”的现象，并且可以在本发明的方法中利用这种现象以进一步改进本领域中已知的方法。
在入射光束在具有不同折射率的两种介质之间的边界处经历TIR的情况下，生成消逝照射场，该场将延伸到折射率较低的介质中数百纳米。穿透深度d取决于入射照射的波长λ(i)、入射角θ以及介质的折射率n1和n2：
d＝λ(i)/4π×(n1 2sin2θ-n2 2)-1/2
消逝场的强度随着与界面距离的增加而呈指数衰减：
E(z)＝E(0)exp(-z/d)
其中E(z)是距界面垂直距离z的能量，E(0)是界面处的能量。
靠近界面，通常在前150nm以内，这种场能够激发荧光团。在足够高的照射功率密度下，荧光团会经历快速的光漂白。与在消逝场强度较弱(即距界面较远)的区域中相比，在消逝场强度较大(即靠近界面)的区域中光漂白速率更快。与距离界面超过150nm的分子相比，在距离界面前50nm内，荧光团的强度和光漂白速率通常可能高多达4倍。
因此，在本发明的方法中，可以利用这种现象来进一步完善对特异性结合和非特异性结合物质的检测。如上所述，目标分析物、第二邻位探针和/或报告酶的一些分子将不可避免地非特异性结合至固体支持物。在固体支持物的表面上，这些非特异性结合的分子靠近固体支持物与样品之间的界面，因此位于消逝场最强的区域。因此，与距离界面更远的荧光物质相比，该区域中的荧光物质发射更多的光子，更快速地经历光漂白，在变成荧光后表现出较短的扩散长度，以及任选地，如果采用PSF(点扩散函数)工程，则生成不同的图像。由于栓链分子的存在，特异性结合的目标分析物分子(即与被栓系的第一邻位探针结合的那些分子)将平均位于距离界面更远的位置，在那里消逝场较弱。当第二邻位探针的分子与这种特异性结合的目标分析物分子相互作用时，这些也将位于该消逝场较弱的区域中。因此，由荧光团和/或荧光反应产物产生的光子发射和光漂白速率可检测地低于更靠近界面处产生的光子发射和光漂白速率。这些荧光物质还将经历更长的扩散，并在PSF修改下生成不同的图像。
PSF修改可以是用于该测定法的显微镜光路中引入的任何像差，这些像差增强在垂直于固体支持物的方向上测量荧光团位置的能力。引入一种称为像散的像差的有效手段是将一个弱柱面透镜(例如焦距为2米)靠近使荧光团成像的相机。柱面透镜导致PSF的不对称，这取决于围绕高数值孔径物镜的焦平面几百纳米的荧光团的z位置。如果焦平面与样品的液体/固体界面大致重合，则源自或结合在栓链上的荧光团的图像与靠近界面的荧光团的图像不同。图像类似于分别沿x轴和y轴定向的椭圆。这些不同的图像可以通过在x和y维度上估计椭圆的宽度来量化。沿x和y轴的这些宽度的这些数值可以用于计算荧光团相对于焦平面的位置，这允许进一步区分非特异性结合的分子和特异性结合的分子。
优选地，用于照射的光源是激光，特别优选在激发波长(即，荧光物质具有明显的吸收截面的波长)下提供从约5kW/cm2至约10kW/cm2的功率密度的激光。可以采用的常见激光波长包括但不限于405nm、473nm、488nm、532nm、561nm、638nm、640nm和/或850nm。考虑到用于检测目标分析物的荧光物质的性质，技术人员将能够容易地选择适当的激光功率和波长。为了生成TIR和消逝场，特别优选使用激光进行照射。
综上所述，这些现象使我们能够将由特异性结合的复合物生成的荧光团的时空特征与由非特异性结合的复合物产生的荧光团的时空特征区分开。
因此，在一个特别优选的实施方案中，检测分析物包括监测由发荧光物质发射的光子的时空分布。检测所需的时间分辨率应足够高(优选10毫秒或更快)来检测单独荧光团的生成、扩散和光漂白事件，或者足够慢(优选100毫秒或更慢)来平均几个这样的事件。在后一种情况下，由于报告分子的扩散时间更长以及栓链分子的动力学，对应于特异性结合的分析物的图像看起来比来自非特异性结合的分析物的图像更宽。
由于本发明方法的高时空分辨率以及区分特异性结合和非特异性结合的能力，因此本发明的方法能够检测是否存在低至单独分子水平(或其他相关实体，如分子、簇、聚集体、病毒等的复合物)的目标分析物。
在一些实施方案中，本发明的方法可以用于平行检测多种(例如至少两种、至少三种或更多种)目标分析物。检测多种分析物通常需要使用对不同分析物具有特异性的多个第一(“捕获”)邻位探针和多个第二(“报告”)邻位探针。
因此，在这样的实施方案中，本发明可以提供一种确定液体样品中多种目标分析物的存在的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使样品与多个第一邻位探针接触并孵育，每个第一邻位探针包含对多种目标分析物中的一种具有特异性的分析物结合域，其中每个第一邻位探针通过聚合物或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物；
(ii)使样品与多个第二邻位探针接触并孵育，每个第二邻位探针包含对多个目标分析物中的一种具有特异性的分析物结合域，其中多个第二邻位探针中的每个彼此独立地
a.包含荧光团；或
b.在接触样品之前与报告酶缀合；或
c.在接触样品的同时或之后与报告酶缀合；或
d.包含用于荧光原位杂交(FISH)或DNA-PAINT的寡核苷酸序列；或
e.包含不同大小的纳米颗粒
(iii)a.如果所述多个第二邻位探针中的任何一个与报告酶缀合，则将所述报告酶的荧光底物添加至样品中以生成荧光反应产物；或
b.如果多个第二邻位探针中的任何一个包含用于荧光原位杂交(FISH)的寡核苷酸序列，则将第二邻位探针与FISH探针杂交，该FISH探针包含荧光团和与第二邻位探针的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列；
c.如果多个第二邻位探针中的任何一个包含用于多个分析物的不同尺寸的纳米颗粒；
(iv)照射样品以使荧光团和/或荧光反应产物发荧光；或纳米颗粒的光散射；和
(v)通过观察来自荧光团和/或荧光反应产物的荧光或纳米颗粒iSCAT的多种散射来检测多种目标分析物。
在这样的实施方案中，不言而喻总共有多于两种的邻位探针。因此，在这样的实施方案中，术语“第一”和“第二”不应照字面理解，而应被认为是扩展本发明的一般构思的功能性描述，其中“第一”邻位探针各自充当“捕获”探针，其通过栓链使目标分析物结合至支持物，“第二”邻位探针充当“报告”探针，其能够检测结合的目标分析物。
总之，多个第一邻位探针应当对所有多种目标分析物具有特异性，而每种第一邻位探针对多种目标分析物中不同的一种具有特异性。因此，如果有两种目标分析物，则应当有两种第一邻位探针，每种邻位探针对两种分析物中不同的一种具有特异性；如果有三种目标分析物，则应当有三种第一邻位探针，每种邻位探针对三种分析物中不同的一种具有特异性；如果有四种目标分析物，则应当有四种第一邻位探针，每个邻位探针对四种分析物中不同的一种具有特异性；对于更多种的目标分析物则以此类推。
类似地，总体上，多种第二邻位探针应当对所有多种目标分析物具有特异性，而每种第二邻位探针对多种目标分析物中不同的一种具有特异性。因此，如果有两种目标分析物，则应当有两种第二邻位探针，每种邻位探针对两种分析物中不同的一种具有特异性；如果有三种目标分析物，则应当有三种第二邻位探针，每种邻位探针对三种分析物中不同的一种具有特异性；如果有四种目标分析物，则应当有四种第二邻位探针，每种邻位探针对四种分析物中不同的一种具有特异性；对于更多种的目标分析物则以此类推。
如本文其他地方关于方法步骤的顺序、样品和目标分析物的性质、邻位探针的性质、栓链的性质、支持物的性质等所述的相同考虑事项经必要的变通后适用于确定多种目标分析物存在的方法。
特别地，在存在多种目标分析物的情况下，这些可以彼此独立地是指示诸如癌症或神经退行性疾病等疾病的存在或指示感染的存在的生物标志物。典型的生物标志物可以例如是激素、肽(例如蛋白质或酶)、碳水化合物、抗体或核酸。通常，多种目标分析物中的每一种都可以是抗原，条件是它们彼此不同。
每个第一邻位探针可以彼此独立地包含抗体、凝集素、可溶性细胞表面受体、来自噬菌体展示或核糖体展示的组合衍生的蛋白质、碳水化合物、适体、affimer、亲合体、affilin、affitin、α体、anticalin、avimer、DARPin、单功能抗体或其组合，或由其组成，条件是每个第一邻位探针应对不同的目标分析物具有特异性。优选地，每个第一邻位探针是抗体。
每个第二邻位探针可以(独立于第一邻位探针的性质并且彼此独立地)包含如上定义的抗体、凝集素、可溶性细胞表面受体、自噬菌体展示或核糖体展示的组合衍生的蛋白质组、碳水化合物、适体、affimer、亲合体、affilin、affitin、α体、anticalin、avimer、DARPin、单功能抗体、酶或寡核苷酸，或由其组成，条件是每个第二邻位探针应对不同的目标分析物具有特异性。
每个第二邻位探针可以彼此独立地包含荧光团或与报告酶缀合，或包含用于荧光原位杂交(FISH)的寡核苷酸序列。当多个第二邻位探针各自包含荧光团时，荧光团可以相同或不同。当多个第二邻位探针各自与报告酶缀合时，该酶可以相同或不同。因此，多个第二邻位探针可以彼此独立地与例如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或β半乳糖苷酶缀合。在多个第二邻位探针与报告酶缀合的情况下，每个第二邻位探针的荧光底物可以相同或不同。多个第二邻位探针中的每一个可以在接触样品之前独立地与其各自的报告酶缀合。可选地，并且彼此独立地，多个第二邻位探针中的每一个可以在缀合其各自的报告酶之前接触样品，并且在接触样品的同时或之后可以将报告酶与探针缀合。在多个第二邻位探针各自包含用于FISH的寡核苷酸序列的情况下，寡核苷酸序列可以相同或不同，并且互补FISH探针中的荧光团可以相同或不同，如本文其他地方所述。
多个第一邻位探针中的每一个通过聚合物或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物。在一个实施方案中，多个第一邻位探针中的每一个通过单独的栓链分子被栓系于支持物，使得每个栓链分子携带一种类型的第一邻位探针。然而，优选地，多个第一邻位探针中的每一个都与相同的栓链分子缀合。在这样的实施方案中，多个第一邻位探针中的每一个都被栓系于同一栓链分子上的不同位点。dsDNA和DNA折纸结构是用于此类目的的特别合适的栓链分子。DNA折纸结构可以具有用于邻位探针的多个结合位点，并因此可以将对不同抗原具有特异性的多个第一邻位探针(例如，两个、三个、四个或更多个第一邻位探针)与该折纸结构缀合。任选地，可以以这种方式同时采用多种DNA折纸结构，以便进一步区分不同的折纸和/或不同的捕获探针位点，从而进一步增加可以并行检测的分析物的数量。在采用多种DNA折纸结构的情况下，可以先将第一邻位探针与折纸结构缀合，然后再将折纸结构拴系于固体支持物。
在又一方面，本发明提供了如本文所述的固体支持物，优选盖玻片、玻璃显微镜载片、光纤、棱镜、微量滴定板或微流体芯片，其具有通过聚合物或生物聚合物栓链分子栓系于其上的第一邻位探针。本文中有关固体支持物的性质、第一邻位探针的性质以及栓链分子的性质的所有讨论，包括栓链分子与支持物的共价或非共价连接手段以及邻位探针与栓链分子的共价或非共价连接手段经必要的变通后适用于本发明的这一方面。不言而喻，这样的支持物应当适合用于本发明的方法。
现在将通过以下非限制性实施例和附图进一步说明本发明，其中：
图1示出了如实施例1中所述的采用TIR荧光检测的本发明一个实施方案的示意图。
图2示出了指示分析物和报告探针的特异性(左)和非特异性(右)结合的光子的空间分布。
图3示出了采用荧光检测的本发明一个实施方案的示意图。该测定法使用钝化的玻璃表面，其上连接有链霉亲和素分子。栓链是通过生物素连接的约2.5kb的DNA分子。该DNA栓链携带与其缀合的抗PSA。检测到的探针是PSA抗原，该抗原被第二Cy3标记的抗PSA亲和标记。
图4示出了指示分析物和报告探针的非特异性(上)和特异性(下)结合的光子的空间分布的图示，比例尺为0.5微米。PSA图像由抗PSA栓系的DNA捕获并用Cy3B缀合的抗PSA检测。使用TIRF显微镜法用532nm(绿色)激光照射样品，并使用10ms时间分辨率成像。
图5示出了指示分析物和报告探针在2kb栓链上的特异性结合(上)和在3kb栓链上的特异性结合的(下)的光子的空间分布的图示，比例尺为0.5微米。通过Cy3缀合的抗小鼠检测被抗异羟基洋地黄毒苷元结合的栓系在2kb和3kb DNA上的小分子异羟基洋地黄毒苷元。
实施例1
图1示出了根据本发明的方法的一种示例性实施方案。在该实施方案中，在玻璃支持物(1)的表面上进行测定。采用全内反射(TIR)照射方案(2)。TIR生成消逝照射场，该场在界面的几百纳米内呈指数衰减(如图右侧所示)。可以从概念上将介质分为高(3a)、中等(3b)和低(3c)照射密度区域。使用生物素化的BSA(4a)和Tween-20(4b)对(1)的表面进行硅烷化和钝化处理。相互作用(5)可以例如是共价键或生物素-链霉亲和素-生物素相互作用，其导致1kb dsDNA栓链(6)通过BSA(4a)结合至表面(1)。相互作用(7)可以例如是生物素-链霉亲和素-生物素相互作用，其使捕获抗体(8)结合到dsDNA栓链上。
将血清样品加载到功能化表面(1)上并孵育。孵育后，抗原(9a)被捕获抗体(8)特异性结合。还有一些抗原(9b)非特异性结合至表面(1)。添加报告抗体(10a)并孵育，并且它们与抗原(9a)、(9b)特异性结合。还有一些报告抗体(10b)非特异性结合至表面(1)。
添加报告酶β-半乳糖苷酶(12)，并在此通过生物素-链霉亲和素相互作用(11)与报告抗体(10a)、(10b)结合。添加荧光底物试卤灵-β-d-吡喃半乳糖苷(RGP)(13)，并被酶(12)转化为荧光报告分子(14a)、(14b)。还有一些报告酶非特异性结合至表面(1)(这在图1中未示出)。
具有高功率密度的激光照射(2)迫使新生的荧光团(14a)、(14b)发射几千个光子，然后变成光漂白的(15)。区域(3a)中的荧光团(14b)发射更多的光子，更快地进行光漂白，并且花费较少的时间从报告酶的位置扩散开。区域(3b)中的荧光团(14a)发射更少的光子，生存时间更长，并且能够从报告酶的位置扩散得更远。光子通过光学系统收集并在相机上成像。扩散到区域(3c)和整体介质中的荧光团仅被微弱地照射，并且未被检测到。
每个相机帧期间收集的光子中包含的位置信息使发射这些光子的荧光团的平均位置可以确定在10纳米精度内。这些平均位置(称为定位)可以在xy坐标系中绘制，如图2所示。每种报告酶生成一个定位簇。荧光团(14a)的定位(16a)是由被栓系的免疫复合物上的酶生成的。这些与由与非特异性结合的抗原(9b)、抗体(10b)和报告酶相关的酶生成的荧光团(14b)的定位(16b)相比更分散。栓链(6)的动力学还导致栓链上结合的酶联免疫复合物运动，从而导致荧光团生成的分散位置被记录为时间的函数。对于存在被栓系的、酶联的、完整的免疫复合物，定位的时空分布以及从正在连续生成的单独荧光团收集的光子数量产生了独特的特征。通过执行工程化的像散或双螺旋点扩散函数，可以进一步区分源自区域(3a)和(3b)中的荧光团的定位，所述函数对荧光团相对于玻璃表面的高度有很强的依赖性。
实施例2
本实施例说明了用于钝化显微镜载波片或盖玻片的简单方案。该方案也可以用于处理微流体芯片。
将盖玻片放在染色缸中，并用超纯水冲洗。然后将染色缸装满新鲜的高纯度丙酮，以便除去可能会以其他方式干扰荧光测量的任何有机化合物。将包含盖玻片和丙酮的染色缸放入超声仪中，并超声处理约20分钟。超声处理后，弃去丙酮，再次用超纯水冲洗盖玻片。冲洗后，将染色缸装满1M KOH，并再次超声处理约20分钟。丢弃KOH，并将盖玻片再次用超纯水冲洗。将盖玻片浸入超纯水中，进行约20分钟的另一超声处理，然后使用氮气干燥盖玻片。任选地，可以使用食人鱼溶液(H2SO4和H2O2的混合物)或通过等离子体处理对盖玻片进一步进行蚀刻，以便改善表面质量以及在随后的步骤中帮助获得高质量的表面钝化。
可以使用天然存在的蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)或合成化合物如聚乙二醇(PEG)进行钝化以防止生物标志物的非特异性结合。以下步骤描述了BSA和PEG作为钝化剂的用途，但是技术人员将能够按照需要将它们改编成替代的钝化剂。在将盖玻片如上所述进行清洁并任选地用食人鱼溶液或等离子体处理进行进一步处理后，将盖玻片用APTES(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)、APTMS(3-氨基丙基三甲氧基硅烷)或二氯二甲基硅烷(DDS)-Tween-20处理。
为了钝化已经用KOH蚀刻和/或用DDS-Tween-20处理的盖玻片，添加100μl含与0.2mg/ml生物素化BSA混合的饱和浓度的BSA的水溶液。
为了用PEG钝化盖玻片，添加100μl水性混合物，该混合物在0.1M的新鲜碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5)中含有至少0.2mg生物素化的NHS-酯PEG和至少8mg NHS-酯mPEG。
制备盖玻片三明治，将其浸入钝化溶液中，并使其在黑暗潮湿的室内静置至少3个小时(推荐过夜孵育)。然后，分开盖玻片并用超纯水冲洗，然后用氮气干燥。
实施例3
本实施例说明了本发明方法的一种可能的实施方式。在本实施例中采用dsDNA作为栓链分子，但是该方案可适于与任何合适的栓链一起使用。采用钝化的微流体腔室作为固体支持物，但是该方案也可以适于本文涵盖的任何形式的固体支持物。可以根据例如实施例2中描述的方案对微流体腔室进行钝化。优化dsDNA溶液的浓度，以使约300至400个栓链分子被固定在固体支持物上。将栓链分子溶液引入微流体腔室并孵育约2分钟。通过用适当的缓冲液洗涤除去未结合的栓链分子，然后将50μl的10nM第一邻位探针溶液引入微流体腔室。将该溶液孵育约5分钟，然后通过用至少100μl的适当的洗涤缓冲液洗涤除去任何未结合的探针。
将用于分析的样品引入微流体腔室，如来自患者的一滴血液。将该样品孵育约5分钟，以使样品中的任何目标分析物(如生物标志物)被拴系的第一邻位探针捕获。
然后，将该腔室用洗涤缓冲液清洗以除去任何未结合的分子，然后引入50μl的10nM第二邻位探针溶液，所述第二邻位探针已与报告酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β半乳糖苷酶)缀合。
通过用100μl洗涤缓冲液冲洗微流体腔室，去除第二邻位探针的任何未结合的分子。然后将报告酶的荧光底物引入微流体腔室中，以便使报告酶与该底物反应并产生荧光物质。
然后将微流体腔室引入TIRF显微镜中并用激光照射，以便使荧光反应产物发荧光。荧光团经历如本文其他地方所述的光漂白和运动，从而允许维持低背景荧光，同时可以检测特异性结合的分析物分子并由于其特征性时空行为而将其与非特异性结合的物质区分开。
实施例4
本实施例说明了具有与其相结合的多个第一邻位探针以便能够并行检测多种分析物的栓链的制备。
采用DNA折纸结构作为栓链。如实施例2中所述对固体支持物进行钝化，并且将折纸结构结合至与实施例3中所述的dsDNA类似的支持物。
DNA折纸结构与生物素、异羟基洋地黄毒苷元(DIG)和异硫氰酸荧光素(FITC)缀合。缀合的生物素提供第一组结合位点，缀合的DIG提供第二组结合位点，缀合的FITC提供第三组结合位点。可以利用这些来提供三种不同类型的抗体的结合位点，所述抗体充当捕获探针。
对第一抗原具有特异性的第一抗体通过生物素-strep相互作用缀合至生物素结合位点。对第二抗原具有特异性的第二抗体通过Ab-抗-dig相互作用缀合至DIG结合位点。对第三抗原具有特异性的第三抗体通过Ab-抗-FITC相互作用缀合至FITC结合位点。
然后可以采用以此方式缀合至DNA折纸栓链的第一、第二和第三抗体中的每一种作为本发明方法的第一邻位探针。由于它们的特异性不同，这允许并行检测三种不同的抗原，就本发明而言，每种抗原都是目标分析物。为了进行并行检测，将不同的荧光团缀合至每个第二邻位探针，所述第二邻位探针可以是抗体，或者采用产生不同荧光反应产物的不同酶进行检测，从而可以区分开与三种不同分析物相关的荧光。
通过与本实施例类似的方法，还可以通过提供合适数量的不同抗体作为第一邻位探针来并行检测四种或更多种不同抗原。任选地，可以采用多个DNA折纸结构作为栓链，每个DNA折纸与不同的抗体缀合并具有与之相关的不同的特征性荧光团，以便允许进一步区分源自不同折纸和/或不同捕获探针位点的荧光。在这种情况下，在将折纸结构固定在微流体腔室中之前，需要将捕获抗体(分别)孵育至折纸结构。
实施例5
本实施例说明了具有多个长度和与之相结合的多个第一邻位探针的栓链的制备，以便能够并行检测多种分析物。
将已经与不同的第一邻位探针缀合的栓链分子的混合物固定到微流体腔室的表面上。每个栓链分子具有彼此不同的长度。
将含有目标生物标志物的样品(血液血清)注入微流体腔室。生物标志物与它们各自的第一邻位探针结合。使用含有酶或荧光团的第二邻位探针来检测每种生物标志物的存在。由于与每个第一邻位探针相关的栓链分子的长度不同，与由第二邻位探针生成的信号相关的PSF将不同。因此，可以使用PSF的差异来协助分配由每个单独生物标志物产生的荧光信号。如果在每个第一/第二邻位探针配对中采用不同的荧光团，以便允许额外在来自不同结合位点的荧光信号之间进行区分，则可以进一步增强这一点。
图5中显示的数据显示了2kb和3kb栓链之间的差异，其中DNA栓链携带栓系在2kb和3kb DNA上的异羟基洋地黄毒苷元。被拴系的异羟基洋地黄毒苷元与抗异羟基洋地黄毒苷元结合，抗异羟基洋地黄毒苷元使用Cy3缀合的抗小鼠抗体标记。与2kb栓链相比，3kb栓链在表面移动的区域更大。
实施例6
本实施例说明了与荧光原位杂交(FISH)探针组合用于并行检测多种分析物的栓链的制备。将带有第一邻位探针的栓链固定在固体支持物的表面上，该表面是微流体腔室的表面。然后将含有生物标志物的血清引入微流体腔室。
生物标志物特异性结合第一邻位探针。第二邻位探针(例如，适体或抗体)与独特的核酸序列缀合。然后除去未结合的第二邻位探针。然后采用FISH探针来检测分析物的存在。
如果采用多个第一邻位探针，则可以采用适当的第二邻位探针和FISH探针来并行检测多种分析物。在这种情况下，可以依次添加和检测对每种分析物具有特异性的FISH探针。因此，例如，可以添加、检测和去除用于第一分析物的FISH探针，然后添加、检测和除去用于第二分析物的FISH探针，依此类推，直到检测到针对第N种分析物的第N FISH探针。也可以用不同的染料修饰不同的FISH探针，以允许同时进行多色成像。

Claims (23)

1.一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，其包括以下步骤：
(i)使样品与第一邻位探针接触并孵育，所述第一邻位探针包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域，其中所述第一邻位探针通过聚合物栓链分子或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物，从而将所述目标分析物栓系于所述支持物；
(ii)由对被拴系的目标分析物具有特异性的单独分子生成信号；和
(iii)通过观察所述信号在所述固体支持物上的运动来检测被栓系的目标分析物。
2.根据权利要求1所述的确定液体样品中目标分析物的存在的方法，其中所述信号是荧光。
3.根据权利要求2所述的确定液体样品中目标分析物的存在的方法，其中使用全内反射荧光显微法来照射样品和检测所述目标分析物。
4.根据权利要求1所述的确定液体样品中目标分析物的存在的方法，其中所述信号是光散射。
5.根据任一项前述权利要求所述的确定液体样品中目标分析物的存在的方法，其包括以下步骤：
(i)使样品与第一邻位探针接触并孵育，所述第一邻位探针包含对所述目标分析物具有特异性的分析物结合域，其中所述第一邻位探针通过聚合物栓链分子或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物；
(ii)使样品与第二邻位探针接触并孵育，所述第二邻位探针包含对所述目标分析物具有特异性的分析物结合域，其中
a.所述第二邻位探针包含荧光团；或
b.所述第二邻位探针在接触样品之前与报告酶缀合；或
c.所述第二邻位探针在接触样品的同时或之后与报告酶缀合；或
d.所述第二邻位探针包含用于荧光原位杂交(FISH)的寡核苷酸序列；或
e.所述第二邻位探针包含纳米颗粒，所述纳米颗粒生成待鉴定的可测量信号；
(iii)a.如果所述第二邻位探针与报告酶缀合，则向样品中添加所述报告酶的荧光底物以生成荧光反应产物；或
b.如果所述第二邻位探针包含用于荧光原位杂交(FISH)的寡核苷酸序列，则使所述第二邻位探针与FISH探针杂交，所述FISH探针包含荧光团和与所述第二邻位探针的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列；
(iv)照射样品以使荧光团或荧光反应产物发荧光或使纳米颗粒散射光；并且
(v)通过观察来自荧光团或荧光反应产物或纳米颗粒的荧光或散射信号的运动来检测所述目标分析物。
6.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述第一邻位探针包括以下或由以下组成：抗体、凝集素、可溶性细胞表面受体、来自噬菌体展示或核糖体展示的组合衍生的蛋白质、碳水化合物、适体、affimer、亲合体、affilin、affitin、α体、anticalin、avimer、DARPin、寡核苷酸、多核苷酸、单功能抗体，或它们的组合。
7.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述第二邻位探针包括抗体、凝集素、可溶性细胞表面受体、来自噬菌体展示或核糖体展示的组合衍生的蛋白质、碳水化合物、适体、affimer、亲合体、affilin、affitin、α体、anticalin、avimer、DARPin、寡核苷酸、多核苷酸、单功能抗体或酶，或者由它们组成。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第二邻位探针包含荧光团或纳米颗粒。
9.根据权利要求7任一项所述的方法，其中所述第二邻位探针在接触样品之前与报告酶缀合。
10.根据权利要求7任一项所述的方法，其中所述第二邻位探针在接触样品的同时或之后与报告酶缀合。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述报告酶是碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或β半乳糖苷酶。
12.根据权利要求5所述的方法，其中所述荧光底物是试卤灵-β-d-吡喃半乳糖苷(RGP)、(10-乙酰基-3,7-二羟基吩
Figure FDA0002760436790000021
嗪(ADHP)、4-甲基伞形酮磷酸酯(MUP)或荧光素二磷酸酯(FDP)。
13.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二邻位探针包含用于荧光原位杂交(FISH)的寡核苷酸序列。
14.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一邻位探针与荧光团或纳米颗粒缀合。
15.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述栓链分子包括表面活性剂、脂质、肽、蛋白质、寡糖、多糖、寡核苷酸或多核苷酸。
16.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述栓链分子包含DNA或RNA。
17.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述栓链分子包含dsDNA或DNA折纸结构。
18.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述栓链分子在含水溶液中的平均端到端距离为约50nm至约1000nm。
19.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述栓链分子包含具有500至3000个碱基对的DNA或RNA，优选dsDNA或DNA折纸结构。
20.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中用激光照射所述样品。
21.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述样品包括来自人类或非人类动物受试者的体液，基本上由其组成或由其组成；或者包括来自植物的流体，基本上由组成或由其组成。
22.一种固体支持物，优选盖玻片、玻璃显微镜载片、光纤、棱镜、微量滴定板或微流体芯片，其具有通过聚合物栓链分子或生物聚合物栓链分子被栓系于其上的第一邻位探针，所述聚合物栓链分子或生物聚合物栓链分子在含水溶液中的平均端对端距离为约50nm至约1000nm。
23.根据权利要求22所述的固体支持物，其中所述栓链分子如权利要求15至19中任一项所定义。
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