KR20230118570A - 강화된 결합 및 검출 특성을 갖는 친화성 시약 - Google Patents

강화된 결합 및 검출 특성을 갖는 친화성 시약 Download PDF

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Abstract

(a) 구조화 핵산 입자(structured nucleic acid particle)와 같은 고정 성분(retaining component)과; (b) (ⅰ) 상기 고정 성분에 부착된 하나 이상의 표지 성분(label component) 및 (ⅱ) 상기 고정 성분에 부착된 하나 이상의 결합 성분(binding component) 중 하나 또는 둘 다를 갖는 친화성 시약(affinity reagent).

Description

강화된 결합 및 검출 특성을 갖는 친화성 시약
교차 참조
본 출원은 2020년 11월 11일에 출원된 미국 가출원 제63/112,607호, 2020년 12월 30일에 출원된 미국 가출원 제63/132,170호 및 2021년 7월 29일에 출원된 미국 가출원 제63/227,080호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 상기 출원들은 본원에 참조로 포함된다.
친화성 시약(affinity reagent)은 다른 분자와 검출 가능한 상호작용을 형성하는 광범위한 종류의 화학 시약을 포함한다. 친화성 시약은 다른 분자와 일시적 또는 가역적 결합 쌍을 형성하는 결합 시약을 포함할 수 있다. 친화성 시약은 폴리펩티드, 핵산 및 다당류와 같은 생체분자의 구조 및 특성을 특성화하는 데 활용될 수 있다. 친화성 시약은 친화성 시약을 시각화할 목적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 종종 이러한 검출 가능한 표지는 형광 표지이다. 예를 들어, 단일 분자 검출에 충분히 강하고 정확한 정량화를 위해 충분히 신뢰할 수 있는 신호를 포함하는 강하고 신뢰할 수 있는 신호를 생성하는 표지된 친화성 시약이 필요하다. 예를 들어, 단일 분자 분해능에서 표적 분자의 검출을 지원하기에 충분한 결합활성(avidity)으로 표적 분자에 강력하게 결합하는 친화성 시약도 필요하다.
본 개시내용은 (a) 고정 성분(retaining component)과; (b) (ⅰ) 하나 이상의 표지 성분(label component) 및 (ⅱ) 하나 이상의 결합 성분(binding component) 중 하나 또는 둘 다를 갖는 친화성 시약(affinity reagent)을 제공한다. 선택적으로, 하나 이상의 표지 성분은 고정 성분에 부착된다. 대체 또는 추가 옵션으로서, 하나 이상의 결합 성분은 고정 성분에 부착된다. 고정 성분은 핵산 오리가미(nucleic acid origami)와 같은 구조화 핵산(structured nucleic acid)을 포함할 수 있다.
친화성 시약은 (a) 고정 성분; (b) 하나 이상의 표지 성분 및 (ⅱ) 복수의 결합 성분을 포함할 수 있다. 선택적으로, 친화성 시약은 평형 해리 상수가 결합 파트너에 대한 복수의 결합 성분 중 어느 하나의 평형 해리 상수 미만이거나, 검출 가능한 프로브는 해리 속도 상수가 결합 파트너에 대한 복수의 결합 성분 중 임의의 것의 해리 속도 상수 미만이다.
친화성 시약은 (a) 고정 성분; (b) 복수의 표지 성분 및 (ⅱ) 하나 이상의 결합 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 친화성 시약은 검출 가능한 프로브로서 구성될 수 있다. 검출 가능한 프로브는 (a) 고정 성분; (b) 하나 이상의 표지 성분; 및 (c) 고정 성분에 부착된 2개 이상의 결합 성분을 포함할 수 있고, 검출 가능한 프로브는 결합 파트너에 대한 평형 해리 상수가 결합 파트너에 대한 2개 이상의 결합 성분 중 임의의 것의 평형 해리 상수 미만이거나, 검출 가능한 프로브는 결합 파트너에 대한 해리 속도 상수가 결합 파트너에 대한 2개 이상의 결합 성분 중 임의의 것의 해리 속도 상수 미만이다.
본 개시내용은 (a) 분석물을 검출 가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 검출 가능한 프로브는 (ⅰ) 고정 성분; (ⅱ) 하나 이상의 표지 성분 및 (ⅲ) 하나 이상의 결합 성분을 포함하는 단계; 및 (b) 하나 이상의 표지 성분으로부터 신호를 획득하여 분석물을 검출하는 단계를 포함하는 분석물 검출 방법을 추가로 제공한다.
또한, (a) 분석물을 제1 검출 가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 제1 검출 가능한 프로브는 (ⅰ) 제1 고정 성분; (ⅱ) 하나 이상의 표지 성분, 및 (ⅲ) 고정 성분에 부착된 2개 이상의 결합 성분의 제1 세트를 포함하고, 제1 세트의 결합 성분 중 적어도 하나는 분석물의 제1 에피토프에 결합하는 단계; (b) 제1 검출 가능한 프로브의 하나 이상의 표지 성분으로부터 신호를 획득하는 단계; (c) 분석물을 제2 검출 가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 제2 검출 가능한 프로브는 (ⅰ) 제2 고정 성분 (ⅱ) 하나 이상의 표지 성분, 및 (ⅲ) 고정 성분에 부착된 2개 이상의 결합 성분의 제2 세트를 포함하고, 제2 세트의 결합 성분 중 적어도 하나는 분석물 내 제2 에피토프에 결합하고, 제2 에피토프는 제1 에피토프와 비교하여 상이한 화학 조성을 갖는 단계; 및 (d) 제2 검출 가능한 프로브의 하나 이상의 표지 성분으로부터 신호를 획득하여 분석물을 검출하는 단계를 포함하는 분석물 검출 방법이 제공된다. 선택적으로, 제2 고정 성분은 제1 고정 성분과 실질적으로 동일한 구조를 갖는다.
또한 본 개시내용은 (a) 결합 성분에 부착된 제1 구조화 핵산 입자를 포함하는 프로브; 및 (b) 결합 성분에 대한 에피토프에 부착된 제2 구조화 핵산 입자를 포함하는 분석물을 포함하는 조성물로서, 프로브는 결합 성분과 에피토프의 결합을 통해 분석물에 부착되어 있는 조성물을 제공한다. 특정 구성에서 상기 구조화 핵산 입자 중 하나 또는 둘 다는 핵산 오리가미를 포함한다.
또한 (a) 복수의 상이한 프로브로서, 각각의 상이한 프로브는 결합 성분에 부착된 제1 구조화 핵산 입자를 갖고, 각각의 상이한 프로브는 상이한 결합 성분을 갖는 프로브; 및 (b) 복수의 상이한 분석물로서, 각각의 상이한 분석물은 상이한 결합 성분에 대한 에피토프에 부착된 제2 구조화 핵산 입자를 갖는 분석물을 포함하는 조성물로서, 상이한 프로브는 복수의 상이한 프로브의 상이한 결합 성분과 복수의 상이한 분석물의 에피토프의 결합을 통해 상이한 분석물에 부착되어 있는 조성물이 제공된다. 선택적으로, 제1 구조화 핵산 입자는 상이한 프로브에 대해 실질적으로 동일하다. 추가 옵션으로서, 제2 구조화 핵산 입자는 상이한 분석물에 대해 실질적으로 동일할 수 있다. 특정 구성에서 상기 구조화 핵산 입자 중 하나 또는 둘 다는 핵산 오리가미를 포함한다. 상이한 프로브의 핵산 오리가미는 스테이플(staple) 구조가 상이한 프로브에 대해 동일한지 또는 상이한지 여부에 관계없이 동일한 스캐폴드(scaffold) 핵산 구조를 선택적으로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상이한 분석물의 핵산 오리가미는 스테이플 구조가 상이한 분석물에 대해 동일한지 또는 상이한지 여부에 관계없이 동일한 스캐폴드 핵산 구조를 선택적으로 포함할 수 있다.
하나 이상의 표지 성분(예를 들어, 검출 가능한 표지)을 포함하는 고정 성분, 및 상기 고정 성분에 커플링된 2개 이상의 결합 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브가 본원에 기술되며, 검출 가능한 프로브는 결합 파트너에 대한 해리 상수가 결합 파트너에 대한 2개 이상의 결합 성분 중 임의의 것의 해리 상수 미만이다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브의 하나 이상의 표지 성분은 검출 가능한 프로브의 고정 성분에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 고정 성분은 닫힌 단일 가닥 핵산을 갖는 스캐폴드, 및 상기 스캐폴드에 혼성화된 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 고정 성분은 스캐폴드 핵산을 포함한다. 스캐폴드는 파지 게놈 또는 플라스미드로부터의, 예를 들어, M13 파지 게놈으로부터의 가닥을 포함할 수 있다. 선택적으로, 고정 성분은 복수의 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 스캐폴드에 어닐링되어, 예를 들어, 오리가미 구조에서 스테이플을 형성할 수 있다. 일부 구성에서, 복수의 올리고뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 비천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 올리고뉴클레오티드의 비천연 뉴클레오티드는 생물직교(bioorthogonal) 또는 클릭 반응에 사용되는 작용성 그룹과 같은 작용성 그룹을 가질 수 있다. 일부 구성에서, 1개, 2개 또는 이보다 많은 결합 성분이 복수의 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 구성에서, 1개, 2개 또는 이보다 많은 표지 성분이 복수의 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 구성에서, 스캐폴드는 적어도 하나의 비천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 스캐폴드의 비천연 뉴클레오티드는 생물직교 또는 클릭 반응에 사용되는 작용성 그룹과 같은 작용성 그룹을 가질 수 있다. 일부 구성에서는, 1개, 2개 또는 이보다 많은 결합 성분이 스캐폴드에 부착된다. 일부 구성에서는 1개, 2개 또는 이보다 많은 표지 성분이 스캐폴드에 부착된다.
일부 구성에서, 2개 이상의 결합 성분을 갖는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 파트너에 대한 해리 상수가 결합 파트너에 대한 2개 이상의 결합 성분 중 임의의 것에 대한 해리 상수 미만이다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 파트너에 대한 해리 상수가 결합 파트너에 대한 2개 이상의 결합 성분 중 임의의 것에 대한 해리 상수의 50% 이하, 25% 이하, 10% 이하일 수 있다. 일부 구성에서, 결합 파트너에 결합될 때 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 오프 레이트(off-rate)는 결합 파트너에 결합될 때 2개 이상의 결합 성분 중 임의의 것에 대한 개별 오프 레이트보다 낮다. 일부 구성에서, 결합 파트너에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 온 레이트(on-rate)는 결합 파트너에 대한 2개 이상의 결합 성분 중 임의의 것에 대한 개별 온 레이트보다 높다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 제1 유형의 에피토프에 대해 0이 아닌 결합 친화성 및 제2 유형의 에피토프에 대해 0이 아닌 결합 친화성을 갖는다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 제1 유형의 에피토프에 대한 제1의 0이 아닌 결합 확률 및 제2 유형의 에피토프에 대한 제2의 0이 아닌 결합 확률을 가질 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 2개 이상의 결합 성분 중 제1 결합 성분은 제1 유형의 에피토프에 대해 제1의 0이 아닌 결합 확률을 갖고 제2 유형의 표적 모이어티에 대해 제2의 0이 아닌 결합 확률을 갖는다. 다른 구성에서, 2개 이상의 결합 성분 중 제1 결합 성분은 제1 유형의 표적 모이어티에 대한 제1의 0이 아닌 결합 확률을 포함하고, 2개 이상의 결합 성분 중 제2 결합 성분은 제2 유형의 표적 모이어티에 대해 제2의 0이 아닌 결합 확률을 포함한다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합 성분 중 적어도 하나는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하고, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합 파트너는 항체 또는 이의 기능적 단편에 대한 에피토프를 갖는다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합 성분 중 적어도 하나는 압타머(aptamer)를 포함하고, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합 파트너는 압타머에 대한 에피토프를 갖는다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 적어도 하나의 결합 성분을 통해 결합 파트너에 결합된다. 선택적으로, 결합 파트너는 2개 이상의 결합 성분을 통해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 결합될 수 있다. 결합 파트너는 폴리펩티드일 수 있다. 결합 성분 중 적어도 하나는 폴리펩티드에서 이량체, 삼량체 또는 사량체 아미노산 서열을 인식하도록 구성될 수 있다. 선택적으로, 폴리펩티드는, 예를 들어, 결합 성분에 의해 인식되는 에피토프 내에 또는 에피토프 외부에 존재하는 번역 후 변형(post-translational modification)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 파트너는 다당류, 중합체, 금속, 세라믹 또는 이들의 조합과 같은 비폴리펩티드 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비폴리펩티드 물질은 다당류, 중합체, 금속 또는 세라믹의 나노입자를 포함한다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 파트너에 비공유 결합되거나 결합 파트너에 공유 결합될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 결합된 결합 파트너는 용액 상태이거나 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 선택적으로, 결합 파트너는 이것이 결합하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 성분인 구조화 핵산 입자 이외의 구조화 핵산 입자에 부착될 수 있다. 구조화 핵산 입자는, 예를 들어, 어레이의 한 부위에서 고체 지지체에 대한 결합 파트너의 부착을 선택적으로 매개할 수 있다.
2개 이상의 결합 성분을 갖는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 고정 성분은 2개 이상의 결합 성분 중 제1 결합 성분이 2개 이상의 결합 성분 중 제2 결합 성분과 접촉하는 것을 제한하도록 구성될 수 있다. 2개 이상의 표지 성분을 갖는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 고정 성분은 2개 이상의 표지 성분 중 제1 표지 성분이 2개 이상의 표지 성분 중 제2 표지 성분과 접촉하는 것을 제한하도록 구성될 수 있다. 표지 성분 및 결합 성분을 갖는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 고정 성분은 표지 성분이 결합 성분과 접촉하는 것을 제한하도록 구성될 수 있다. 선택적으로, 고정 성분은 2개 이상의 성분 중 제1 성분이 2개 이상의 성분 중 제2 성분의 지정된 거리, 예를 들어, 1nm 이하, 5nm 이하, 10nm 이하, 20nm 이하의 거리 내에 들어오는 것을 제한할 수 있다. 일부 구성에서, 상기 제약은 각도 오프셋(angular offset)으로 인해 발생한다. 예를 들어, 각도 오프셋은 적어도 약 90° 또는 180°일 수 있다. 일부 구성에서, 상기 제약은 차단 모이어티(blocking moiety), 예를 들어, 고정 성분에 부착된 차단 모이어티로 인해 발생한다. 예시적인 차단 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥사이드(PEO), 선형 또는 분지형 알칸 사슬, 또는 덱스트란을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 고정 성분은 제2 면으로부터 오프셋된 제1 면을 갖는 3차원 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 면은 적어도 약 90° 또는 180°의 각도 오프셋인 제2 면으로부터의 오프셋을 가질 수 있다. 선택적으로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합 성분 중 하나, 일부 또는 전부는 제1 면에 존재하도록 제한되고 제2 면에 존재하지 않도록 제한된다. 일부 구성에서, 제1 면과 제2 면은 각각 하나 이상의 결합 성분을 포함할 수 있다. 추가 옵션으로서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 표지 성분 중 하나, 일부 또는 전부는 고정 성분의 제1 면에 존재하도록 제한되고 고정 성분의 제2 면에 존재하지 않도록 제한될 수 있다. 일부 구성에서, 제1 면과 제2 면은 각각 하나 이상의 표지 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 고정 성분의 제1 면에 결합 성분을 유지하면서 고정 성분의 다른 면에 표지 성분을 유지하도록 구성될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 하나, 일부 또는 모든 결합 성분이 하나, 일부 또는 모든 표지 성분이 존재하는 고정 성분의 면에 존재하지 않게 제한하도록 구성될 수 있다. 더욱이, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 하나, 일부 또는 모든 표지 성분이 하나, 일부 또는 모든 결합 성분이 존재하는 고정 성분의 면에 존재하지 않게 제한하도록 구성될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 고정 성분은 핵산 나노볼 또는 핵산 오리가미와 같은 구조화 핵산 입자(structured nucleic acid particle, SNAP)를 포함할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 하나 이상의 표지 성분은, 예를 들어, 광학 표지(예를 들어, 형광단, 발광단), 방사성 표지 또는 핵산 기반 표지(예를 들어, 서열 태그)를 포함하는 다양한 표지 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 2개 이상의 표지 성분은 중첩되거나 구별할 수 없는 신호를 생성할 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 표지 성분은 동일한 파장에서 방출하도록 구성된 형광단일 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 2개 이상의 표지 성분은 서로 분해되는 신호를 생성한다. 예를 들어, 2개 이상의 표지 성분은 서로 다른 파장에서 방출하도록 구성된 형광단일 수 있다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 2개 이상의 표지 성분은 포스터(Forster) 공명 에너지 전달 메커니즘에서 도너 및 억셉터를 포함한다. 대안적으로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 2개 이상의 표지 성분은 소광(quenching) 또는 포스터 공명 에너지 전달을 배제하는 거리만큼 서로 분리될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 2개 이상의 표지 성분은 소광 또는 포스터 공명 에너지 전달을 배제하는 상대적 배향을 가질 수 있다. SNAP를 포함하는 구성의 경우, 제1 형광 표지는 SNAP의 제1 뉴클레오티드 위치에 부착될 수 있고 제2 형광 표지는 SNAP의 제2 뉴클레오티드 위치에 부착되며, 제1 뉴클레오티드 위치는 구조화 핵산 입자의 1차 서열에서 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 뉴클레오티드 위치만큼 제2 뉴클레오티드 위치로부터 분리된다. 대안적으로 또는 추가로, 제1 뉴클레오티드 위치는 구조화 핵산 입자의 1차 서열에서 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 뉴클레오티드 위치만큼 제2 뉴클레오티드 위치로부터 분리될 수 있다.
결합 성분 또는 표지 성분은 링커에 의해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 부착될 수 있다. 링커는 강성 링커 또는 가요성 링커일 수 있다. 예시적인 가요성 링커는 PEG, PEO, 알칸 사슬, 단일 가닥 핵산 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이중 가닥 핵산 또는 분지형 알칸 사슬이 강성 링커로서 사용될 수 있다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 주요 지름은 결합하는 결합 파트너의 주요 지름보다 크다. 선택적으로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 부피는 결합하는 결합 파트너의 부피보다 크다.
특정 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 광학적으로 검출 가능한 고정 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 1개, 2개 또는 이보다 많은 결합 성분이 광학적으로 검출 가능한 고정 성분에 부착될 수 있다. 이러한 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 표지 성분을 포함할 필요가 없으며 검출은 광학적으로 검출 가능한 고정 성분에 의해 생성된 신호의 관찰을 기반으로 수행될 수 있다. 특히 유용한 광학적으로 검출 가능한 고정 성분은 형광 나노입자, FluoSpheres™ 또는 퀀텀닷(quantum dot)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 측면에서, 광학적으로 검출 가능한 고정 성분, 및 광학적으로 검출 가능한 고정 성분에 결합된 2개 이상의 결합 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 본원에 기술되며, 상기 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 파트너에 대한 해리 상수는 결합 파트너에 대한 2개 이상의 결합 성분 중 임의의 것의 해리 상수 미만이다.
또 다른 측면에서, 광학적으로 검출 가능한 고정 성분, 및 광학적으로 검출 가능한 고정 성분에 결합된 2개 이상의 결합 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 본원에 기술되며, 상기 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 파트너에 대한 결합 온 레이트는 결합 파트너에 대한 2개 이상의 결합 성분 중 임의의 것의 결합 온 레이트보다 높다.
또 다른 측면에서, 광학적으로 검출 가능한 고정 성분, 및 광학적으로 검출 가능한 고정 성분에 결합된 2개 이상의 결합 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 본원에 기술되며, 상기 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 파트너에 대한 결합 오프 레이트는 결합 파트너에 대한 2개 이상의 결합 성분 중 임의의 것의 결합 오프 레이트보다 낮다.
또 다른 측면에서, 분석물을 검출 가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 분석물은 검출 가능한 프로브의 결합 파트너인 단계 및 검출 가능한 프로브로부터 신호를 획득함으로써 분석물을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기술된다. 상기 방법은 획득된 신호로부터 분석물을 확인하는 단계, 또는 획득된 신호로부터 분석물의 화학 조성을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분석물은 폴리펩티드를 포함하고, 결정되는 화학 조성은 폴리펩티드의 적어도 일부의 아미노산 서열의 존재 또는 부재, 또는 폴리펩티드에서 번역 후 변형된 아미노산의 존재 또는 부재를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 획득된 신호로부터 분석물을 정량화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 획득된 신호로부터 고체 지지체 상의 분석물의 위치를 결정하는 단계, 예를 들어, 분석물이 존재하는 어레이 내 부위를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호는 검출 가능한 프로브의 광학적으로 검출 가능한 고정 성분으로부터 획득된다. 일부 실시양태에서, 신호는 검출 가능한 프로브의 하나 이상의 표지 성분으로부터 획득된다.
또 다른 측면에서, (a) 복수의 상이한 분석물을 제1의 복수의 검출 가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 제1의 복수의 검출 가능한 프로브로부터의 검출 가능한 프로브는 복수의 상이한 분석물로부터의 상이한 분석물의 제1 서브세트에 결합하는 단계, (b) 제1의 복수의 검출 가능한 프로브로부터 신호를 획득하는 단계, (c) 복수의 상이한 분석물을 제2의 복수의 검출 가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 제2의 복수의 검출 가능한 프로브로부터의 검출 가능한 프로브는 복수의 상이한 분석물로부터의 상이한 분석물의 제2 서브세트에 결합하고, 상이한 분석물의 제1 서브세트는 분석물의 제2 서브세트와 상이한 단계, (d) 제2의 복수의 검출 가능한 프로브로부터 신호를 획득하는 단계, (e) 단계 (b) 및 단계 (d)에서 획득된 신호에 기초하여 분석물을 확인하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기술된다. 선택적으로, 제1의 복수의 검출 가능한 프로브는 제2의 복수의 검출 가능한 프로브와 실질적으로 동일한 2개 이상의 결합 성분을 포함한다. 대안적으로, 제1의 복수의 검출 가능한 프로브는 제2의 복수의 검출 가능한 프로브의 2개 이상의 결합 성분과 상이한 2개 이상의 결합 성분을 포함할 수 있다. 추가 옵션으로서, 제1의 복수의 검출 가능한 프로브 중 하나, 일부 또는 전부는 고정 성분을 포함할 수 있다. 선택적으로, 고정 성분은 제1의 복수의 검출 가능한 프로브의 일부 또는 전부에 대해 공통 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 또는 모든 검출 가능한 프로브에 대한 고정 성분은 동일한 스캐폴드 폴딩 구조와 같은 오리가미 구조를 포함할 수 있다. 유사하게, 제1의 복수의 검출 가능한 프로브 중 하나, 일부 또는 전부에 대한 고정 성분은 제2의 복수의 검출 가능한 프로브 중 하나, 일부 또는 전부에 대한 고정 성분과 공통된 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2의 복수의 검출 가능한 프로브의 일부 또는 전부에 대한 고정 성분은 동일한 스캐폴드 폴딩 구조와 같은 오리가미 구조를 포함할 수 있다.
일부 구성에서, 상기 방법은 단계 (c) 전에 복수의 상이한 분석물로부터 제1의 복수의 검출 가능한 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법의 일부 구성에서, 제1의 복수의 검출 가능한 프로브는 제2의 복수의 검출 가능한 프로브로서 하나 이상의 표지 성분을 생성하는 신호와 동일한 신호를 생성한다. 예를 들어, 제1의 복수의 검출 가능한 프로브는 제2의 복수의 검출 가능한 프로브와 동일한 하나 이상의 표지 성분을 포함할 수 있다. 상기 방법의 일부 구성에서, 제1의 복수의 검출 가능한 프로브는 제2의 복수의 검출 가능한 프로브의 하나 이상의 표지 성분과 상이한 하나 이상의 표지 성분을 포함한다. 상기 방법의 일부 구성에서, 제1의 복수의 검출 가능한 프로브는 제2의 복수의 검출 가능한 프로브와 동일한 광학적으로 검출 가능한 고정 성분을 포함한다. 상기 방법의 일부 구성에서, 제1의 복수의 검출 가능한 프로브는 제2의 복수의 검출 가능한 프로브의 광학적으로 검출 가능한 고정 성분과 상이한 광학적으로 검출 가능한 고정 성분을 포함한다.
본원에 제시된 방법에서 친화성 시약에 결합되거나 검출 가능한 프로브에 의해 검출되는 하나 이상의 상이한 분석물은 고체 지지체에 부착될 수 있다. 예를 들어, 복수의 상이한 분석물의 개별 분석물이 고체 지지체 상의 각각의 위치에 부착될 수 있고, 이로써 고체 지지체가 분석물의 어레이를 포함한다.
추가로 본 개시내용에 의해 (a) 물질 내 개별 위치에 결합 파트너를 포함하는 물질(예를 들어, 고체 지지체)을 제공하는 단계; (b) 물질을 검출 가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 검출 가능한 프로브는 (ⅰ) 고정 성분, (ⅱ) 검출 가능한 신호를 생성하도록 구성된 하나 이상의 표지 성분 및 (ⅲ) 고정 성분에 결합된 2개 이상의 결합 성분을 포함하고, 상기 고정 성분 및 2개 이상의 결합 성분은 검출 가능한 프로브를 형성하는 단계; (c) 하나 이상의 표지 성분으로부터 검출 가능한 신호를 검출하는 단계; 및 (d) 검출 가능한 신호의 개별 위치를 확인하여 물질 내 결합 파트너의 위치를 찾는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 선택적으로, 검출 가능한 프로브는 임의의 결합 성분에 결합 파트너의 결합에 대한 해리 상수의 절반 이하인 해리 상수로 결합 파트너를 개별적으로 결합시킨다.
또한, (a) 복수의 커플링 그룹을 포함하는 고정 성분을 제공하는 단계 및 (b) 복수의 커플링 그룹의 커플링 그룹을 복수의 결합 성분에 부착시키는 단계를 포함하는, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 형성하는 방법이 제공된다. 선택적으로, 상기 방법은 (c) 복수의 커플링 그룹의 커플링 그룹을 복수의 표지 성분에 부착하는 단계를 추가로 포함한다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 성분 사이의 부착은 공유 또는 비공유일 수 있다. 핵산은 특히 유용한 커플링 그룹을 제공한다. 예를 들어, 상기 방법에서 커플링 그룹은 결합 성분 및/또는 표지 성분에 부착된 상보성 핵산에 어닐링하는 단일 가닥 핵산 모이어티를 포함할 수 있다. 고정 성분은 알려진 위치에 단일 가닥 핵산 모이어티를 위치시키도록 조작된 핵산 오리가미를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 핵산 모이어티는 스캐폴드 가닥에 어닐링되는 스테이플 가닥 또는 올리고뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 다른 유용한 비공유 부착은, 예를 들어, 스트렙트아비딘-비오틴(streptavidin-biotin), SpyCatcher-SpyTag, SdyCatcher-SdyTag 및 SnoopCatcher-SnoopTag와 같은 수용체-리간드 쌍에 의해 매개되는 부착을 포함한다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 성분을 공유적으로 부착시키기 위해 임의의 다양한 작용성 그룹이 사용될 수 있다. 생물직교 반응과 클릭(Click) 반응이 특히 유용하다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 제조하는 방법은 고정 성분 상에 부동태화층(passivating layer)을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 고정 성분의 패시베이션(passivation)은, 예를 들어, 작용성 그룹(예를 들어, 커플링 그룹), 표지 성분 또는 결합 성분을 고정 성분에 부착하기 전에 수행할 수 있다. 선택적으로, 부동태화층은 금속, 금속 산화물, 유기 작용성 그룹 또는 중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 금속은 금, 은, 구리, 티타늄 또는 철을 포함할 수 있다. 선택적으로, 금속 산화물은 산화티타늄, 알루미나, 이산화규소 또는 산화마그네슘을 포함한다. 선택적으로, 유기 작용성 그룹은 포스페이트, 포스포네이트, 카복실레이트, 에폭사이드 또는 실란을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 탄화수소 중합체 또는 바이오중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄화수소 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 또는 알칸 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이오중합체는 다당류, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.
본 개시내용의 검출 가능한 프로브는 이중 가닥 영역 및 압타머를 포함할 수 있으며; 이중 가닥 영역은 2개 이상의 표지 성분을 포함한다. 예를 들어, 표지 성분은 상기 가닥 중 하나 또는 둘 다에서 형광 표지된 뉴클레오티드일 수 있다. 선택적으로, 형광 표지된 뉴클레오티드는, 예를 들어, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 뉴클레오티드만큼 서로 분리될 수 있다. 선택적으로, 이중 가닥 영역은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 형광단 또는 다른 표지 성분을 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브의 2개 이상의 표지 성분은 서로 동일하거나 서로 상이할 수 있다.
선택적으로 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 포함된 압타머 또는 다른 결합 성분은 αXβ 형태의 서열의 일부 또는 전부를 인식하거나 이에 결합할 수 있으며, X는 원하는 에피토프이고 α 및 β는 임의의 아미노산 잔기이다. 선택적으로, 압타머는 αXβ 형태의 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 80% 또는 90%를 인식하거나 이에 결합할 수 있다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 포함된 압타머 또는 다른 결합 성분은 임의의 다른 3개의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하지 않고 원하는 3개의 아미노산 에피토프를 인식하거나 이에 결합할 수 있으며, 원하는 에피토프를 둘러싸는 인접 서열(flanking sequence)에 관계없이 실질적으로 친화성이 유사한 원하는 3개의 아미노산 에피토프에 결합한다.
또 다른 측면에서, 인간 프로테옴(proteome)에서 모든 단백질의 5% 내지 10%에 결합하는 전환 가능한 압타머가 본원에 기술되며; 전환 가능한 압타머는 2개 이상의 형광 모이어티를 포함한다.
본 발명은 3' 엔드에 프라이머 서열을 갖는 압타머를 합성하는 단계, 상기 프라이머 서열에 주형 DNA 가닥을 혼성화시키는 단계로서, 상기 주형 DNA 가닥은 프라이머 및 주형 영역에 상보적인 세그먼트를 포함하는 단계 및 및 상기 주형을 따라 압타머 분자의 3' 엔드를 확장하기 위해 폴리머라제를 사용하는 단계를 포함하는, 형광 표지된 압타머의 제조 방법을 추가로 제공한다. 선택적으로, 폴리머라제 반응은 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 믹스로 수행된다. 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 종은 표지를 포함할 수 있는 반면, 다른 뉴클레오티드 종은 표지가 없다. 예를 들어, 폴리머라제 반응은 4개의 뉴클레오티드(아데닌, 시토신, 구아닌 및 티민 또는 우라실)로 수행될 수 있으며, 이 중 3개의 뉴클레오티드는 표지되지 않고 4번째 뉴클레오티드는 형광 표지되며, 주형은 형광 표지된 뉴클레오티드에 상보적인 염기가 사전 결정된 패턴으로 발생하도록 설계된다. 선택적으로, 형광 표지된 뉴클레오티드에 상보적인 염기는 주형을 따라 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50번째 위치마다 발생할 수 있다.
또 다른 측면에서, 상술한 형광 표지된 압타머의 제조 방법으로서, 압타머를 형광 표지된 올리고뉴클레오티드에 결찰시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기술된다. 다른 구성에서, 형광 표지된 압타머의 제조 방법은 3' 엔드에 확장 서열을 갖는 압타머를 합성하는 단계, 스플린트(splint) 핵산 가닥을 확장 서열에 혼성화하는 단계 및 표지된 올리고뉴클레오티드를 스플린트 핵산 가닥에 혼성화하여 표지된 올리고뉴클레오티드의 엔드가 확장 서열의 엔드에 인접하도록 하고, 리가아제를 사용하여 확장 서열을 통해 표지된 올리고뉴클레오티드를 압타머에 결찰시키는 단계를 포함할 수 있다.
참조에 의한 통합
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
도 1a는 물체의 두 면 사이에 각도 오프셋이 있는 물체를 보여준다.
도 1b는 물체의 두 면 사이에 각도 오프셋이 있는 물체를 보여준다.
도 2a는 정사각형 고정 성분의 대략적인 2차원 투영(projection)을 보여준다.
도 2b는 원형 고정 성분의 대략적인 2차원 투영을 보여준다.
도 3a는 2개의 결합 성분 사이의 상대적 분리를 보여준다.
도 3b는 2개의 결합 성분 사이의 상대적 분리를 보여준다.
도 3c는 2개의 결합 성분 사이의 상대적 분리를 보여준다.
도 4a는 2개의 결합 성분을 분리하기 위한 구성을 보여준다.
도 4b는 2개의 결합 성분을 분리하기 위한 구성을 보여준다.
도 4c는 2개의 결합 성분을 분리하기 위한 구성을 보여준다.
도 4d는 2개의 결합 성분을 분리하기 위한 구성을 보여준다.
도 5a는 고정 성분 상의 표지 성분을 이격시키기 위한 구성을 보여준다.
도 5b는 고정 성분 상의 표지 성분을 이격시키기 위한 구성을 보여준다.
도 6a는 고정 성분 상의 결합 성분 및 표지 성분의 구성을 보여준다.
도 6b는 고정 성분 상의 결합 성분 및 표지 성분의 구성을 보여준다.
도 6c는 고정 성분 상의 결합 성분 및 표지 성분의 구성을 보여준다.
도 6d는 고정 성분 상의 결합 성분 및 표지 성분의 구성을 보여준다.
도 6e는 고정 성분 상의 결합 성분 및 표지 성분의 구성을 보여준다.
도 6f는 고정 성분 상의 결합 성분 및 표지 성분의 구성을 보여준다.
도 7a는 성분 결합을 위한 링커를 포함하는 검출 가능한 프로브의 구성을 보여준다.
도 7b는 성분 결합을 위한 링커를 포함하는 검출 가능한 프로브의 구성을 보여준다.
도 8은 추가 결합활성 성분이 있는 검출 가능한 프로브의 구성을 보여준다.
도 9a는 검출 가능한 프로브에 대한 약한 결합 상호작용을 생성하기 위한 시스템의 구성을 보여준다.
도 9b는 검출 가능한 프로브에 대한 약한 결합 상호작용을 생성하기 위한 시스템의 구성을 보여준다.
도 10a는 검출 가능한 프로브에 대한 약한 결합 상호작용을 생성하는 방법을 보여준다.
도 10b는 검출 가능한 프로브에 대한 약한 결합 상호작용을 생성하는 방법을 보여준다.
도 10c는 검출 가능한 프로브에 대한 약한 결합 상호작용을 생성하는 방법을 보여준다.
도 11a는 2개의 검출 가능한 프로브와의 약한 결합 상호작용을 생성하는 방법을 보여준다.
도 11b는 2개의 검출 가능한 프로브와의 약한 결합 상호작용을 생성하는 방법을 보여준다.
도 11c는 2개의 검출 가능한 프로브와의 약한 결합 상호작용을 생성하는 방법을 보여준다.
도 11d는 2개의 검출 가능한 프로브와의 약한 결합 상호작용을 생성하는 방법을 보여준다.
도 11e는 2개의 검출 가능한 프로브와의 약한 결합 상호작용을 생성하는 방법을 보여준다.
도 12a는 저강도 형광 표지에 대한 센서 픽셀 그룹에 대한 형광 강도 측정값을 보여준다.
도 12b는 고강도 형광 표지에 대한 센서 픽셀 그룹에 대한 형광 강도 측정값을 보여준다.
도 13은 결합 파트너와 결합하는 고도로 관찰 가능한 검출 가능한 프로브의 단면도를 보여준다.
도 14a는 고정 성분 상에 형광 공명 에너지 전달(Fluorescent resonance energy transfer, FRET) 쌍을 생성하기 위한 구성을 보여준다.
도 14b는 검출 가능한 프로브 상에 형광 공명 에너지 전달(FRET) 쌍을 생성하기 위한 구성을 보여준다.
도 15a는 핵산 바코드 및 약한 2차 상호작용을 활용하여 결합 상호작용을 검출하기 위한 방법의 제1 단계를 보여준다.
도 15b는 핵산 바코드 및 약한 2차 상호작용을 활용하여 결합 상호작용을 검출하기 위한 방법의 제2 단계를 보여준다.
도 15c는 핵산 바코드 및 약한 2차 상호작용을 활용하여 결합 상호작용을 검출하기 위한 방법의 제3 단계를 보여준다.
도 15d는 핵산 바코드 및 약한 2차 상호작용을 활용하여 결합 상호작용을 검출하기 위한 방법의 제4 단계를 보여준다.
도 16a는 결합 경쟁자를 포함하는 검출 가능한 프로브 조성물을 보여준다.
도 16b는 결합 경쟁자를 포함하는 검출 가능한 프로브 조성물을 보여준다.
도 17a는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포획제로서 활용하는 방법을 보여준다.
도 17b는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포획제로서 활용하는 방법을 보여준다.
도 17c는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 폴리펩티드 검정을 위한 포획제로서 활용하는 방법을 보여준다.
도 18a는 결합 파트너에 대한 하나 초과의 검출 가능한 프로브의 결합을 검출하는 방법의 제1 단계를 보여준다.
도 18b는 결합 파트너에 대한 하나 초과의 검출 가능한 프로브의 결합을 검출하는 방법의 제2 단계를 보여준다.
도 18c는 결합 파트너에 대한 하나 초과의 검출 가능한 프로브의 결합을 검출하는 방법의 제3 단계를 보여준다.
도 19a는 펩티드 서열을 결정하기 위해 검출 가능한 프로브를 활용하는 방법을 보여준다.
도 19b는 펩티드 서열을 결정하기 위해 검출 가능한 프로브를 활용하는 방법을 보여준다.
도 19c는 펩티드 서열을 결정하기 위해 검출 가능한 프로브를 활용하는 방법을 보여준다.
도 19d는 펩티드 서열을 결정하기 위해 검출 가능한 프로브를 활용하는 방법을 보여준다.
도 20a는 결합 경쟁자를 활용하여 결합 상호작용을 변경하는 방법을 보여준다.
도 20b는 결합 경쟁자를 활용하여 결합 상호작용을 변경하는 방법을 보여준다.
도 21a는 검출 가능한 프로브를 제조하는 방법을 보여준다.
도 21b는 검출 가능한 프로브를 제조하는 방법을 보여준다.
도 22는 복수의 결합 파트너의 특성화를 위한 검출 가능한 프로브의 사용을 보여준다.
도 23은 DNA 오리가미 고정 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 단순화된 개략도를 보여준다.
도 24a는 퀀텀닷 기반 검출 가능한 프로브에 대한 결합 특성화 데이터를 보여준다.
도 24b는 퀀텀닷 기반 검출 가능한 프로브에 대한 결합 특성화 데이터를 보여준다.
도 25는 DNA 오리가미 고정 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 단순화된 개략도를 보여준다.
도 26은 클릭 반응을 통해 항체 기반 결합 성분을 오리가미 고정 성분에 부착하는 개략도를 보여준다.
도 27은 항체-올리고뉴클레오티드 접합체를 함유하는 SDS-Page 겔의 이미지를 보여준다.
도 28a는 폴리펩티드 표적에 대한 검출 가능한 프로브의 결합 데이터를 보여준다.
도 28b는 폴리펩티드 표적에 대한 검출 가능한 프로브의 결합 데이터를 보여준다.
도 28c는 폴리펩티드 표적에 대한 검출 가능한 프로브의 결합 데이터를 보여준다.
도 28d는 폴리펩티드 표적에 대한 검출 가능한 프로브의 결합 데이터를 보여준다.
도 29a는 음성 대조군 폴리펩티드 어레이에 대한 검출 가능한 프로브 결합의 형광 현미경 이미지를 보여준다.
도 29b는 음성 대조군 폴리펩티드 어레이에 대한 검출 가능한 프로브 결합의 형광 현미경 이미지를 보여준다.
도 29c는 폴리펩티드 어레이에 대한 검출 가능한 프로브 결합의 형광 현미경 이미지를 보여준다.
도 30은 폴리펩티드 표적에 대한 검출 가능한 프로브의 결합 데이터를 보여준다.
도 31a는 비핵산 고정 성분의 구성을 보여준다.
도 31b는 비핵산 고정 성분의 구성을 보여준다.
도 31c는 비핵산 고정 성분의 구성을 보여준다.
도 31d는 비핵산 고정 성분의 구성을 보여준다.
도 32a는 비핵산 고정 성분을 형성하기 위한 방법의 제1 단계를 보여준다.
도 32b는 비핵산 고정 성분을 형성하기 위한 방법의 제2 단계를 보여준다.
도 32c는 비핵산 고정 성분을 형성하기 위한 방법의 제1 단계를 보여준다.
도 32d는 비핵산 고정 성분을 형성하기 위한 방법의 제2 단계를 보여준다.
도 32e는 비핵산 고정 성분을 형성하기 위한 방법의 제3 단계를 보여준다.
도 33은 비핵산 고정 성분을 형성하는 방법을 보여준다.
도 34a는 비핵산 고정 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브의 구성을 보여준다.
도 34b는 비핵산 고정 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브의 구성을 보여준다.
도 34c는 비핵산 고정 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브의 구성을 보여준다.
도 35a는 복수의 검출 가능한 프로브로부터 형성된 다중 프로브 복합체를 보여준다.
도 35b는 복수의 검출 가능한 프로브로부터 형성된 다중 프로브 복합체를 보여준다.
도 35c는 복수의 검출 가능한 프로브로부터 형성된 다중 프로브 복합체를 보여준다.
도 36a는 제어된 형태의 다중 프로브 복합체를 보여준다.
도 36b는 제어된 형태의 다중 프로브 복합체를 보여준다.
도 37a는 비핵산 고정 성분으로부터 검출 가능한 프로브를 형성하기 위한 방법의 제1 단계를 보여준다.
도 37b는 비핵산 고정 성분으로부터 검출 가능한 프로브를 형성하기 위한 방법의 제2 단계를 보여준다.
도 37c는 비핵산 고정 성분으로부터 검출 가능한 프로브를 형성하기 위한 방법의 제3 단계를 보여준다.
도 38a는 약물 전달을 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 복합체를 활용하는 제1 단계를 보여준다.
도 38b는 약물 전달을 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 복합체를 활용하는 제2 단계를 보여준다.
도 38c는 약물 전달을 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 복합체를 활용하는 제3 단계를 보여준다.
도 38d는 약물 전달을 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 복합체를 활용하는 제4 단계를 보여준다.
도 39a는 2차 고정 성분으로 형성된 다중 프로브 복합체를 보여준다.
도 39b는 2차 고정 성분으로 형성된 다중 프로브 복합체를 보여준다.
도 40은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포획제로서 활용하는 친화성 크로마토그래피 시스템을 보여준다.
도 41은 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브를 제조하기 위한 개략도를 보여준다.
도 42a는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 특성화 데이터를 보여준다.
도 42b는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 특성화 데이터를 보여준다.
도 42c는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 특성화 데이터를 보여준다.
도 42d는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 특성화 데이터를 보여준다.
도 42e는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 특성화 데이터를 보여준다.
도 42f는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 특성화 데이터를 보여준다.
도 43a는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 결합 특성화 데이터를 보여준다.
도 43b는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 결합 특성화 데이터를 보여준다.
도 43c는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 결합 특성화 데이터를 보여준다.
도 43d는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 결합 특성화 데이터를 보여준다.
도 44a는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 안정성 특성화 데이터를 보여준다.
도 44b는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 안정성 특성화 데이터를 보여준다.
도 44c는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 안정성 특성화 데이터를 보여준다.
도 45a는 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 결합 특성화 데이터를 보여준다.
도 45b는 Alexa-Fluor®기반 압타머에 대한 결합 특성화 데이터를 보여준다.
도 45c는 APC 기반 압타머에 대한 결합 특성화 데이터를 보여준다.
도 45d는 SureLight™ APC 기반 압타머에 대한 결합 특성화 데이터를 보여준다.
도 46은 이용 가능한 친화성 시약 부착 부위의 양이 상이한 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브에 대한 결합 데이터를 보여준다.
도 47은 his-태그된 Her2(표적 상(on-target)) 및 미오글로빈(표적 외(off-target))에 대한 직접 부착 또는 사전 어닐링 프로토콜로 제작된 형광 나노입자 B1 프로브에 대한 결합 데이터를 보여준다.
도 48은 표적을 포함하는 펩티드의 예시적인 목록과 함께 친화성 시약의 선택을 위한 고정된 표적을 보여준다.
도 49a는 본원에 기술된 바와 같은 표지된 친화성 시약의 개략도를 제공한다.
도 49b는 효소적 확장에 의해 핵산 프로브에 표지 성분을 부착시키는 방법을 보여준다.
도 50은 친화성 시약을 형광 표지하는 일부 예시적인 방법을 도식화한 것이다. 도 50a는 단일 형광단이 부착된 압타머를 보여준다. 도 50b는 이중 가닥 핵산 표지 영역이 있는 압타머를 보여주며, 상기 표지 영역에는 2개의 형광단이 부착되어 있다. 도 50c는 주형을 사용한 압타머로의 다수의 규칙적으로 이격된 형광단의 부착을 보여준다.
도 51은 형광단을 포함하는 핵산의 단일 가닥에 혼성화된, 압타머를 포함하는 핵산의 단일 가닥을 포함하는 표지된 프로브를 보여준다.
도 52는 이중 가닥 DNA를 보여주는 488nm에서 가시화된 겔 및 혼입된 형광단을 보여주는 647nm에서 가시화된 겔을 보여준다. 이러한 표지된 친화성 시약은 효소적 확장 및 형광단 변형된 뉴클레오티드의 통합을 통해 생성되었다.
도 53a는 이중 가닥 DNA를 보여주는 488nm에서 시각화된 겔을 보여준다.
도 53b는 혼입된 형광단을 보여주는 647nm에서 시각화된 겔을 보여준다. 이러한 표지된 친화성 시약은 효소적 확장 및 화학적으로 변형된 뉴클레오티드의 통합을 통해 생성되었다. 후속적으로, 일부 실시양태에 따라 형광단을 통합하기 위해 화학 접합이 사용되었다.
도 54는 표지된 압타머 농도를 보여준다.
도 55a는 도 54의 표지된 압타머에서 형광단 농도를 보여준다.
도 55b는 도 8a에서 형광단 농도를 결정하기 위해 사용된 dUTP-647 표준 곡선을 보여준다.
도 56은 도 54 및 55로부터 계산된 형광단:DNA 비율을 보여준다.
도 57a는 고정된 펩티드에 결합된 표지된 압타머를 보여준다.
도 57b는 고정된 표적 펩티드에 대한 표지된 압타머의 결합을 보여준다.
도 57c는 고정된 비표적 펩티드에 대한 표지된 압타머의 결합을 보여준다.
도 57d는 아민 코팅된 커버슬립 상의 제한 희석에서 표지된 압타머의 현미경 관찰을 보여준다.
도 58a는 검출 가능한 프로브와 SNAP 부착된 폴리펩티드 사이의 결합 반응을 보여준다.
도 58b는 복수의 검출 가능한 프로브와 SNAP 부착된 폴리펩티드 어레이 사이의 결합 반응을 보여준다.
친화성 시약과 결합 표적 사이의 상호작용의 검출은 물리적 시스템의 공간적 및/또는 시간적 특성화 및/또는 정량화를 제공하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)과 같은 친화성 시약 기반 방법을 사용하여 생화학 샘플 내 바이오마커의 존재 및 잠재적 양을 결정할 수 있다. 친화성 시약은 예상치 못한 또는 예상 밖의 표적과의 상호작용, 또는 예상한 표적과의 상호작용 실패와 같은 복잡한 거동을 나타낼 수 있다. 벌크 또는 대규모 특성화에서 친화성 시약은 복잡한 거동 측면이 실험 오류 내에 속하도록 충분한 정도로 조작되어 유용한 상호작용 데이터를 생성할 수 있다. 그러나 친화성 시약을 활용하는 단일 분자 검정의 경우, 복잡한 친화성 시약 거동으로 인해 단일 분자 친화성 시약 상호작용 데이터의 해석이 복잡해지는 비정상적인 결과(예를 들어, 위음성(false negatives), 위양성(false positives))가 생성될 수 있다.
친화성 시약과 결합 파트너 사이의 결합 상호작용에 영향을 미치는 다양한 인자로 인해, 결합은 일시적일 수 있다. 일부 경우에, 친화성 시약은 결합 파트너와 자유롭게 회합되고 해리될 수 있다. 다른 경우에, 친화성 시약은 안정하거나 준안정한 복합체를 생성하기에 충분한 강도를 지닌 결합 파트너와 상호작용할 수 있다. 또한, 일부 경우에 친화성 시약은 예상치 못한 또는 예상 밖의 결합 파트너와 결합할 수 있다.
친화성 시약과 결합 파트너 사이의 복잡한 상호작용 특성으로 인해 일부 친화성 시약 상호작용은 기존의 이원 상호작용 프레임워크(즉, 단일 결합 파트너, 결합 또는 결합 없음)에 맞지 않을 수 있다. 예를 들어, 친화성 시약은 다음을 포함하는 다양한 이유로 이용 가능한 결합 파트너와의 상호작용이 관찰되지 않을 수 있다: 1) 친화성 시약은 결합 파트너에 충분히 근접하지 못함; 2) 친화성 시약은 회합이 관찰되는 시간 간격 동안 결합 파트너와 회합된 상태를 유지하지 못함; 또는 3) 친화성 상호작용을 방해하거나 약화시키는 환경 변화(예를 들어, 결합 파트너 또는 친화성 시약의 구조적 변화). 마찬가지로, 친화성 시약은 1) 친화성 상호작용을 강화하는 환경 변화; 또는 2) 회합이 관찰되는 시간 간격 동안 발생하는 일시적 회합과 같은 다양한 이유로 예상치 못한 또는 예상 밖의 표적으로의 결합이 관찰될 수 있다.
결과적으로, 일부 친화성 시약 상호작용은 확률적(probabilistic) 또는 확률론적 프레임워크(stochastic framework)(예를 들어, 다중 결합 파트너, 각 표적에 대한 결합의 0이 아닌 확률) 내에서 가장 잘 설명될 수 있다. 친화성 시약 결합에 대한 확률적 또는 확률론적 모델은 단일 상호작용 측정이 반드시 결정적인 특성을 제공하지는 않을 수 있는 단일 분자 검정에 특히 유용할 수 있다. 이러한 상황에서, 다중 측정 라운드 또는 사이클은 측정 신뢰도를 높일 수 있다.
친화성 시약이 특정 조건에서 항상 최적으로 작용하지는 않을 수 있지만, 친화성 시약은 특정 목적을 위해 그 거동을 증가시키거나 개선하도록 조작될 수 있다. 수정될 수 있는 친화성 시약 거동의 두 가지 측면에는 결합활성과 관찰 가능성이 포함된다.
결합활성은 친화성 시약과 결합 파트너 사이의 다수의 종종 상승적인 결합 상호작용의 존재로 인해 결합 파트너에 결합된 상태로 유지되는 친화성 시약의 경향으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 친화성 시약에 의해 인식되는 복수의 상이한 에피토프를 갖는 결합 파트너로 인해 및/또는 결합 파트너에서 에피토프를 인식하는 복수의 결합 성분을 갖는 프로브로 인해 다중 결합 상호작용이 발생할 수 있다. 이러한 현상의 일반적인 예는 항체의 결합활성인데, 특정 표적에 대한 단일 항체의 다중 결합 부위의 약한 결합을 통해 결합활성이 종종 달성되어 결합 파트너와 항체의 임의의 개별 결합 부위 사이의 결합 강도보다 더 큰 겉보기 결합 강도를 생성한다.
관찰 가능성은 친화성 시약과 이의 결합 파트너 사이의 결합 상호작용을 검출하는 능력으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 관찰 가능성은 친화성 시약과 이의 결합 파트너 사이의 상호작용 동안 검출되는 친화성 시약의 경향을 나타낼 수 있다. 일부 구성에서, 관찰 가능성은 친화성 시약과 이의 결합 파트너 사이의 상호작용 후에 검출될 수 있는 신호 또는 신호 생성 태그(예를 들어, 핵산 태그)를 생성하는 친화성 시약의 경향을 나타낼 수 있다. 관찰 가능성은 검출 중 충분한 시간 간격 동안 상호작용을 유지하는 친화성 시약의 능력과 상호작용의 검출 가능한 신호를 감소시킬 수 있는 메커니즘(예를 들어, 광표백, 표지 성분의 절단)에 대한 친화성의 저항 모두에 의해 영향을 받을 수 있다.
결합 파트너에 대한 결합활성이 강화된 프로브를 포함하는 조성물이 본원에 기술된다. 일부 구성에서, 프로브는 검출 가능하고, 선택적으로 강화된 관찰 가능성을 지닌다. 친화성 시약 및 검출 가능한 프로브와 같은 본원에 기술된 조성물은, 예를 들어, 친화성 시약 상호작용의 다중 라운드 또는 사이클이 측정되는 구성을 포함하는 단일 분자 특성화 검정에 특히 유용할 수 있다. 상기 조성물은 선택적으로 하나 이상의 결합 파트너에 대한 강화된 결합활성 특성을 지닌 동시에 가역적 결합이, 예를 들어, 결합 측정의 다중 사이클 또는 라운드가 가능하도록 결합 파트너로부터 제거될 수 있도록 구성된다. 상기 조성물은 선택적으로 친화성 시약 상호작용이 측정되는 시스템의 배경 신호를 충분히 초과하는 신호 수준에서 표지의 관찰 및 측정이 가능한 가변 검출 표지를 가질 수 있다.
일부 구성에서, 본원에 기술된 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 복수의 결합 성분 및 복수의 표지 성분(예를 들어, 검출 표지) 중 하나 또는 둘 다와 회합된 고정 성분을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 복수의 결합 성분은 특정 결합 파트너에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합을 위한 강화된 결합활성이 가능한 구성으로 고정 성분 상에 표시될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 친화성은 특정 결합 파트너에 대한 개별 결합 성분 중 어느 하나의 친화성을 초과할 수 있다. 일부 구성에서, 결합 파트너에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성은 결합 파트너에 대한 복수의 결합 성분의 친화성의 합을 초과할 수 있다. 또한, 검출 표지에 의해 생성된 검출 가능한 신호를 강화하는 방식으로 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 고정 성분 상에 복수의 표지 성분이 표시될 수 있다. 예를 들어, 신호는 강도, 기간 또는 특이성과 관련하여 강화될 수 있다. 특정 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 친화성 시약과 이의 결합 파트너 사이의 상호작용을 방해하는 화학종(예를 들어, 계면활성제, 변성제)의 존재 하에서 안정한 특성을 추가로 보유할 수 있으며, 이에 따라 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 구조를 손상시키거나 방해하지 않으면서 결합 파트너로부터 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 제거가 가능하다.
일부 구성에서, 기술된 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 핵산 오리가미를 복수의 결합 성분(예를 들어, 항체, 항체 단편, 미니 단백질, DARPin, DNA 압타머, RNA 압타머 등) 및/또는 복수의 표지 성분(예를 들어, 형광단, 핵산 태그, 퀀텀닷, 형광 나노입자, 형광 단백질)에 커플링되는 고정 성분으로서 사용한다. 일부 구성에서, 핵산 오리가미 기반 고정 성분은 사전 결정된 위치에서 복수의 결합 성분 및/또는 복수의 표지 성분의 부착이 가능한 규칙적 또는 대칭적 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 성분은 사전 정의된 거리만큼 서로 분리될 수 있거나, 상기 성분은 상승적 기능을 달성하도록 배향될 수 있거나, 상기 성분은 서로의 활성 억제를 줄이거나 방지하도록 배향될 수 있다. 간격 및 배향을 조정하는 능력은 형광단 표지 사이의 감소된 소광(quenching) 또는 형광단 표지 사이의 강화된 포스터 공명 에너지 전달(FRET)과 같은 원하는 검출 특성을 생성할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 하나 이상의 결합 파트너에 대한 친화성 시약의 친화성을 조정하기 위해 간격 및 배향을 조정할 수 있다.
특정 구성에서, 검출 가능한 프로브는 광학적으로 검출 가능한 입자를 사용할 수 있다. 상기 입자에는 복수의 결합 성분이 부착될 수 있는 변형 가능한 표면이 있을 수 있다. 광학적으로 검출 가능한 입자는 형광 또는 발광 나노입자(예를 들어, FluoSphere™ 또는 퀀텀닷)를 포함할 수 있다. 변형 가능한 표면 코팅은 하이드로겔 또는 중합체를 포함할 수 있다. 이러한 구성에서, 광학적으로 검출 가능한 입자는 검출 가능한 프로브에 대한 결합 성분의 부착을 위한 고정 성분 및 프로브 검출을 위한 표지 성분 모두로서 작용할 수 있다. 일부 구성에서, 광학적으로 검출 가능한 입자의 표면 코팅은 결합 성분을 검출 가능한 프로브에 부착하기 위한 고정 성분으로서 작용할 수 있다.
추가 구성에서, 검출 가능한 프로브의 복합체를 형성하기 위해 2개 이상의 검출 가능한 프로브를 조합할 수 있다. 2개의 친화성 시약 사이 또는 친화성 시약과 검출 가능한 프로브 사이에 유사한 복합체가 만들어질 수 있다. 프로브 및/또는 시약의 복합체는 유사한 친화성(예를 들어, 1가 프로브 또는 시약) 또는 상이한 친화성(예를 들어, 다가 프로브)의 결합 성분을 보유할 수 있다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 경쟁자 친화성 시약과 조합되거나 그에 커플링된다. 경쟁자 친화성 시약은 자유 분자로서 구성되거나 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 부착된 결합 성분으로서 구성될 수 있다. 경쟁자 친화성 시약은 일부 경우에 관심 결합 파트너에 대한 친화성 또는 특이성이 감소하여 비경쟁자 친화성 시약보다 더 높은 수준의 다중기능성(promiscuity)을 초래한다. 경쟁자 친화성 시약의 존재는 특정 결합 파트너에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성을 강화시킬 수 있다.
본 개시내용은 결합 파트너에 대한 강화된 결합활성과 강화된 관찰 가능성을 지닌 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포함하는 조성물을 사용하여 분석물을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 폴리펩티드 검출에 사용하기 위한 방법이 본원에 예시된다. 분석 화학 검정, 생화학 검정, 분자 진단 검정, 분자 법의학 검정, 품질 관리 검정 등에 의해 표적이 되는 것과 같은 임의의 다양한 분석물이 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
이종 폴리펩티드 샘플의 특성화 및 정량화는 종종 단백질 및/또는 펩티드가 광범위하게 다양한 양으로 공존함으로써 방해를 받는다. 예를 들어, 낮은 카피 수 단백질로부터의 신호는 정량적 특성화 검정에서 높은 카피 수 단백질로부터의 신호에 의해 묻힐 수 있다. 단백질체(proteomic) 수준(예를 들어, 수만 가지의 고유한 단백질 종)에서 수행되는 폴리펩티드 특성화 검정의 정확도는 고감도 분석 기술과 고신뢰성 예측 기술의 조합을 통해 이익을 얻을 수 있다.
생물학적 분석은 생물학적 시스템의 분자 작동을 검사하는 데 이용 가능한 도구의 발전으로 인해 큰 이익을 얻을 수 있다. 유전체학 기술, 단일 세포 분석 플랫폼 및 고감도 화학 분석 시스템의 발전은 생물학적 시스템이 어떻게 기능하는지에 대한 연구자와 임상의의 관점을 크게 향상시킬 수 있으며, 결국 질환 및 기타 인간 건강 상태에 대한 이해, 치료 및 예방을 향상시킬 수 있다.
이러한 진보된 도구 중 다수는 상이한 생물학적 분자와 결합하거나 다르게는 회합할 수 있는 검출 가능한 시약의 사용으로부터 이익을 얻으며, 상기 결합은 주어진 시스템에서 이러한 분자의 존재 및/또는 정량화의 확인을 가능하게 하며, 그 존재 및/또는 수량은 상기 시스템의 기능에 대한 이해를 제공한다. 예로서, 이러한 도구 중 다수는 단백질, 핵산 등과 같은 생물학적 시스템으로부터의 상이한 분자 종을 고정된 기재 또는 비드와 같은 지지체 구조 상에 고정하기 위해 제공된다. 이어서 친화성 시약이라고도 하는, 상이한 분자 종에 대해 결합 친화성 수준을 갖는 분자는 2개를 함께 접촉함으로써 결합된 분자를 조사하여 친화성 시약이 결합하는지 여부, 결합 위치 및/또는 얼마나 오래 결합하는지를 나타내는 데 사용할 수 있으며, 이는 생물학적 샘플에서 특정 분자의 잠재적 존재를 나타낸다.
결합의 검출은 전형적으로 친화성 시약의 표지 성분의 검출을 통해 달성될 수 있다. 표지 성분은 친화성 시약의 고유한 부분일 수 있지만, 많은 경우에 표지 성분은 친화성 시약에 부착된 외인성 화학적 또는 구조적 모이어티일 수 있다. 표지 성분을 갖는 친화성 시약은 검출 가능한 프로브로서 기능할 수 있다.
예를 들어, 형광 염료 표지, 효소(예를 들어, 유색 시약 또는 생성물과의 반응을 촉매하는 효소), 전기화학 표지, 예컨대 고도로 하전된 표지 그룹, 또는 심지어 후속 처리를 통해 검출되는 그룹, 예컨대, 핵산 증폭 처리(nucleic acid amplification process), 시퀀싱 처리(sequencing process) 또는 혼성화 검정을 통해 후속적으로 확인될 수 있는 핵산 바코드 표지와 같은 광학적으로 검출 가능한 표지를 포함하는 다양한 외인성 검출 가능한 표지가 이러한 목적에 일반적으로 유용할 수 있다. 형광 표지는 친화성 시약과 단백질 또는 펩티드와 같은 다른 분자 사이의 결합 상호작용을 시각화하는 데 유용하다.
친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브가 사용되는 적용에 따라, 상이한 정도의 신호 강도가 바람직하거나 심지어 필요할 수 있다. 예로서, 많은 적용에서 결합 신호의 증폭은 많은 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브의 결합을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 단일 검출 가능한 모이어티의 다중 분자가 단일 위치에 응집되도록 샘플이 분리될 수 있으며, 따라서 더 쉽게 관찰 또는 검출된다. 대안적으로 또는 추가로, 2차 결합 시스템은 별도의 표지 성분이 후속적으로 결합 및 검출될 수 있는 다수의 추가 결합 부위를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
그러나 일부 경우에 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브의 단일 분자가 샘플의 단일 분자에 결합하는 것을 정량적 방식으로 시각화하는 것이 유용할 수 있다. 알 수 있는 바와 같이, 개별 분자의 검출은 검출 측면에서 많은 어려움을 제시한다. 그러한 과제 중 하나는 원시 신호 강도 면에서 및 시스템의 배경 노이즈 강도와 관련된 신호 강도 면에서 이용 가능한 분석 시스템에 의해 검출될 수 있는 충분한 신호 강도(예를 들어, 신호 강도 및 지속 시간)를 갖는 단일 분자에 대한 시약 또는 프로브의 단일 분자의 결합으로부터 검출 가능한 신호를 제시하는 능력이다.
신호 강도 문제는 단독으로 또는 조합하여 여러 접근 방식을 통해 해결할 수 있다. 예를 들어, 고감도 현미경 기술을 사용하면 강도가 작고/거나 지속 시간이 짧은 단일 분자 신호를 포함하여 매우 낮은 수준의 신호를 검출하는 능력을 강화시킬 수 있다. 추가로, 신호 강도는 단일 분자와 관련된 신호를 크게 증가시키기 위해 다중 표지 성분(예를 들어, 친화성 시약 분자 또는 검출 가능한 프로브 분자와 같은 단일 분자에 대한 다중 표지 성분)의 통합을 통해 증가할 수 있고, 이에 따라검출 가능성을 개선시킨다. 다시, 예를 들어, 형광 표지의 경우, 단일 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브에 여러 형광 부분을 부착하여 신호 강도를 증가시킬 수 있다. 그러나 단순히 형광 염료 표지가 있는 프로브 또는 시약을 로딩하면 자체적으로 문제가 발생할 수 있다. 프로브 또는 시약 상의 하나의 형광 부분이 프로브 또는 시약 상의 다른 형광 부분을 소멸시키지 않고 프로브 또는 시약 상의 형광 부분의 수를 제어할 수 있고 이러한 표지 그룹을 프로브 또는 시약에 부착하는 화학 작용이 프로브 자체의 결합 친화성을 방해하지 않도록 프로브 또는 시약을 구성하는 데 주의를 기울일 수 있다.
특히 유용한 친화성 시약 및 검출 가능한 프로브는 특정 단백질, 대사산물, 세포 또는 세포 계면에 결합할 수 있다. 이러한 친화성 시약 및 검출 가능한 프로브의 예는 천연 발생 아미노산으로 구성된 단백질 기반 프로브, 소분자 프로브, 천연 발생 염기로 구성된 핵산 기반 프로브, 및 비천연 뉴클레오티드 및 아미노산으로 구성된 프로브를 포함할 수 있다. 상기 시약은 주어진 에피토프 또는 다른 표적에만 배타적으로 결합하도록 구성될 수 있다.
결합의 배타성은 종종 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브에서 바람직한 특성으로 간주된다. 친화성 시약 또는 프로브가 다른 표적에 대한 결합을 최소화하면서 단 하나의 표적 종에만 결합하도록 상당한 노력을 기울인다. 예를 들어, 표적 종은 특정 아미노산 서열일 수 있다. 그 서열이 생물학적 샘플에서 발견되는 단백질에 대해 고유하면, 그 서열에 특이적인 시약 또는 프로브는 샘플 환경에서 단백질에 대해 특이적일 것이다. 이와 같이 시약 또는 프로브를 사용하여 샘플의 단백질을 확인하거나 심지어 정량화할 수 있다. 본원에 추가로 상세히 제시된 바와 같이, 샘플에서 하나 이상의 상이한 단백질에 결합하는 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브를 갖는 것이 유용할 수 있는 특정 사용 사례가 있다. 예를 들어, 유용한 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 2개 이상의 상이한 단백질에 공통인 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 프로브 또는 시약은 2개 이상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있으며, 상기 에피토프는 상이한 단백질 또는 동일한 단백질의 상이한 영역에 존재한다. 본원에 제시된 조성물 및 방법에서 유용한 효과를 내기 위해 샘플에서 다수의 표적에 결합하는 친화성 프로브 및 검출 가능한 프로브가 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어는 달리 명시되지 않는 한 관련 기술에서 통상적인 의미인 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 여러 용어와 그 의미는 아래에 제시되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "친화성 시약"은 특이적으로, 재현 가능하게 또는 높은 확률로 결합 파트너에 결합할 수 있는 분자 또는 기타 물질을 지칭한다. 특이적 결합은 10-4 M, 10-6 M, 10-8 M, 10-10 M, 10-12 M, 10-14 M 미만인 해리 상수(KD)와 같은 결합 상수의 관점에서 특성화될 수 있다. 높은 확률은 적어도 0.25, 0.5, 0.51, 0.75, 0.9, 0.99 이상의 확률(0에서 1의 범위)로 특성화될 수 있다. 친화성 시약은 선택적으로 이의 결합 파트너보다 크거나 작거나 같은 크기일 수 있다. 친화성 시약은 결합 파트너와 가역적 또는 비가역적 상호작용을 형성할 수 있다. 친화성 시약은 공유 또는 비공유 방식으로 결합 파트너와 결합할 수 있다. 친화성 시약은 전형적으로 비촉매적이고 화학적으로 비반응성이어서 본원에 제시된 방법에서 결합하는 결합 파트너의 화학 구조를 영구적으로 변경하지 않는다. 대안적으로, 친화성 시약은 이것이 결합하는 결합 파트너에서 검출 가능한 변화를 생성하는 화학 변형(예를 들어, 결찰, 절단, 연결 등)을 촉매하거나 이에 참여하도록 구성될 수 있다. 선택적으로, 반응 생성물은 상호작용의 검출을 가능하게 할 수 있다. 친화성 시약은 반응성 친화성 시약(예를 들어, 키나제, 리가제(ligase), 프로테아제, 뉴클레아제 등) 또는 비반응성 친화성 시약(예를 들어, 항체, 항체 단편, 압타머, DARPin, 펩타머(peptamer) 등)을 포함할 수 있다. 친화성 시약은 결합 파트너와의 결합을 매개하거나 용이하게 하는 하나 이상의 알려진 및/또는 특성화된 결합 성분 또는 결합 부위(예를 들어, 상보성 한정 영역)를 포함할 수 있다. 따라서, 친화성 시약은 1가(예를 들어, 단일 결합 성분만 가짐), 2가(예를 들어, 2개의 결합 성분만 가짐), 3가(예를 들어, 3개의 결합 성분만 가짐), 4가(예를 들어, 4개의 결합 성분만 가짐) 또는 다가(예를 들어, 2개 이상의 결합 성분이 있음)일 수 있다. 예시적인 친화성 시약은 본원에 참조로 포함된 미국 가출원 제63/112,607호에 제시된 검출 가능한 프로브 및 프로브를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자 또는 이의 기능적 단편을 지칭한다. 항체는 결합 파트너 내의 하나 이상의 에피토프에 대한 특이성을 가질 수 있다. 항체는 천연 발생하거나 조작되거나 진화될 수 있다. 항체는 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일 사슬 항체(scFv), 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 디아바디, 및 특이적 에피토프 결합을 폴리펩티드에 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 목적을 위해 선형 항체도 포함된다. 예시적인 항체는 IgM, IgA, IgG, IgD 및 IgE와 같은 면역글로불린 아이소타입을 포함한다. 예시적인 항체 단편은 F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fab 단편, Fv 단편, scFV 단편, rIgG 단편 및 Fc 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "대략"은 형상과 관련하여 사용될 때 형상의 2개 이상의 척도를 기준으로 이상적인 형상의 20% 이내인 형상을 의미할 수 있다. 예를 들어, 도 2a - 2b는 각각 점선으로 도시된 정사각형(220) 또는 원(225)의 이상적인 경계와 함께 대략 정사각형 및 대략 원형인 2차원 몸체(210 및 215)를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "대략적인"은 길이, 면적 또는 부피와 관련하여 사용될 때 주어진 측정치의 10% 이내인 길이, 면적 또는 부피를 의미할 수 있다. 예를 들어, 10밀리미터(mm)의 길이는 9mm와 11mm 사이의 임의의 길이를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "어레이"는 분석물이 서로 구별될 수 있도록 하는 고유 식별자와 회합된 분석물(예를 들어, 단백질)의 집단을 지칭한다. 고유 식별자는 분석물과 회합되고 어레이의 다른 식별자와 구별되는 고체 지지체(예를 들어, 입자 또는 비드), 구조화 핵산 입자, 고정 성분, 고체 지지체의 위치(예를 들어, 공간 어드레스), 태그, 표지(예를 들어, 발광단) 또는 바코드(예를 들어, 핵산 바코드)일 수 있다. 분석물은, 예를 들어, 공유 또는 비공유(예를 들어, 이온 결합, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 정전기 등) 결합을 통해 부착에 의해 고유 식별자와 회합될 수 있다. 어레이는 상이한 고유 식별자에 각각 부착된 상이한 분석물을 포함할 수 있다. 어레이는 동일하거나 유사한 분석물에 부착된 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 어레이는 각각 상이한 분석물을 보유하는 개별 고체 지지체 또는 개별 어드레스를 포함할 수 있으며, 상기 상이한 분석물은 고체 지지체 또는 어드레스의 위치에 따라 확인될 수 있다. 어레이에 포함될 수 있는 분석물 또는 다른 분자는, 예를 들어, SNAP와 같은 핵산, 폴리펩티드, 효소, 친화성 시약, 결합 파트너, 리간드 또는 수용체일 수 있다.
본원에서 사용되는 "부착된"이라는 용어는 두 가지가 서로 결합, 고정, 접착, 연결 또는 결합된 상태를 지칭한다. 예를 들어, 결합 성분은 공유 또는 비공유 결합에 의해 고정 성분에 부착될 수 있다. 공유 결합은 원자 사이에 전자쌍을 공유하는 것이 특징이다. 비공유 결합은 전자 쌍의 공유를 수반하지 않는 화학 결합이며, 예를 들어, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 친수성 상호작용 및 소수성 상호작용을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합 친화성" 또는 "친화성"은 친화성 시약과 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 사이의 결합 강도 또는 정도를 지칭한다. 일부 경우에, 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 친화성 시약의 결합 친화성은 매우 작거나 사실상 0일 수 있다. 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 친화성 시약의 친화성 시약의 결합 친화성은 "고친화성", "중간 친화성" 또는 "저친화성"으로 정성화될 수 있다. 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 친화성 시약의 결합 친화성은 상호작용의 평형 해리 상수((KD)가 약 100nM 미만인 경우 "고친화성", 상호작용의 해리 상수가 약 100nM 내지 1mM인 경우 "중간 친화성", 상호작용의 해리 상수가 약 1mM 초과인 경우 "저친화성"로 정량화될 수 있다. 결합 친화성은 평형 해리 상수, 평형 회합 상수(equilibrium association constant, KA), 회합 속도 상수(association rate constant, kon), 해리 속도 상수(dissociation rate constant, koff) 등과 같은 생화학 분야에 공지된 용어로 기술될 수 있다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 Segel,　Enzyme Kinetics　John Wiley and Sons, New York (1975) 참고.
본원에서 사용되는 용어 "결합 성분"은 친화성 시약의 모이어티를 지칭하며, 상기 모이어티는 특이적으로, 재현 가능하게 또는 높은 확률로 결합 파트너에 결합할 수 있다. 예시적인 결합 성분은 항체 또는 이의 기능적 단편(예를 들어, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 디-scFv, 트리-scFv, 미세항체(microantibody), 인트라바디(intrabody), 아피바디(affibody), 아필린(affilin), 아피머(affimer), 아피틴(affitin), 알파바디(alphabody), 안티칼린(anticalin), 아비머(avimer), DARPin, 쿠니츠 도메인 펩티드(Kunitz domain peptide), 모노바디(monobody), 나노클램프(nanoCLAMP), 미니-펩티드 결합제 등), 렉틴(lectin) 또는 이의 기능적 단편, 아비딘(avidin), 스트렙트아비딘(streptavidin), 압타머, 핵산 단일 가닥 또는 이중 가닥, 또는 본원에 제시되거나 당업계에 공지된 다른 친화성 시약을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 결합 성분의 예는 본원에 참조로 포함된 미국 가출원 제63/112,607호에 제시된 바와 같은 프로브를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "결합 컨텍스트(binding context)"는 친화성 시약-결합 파트너 상호작용이 관찰되는 환경 조건을 지칭한다. 환경 조건은 온도, 유체 특성(예를 들어, 이온 강도, pH), 상대 농도, 절대 농도, 유체 조성, 결합 파트너 형태, 친화성 시약 형태 및 이들의 조합과 같은, 친화성 시약과 결합 파트너 사이의 상호작용에 영향을 미칠 수 있는 모든 요인을 포함할 수 있다. 환경 조건은 에피토프 외부에 있지만 에피토프와 결합 시약의 상호작용에 영향을 미치는, 결합 파트너의 구조적 특징을 포함할 수 있다. 상기 구조적 특징은, 예를 들어, 폴리펩티드의 1차, 2차, 3차 또는 4차 구조에서 에피토프에 근접한 폴리펩티드의 아미노산 또는 영역을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합 파트너"는 친화성 시약 또는 결합 성분에 의해 인식되는 분자 또는 다른 물질을 지칭한다. 친화성 시약은 샘플의 다른 분자 또는 물질에 비해 특정 결합 파트너를 특이적으로 또는 재현 가능하게 인식할 수 있다. 대안적으로, 친화성 시약은, 예를 들어, 상이한 폴리펩티드의 더 큰 세트 중에서 상이한 폴리펩티드 서열의 서브세트에 다중기능적으로 결합하는 것과 같이 샘플 내의 복수의 상이한 결합 파트너를 인식할 수 있다. 결합 파트너는 이러한 상호작용이 발생하는지 여부에 관계없이 친화성 시약과 상호작용을 형성할 수 있다. 결합 파트너는 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 결합 파트너는 나노입자 또는 마이크로입자와 같은 강성 구조를 가질 수 있다. 결합 파트너는 용융 또는 동적 구조(예를 들어, 구형 단백질, 구형 중합체)를 가질 수 있다. 결합 파트너는 용액상 또는 고상일 수 있다. 예를 들어, 결합 파트너는 친화성 시약을 함유하는 용액 내에서 자유로울 수 있거나 친화성 시약이 접근할 수 있는 표면 또는 계면에 국한될 수 있다. 결합 파트너는 구조화 핵산 입자(예를 들어, 핵산 오리가미) 또는 고정 성분에 부착될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합 확률"은 친화성 시약이, 예를 들어, 고정된 결합 컨텍스트 내에서 결합 파트너 및/또는 에피토프와 상호작용하는 것으로 관찰될 수 있는 확률을 지칭한다. 결합 확률은 이산 숫자(예를 들어, 0.4 또는 40%), 이산 숫자의 행렬 또는 수학적 모델(예를 들어, 이론적 또는 경험적 모델)로서 표현될 수 있다. 결합 확률은 결합 특이성, 표적 에피토프의 위치를 찾을 가능성, 또는 결합 상호작용이 검출되기에 충분한 시간 동안 결합할 가능성을 포함하는 하나 이상의 인자를 포함할 수 있다. 전체 결합 확률은 결합 컨텍스트에 대해 모든 인자가 가중되었을 때의 결합 확률을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합 특이성"은 다른 결합 파트너 또는 에피토프에 비해 결합 파트너 또는 에피토프와 우선적으로 상호작용하는 친화성 시약의 경향을 지칭한다. 친화성 시약은 임의의 가능한 결합 파트너 또는 에피토프에 대해 계산된, 관찰된, 알려진 또는 예측된 결합 특이성을 가질 수 있다. 결합 특이성은 샘플 내 전체, 일부 또는 적어도 하나의 다른 분석물에 대한 단일 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 선택성을 지칭할 수 있다. 또한, 결합 특이성은 샘플 내 적어도 하나의 다른 분석물에 비해 샘플 내 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티의 서브세트에 대한 선택성을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생물직교 반응"은 생물학적 시스템의 일부 또는 모든 천연 생물학적 과정, 기능 또는 활성을 방해하지 않고 생물학적 시스템 내에서(시험관 내 및/또는 생체 내) 발생할 수 있는 화학 반응을 지칭한다. 생물직교 반응은 생물직교 반응에 의해 표적화되는 것 이외의 생물학적 시스템의 성분에 대해 불활성인 것으로 추가로 특성화될 수 있다. 생물직교 반응은 클릭 반응을 포함할 수 있다. 생물직교 또는 클릭 반응은 스타우딩거 결찰(Staudinger ligation), 무구리 클릭 반응(copper-free click reaction), 니트론 쌍극자 첨가 환화(nitrone dipole cycloaddition), 노르보르넨 첨가 환화(norbornene cycloaddition), 옥사노보르나디엔 첨가 환화(oxanobornadiene cycloaddition), 테트라진 결찰(tetrazine ligation), [4+1] 첨가 환화, 테트라졸 광클릭 반응(tetrazole photoclick reaction) 또는 쿼드리사이클란 결찰(quadricyclane ligation)을 포함할 수 있다. 생물직교 반응은 소르타제(sortase), 리가제 또는 서브틸리가제(subtiligase)와 같은 효소에 의한 제1 분자와 제2 분자 사이의 부착과 같은 효소적 접근을 이용할 수 있다. 생물직교 반응은 SpyCatcher/SpyTag, SnoopCatcher/SnoopTag 또는 SdyCatcher/SdyTag와 같은 비가역적 펩티드 포획 시스템을 활용할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "클릭 반응"은 생체 적합성 시약을 이용하는 단일 단계의 열역학적으로 유리한 접합 반응을 지칭한다. 독성 또는 생물학적으로 양립할 수 없는 시약(예를 들어, 산, 염기, 중금속)을 사용하지 않도록, 또는 독성 또는 생물학적으로 양립할 수 없는 부산물을 생성하지 않도록 클릭 반응을 구성할 수 있다. 클릭 반응은 수성 용매 또는 버퍼(예를 들어, 포스페이트 버퍼, Tris 버퍼, 식염수 버퍼, MOPS 등)를 사용할 수 있다. 예를 들어, 반응의 깁스(Gibbs) 자유 에너지가 약 -5 킬로줄/몰(kJ/mol) 미만, -10kJ/mol 미만, -25kJ/mol 미만, -50kJ/mol 미만, -100kJ/mol 미만, -200kJ/mol 미만, -300kJ/mol 미만, -400kJ/mol 미만 또는 -500kJ/mol 미만인 것과 같이 반응의 깁스 자유 에너지가 음인 경우 클릭 반응은 열역학적으로 유리할 수 있다. 예시적인 생물직교 및 클릭 반응은 본원에 참조로 포함된 WO2019/195633A1에 자세히 기술되어 있다.
"포함하는"이라는 용어는 인용된 요소뿐만 아니라 임의의 추가 요소를 더 포함하는 제한이 없는(open-ended) 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 "각각"이라는 용어는 항목 모음과 관련하여 사용될 때 모음의 개별 항목을 확인하기 위한 것이지만 반드시 모음의 모든 항목을 지칭하는 것은 아니다. 명시적 공개 또는 문맥에 달리 지시되어 있는 경우 예외가 있을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 친화성 시약에 의해 인식되거나 특이적으로 결합하는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 에피토프는 폴리펩티드의 1차 구조에서 순차적으로 인접한 아미노산 서열, 또는 폴리펩티드의 2차, 3차 또는 4차 구조에서 구조적으로 인접한 아미노산을 포함할 수 있다. 에피토프는 선택적으로 항체에 의해 인식되거나 항체에 결합될 수 있다. 그러나 에피토프는 임의의 항체에 의해 반드시 인식될 필요는 없으며, 예를 들어, 압타머, 미니단백질 또는 다른 친화성 작용제에 의해 대신 인식된다. 에피토프는 선택적으로 항체에 결합하여 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러나, 에피토프는 반드시 면역 반응에 참여할 필요도 없고 면역 반응을 유도할 수도 없다. 용어 "친화성 표적"은 본원에서 용어 "에피토프"와 동의어로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "외인성"은 분자의 모이어티와 관련하여 사용될 때 분자의 천연 유사체에 존재하지 않는 부분을 의미한다. 예를 들어, 아미노산의 외인성 표지는 천연 발생 아미노산에 존재하지 않는 표지이다. 유사하게, 항체에 존재하는 외인성 표지는 항체의 고유 환경에서 발견되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "작용성 그룹"은 분자에 반응성, 극성, 소수성, 친수성, 용해도, 결합 친화성 등과 같은 화학 특성을 부여하는 분자 내 모이어티 또는 원자단을 지칭한다. 작용성 그룹은 유기 모이어티를 포함할 수 있거나 무기 원자를 포함할 수 있다. 예시적인 작용성 그룹은 생물직교 반응물, 클릭 반응물, 알킬, 알케닐, 알키닐, 페닐, 할라이드, 하이드록실, 카보닐, 알데히드, 아실 할라이드, 에스테르, 카복실레이트, 카복실, 카보알콕시, 메톡시, 하이드로퍼옥시, 에테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 아세탈, 케탈, 오르토에스테르, 에폭사이드, 카복실산 무수물, 카복스아미드, 아민, 케티민, 알디민, 이미드, 아지드, 아조, 시아네이트, 이소시아네이트, 니트레이트, 니트릴, 이소니트릴, 니트로속시(nitrosoxy), 니트로, 니트로소, 옥심, 피리딜, 카바메이트, 설프하이드릴, 설파이드, 디설파이드, 설피닐, 설포닐, 설피놈(sulfinom), 설포, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 카보노티오일, 티오에스테르, 티오노에스테르, 포스피노, 포스포노, 포스포네이트, 포스페이트, 보로노(borono), 보로네이트(boronate) 및 보리네이트(borinate) 작용성 그룹을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "표지"는 검출 가능한 특징을 제공하는 분자 또는 이의 모이어티를 지칭한다. 검출 가능한 특징은, 예를 들어, 방사선의 흡광도, 발광 방출, 발광 수명, 발광 편광, 형광 방출, 형광 수명, 형광 편광 등과 같은 광학 신호; 레일리 산란(Rayleigh scattering) 및/또는 미 산란(Mie scattering); 리간드 또는 수용체에 대한 결합 친화성; 자기 특성; 전기적 특성; 전하; 질량; 방사능 등일 수 있다. 예시적인 표지는 제한 없이 형광단, 발광단, 발색단, 나노입자(예를 들어, 금, 은, 탄소 나노튜브), 중원자(heavy atom), 방사성 동위원소, 질량 표지, 전하 표지, 스핀 표지, 수용체, 리간드 등을 포함한다. 표지는 실시간으로 검출되는 신호(예를 들어, 형광, 발광, 방사능)를 생성할 수 있다. 표지 성분은 오프라인(예를 들어, 핵산 바코드) 또는 시간 분해(time-resolved) 방식(예를 들어, 시간 분해 형광)으로 검출되는 신호를 생성할 수 있다. 표지 성분은 특징적인 주파수, 강도, 극성, 지속 시간, 파장, 서열 또는 핑거프린트(fingerprint)가 있는 신호를 생성할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "표지 성분"은 친화성 시약 또는 검출 가능한 특징을 제공하는 다른 물질의 모이어티를 지칭한다. 검출 가능한 특징은, 예를 들어, 표지와 관련하여 본원에 제시된 임의의 것일 수 있다. 표지 성분은 다른 분자나 물질에 부착될 수 있거나 부착 능력이 있다. 표지 성분에 부착될 수 있는 예시적인 분자는 친화성 시약 또는 결합 파트너를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산 나노볼"은 구형 또는 구체의 핵산 구조를 지칭한다. 핵산 나노볼은 구형 구조로 배열된 서열 영역의 쇄상체(concatemer)를 포함할 수 있다. 핵산 나노볼은 DNA, RNA, PNA, 변형된 또는 비천연 핵산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산 오리가미"는 핵산(들)의 천연 발생 나선형 구조에 더하여 조작된 3차 또는 4차 구조를 포함하는 핵산 작제물을 지칭한다. 핵산 오리가미는 DNA, RNA, PNA, 변형 또는 비천연 핵산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 핵산 오리가미는 오리가미 입자의 조작된 구조화를 생성하기 위해 서열 상보성을 통해 혼성화하는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산 오리가미는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산의 섹션 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예시적인 핵산 오리가미 구조는 나노튜브, 나노와이어, 케이지, 타일, 나노구, 블록 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 핵산 오리가미는 선택적으로 다수의 더 작은 핵산이 혼성화하는 상대적으로 긴 스캐폴드 핵산을 포함할 수 있으며, 이에 따라 스캐폴드에서 조작된 구조를 생성하는 폴드(fold) 및 벤드(bend)를 생성한다. 스캐폴드 핵산은 원형 또는 선형일 수 있다. 스캐폴드 핵산은 단일 가닥일 수 있지만 더 작은 핵산에 혼성화될 수 있다. 더 작은 핵산(때때로 "스테이플"이라고도 함)은 스캐폴드의 두 영역에 혼성화할 수 있으며, 스캐폴드의 상기 두 영역은 더 작은 핵산에 혼성화하지 않는 개재 영역에 의해 분리된다.
본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 분자를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA, PNA, 변형된 뉴클레오티드, 비천연 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 약 200개 미만, 190개 미만, 180개 미만, 170개 미만, 160개 미만, 150개 미만, 140개 미만, 130개 미만, 120개 미만, 110개 미만, 100개 미만, 90개 미만, 80개 미만, 70개 미만, 60개 미만, 50개 미만, 40개 미만, 30개 미만, 25개 미만, 20개 미만, 15개 미만, 10개 미만 또는 5개 미만의 뉴클레오티드와 같은 제한된 수의 뉴클레오티드 서브유닛을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "오프셋"은 분자 구조와 관련하여 사용될 때 2개의 라인(2차원) 또는 2개의 평면(3차원) 사이의 배향의 공간적 차이를 지칭한다. 평면은 오리가미 타일의 면과 같은 분자 구조의 표면과 유사할 수 있다. 오프셋은 거리 오프셋 및/또는 각도 오프셋을 포함할 수 있다. 도 1a 및 1b는 상이한 2차원 형상(이는 3차원 구조의 2차원 투영일 수 있음)에 대한 각도 오프셋의 예를 도시한다. 도 1a의 이등변삼각형(100)은 제1 면(110)과 제2 면(120) 사이에 120°의 각도 오프셋을 가지며, 상대 배향은 직교 벡터 A 및 A'로 표시된다. 도 1b의 직사각형(130)은 제1 면(110)과 제2 면(120) 사이에 180°의 각도 오프셋을 가지며, 상대 배향은 직교 벡터 A 및 A'로 표시된다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리펩티드는 단백질, 올리고펩티드 또는 펩티드로도 지칭될 수 있다. 용어 "단백질", "폴리펩티드", "올리고펩티드" 및 "펩티드"는 아미노산 서열 조성 또는 길이, 분자량, 분자 기원 등과 같은 특징이 상이한 분자를 지칭하기 위해 선택적으로 사용될 수 있지만, 상기 용어는 본질적으로 모든 맥락에서 그러한 구별을 포함하도록 의도되지 않는다. 폴리펩티드는 천연 발생 분자 또는 합성 분자일 수 있다. 폴리펩티드는 하나 이상의 비천연 아미노산, 변형된 아미노산 또는 비아미노산 링커를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 D-아미노산 거울상이성질체, L-아미노산 거울상이성질체 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산은 자연적으로 또는 합성적으로, 예컨대 번역 후 변형에 의해 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "다중기능성"은 친화성 시약과 관련하여 사용될 때 2개 이상의 상이한 결합 파트너에 결합하거나 결합 능력이 있는 결합제를 지칭한다. 예를 들어, 다중기능성 결합제는 1) 상이한 결합 파트너의 구조 내의 공통 에피토프의 존재로 인해 복수의 상이한 결합 파트너에 결합할 수 있거나; 2) 다수의 상이한 에피토프에 결합하거나; 3) 두 특성의 조합을 갖는다. 다중기능성 결합제는 에피토프 또는 표적 모이어티의 결합 컨텍스트에 관계없이 특정 에피토프 또는 표적 모이어티의 존재로 인해 복수의 결합 파트너에 결합할 수 있다. 결합 컨텍스트는, 예를 들어, 에피토프 또는 표적 모이어티를 둘러싸는 국소 화학 환경, 예컨대 인접(flanking), 인접한(adjacent) 또는 인근(neighboring) 화학 엔티티(예를 들어, 폴리펩티드 에피토프의 경우, 상기 에피토프에 대한 인접 아미노산 서열, 또는 인접한 또는 인근 비연속적 아미노산 서열)를 포함할 수 있다. 다중기능성 친화성 시약에 의해 결합된 복수의 상이한 에피토프는 구조적으로 또는 화학적으로 관련된 에피토프를 포함할 수 있는데 그럼에도 아미노산 함량이 상이하다. 예를 들어, 친화성 시약은 WXK 형태의 삼량체 펩티드 서열에 대한 결합 친화성을 보유하는 경우 다중기능성인 것으로 간주될 수 있고, X는 임의의 가능한 아미노산이다. 결합 다중기능성에 관한 추가 개념은 본원에 참조로 포함된 WO 2020/106889A1에서 논의된다.
본원에서 사용되는 용어 "고정 성분"은 적어도 2개의 다른 성분을 연결하는 친화성 시약, 검출 가능한 로브(robe) 또는 다른 물질의 모이어티를 지칭한다. 고정 성분은 서로 특정 거리 내에서 2개의 다른 성분을 유지할 수 있다. 예를 들어, 2개의 다른 성분은 최대 1000nm, 500nm, 100nm, 50nm, 10nm, 5nm, 1nm 이하의 거리로 유지될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 고정 성분은 서로 최소 거리로 2개의 다른 모이어티를 분리할 수 있다. 예를 들어, 2개의 다른 성분은 적어도 1nm, 5nm, 10nm, 50nm, 100nm, 500nm, 1000nm 이상의 거리로 유지될 수 있다. 고정 성분은, 예를 들어, 구조화 핵산 입자, 핵산 나노볼, 핵산 오리가미, 단백질 핵산, 폴리펩티드, 합성 중합체, 다당류, 유기 입자, 무기 입자, 겔, 하이드로겔, 코팅된 입자 등을 포함할 수 있다. 고정 성분은 선택적으로 중합체 구조를 가질 수 있다. 대안적으로, 고정 성분은 중합체 구조를 가질 필요는 없다. 일부 실시양태에서, 고정 성분은 이것이 부착되는 다른 성분과 조성이 유사하다. 예를 들어, 폴리펩티드 물질로 구성된 복수의 결합 성분이 폴리펩티드 고정 성분에 부착될 수 있다. 대안적으로, 고정 성분은 이것이 부착되는 다른 성분과 조성이 실질적으로 상이할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 물질로 구성된 복수의 결합 성분은 부분적으로 또는 전체적으로 폴리펩티드 이외의 물질, 예컨대 핵산 물질, 또는 유기 또는 무기 나노입자(예를 들어, 탄소 나노구, 이산화규소 나노구 등)로 구성된 고정 성분에 부착될 수 있다. 고정 성분은 표지 성분 또는 결합 성분과 같은 다른 성분을 고정 성분에 부착할 수 있도록 하는 하나 이상의 부착 부위를 포함할 수 있다. 부착 부위는 작용성 그룹, 활성 부위, 결합 리간드, 결합 수용체, 핵산 서열, 또는 결합 성분, 표지 성분 또는 다른 검출 가능한 프로브 성분에 공유 또는 비공유 부착을 형성할 수 있는 임의의 다른 엔티티를 포함할 수 있다. 고정 성분은 유기 또는 무기 입자, 또는 나노입자를 포함할 수 있다. 스캐폴드는, 예를 들어, 중합체 코팅된 FluoSphere™ 또는 중합체 코팅된 퀀텀닷에서 발생하는 것과 같이 다른 성분의 부착을 가능하게 하는 코팅 또는 표면층을 포함할 수 있다. 고정 성분의 예는 본원에 참조로 포함된 미국 가출원 제63/112,607호에 제시된 바와 같은 스캐폴드를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "부위"는 어레이와 관련하여 사용될 때 특정 분자 또는 분석물, 예컨대 폴리펩티드, 핵산, 구조화 핵산 또는 작용성 그룹에 의해 점유되거나 점유되도록 구성된 어레이 내 위치를 의미한다. 부위는 단일 분자만 함유할 수 있거나 동일한 종의 여러 분자의 집단(즉, 분자의 앙상블)을 함유할 수 있다. 대안적으로, 부위는 상이한 종인 분자의 집단을 포함할 수 있다. 어레이의 부위는 전형적으로 불연속적이다. 불연속 부위는 근접할 수 있고 서로 간에 간극 틈(interstitial space)이 있을 수도 있다. 본원에서 유용한 어레이는, 예를 들어, 100미크론 미만, 10미크론 미만, 1미크론 미만 또는 0.5미크론 미만, 0.1미크론 미만, 0.01미크론 미만으로 분리된 부위를 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 어레이는 적어도 0.01미크론, 0.1미크론, 0.5미크론, 1미크론, 10미크론, 100미크론 이상 분리된 부위를 가질 수 있다. 부위는 면적이 각각 1 제곱 밀리미터 미만, 500 제곱 미크론 미만, 100 제곱 미크론 미만, 25 제곱 미크론 미만, 1 제곱 미크론 미만일 수 있다. 어레이는 적어도 약 1×104개, 1×105개, 1×106개, 1×107개, 1×108개, 1×109개, 1×1010개, 1×1011개, 1×1012개 이상의 부위를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "고체 지지체"는 수성 액체에 불용성인 강성 기재를 지칭한다. 기재는 비다공성 또는 다공성일 수 있다. 기재는 선택적으로 (예를 들어, 다공성으로 인해) 액체를 흡수할 수 있지만 전형적으로 액체를 흡수할 때 기재가 실질적으로 부풀지 않고 액체가 건조에 의해 제거될 때 실질적으로 수축하지 않을 만큼 충분히 강성일 것이다. 비다공성 고체 지지체는 일반적으로 액체 또는 기체에 대해 불투과성이다. 예시적인 고체 지지체는 유리 및 개질되거나 작용화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, Teflon™, 환형 올레핀, 폴리이미드 등을 포함함), 나일론, 세라믹, 수지, Zeonor™, 실리콘 및 변성 실리콘을 포함하는 실리카 또는 실리카 기반 물질, 탄소, 금속, 무기 유리, 광섬유 번들 및 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "종(species)"은 동일한 화학 구조를 공유하는 분자 또는 모이어티를 확인하는 데 사용된다. 예를 들어, 아미노산 서열이 동일한 개별 에피토프 모이어티는 동일한 종의 에피토프인 반면, 서열이 상이한 에피토프 모이어티는 상이한 종의 에피토프이다. 동일한 유전자로부터 발현된 단백질은 동일한 종의 유전자 생성물이며, 동일한 유전자로부터 발현되고 동일한 번역 후 변형을 갖는 단백질은 동일한 프로테오형(proteoform) 또는 이소형(isoform)이다. 두 단백질은 동일한 유전자로부터 발현될 수 있지만 다른 단백질 변형을 가질 수 있으며, 이 경우 두 단백질은 동일한 종의 유전자 생성물이지만 상이한 프로테오형 또는 이소형이다.
본원에서 사용되는 용어 "구조화 핵산 입자"(또는 "SNAP")는 압축된 3차원 구조를 갖는 단일 사슬 또는 다중 사슬 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 압축된 3차원 구조는 SNAP와 서열 길이가 동일한 핵산에 대한 랜덤 코일 또는 다른 비구조화 상태와 관련하여 SNAP의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius) 또는 스토크 반경(Stoke's radius)의 측면에서 선택적으로 특성화될 수 있다. 압축된 3차원 구조는 선택적으로 3차 구조와 관련하여 특성화될 수 있다. 예를 들어, SNAP는 랜덤 코일 또는 다른 비구조화 상태에서 동일한 핵산 분자와 비교하여 폴리뉴클레오티드 가닥의 영역 사이에서 증가된 수의 내부 결합 상호작용, 영역 사이의 거리 감소, 가닥에서 증가된 수의 벤드 및/또는 가닥에서 더 극심한 벤드를 갖도록 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 압축된 3차원 구조는 선택적으로 4차 구조와 관련하여 특성화될 수 있다. 예를 들어, SNAP는 랜덤 코일 또는 다른 비구조화 상태의 동일한 핵산 분자와 비교하여 폴리뉴클레오티드 가닥 사이의 증가된 수의 상호작용 또는 가닥 사이의 거리 감소를 갖도록 구성될 수 있다. 일부 구성에서, SNAP의 2차 구조(즉, 폴리뉴클레오티드 가닥의 나선 꼬임 또는 배향)는 랜덤 코일 또는 다른 비구조화 상태에서 동일한 핵산 분자보다 더 조밀하도록 구성될 수 있다. SNAP는 SNAP에 추가 분자의 부착이 가능하도록 선택적으로 변형될 수 있다. SNAP은 DNA, RNA, PNA, 변형된 또는 비천연 핵산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. SNAP는 혼성화하여 SNAP 구조를 형성하는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. SNAP 내 복수의 올리고뉴클레오티드는 다른 분자(예를 들어, 친화성 시약, 결합 파트너, 작용성 그룹 또는 검출 가능한 표지)에 부착되거나 (예를 들어, 작용성 그룹에 의해) 다른 분자에 부착되도록 구성된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. SNAP는 핵산 오리가미와 같이 조작되거나 합리적으로 설계된 구조를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "실질적으로 동일한"이란 용어는 2개 이상의 구조와 관련하여 사용될 때 구조가 동일한 결과를 얻기 위해 실질적으로 동일한 방식으로 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 수행 능력이 있음을 지칭한다. 예를 들어, 실질적으로 동일한 2개의 구조화 핵산 입자는 동일한 1차 구조를 가질 수 있다. 선택적으로, 이들은 3차 또는 4차 구조가 상이하지 않는 한 1차 구조가 상이할 수 있다. 선택적으로, 이들은 본원에 기재된 방법에서 동일한 결과를 얻기 위해 실질적으로 동일한 방식으로 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 한, 1차, 2차, 3차 또는 4차 구조 중 하나 이상이 상이할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "표적 모이어티"는 결합 상호작용을 매개하거나 촉진하는 에피토프 내 특정 화학 구조를 지칭한다. 표적 모이어티는 작용성 그룹, 측쇄, 활성 부위, 또는 특성화할 수 있는 구조를 지닌 다른 화학 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 모이어티는 폴리펩티드 에피토프의 일부를 형성하는 하나 이상의 아미노산 또는 이의 측쇄(들)일 수 있다. 표적 모이어티는 결합 파트너에 대한 친화성 시약의 결합을 유발하는 상호작용을 용이하게 하거나 매개하기 위해 친화성 시약의 결합 위치와 특이적으로 상호작용할 수 있다.
본원에서 사용되는 "조정 가능한"이란 용어는 고정 성분, 스캐폴드 또는 분자의 구조에서 성분 또는 부착 부위의 특이적인, 정확한 및/또는 합리적인 위치의 조정 가능성을 지칭한다. 조정 가능한 고정 성분은 고정 성분 구조의 특정 부위 또는 특정 영역 내에서 다른 성분을 부착하거나, 고정 성분 구조의 특정 부위 또는 특정 영역에서 다른 성분을 부착하기 위한 부착 부위를 생성하는 능력을 지칭할 수 있다. 본원에서 사용되는 "조정 가능성"은 조정 가능한 구조 또는 아키텍처를 갖는 프로브 또는 고정 성분의 특성을 지칭한다.
작업 실시예 또는 달리 지시된 경우를 제외하고, 본원에 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은 백분율과 관련하여 사용될 때 언급되는 값의 ±5%를 의미할 수 있다. 예를 들어, 약 90%는 85% 내지 95%를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "2차원 투영"은 실질적인 기하학적 또는 공간적 왜곡 없이 평면 2차원 표면 상에 3차원 구조의 투영에 의해 점유될 영역 또는 형상을 지칭한다. 예를 들어, 평면 2차원 표면 상의 구의 2차원 투영은 구의 지름과 동일한 지름을 지닌 원형 영역을 표면에 생성한다. 2차원 투영은 3차원 구조의 임의의 표면에 직교하는 기준 프레임을 포함하여 임의의 기준 프레임으로부터 형성될 수 있다.
검출 가능한 프로브 및 친화성 시약의 구조 및 기능
결합 파트너에 대한 증가된 결합 결합활성, 증가된 관찰 가능성 또는 둘 다를 지닌 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 본원에 기술된다. 검출 가능한 프로브에 대해 본원에 예시된 구조적 및 기능적 특성은 다른 친화성 시약에 존재할 수 있다. 역으로, 친화성 시약에 대해 본원에 예시된 구조적 및 기능적 특성은 검출 가능한 프로브에 존재할 수 있다. 따라서, 검출 가능한 프로브와 관련하여 본원에 제시된 조성물, 구조 및 방법은 다른 친화성 시약에 적용될 수 있고 그 반대도 가능하다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 집합적으로 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 구조 내에 함유된 복수의 결합 성분 중 임의의 개별 결합 성분과 비교하여 결합 파트너에 대한 프로브의 전체 결합 친화성을 증가시키는 복수의 결합 성분을 포함할 수 있다. 당업계에 공지되거나 본원에 제시된 임의의 다양한 친화성 시약은 본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 부착될 때 결합 성분으로서 기능할 수 있다. 본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 검출 가능한 프로브(또는 친화성 시약)와 결합 파트너 사이의 결합 상호작용의 관찰을 가능하게 하는 하나 이상의 표지 성분을 추가로 포함할 수 있다. 당업계에 공지되거나 본원에 제시된 임의의 다양한 검출 가능한 표지는 본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 부착될 때 표지 성분으로서 기능할 수 있다.
본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 (a) 고정 성분; (b) 표지 성분, 및 (c) 고정 성분에 부착된 1개, 2개 또는 이보다 많은 결합 성분을 포함할 수 있다. 특히 흥미로운 것은 부착된 다른 성분의 정확한, 사전 결정된 및/또는 합리적인 표시를 제공하기 위해 공간 및/또는 배향이 조정 가능한 고정 성분이다. 예를 들어, 결합 성분은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합 결합활성 및/또는 관찰 가능성을 증가시키는 구성으로 부착될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 적어도 하나의 결합 성분 및/또는 적어도 하나의 표지 성분을 부착하기에 충분한 위치를 제공하는 고정 성분을 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 고정 성분은 복수의 작용성 그룹, 반응성 부위, 핵산 또는 고정 성분에 대한 다른 분자의 부착을 가능하게 하는 작용성 그룹을 포함하는 천연, 인공 또는 합성 입자일 수 있다. 고정 성분은 무정형, 구형 또는 불규칙한 구조를 지닐 수 있다(예를 들어, DNA 나노볼, FluoSphere™ 또는 퀀텀닷과 같은 형광 나노입자). 고정 성분은 규칙적 또는 대칭 구조를 지닐 수 있다(예를 들어, 탄소 나노구, 탄소 나노튜브, 금속 나노튜브, 세라믹 나노입자). 고정 성분은 입자 또는 나노입자와 같은 주형 입자에 의해 형성되는 쉘 또는 스캐폴드를 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 주형 입자는 FluoSphere™ 또는 퀀텀닷과 같은 표지 성분을 포함할 수 있다. 고정 성분은 중합체, 금속, 반도체, 세라믹, 유리 및 생체분자(예를 들어, DNA 또는 RNA와 같은 핵산, 단백질, 다당류)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 물질을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 고정 성분은 부분적으로 또는 실질적으로 완전한 이중 가닥 핵산을 포함할 수 있다. 이중 가닥 핵산은 표지 성분 사이의 더 나은 간격을 제공하기 위해 고정 성분에 추가의 구조적 강성을 부여할 수 있다. 이러한 경우, 표지 성분은 이중 가닥 핵산의 한 가닥 또는 두 가닥 모두에 결합될 수 있다. 고정 성분은 구조화 입자 또는 합리적으로 설계된 입자를 포함할 수 있다. 고정 성분은 하나 이상의 결합 성분 및/또는 하나 이상의 표지 성분을 부착하도록 구성된 구조화 핵산 입자(SNAP)를 포함할 수 있다. 일부 구성에서, SNAP는 DNA 오리가미 입자 또는 DNA 나노볼을 포함할 수 있다.
고정 성분은 다른 성분(예를 들어, 결합 성분, 표지 성분 또는 다른 고정 성분)을 부착하기 위한 복수의 부위를 포함할 수 있다. 고정 성분은 결합 성분 및/또는 표지 성분을 커플링하기 위한 고유 또는 전용 위치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 고정 성분은 결합 성분에 커플링된 핵산에 상보적인 제1 서열을 갖는 핵산을 포함할 수 있고, 표지 성분에 커플링되는 핵산에 상보적인 제2 서열을 갖는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 제1 서열은 제2 서열과 상이할 수 있어서 상이한 유형의 성분이 커플링 부위의 서브세트에 적절하게 향하게 된다. 대안적으로, 제1 서열과 제2 서열은 동일할 수 있다. 선택적으로, 고정 성분은 결합 성분에 커플링된 작용성 그룹과 공유 결합을 형성하도록 구성된 하나 이상의 제1 작용성 그룹을 포함할 수 있고, 표지 성분에 커플링된 작용성 그룹과 공유 결합을 형성하도록 구성된 하나 이상의 제2 작용성 그룹을 추가로 포함할 수 있다. 제1 작용성 그룹(들)은 제2 작용성 그룹(들)과 상이할 수 있어서 상이한 유형의 성분이 커플링 부위의 서브세트로 적절하게 향하게 된다. 예를 들어, 복수의 제1 작용성 그룹은 복수의 제2 작용성 그룹이 참여하는 결합 형성 반응에 직교하는 결합 형성 반응에 참여할 수 있다. 대안적으로, 제1 작용성 그룹과 제2 작용성 그룹은 동일할 수 있다. 일부 구성에서, 고정 성분은 핵산 및 작용성 그룹과 같은 부착 부위 유형의 혼합물을 포함할 수 있으며, 각 유형의 부착 부위는 상이한 유형의 성분을 부착하도록 구성된다.
고정 성분은 고정 성분에 부착되는 하나 이상의 다른 성분(예를 들어, 결합 성분, 표지 성분 또는 다른 고정 성분)을 포함할 수 있다. 고정 성분은 공유 결합(예를 들어, 클릭 반응을 통해), 배위 결합(예를 들어, 실리콘 나노입자에 대한 실란 링커) 또는 비공유 결합(예를 들어, 핵산 혼성화)에 의해 다른 구성요소에 부착될 수 있다. 고정 성분은 고정 성분 상의 작용성 그룹과 다른 성분 상의 작용성 그룹 사이에 공유 결합을 형성하는 화학 반응에 의해 다른 성분에 부착될 수 있다. 상기 반응은 친핵성 치환, 친전자성 치환 및 제거 반응을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 일어날 수 있다. 일부 구성에서, 고정 성분과 다른 성분 사이의 공유 결합은 생물직교 또는 클릭 반응에 의해 형성될 수 있다. 고정 성분 및/또는 다른 성분은 생물직교 또는 클릭 반응에 참여하도록 구성된 작용성 그룹을 포함하도록 변형될 수 있다. 고정 성분을 하나 이상의 다른 성분에 부착하는데 사용될 수 있는 예시적인 작용성 그룹 및 결합은, 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 제조와 관련하여 본원에서 더 상세히 기술된다.
일부 구성에서, 고정 성분은 SNAP와 같은 핵산 구조를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 핵산 구조는 고정 성분에 다른 성분(예를 들어, 결합 성분, 표지 성분 또는 다른 고정 성분)을 부착하기 위한 표적화된 부위 특이적 혼성화 부위를 제공하는 단일 가닥 핵산의 영역을 포함할 수 있다. 이러한 구성에서, 상보성 올리고뉴클레오티드에 부착된 다른 성분은 고정 성분 상의 표적화된 부위에 부착을 형성하기 위해 고정 성분 상의 단일 가닥 서열에 어닐링될 수 있다. 다른 구성에서, 작용성 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 고정 성분에 어닐링됨으로써 올리고뉴클레오티드 상의 작용성 그룹과 다른 성분 상의 작용성 그룹 사이의 화학 반응(예를 들어, 클릭 반응)을 통해 또 다른 성분의 후속 부착을 가능하게 할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 복수의 결합 성분에 부착된 고정 성분을 포함할 수 있다. 고정 성분에 부착된 복수의 결합 성분은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성을 증가시키기 위해 선택될 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 종과 관련하여 동종(예를 들어, 항체만, 압타머만, 나노바디만, 미니-펩티드 결합제만, DARPin만 등)인 복수의 결합 성분을 포함할 수 있다. 다른 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 종과 관련하여 이종(예를 들어, 항체, 나노바디, 미니 단백질 결합제, DARPin 및/또는 압타머의 혼합물)인 복수의 결합 성분을 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 특정 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대해 본질적으로 동일한 결합 특이성을 지닌 복수의 결합 성분을 포함할 수 있다. 다른 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 특정 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 결합 특이성이 혼합된 복수의 결합 성분을 포함할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 부착된 결합 성분의 양 및/또는 다양성은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성을 증가시키기 위해 선택될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 서로 상이한지(예를 들어, 결합 성분의 이종 혼합물) 또는 동일한지(예를 들어, 결합 성분의 동종 세트)에 관계없이 총 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 서로 상이한지 또는 동일한지에 관계없이 총 약 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 이하일 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 성분의 이종 혼합물을 선택된 비율로 포함할 수 있으며, 이종성은 결합 성분 종 및/또는 결합 특이성을 기반으로 한다. 예를 들어, 특정 에피토프에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 몰 기준으로 약 3:1의 비율로 높은 특이성 결합 성분 및 중간 특이성 결합 성분을 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 제1 결합 성분 및 상이한 제2 결합 성분을 적어도 약 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 25:1, 50:1, 100:1, 250:1, 500:1, 1000:1, 2500:1, 5000:1, 10000:1, 25000:1, 50000:1, 100000:1, 250000:1, 500000:1, 1000000:1 이상의 비율로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 제1 결합 성분 및 상이한 제2 결합 성분을 약 1000000:1, 500000:1, 250000:1, 100000:1, 50000:1, 25000:1, 10000:1, 5000:1, 2500:1, 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 50:1, 25:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1.5:1 이하의 비율로 포함할 수 있다.
본 개시내용의 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대해 특성화된 결합 확률을 가질 수 있다. 예를 들어, 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분은 특정 폴리펩티드 에피토프에 결합하는 것으로 알려져 있을 수 있고 높은 결합 확률을 나타내는 것으로 알려져 있을 수 있다(예를 들어, 매 관찰 100회 중 1회는 결합 증거를 보여주지 못함). 또 다른 예에서, 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분은 낮지만 0이 아닌 결합 확률(예를 들어, 주어진 관찰에 대해 결합 확률이 0.00001%)로 특정 에피토프에 결합하는 것으로 특성화될 수 있다. 확률적 특성화는 결합 확률에 관한 두 가지 측면을 포함할 수 있다 1) 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 결합의 구조 의존적 가능성; 및 2) 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 결합의 환경 의존적 가능성.
결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분의 결합 확률은 비폴리펩티드 또는 이종 시스템(예를 들어, 토양, 미정제 세포 용해물, 체액)을 포함하도록 폴리펩티드를 넘어 확장될 수 있다. 예를 들어, 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분은 복합물의 성분(예를 들어, 중합체 매트릭스에 포매된 금속 나노입자)에 대해 특성화된 결합 확률을 가질 수 있거나 다당류 내의 구조적 서브유닛(예를 들어, 글리코실화, 헤미셀룰로오스, 셀룰로오스, 리그닌, 펙틴 등)에 우선적으로 결합할 수 있다. 당업자는 비폴리펩티드 또는 이종 시스템을 위한 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분이 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분이 낮은 결합 친화성을 갖는, 비폴리펩티드 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 결합할 0이 아닌 확률을 보유하는 유사한 특성을 나타낼 수 있음을 본 개시내용으로부터 인식할 것이다.
친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분의 결합 친화성 또는 결합 다중기능성은 폴리펩티드 1차, 2차, 3차 또는 4차 구조(즉, 아미노산 서열)가 결합에 미치는 영향과 관련될 수 있다. 예를 들어, 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분은 특정 폴리펩티드 에피토프 서열(예를 들어, 아미노산 삼량체, 사량체, 오량체 등)에 대한 선호도가 증가하거나 감소하는 결합을 특징으로 할 수 있다. 에피토프에 결합하는 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분의 구조 의존적 가능성은 서열 컨텍스트(예를 들어, 펩티드 에피토프의 아미노 말단 및/또는 카보닐 말단 옆에 있는 아미노산; 폴리펩티드의 2차 또는 3차 구조에서 펩티드 에피토프에 근접한 아미노산 잔기, 펩티드 에피토프 내부 또는 주변의 번역 후 변형의 존재 또는 부재 등)의 영향을 받을 수 있다. 본 개시내용의 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분은 아미노산 에피토프 패밀리(예를 들어, AXA, 여기서 A는 알라닌을 나타내고 X는 20개의 천연 발생 아미노산 중 임의의 것을 나타냄)에 대해 실질적인 친화성 또는 다중기능성을 가질 수 있다. 결합의 구조 의존적 가능성은 경험적 결합 모델 또는 결합 확률의 데이터베이스와 같이 폴리펩티드 특성화에 사용되는 각각의 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분에 대해 계산될 수 있다. 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분은 적어도 약 0.000001%, 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, 99.9999%, 99.99999%, 99.999999% 이상의 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 결합할 서열 특이적 가능성을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분은 약 99.999999%, 99.99999%, 99.9999%, 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99.5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001%, 0.00001%, 0.000001% 이하의 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 결합할 서열 특이적 가능성을 가질 수 있다.
폴리펩티드의 에피토프에 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분을 결합시키는 환경 의존적 가능성은 에피토프 및/또는 폴리펩티드의 구조 이외의 변수가 결합에 미치는 영향과 관련될 수 있다. 예를 들어, 특정 에피토프에 대한 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분의 결합은 용매 화학 조성(예를 들어, 용매 동일성, 용매 극성, 용매의 이온 강도, 버퍼 농도, pH, 계면활성제 또는 변성제의 존재, 등)을 기반으로 달라질 수 있다. 다른 비폴리펩티드 변수는 결합 시간; 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분의 농도; 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티의 농도; 열, 전기장, 자기장 및 유체 속도장(fluid velocity field)과 같은 외부에 적용된 장의 존재를 포함할 수 있다. 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분은 적어도 약 0.000001%, 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, 99.9999%, 99.99999%, 99.999999% 이상의 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 환경 의존적 결합 가능성을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분은 약 99.999999%, 99.99999%, 99.9999%, 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99.5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001%, 0.00001%, 0.000001% 이하의 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 환경 의존적 결합 가능성을 가질 수 있다.
일부 구성에서, 구조 의존적 결합 가능성 및 환경 의존적 결합 가능성은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 결합하는 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분의 전반적인 가능성 또는 확률을 결정하기 위해 조합될 수 있다. 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분에 대한 확률적 결합 프로필을 생성하기 위해 일부 또는 모든 알려진 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대해 전체 가능성 또는 확률을 편집할 수 있다. 일부 구성에서, 친화성 작용제, 프로브 또는 결합 성분은 전체 결합 확률이 적어도 약 20%인 N 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 세트 및 전체 결합 확률이 0.1% 이하인 M 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 세트에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, N ≥ 1, M ≥ 1 및 M ≥ 10N이다. 친화성 시약, 프로브 또는 성분은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티로의 결합의 전체 가능성 또는 확률이 적어도 약 0.000001%, 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, 99.9999%, 99.99999%, 99.999999% 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 친화성 시약, 프로브 또는 결합 성분은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티로의 결합의 전체 가능성 또는 확률이 약 99.999999%, 99.99999%, 99.9999%, 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99.5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001%, 0.00001%, 0.000001% 이하일 수 있다.
고정 성분은 고정 성분과 관련된 하나 이상의 표지 성분을 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 하나 이상의 표지 성분은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 고정 성분에 부착될 수 있다. 일부 구성에서, 하나 이상의 표지 성분은 검출 가능한 프로브(예를 들어, 핵산 인터칼레이션 염료) 또는 친화성 시약과 비공유 결합될 수 있다. 일부 구성에서, 고정 성분은 표지 성분을 둘러싸거나 둘러쌀 수 있다(예를 들어, FluoSphere™ 또는 퀀텀닷의 중합체 코팅). 표지 성분은 공유 결합(예를 들어, 클릭 반응을 통해), 배위 결합(예를 들어, 실리콘 나노입자에 대한 실란 링커) 또는 비공유 결합(예를 들어, 핵산 혼성화)에 의해 고정 성분에 부착될 수 있다. 표지 성분은 고정 성분 상의 작용성 그룹과 표지 성분 상의 작용성 그룹 사이에 공유 결합을 형성하는 화학 반응에 의해 고정 성분에 부착될 수 있다. 상기 반응은 본원에 제시되거나 당업계에 공지된 것을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 일어날 수 있다.
고정 성분은 다른 성분(예를 들어, 결합 성분, 표지 성분 또는 다른 고정 성분)에 대한 하나 이상의 부착 부위를 제공하는 입자(예를 들어, 미세입자 또는 나노입자)를 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 입자는 작용화되거나 작용화될 수 있거나 다른 성분에 대한 부착 부위를 제공하도록 변형될 수 있는 표면을 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 입자는 성분에 대한 부착 부위를 함유하거나 함유하도록 변형될 수 있는 코팅(예를 들어, 중합체 또는 하이드로겔 코팅) 또는 쉘을 위한 주형을 제공할 수 있다. 일부 구성에서, 고정 성분은 표지 성분(예를 들어, FluoSphere™ 또는 퀀텀닷)으로서 효과적으로 기능할 수 있다. 입자는 성분의 부착을 위한 부착 부위 또는 변형 가능한 부위를 제공하는 주변 또는 동심원 쉘, 층 또는 코팅을 포함할 수 있다. 쉘, 코팅 또는 층은 입자 표면에 공유 또는 비공유 연결된 중합체 또는 하이드로겔을 포함할 수 있다. 쉘, 코팅 또는 층은 공유 결합을 형성할 수 있거나 다른 분자와 공유 결합을 형성하도록 변형될 수 있는 복수의 작용성 그룹을 포함할 수 있다. 쉘, 코팅 또는 층은 부착 부위를 제공하거나 다르게는 표면을 변형시키는 추가 그룹으로 변형될 수 있다(예를 들어, 표면의 페길화(PEGylation)에 의한 입체 장애 제공).
임의의 다양한 검출 가능한 모이어티가 본원에 기술된 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브에 대한 표지 성분으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 표지는 전기화학 표지일 수 있으며 전기화학 검출에 의해 검출될 수 있다. 이들은 하전된 모이어티, 예를 들어, 큰 핵산, 폴리라이신 및 기타 고도로 하전된 화학 구조일 수 있으며 검출 영역은 ChemFET 유형 센서일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 경우에 검출 가능한 모이어티는 광학적으로 검출 가능한 모이어티, 즉 표지로부터 나오는 차동 광 에너지의 관찰에 기초하여 검출 가능한 모이어티일 수 있다.
검출 가능한 프로브는 하나 이상의 표지 성분에 부착된 하나 이상의 고정 성분을 포함할 수 있다. 고정 성분에 부착된 하나 이상의 표지 성분은 검출 가능한 프로브의 관찰 가능성을 증가시키기 위해 선택될 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브는 표지 종(예를 들어, 단일 유형의 형광단, 동종 핵산 바코드 등)과 관련하여 동종인 복수의 표지 성분을 포함할 수 있다. 다른 구성에서, 검출 가능한 프로브는 복수의 이종 표지 성분 종(예를 들어, 방출 파장이 상이한 형광단의 혼합물, 형광단과 핵산 바코드의 혼합물)을 포함할 수 있다. 선택적으로, 검출 가능한 프로브는 중첩 신호 또는 본원에 제시된 방법 또는 장치에서 검출될 때 구별할 수 없는 신호를 생성하는 복수의 표지 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브에 존재하는 복수의 형광단은 형광단이 서로 동일한 파장에서 여기되든 서로 상이한 파장이 형성되든 공통 파장에서 형광을 방출할 수 있다. 대안적으로, 검출 가능한 프로브는 서로 상이한 신호, 예를 들어, 본원에 제시된 방법 또는 장치에서 검출될 때 구별될 수 있거나 구별되는 신호를 생성하는 복수의 표지 성분을 함유할 수 있다.
검출 가능한 표지 또는 표지 성분은 친화성 시약(예를 들어, 검출 가능한 프로브)과 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 사이의 상호작용의 확인을 가능하게 하는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 표지 성분은 공간적으로 분해된 위치에서 검출 가능한 신호를 제공하는 것과 같이 공간 정보를 제공하도록 구성될 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 표지 성분은 선택적으로 공간적으로 분해된 위치에서 소멸 또는 감쇠 신호를 제공하는 것과 같은 시간 정보를 제공하도록 구성될 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 표지 성분은 여기 소스(excitation source)(예를 들어, 방사선, 열, 화학 기재)가 있을 때 검출 가능한 신호를 방출할 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 표지 성분은 여기 소스(예를 들어, 방사성 표지 또는 화학발광 표지)가 없을 때 검출 가능한 신호를 방출할 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 표지 성분은 핵산 또는 폴리펩티드 바코드와 같은 암호화된 신호를 포함할 수 있다.
일부 구성에서, 표지 성분은 부착된 효소, 단백질 또는 검출 가능한 화학 신호를 생성하는 일련의 효소를 포함할 수 있다. 예시적인 효소는 호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP) 또는 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase)를 포함할 수 있다. 기재 분자를 검출 가능한 분자(예를 들어, 형광 화합물)로 전환시키거나 기재 분자에 결합하여 효소 또는 단백질에서 형광 또는 발광 효과를 생성하는 효소 또는 단백질을 선택할 수 있다. 예를 들어, HRP는 ABTS, OPD, AmplexRed, DAB, AEC, TMB, 호모바닐산(homovanillic acid) 또는 루미놀(luminol)과 같은 기재 분자를 형광 또는 발광 분자로 전환할 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 기재 분자의 존재하에 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티와 상호작용하여 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 결합 상호작용의 위치에 대한 공간 신호를 제공하는 침착된 형광 또는 발광 분자를 생성할 수 있다. 대안적인 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 결합 상호작용은 기재 분자의 일련의 반응을 통해 검출 가능한 신호를 생성하는 반응 경로 또는 반응 순서에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, HRP 또는 알칼리 포스파타제와 같은 효소는 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티와 함께 공동국소화될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 기재 분자를 공동국소화된 효소에 의해 처리되거나 변경될 수 없는 기재로부터 공동국소화된 효소에 대한 기재인 생성물로 전환시키는 하나 이상의 효소를 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 기재를 검출 가능한 생성물로 전환시키는 복수의 상이한 효소 또는 효소 복합체(예를 들어, 폴리케타이드 합성효소(polyketide synthase))를 포함할 수 있다.
검출 가능한 표지 또는 표지 성분은 선택된 표지 종에 대해 적절한 신호 검출 소스에 의해 검출될 수 있다. 광학 표지 및 광학 검출기가 특히 유용하다. 본원에서 사용될 수 있는 광학 검출 장치 및 구성요소의 예는 Illumina™, Inc.(예를 들어, HiSeq™, MiSeq™, NextSeq™ 또는 NovaSeq™ 시스템), Life Technologies™(예를 들어, ABI PRISM™ 또는 SOLID™ 시스템), Pacific Biosciences(예를 들어, Sequel™ 또는 RS II™ 시스템과 같은 SMRT™ 기술을 사용하는 시스템) 또는 Qiagen(예를 들어, Genereader™ 시스템)에 의해 제공되는 것, 또는 각각 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 공보 제2010/0111768 A1호 또는 미국 특허 제7,329,860호; 제8,951,781호 또는 제9,193,996호에 기술된 것과 같이 핵산 시퀀싱을 위해 상용화된 것을 포함한다. 다른 유용한 검출기는 각각 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,888,737호; 제6,175,002호; 제5,695,934호; 제6,140,489호; 또는 제5,863,722호; 또는 미국 특허 공보 제2007/007991 A1호, 제2009/0247414 A1호 또는 제2010/0111768호; 또는 WO2007/123744를 참조할 수 있다.
본원에 제시된 방법에서 사용될 수 있는 다른 검출 기술은, 예를 들어, 질량을 감지하는 데 사용될 수 있는 질량 분석법; 표면에 대한 결합을 감지하는 데 사용할 수 있는 표면 플라즈몬 공명; 표지가 흡수하는 에너지의 파장을 감지하는 데 사용할 수 있는 흡광도; 표지의 존재로 인한 온도 변화를 감지하는 데 사용할 수 있는 열량 측정법; 표지의 전기 특성을 인식하는 데 사용될 수 있는 전기 전도도 또는 임피던스(impedance), 또는 다른 알려진 분석 기술을 포함한다. 예를 들어, 하전된 표지는 양성자 또는 피로포스페이트의 검출에 사용되는 chemFET 검출기와 같은 전자 검출기를 사용하여 검출할 수 있다(예를 들어, 각각 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 공보 제2009/0026082 A1호; 제2009/0127589 A1호; 제2010/0137143호 A1호; 또는 제2010/0282617 A1호, 또는 미국 매사추세츠주 월섬(Waltham) 소재의 ThermoFisher로부터 상업적으로 입수 가능한 Ion Torrent™ 시스템으로 상용화된 검출기 참조). 각각 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 공보 제2017/0240962 A1호, 제2018/0051316 A1호, 제2018/0112265 A1호, 제2018/0155773 A1호 또는 제2018/0305727 A1호; 또는 미국 특허 제9,164,053호, 제9,829,456호, 제10,036,064호 또는 제10,125,391호에 기술된 것 중 하나 이상과 같은 FET 검출기를 사용할 수 있다.
표지 성분은 발광 모이어티 또는 분자(예를 들어, 발광단 또는 형광단)를 포함할 수 있다. 다른 파장의 빛에 의해 여기되는 것에 반응하여 한 파장의 빛을 방출하는 발광단은 쉽게 검출 가능한 광 신호를 제공하고 여기 및 방출광 스펙트럼을 제공하여 배치 및 사용에 큰 유연성을 제공할 수 있는 주어진 능력을 고려할 때 광학적으로 검출 가능한 표지로서 특히 유용하다.
임의의 다양한 발광단이 본원에서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 발광단은 작은 분자일 수 있다. 일부 경우에, 발광단은 단백질일 수 있다. 발광단은 자외선 스펙트럼, 가시 스펙트럼 또는 적외선 스펙트럼에서 방출하는 표지를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 발광단은 FITC, Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 750, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 쿠마린(Coumarin), BODIPY FL, 퍼시픽 그린(Pacific Green), 오리건 그린(Oregon Green), Cy3, Cy5, 퍼시픽 오렌지(Pacific Orange), TRITC, 텍사스 레드(Texas Red), R-피코에리트린(R-Phycoerythrin), 알로프코시아닌(Allophcocyanin, APC)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 표지는 Atto 염료, 예를 들어, Atto 390, Atto 425, Atto 430, Atto 465, Atto 488, Atto 490, Atto 495, Atto 514, Atto 520, Atto 532, Atto 540, Atto 550, Atto 565, Atto 580, Atto 590, Atto 594, Atto 610, Atto 611, Atto 612, Atto 620, Atto 633, Atto 635, Atto 647, Atto 655, Atto 680, Atto 700, Atto 725, Atto 740, Atto MB2, Atto Oxa12, Atto Rho101, Atto Rho12, Atto Rho13, Atto Rho14, Atto Rho3B, Atto Rho6G 또는 Atto Thio12일 수 있다. 일부 경우에, 발광단은 형광 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein, BFP), 오렌지색 형광 단백질(orange fluorescent protein, OFP) 및 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광 단백질일 수 있다. 예를 들어, 광범위한 유효 발광단은 Thermo Fisher Scientific의 Molecular Probes 사업부에서 상업적으로 입수 가능하고/거나 본원에 참조로 포함된 Molecular Probes Handbook(11th Edition)에 일반적으로 기술되어 있다. 표지 성분은 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), 프로피디움 브로마이드(propidium bromide), 크리스탈 바이올렛(crystal violet), 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI), 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD), Hoescht 33258, Hoescht 33342, Hoescht 34580, YOYO-1, DiYO-1, TOTO-1, DiTO-1 또는 이들의 조합과 같은 인터칼레이션 염료를 포함할 수 있다.
특정 형광 표지 또는 다른 발광단은 원하는 용도에 따라 선택될 수 있으며, 일부 경우에는, 예를 들어, 다중 검출을 최적화하기 위해 흡수/방출 스펙트럼을 기반으로 선택될 수 있다. 마찬가지로, 일부 경우에 발광단은 상호작용하여 유리한 형광 특성을 제공하는 형광 염료 쌍을 포함할 수 있다. 예를 들어, 쌍을 이룬 염료는 포스터 공명 에너지 전달(FRET) 쌍으로 기능할 수 있으며, 이 쌍 중 한 구성원(즉, "도너")의 여기로 인해 여기되거나 다른 구성원(즉, "억셉터")으로 전달되는 에너지 전달이 발생한다. 이어서 억셉터는 도너에서만 발생한 방출로부터 시프트된 파장에서 발광을 방출한다.
일부 경우에, 광학적으로 검출 가능한 표지는 다른 유형의 검출 가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 반도체 나노입자, "퀀텀닷" 또는 FluoSphere™ 입자와 같은 발광 입자(예를 들어, 마이크로입자 또는 나노입자)가 표지 성분으로서 포함될 수 있다.
발광단은 특징적인 여기 또는 흡광 파장을 특징으로 할 수 있다. 여기 소스는 발광단의 특징적인 여기 또는 흡광 파장으로 조정된 광원을 포함할 수 있다. 발광단은 피크 파장에서 발생하는 광의 최대 흡수와 함께 파장 범위에 걸쳐 광을 흡수할 수 있다. 발광단은 피크 여기에서 또는 그 근처에서 여기될 수 있다. 본원에 제시된 방법의 특정 구성에서, 발광단은 스펙트럼의 자외선(UV), 가시광선(VIS) 또는 적외선(IR) 영역의 방사선에 의해 여기될 수 있다. VIS 영역의 여기는 스펙트럼의 적색, 오렌지색, 황색, 녹색, 청색 또는 바이올렛 영역 중 하나 이상에서 발생할 수 있다. 발광단은 특징적인 방출 파장을 특징으로 할 수 있다. 발광단은 피크 파장에서 발생하는 최대 광 방출과 함께 파장 범위에 걸쳐 광을 방출할 수 있다. 발광단은 피크 방출에서 또는 그 근처에서 검출될 수 있다. 본원에 제시된 방법의 특정 구성에서, 발광단으로부터의 방출은 스펙트럼의 자외선(UV), 가시광선(VIS) 또는 적외선(IR) 영역에서 검출될 수 있다. VIS 영역에서의 검출은 스펙트럼의 적색, 오렌지색, 황색, 녹색, 청색 또는 바이올렛 영역 중 하나 이상에서 발생할 수 있다.
검출 가능한 프로브에서 다중 표지 성분의 존재는, 예를 들어, 1) 검출 가능성을 증가시키고/거나; 2) 표지 손실 시 중복성을 제공(예를 들어, 광표백, 화학 손상, 표지 절단 등)하고/거나; 3) 검출 가능한 프로브에 의해 생성된 신호 강도를 증가시킴으로써 검출 가능한 프로브의 관찰 가능성을 증가시킬 수 있다. 검출 가능한 프로브와 회합된 표지 성분의 양은 프로브 크기, 원하는 표지 간격, 신호 강도, 측정 길이, 측정 환경 및 표지 크기를 포함한 다양한 요인에 의해 결정될 수 있다.
검출 가능한 프로브는 선택된 수의 관련 표지 성분을 가질 수 있다. 검출 가능한 프로브는 서로 상이(예를 들어, 본원에 제시된 방법 또는 장치에서 서로 구별할 수 있는 신호를 생성하는 표지의 이종 혼합물)한지 또는 동일(예를 들어, 본원에 제시된 방법 또는 장치에서 구별할 수 없는 신호를 생성하는 표지의 혼합물)한지에 관계없이 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 이상을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브는 서로 상이(예를 들어, 본원에 제시된 방법 또는 장치에서 서로 구별할 수 있는 신호를 생성하는 표지의 이종 혼합물)한지 또는 동일(예를 들어, 본원에 제시된 방법 또는 장치에서 구별할 수 없는 신호를 생성하는 표지의 혼합물)한지에 관계없이 약 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 이하를 가질 수 있다.
검출 가능한 프로브에서 표지 성분의 선택된 다양성 또는 양은 배경 신호를 초과하는 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 형광에 의해 검출되는 프로브는 자발형광(autofluorescence), 신호 누화(signal cross-talk) 및 충돌 외부 소스(impinging external source)와 같은 소스로부터 기존 배경을 초과하는 형광 신호를 생성할 수 있다. 검출 가능한 프로브는 신호 배경 강도(예를 들어, 최대, 최소 또는 평균)를 적어도 2배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배 이상 초과하는 검출 가능한 신호 강도를 생성하도록 구성된 표지 성분의 다양성 또는 양을 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 검출 가능한 프로브는 신호 배경 강도(예를 들어, 최대, 최소 또는 평균)를 약 100배, 50배, 25배, 10배, 5배, 2배 이하로 초과하는 검출 가능한 신호 강도를 생성하도록 구성된 일정량의 표지 성분을 포함할 수 있다.
검출 가능한 프로브는 하나 초과의 유형 및/또는 종의 표지 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브는 적어도 하나의 발광단 및 적어도 하나의 핵산 바코드 서열을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 검출 가능한 프로브는 2개 이상의 상이한 발광단(예를 들어, Alexa-Fluor® 488 및 Alexa-Fluor® 647)을 포함할 수 있다. 상이한 발광단은 여기 스펙트럼, 방출 스펙트럼, 발광 수명 또는 발광 극성과 같은 하나 이상의 신호 특성과 관련하여 상이할 수 있다. 일부 구성에서 상이한 발광단은 하나 이상의 신호 특성과 관련하여 유사할 수 있다. 예를 들어, 2개의 발광단은 동일한 파장에서 여기될 수 있지만 상이한 파장에서 방출한다. 이와 같이, 단일 여기 소스는 2개의 상이한 발광단을 여기시키는 데 사용될 수 있는데 그럼에도 방출 특성의 차이를 기반으로 구별된다. 검출 가능한 프로브는 고유한 신호 핑거프린트 생성, 다중 표지 검출 방법(예를 들어, FRET 또는 발광 소광) 가능 및/또는 위양성 또는 위음성 검출을 줄이기 위한 신호 중복 생성을 포함한 다양한 목적을 위해 하나 초과의 유형 및/또는 종의 표지 성분을 포함할 수 있다.
검출 가능한 프로브는 표지 유형 및/또는 종을 기반으로 표지 성분의 이종 혼합물을 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브는 서로 동일한지 또는 서로 상이한지에 관계없이 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 이상의 표지 성분을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브는 서로 동일한지 또는 서로 상이한지에 관계없이 약 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 이하의 표지 성분을 가질 수 있다.
검출 가능한 프로브는 검출 가능한 표지 종을 기반으로 표지 성분의 이종 혼합물을 선택된 비율로 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 에피토프에 대한 검출 가능한 프로브는 Alexa-Fluor® 488 및 Alexa-Fluor®-647 염료를 각각 몰 기준으로 약 3:1의 비율로 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브는 제1 표지 성분 및 상이한 제2 표지 성분을 적어도 약 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 25:1, 50:1, 100:1, 250:1, 500:1, 1000:1, 2500:1, 5000:1, 10000:1, 25000:1, 50000:1, 100000:1, 250000:1, 500000:1, 1000000:1 이상의 비율로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브는 제1 표지 성분 및 상이한 제2 표지 성분을 약 1000000:1, 500000:1, 250000:1, 100000:1, 50000:1, 25000:1, 10000:1, 5000:1, 2500:1, 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 50:1, 25:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1.5:1 이하의 비율로 포함할 수 있다.
도 49a는 검출 가능한 프로브의 개략도를 제공한다. 각각의 검출 가능한 프로브는 표지된 친화성 프로브(200)와 주형(201)의 두 부분으로 이루어진다. 도시된 바와 같이, 표지된 친화성 프로브(200)는 결합 성분(200a), 고정 성분을 제공하는 어닐링 영역(200b) 및 효소적으로 확장된 표지 성분(200c)을 포함한다. 주형(201)은 어닐링 영역(200b)에 상보적인 서열(201a), 및 (200c)의 효소적 확장을 위한 주형(201b)을 포함한다. 도 49b는 표지 성분을 형성하기 위한 압타머 프로브의 효소적 확장의 단계적 설명을 보여준다.
일부 경우에, 표지 성분은 고정 성분(예를 들어, 미국 가출원 제63/112,607호에 제시된 스캐폴드)을 포함하거나 이에 부착될 수 있다. 복수의 표지 성분은 고정 성분을 따라 무작위로 이격되어 제공될 수 있거나, 일부 경우에는 고정 성분의 길이를 따라 규칙적 또는 준규칙적 간격으로 배치될 수 있다. 다른 경우에, 단일 표지 성분은, 예를 들어, 핵산의 5' 말단에서 고정 성분에 부착될 수 있다, 도 50a 참조. 또 다른 경우에, 고정 성분의 핵산은 어닐링 영역을 포함하도록 설계될 수 있고, 어닐링 영역 끝에 단일 표지 성분(예를 들어, 형광단)을 가질 수 있다. 추가의 단일 형광단을 가진 핵산의 제2 가닥을 이 영역에 어닐링할 수 있다, 도 50b 참조.
본 개시내용의 친화성 시약은 임의의 표지 성분을 포함할 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 친화성 시약은 본원에 제시된 하나 이상의 표지 성분 또는 표지 성분의 종을 생략하도록 또는 갖지 않도록 구성될 수 있다. 또한, 하나 이상의 표지 성분을 갖는 것으로 본원에 제시된 예시적인 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 예시된 표지 성분 중 하나 이상을 생략하도록 재구성될 수 있다. 또한, 본 발명의 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 본원에 제시된 하나 이상의 결합 성분 또는 결합 성분의 종을 생략하도록 또는 갖지 않도록 구성될 수 있음을 이해할 것이다.
고정 성분은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 중심 구조 요소를 형성할 수 있다. 일부 구성에서, 고정 성분은 결합 성분, 표지 성분 또는 기타 고정 성분과 같은 다른 성분의 물리적 위치 지정에 대한 제한 또는 제어를 제공하도록 구조화될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 성분 사이의 접촉 또는 교차 반응성을 방지하기 위해 고정 성분 상의 충분히 이격된 위치에 부착된 결합 성분을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 검출 가능한 프로브는 인접한 발광단 사이의 소광을 감소시키거나 방지하기 위해 고정 성분 상의 충분히 이격된 위치에 부착된 발광단을 포함할 수 있다. 세 번째 예에서, 검출 가능한 프로브는 FRET를 용이하게 하기 위해 이격되고 배향된 고정 성분 상의 위치에 부착된 발광단을 포함할 수 있다. 고정 성분은 부착된 성분의 위치 및/또는 배치를 제어하도록 조작되거나 합리적으로 설계될 수 있다. 고정 성분의 설계에 영향을 미칠 수 있는 요소는 다음을 포함한다: 1) 인접한 성분 사이의 가능한 상호작용 특성; 2) 인접한 성분 사이의 상호작용 가능성; 3) 인접한 성분 사이의 가능한 상호작용에 대한 임계 척도(예를 들어, 거리, 부피, 시간); 4) 고정 성분의 물리적 특성(예를 들어, 형상, 형태, 크기, 강성 등); 5) 부착된 프로브 성분의 물리적 특성(형상, 형태, 크기, 유체역학적 반경 등); 6) 성분을 고정 성분에 결합시키는 선택적 링커의 성질 및 특성; 및 7) 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 결합 파트너 사이의 가능한 상호작용의 성질.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 하나 이상의 핵산을 포함하는 고정 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고정 성분을 형성하는 하나 이상의 핵산은 핵산 오리가미 구조, 핵산 나노볼 구조 또는 다른 구조화 핵산 입자의 형태를 취할 수 있다. 핵산 고정 성분은 단일 핵산 가닥 또는 복수의 올리고뉴클레오티드 가닥과 같은 복수의 핵산 가닥을 포함할 수 있다. 복수의 핵산 가닥을 포함하는 고정 성분은 복수의 가닥 사이의 혼성화에 의해 형성되어 천연 나선형 구조를 넘어 구조 복잡성이 증가된 핵산 구조를 형성할 수 있다. 핵산은 DNA, RNA, PNA 또는 이들의 조합과 같은 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 발광 변형된 뉴클레오티드와 같은 비천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산은 광분해성 링커(예를 들어, 니트로벤질, 카보닐 또는 벤질 기반 광절단 가능 링커)와 같은 구조 내에 비뉴클레오티드 잔기를 포함할 수 있다. 핵산을 포함하는 고정 성분은 특정 조건 하에서 파괴되거나 불안정해지도록 구조화될 수 있다. 고정 성분은, 예를 들어, 결합 파트너로부터 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 제거를 용이하게 하기 위해 분해되거나 불안정화될 수 있다. 핵산을 포함하는 고정 성분은 제한 효소에 의해 절단될 수 있는 복수의 제한 부위를 포함할 수 있으며, 이로써 핵산 고정 성분의 분해 또는 불안정화를 촉진할 수 있다. 핵산을 포함하는 고정 성분은 복수의 광절단 가능 결합, 화학 절단 가능 결합 또는 기타 반응성 결합을 포함할 수 있으며, 이로써 고정 성분의 분해 또는 불안정화를 촉진할 수 있다.
고정 성분은 핵산 나노볼을 포함할 수 있다. 나노볼은 그 자체로 접혀져 조밀한 구조를 형성하는 핵산의 단일 가닥을 포함할 수 있다. 선택적으로, 나노볼은 가교결합되어 나노볼을 비교적 압축 구조로 제한할 수 있다. 예시적인 가교결합은 단일 가닥의 상이한 영역에 혼성화하는 소랄렌(psoralen) 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 화학 가교결합을 포함한다. 핵산 나노볼은 원형 주형의 회전 환 증폭(rolling circle amplification)에 의해 생성되어 쇄상체 증폭 생성물을 산출할 수 있고 쇄상체 내 각 서열 단위는 원형 주형을 보완하는 서열을 갖는다. 핵산 나노볼에 통합될 수 있는 예시적인 서열 요소는 소스 또는 사용 이력과 같은 나노볼에 대한 정보를 제공하는 태그 서열, 가닥내 가교결합제로서 사용되는 올리고뉴클레오티드를 보완하는 서열, 작용성 그룹에 부착된 올리고뉴클레오티드를 보완하는 서열, 또는 결합 성분 또는 표지 성분과 같은 성분 등을 포함한다. 예시적인 핵산 나노볼 및 이들의 제조 및 사용 방법은 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제8,445,194호에 제시되어 있다.
핵산 나노볼은 회전 환 증폭(RCA) 또는 쇄상체 반복 단위의 결찰과 같은 방법에 의해 형성될 수 있다. 핵산 나노볼은 특정 수의 쇄상체 반복 단위를 포함할 수 있다. 핵산 나노볼은 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 이상의 쇄상체 단위를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 핵산 나노볼은 약 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 이하의 쇄상체 단위를 포함할 수 있다. 핵산 나노볼의 쇄상체 단위는 뉴클레오티드 서열 길이가 적어도 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200개 이상의 뉴클레오티드 일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 핵산 나노볼의 쇄상체 단위는 뉴클레오티드 서열 길이가 약 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20개 이하의 뉴클레오티드일 수 있다.
고정 성분은 핵산 오리가미를 포함할 수 있다. 따라서, 고정 성분은 구, 케이지, 세관(tubule), 상자, 타일, 블록, 나무, 피라미드, 바퀴, 이들의 조합 및 임의의 다른 가능한 구조와 같은 3차 또는 4차 구조를 갖는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. DNA 오리가미로 형성된 이러한 구조의 예는 본원에 참조로 포함된 Zhao 등. Nano Lett. 11, 2997-3002 (2011)에 제시되어 있다. 일부 구성에서, 핵산 오리가미는 스캐폴드 및 복수의 스테이플을 포함할 수 있으며, 상기 스캐폴드는 단일 연속 핵산 가닥이고, 상기 스테이플은 전체적으로 또는 부분적으로 스캐폴드 핵산과 혼성화하도록 구성된 올리고뉴클레오티드이다. 연속 스캐폴드 가닥 및 여러 스테이플 가닥을 사용하여 형성된 핵산 오리가미 구조의 예는 각각 본원에 참조로 포함된 Rothemund Nature 440:297-302(2006) 또는 미국 특허 제8,501,923호 또는 제9,340,416호에 제시되어 있다. (예를 들어, 오리가미 또는 나노볼 구조에서 발견되는) 하나 이상의 핵산을 포함하는 고정 성분은 단일 가닥 핵산 영역, 이중 가닥 핵산 영역 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 오리가미는 닫힌 핵산 가닥을 갖는 스캐폴드, 및 상기 스캐폴드에 혼성화된 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 핵산 스캐폴드는 상보성 올리고뉴클레오티드 없이 원형 또는 연결된 가닥(즉, 5' 또는 3' 말단 없음)인 핵산의 연속 가닥을 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 핵산 스캐폴드는 바이러스 게놈 또는 박테리아 플라스미드와 같은 천연 공급원으로부터 유래된다. 다른 구성에서, 핵산 스캐폴드는 조작되거나 합리적으로 설계되거나 합성될 수 있다. 스캐폴드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 조립 전, 도중 또는 후에 추가 성분(예를 들어, 결합 성분, 표지 성분 또는 다른 고정 성분)을 부착하기 위한 작용성 그룹 또는 부착 부위를 제공할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 연결 그룹 또는 작용성 그룹(예를 들어, 클릭 반응을 수행하도록 구성된 작용성 그룹)을 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 핵산 스캐폴드는 M13 바이러스 게놈의 단일 가닥을 포함할 수 있다. 핵산 스캐폴드의 크기는 고정 성분의 원하는 크기에 따라 달라질 수 있다. 핵산 스캐폴드는 적어도 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 핵산 스캐폴드는 최대 약 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
핵산 오리가미와 같은 고정 성분은 복수의 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 스테이플)를 포함할 수 있다. 스테이플은 핵산 스캐폴드, 다른 스테이플 또는 이들의 조합과 혼성화하도록 구성된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 스테이플은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 스테이플은 결합 성분, 표지 성분, 화학 반응성 그룹(예를 들어, 작용성 그룹 또는 핸들) 또는 기타 그룹(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티)과 같은 추가의 화학 엔티티를 포함하도록 변형될 수 있다. 스테이플은 선형 또는 원형 핵산을 포함할 수 있다. 스테이플은 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 스테이플은 상보성 염기쌍 혼성화 또는 결찰에 의해 다른 핵산과 결합하도록 구성될 수 있다. 스테이플은 상보성 핵산 가닥에 대한 프라이머 역할을 하도록 구성될 수 있으며 프라이밍 스테이플은 효소(예를 들어, 주형 지정 폴리머라제와 같은 폴리머라제 또는 말단 전이효소와 같은 비주형 지정 폴리머라제)에 의해 확장되어 이중 가닥 핵산의 확장된 영역을 형성할 수 있다.
스테이플은 고정 성분의 설계에 따라 임의의 길이일 수 있다. 스테이플은 CADNANO, ATHENA 또는 DAEDALUS와 같은 소프트웨어 패키지로 설계될 수 있다. 스테이플은 길이가 적어도 약 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 스테이플은 길이가 약 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 25, 10개 이하의 뉴클레오티드일 수 있다.
스테이플은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 결합 성분 또는 표지 성분과 같은 추가 성분을 부착하기 위한 부착 부위를 제공할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 조립 전, 도중 또는 후에 추가 성분에 대한 부착 부위로서 활용될 수 있다. 스테이플은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 스테이플은 약 100, 75, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
스테이플은 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 핵산 오리가미의 원하는 안정성을 달성하도록 설계되거나 변형될 수 있다. 안정성은 조립된 오리가미에서 개별 올리고뉴클레오티드의 해리에 의해 영향을 받을 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 손실은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대한 기능의 손실(예를 들어, 성분 부착 부위의 손실, 결합 성분의 손실, 표지 성분의 손실 등) 또는 2차 또는 3차 구조의 불안정화를 포함한 다양한 불안정화 효과를 가질 수 있으며, 이로써 다른 올리고뉴클레오티드의 추가 불안정화를 촉진한다. 핵산 고정 성분의 스캐폴드 또는 스테이플은 핵산 고정 성분의 안정성을 촉진하는 공유 또는 비공유 결합을 형성하도록 구성된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 다른 올리고뉴클레오티드 또는 스캐폴드 가닥에서 변형된 뉴클레오티드와 공유 결합 또는 가교결합을 형성하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 올리고뉴클레오티드는 해리 가능성을 감소시키기 위해 혼성화 길이 또는 용융 온도가 최소이도록 설계될 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 올리고뉴클레오티드는 다른 올리고뉴클레오티드 또는 특정한 수의 염기쌍을 형성하는 스캐폴드 가닥과 혼성화할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 연속 또는 전체 염기쌍의 혼성화 영역을 형성할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 올리고뉴클레오티드는 약 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5개 이하의 연속 또는 전체 염기쌍의 혼성화 영역을 형성할 수 있다.
검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 핵산 오리가미의 올리고뉴클레오티드는 특성화된 용융 온도를 가질 수 있다. 상기 용융 온도는 뉴클레오티드 염기쌍 결합 상호작용이 중단되어 올리고뉴클레오티드가 해리되는 온도를 지칭할 수 있다. 핵산 고정 성분의 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃ 이상의 특성화된 용융 온도를 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 핵산 고정 성분의 올리고뉴클레오티드는 약 90℃, 89℃, 88℃, 87℃, 86℃, 85℃, 84℃, 83℃, 82℃, 81℃, 80℃, 79℃, 78℃, 77℃, 76℃, 75℃, 74℃, 73℃, 72℃, 71℃, 70℃, 69℃, 68℃, 67℃, 66℃, 65℃, 64℃, 63℃, 62℃, 61℃, 60℃, 59℃, 58℃, 57℃, 56℃, 55℃, 54℃, 53℃, 52℃, 51℃, 50℃ 이하의 특성화된 용융 온도를 가질 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 고정 성분 상의 특정 위치에 복수의 결합 성분을 배치하도록 구성된 고정 성분을 포함할 수 있다. 상대적 위치는 인접한 결합 성분 사이의 긍정적 또는 부정적 상호작용 가능성에 의해 부분적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 일부 인접한 결합 성분(예를 들어, 압타머, 펩타머)은 특정 종의 결합 성분과 근접하게 될 때 잘못 폴딩되거나 구조적 변화가 발생하기 쉽다. 이러한 결합 성분은 그러한 부정적 상호작용의 가능성을 최소화하기에 충분한 분리로 이익을 얻을 수 있다. 다른 예에서, 몇몇 결합 성분은 다수의 결합 성분이 근접하게 될 때 결합활성의 증가를 경험할 수 있다. 일부 구성에서, 고정 성분의 특정 위치에 결합 성분을 위치시키는 것은 긍정적인 결합활성 효과와 부정적인 친화성 시약 사이의 상호작용 간의 균형을 최적화함으로써 결정될 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 상의 결합 성분의 위치는 고정 성분의 구조 특성에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 결정될 수 있다. 일부 구성에서, 고정 성분은, 예를 들어, 용액에서 또는 고체 지지체 상에서 특정 조성물 또는 방법에 사용될 때 변형되기 쉽지 않은 본질적으로 강성, 비탄성 또는 변형 불가능한 물질(예를 들어, 탄소 또는 금속 나노입자)을 포함할 수 있다. 다른 구성에서, 고정 성분은 스트레칭, 압축 또는 굽힘(예를 들어, 비틀림 또는 측면 굽힘)과 같은 어느 정도 변형되기 쉬운 가요성 또는 변형 가능한 물질(예를 들어, 중합체, 핵산 등)을 포함할 수 있다. 고정 성분의 자연적 변형은 고정 성분에 부착된 인접한 결합 성분의 상대적 근접성을 증가시키거나 감소시키는 구조적 변화를 생성할 수 있다.
결합 성분은 친화성 시약이 유효 점유 부피가 중첩되지 않도록 다른 결합 성분에 대해 충분히 분리되어 고정 성분에 위치할 수 있다. 도 3a는 고정 성분(300)에 부착된 제1 결합 성분(310) 및 제2 결합 성분(320)의 개략도를 도시한다. 제1 결합 성분(310)은 유효 점유 부피(315)를 갖고 제2 결합 성분(320)은 유효 점유 부피(325)를 갖는다. 제1 결합 성분(310) 및 제2 결합 성분(320)은 유효 점유 부피(315 및 325)가 중첩되지 않도록 보장하는 데 필요한 최소 거리인 이격 거리 Δs에서 고정 성분(300)에 부착된다.
일부 구성에서, 결합 성분은 결합 성분이 이격 갭을 갖도록 다른 결합 성분에 비해 충분히 분리되어 고정 성분 상에 위치될 수 있다. 도 3b는 이격 갭 Δs으로 고정 성분(300)에 부착된 제1 결합 성분(310) 및 제2 결합 성분(320)의 개략도를 도시한다. 제1 결합 성분(310)은 유효 점유 부피(315)를 갖고 제2 결합 성분(320)은 유효 점유 부피(325)를 갖는다. 제1 결합 성분(310) 및 제2 결합 성분(320)은 유효 점유 부피(315 및 325)가 길이 Δg의 이격 갭을 갖도록 보장하는 데 필요한 최소 거리인 이격 거리 Δs에서 고정 성분(300)에 부착된다.
일부 구성에서, 결합 성분은 유효 점유 부피가 중첩되도록 다른 결합 성분에 대해 분리되어 고정 성분에 위치할 수 있다. 도 3c는 고정 성분(300)에 부착된 제1 결합 성분(310) 및 제2 결합 성분(320)의 개략도를 도시한다. 제1 결합 성분(310)은 유효 점유 부피(315)를 갖고 제2 결합 성분(320)은 유효 점유 부피(325)를 갖는다. 제1 결합 성분(310) 및 제2 결합 성분(320)은 유효 점유 부피(315 및 325)가 중첩되도록 하는 이격 거리 Δs에서 고정 성분(300)에 부착되어 중첩 부피 ΔV를 생성한다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 상의 결합 성분의 위치는 전체적으로 또는 부분적으로 결합 성분을 고정 성분에 연결하는 선택적 링커의 구조 특성에 의해 결정될 수 있다. 링커는 고정 성분과 결합 성분 사이의 이격 제공, 결합 성분 위치 지정, 다른 화학 엔티티에 대한 부착 부위 제공, 원치 않는 고정 성분 - 결합 성분 상호작용의 가능성 최소화 또는 고정 성분과 결합 성분 사이의 원하는 화학 특성(예를 들어, 소수성)과 같은 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 링커는 강성 또는 형태적으로 구속된 화학 그룹(예를 들어, 알켄, 알킨, 환형 화합물)을 포함할 수 있다. 링커는 가요성, 동적 또는 이동성 화학 그룹(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 또는 알칸 사슬)을 포함할 수 있다. 링커는 방법 또는 존재하는 장치에서 다른 핵산에 결합하도록 구성되지 않은 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산(예를 들어, RNA, DNA, PNA)을 포함하는 링커는 그 자체로 2차 구조(예를 들어, 헤어핀, 스템 및/또는 루프 구조)의 영역을 형성하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 링커는 고정 성분에 부착된 결합 성분의 움직임에 대해 추가로 자유도를 제공할 수 있다.
도 4a - 4d는 결합 성분이 링커에 의해 고정 성분에 부착될 때 점유할 수 있는 부피를 조절하는 예시적인 방법을 도시한다. 도 4a는 각각 링커(420 및 422)에 의해 실질적으로 편평한 고정 성분 표면(400)에 부착된 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412)의 개략도를 도시한다. 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412)은 각각 정적 유효 점유 부피(415 및 417)를 갖는다(정적 유효 점유 부피는 링커에 의해 야기된 움직임이 없는 결합 성분에 의해 점유된 최대 부피이다). 링커(420 및 422)는 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412)이 움직일 추가 자유도를 제공하여 각각 동적 유효 점유 부피(425 및 427)를 생성한다. 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412)은 동적 유효 점유 부피(425 및 427) 사이의 이격 갭 Δg 1 을 생성하는 거리 Δs 1 에 의해 분리되는 편평한 고정 성분 표면(400) 상의 위치에서 링커(420 및 422)에 의해 부착되어 결합 성분이 서로 접촉하거나 상호작용할 수 없다. 대안적으로, 도 4b는 2개의 인접한 결합 성분 사이의 상호작용을 방해하기 위한 중간 화학 모이어티의 사용을 도시한다. 도 4b는 각각 링커(420 및 422)에 의해 실질적으로 편평한 고정 성분 표면(400)에 부착된, 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412), 및 중간 화학 모이어티 또는 차단 그룹(430)(예를 들어, PEG, PEO, 알칸 사슬, 덱스트란)의 개략도를 도시한다. 제1 결합 성분(410), 제2 결합 성분(412) 및 차단 그룹(430)은 각각 정적 유효 점유 부피(415, 417 및 435)를 갖는다(정적 유효 점유 부피는 링커에 의해 야기된 움직임이 없는 결합 성분에 의해 점유된 최대 부피이다). 링커(420 및 422)는 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412)이 움직일 추가 자유도를 제공하여 각각 동적 유효 점유 부피(425 및 427)를 생성한다. 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412)은 거리 Δs 2 만큼 분리된 편평한 고정 성분 표면(400) 상의 위치에서 링커(420 및 422)에 의해 부착되고 유효 이격 갭 Δg 2 는 중간 화학 모이어티 또는 차단 그룹(430)에 의한 방해(예를 들어, 입체적 반발)로 인해 동적 유효 점유 부피(425 및 427) 사이에 생성된다. 중간 화학 모이어티 또는 차단 그룹(430)의 사용은 결합 성분 간 상호작용의 차단으로 인해 실질적으로 편평한 표면 상의 결합 성분 사이에 필요한 거리 Δs 2 를 감소시킬 수 있다.
도 4c는 고정 성분의 형태를 변경함으로써 결합 성분 상호작용을 최소화하는 개략도를 도시한다. 도 4c는 각각 링커(420 및 422)에 의해 편평하지 않은 고정 성분 표면(450)에 부착된 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412)의 개략도를 도시한다. 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412)은 각각 정적 유효 점유 부피(415 및 417)를 갖는다(정적 유효 점유 부피는 링커에 의해 야기된 움직임이 없는 결합 성분에 의해 점유된 최대 부피이다). 링커(420 및 422)는 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412)이 움직일 추가 자유도를 제공하여 각각 동적 유효 점유 부피(425 및 427)를 생성한다. 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412)은 동적 유효 점유 부피(425 및 427) 사이에 이격 갭 Δg 3 을 생성하는 거리 Δs 3 만큼 분리된 편평하지 않은 고정 성분 표면(450) 상의 위치에서 링커(420 및 422)에 의해 부착되어 결합 성분이 서로 접촉하거나 상호작용할 수 없다. 대안적으로, 도 4d는 2개의 인접한 결합 성분 간 상호작용을 방해하기 위한 중간 화학 모이어티의 사용을 도시한다. 도 4d는 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412), 및 각각 링커(420 및 422)에 의해 편평하지 않은 고정 성분 표면(450)에 부착된 중간 화학 모이어티 또는 차단 그룹(430)(예를 들어, PEG)의 개략도를 도시한다. 제1 결합 성분(410), 제2 결합 성분(412), 및 중간 화학 모이어티 또는 차단기(430)는 각각 정적 유효 점유 부피(415, 417 및 435)를 갖는다(정적 유효 점유 부피는 링커에 의해 야기된 움직임이 없는 결합 성분에 의해 점유된 최대 부피이다). 링커(420 및 422)는 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412)이 움직일 추가 자유도를 제공하여 각각 동적 유효 점유 부피(425 및 427)를 생성한다. 제1 결합 성분(410) 및 제2 결합 성분(412)은 거리 Δs 4 로 분리된 편평한 고정 성분 표면(450) 상의 위치에서 링커(420 및 422)에 의해 부착되고 유효 이격 갭 Δg 4 는 중간 화학 잔기(430)에 의한 방해(예를 들어, 입체적 반발)로 인해 동적 유효 점유 부피(425 및 427) 사이에 생성된다. 중간 화학 모이어티 또는 차단 그룹(430)의 사용은 결합 성분 상호작용의 차단으로 인해 편평하지 않은 표면 상의 결합 성분 사이에 필요한 거리 Δs를 감소시킬 수 있다.
도 5a 및 5b는 핵산을 포함하는 고정 성분 상의 표지 성분의 상대적 위치 및/또는 배향을 제어하기 위한 대안적 구성을 나타낸다. 도 5a는 연속 스캐폴드 가닥(510)과 더 짧은 스테이플 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 올리고뉴클레오티드(520 및 522)) 사이의 혼성화에 의해 형성된 나선형 핵산의 짧은 영역을 보여준다. 올리고뉴클레오티드는 때때로 짧은 가닥 파단(525)에 의해 중단된다. 스테이플 올리고뉴클레오티드(520 및 522)는 각각 형광단(530 및 532)을 추가로 포함한다. 형광단(530 및 532)이 부착된 올리고뉴클레오티드(520 및 522) 상의 위치로 인해, 형광단(530 및 532)은 이격 거리 Δs f1 로 고정 성분의 동일한 쪽에 위치한다. 형광단(530 및 532)의 부착 부위를 변경하거나 형광단이 부착된 올리고뉴클레오티드를 변경하여 필요에 따라 이격 거리를 늘리거나 줄일 수 있다. 대안적으로, 도 5b는 연속 스캐폴드 가닥(510)과 더 짧은 스테이플 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 올리고뉴클레오티드(520 및 522)) 사이의 혼성화에 의해 형성된 나선형 핵산의 짧은 영역을 보여준다. 올리고뉴클레오티드는 때때로 짧은 가닥 파단(525)에 의해 중단된다. 스테이플 올리고뉴클레오티드(520 및 522)는 각각 형광단(530 및 532)을 추가로 포함한다. 형광단(530 및 532)이 부착된 올리고뉴클레오티드(520 및 522) 상의 위치로 인해, 형광단(530 및 532)은 이격 거리 Δs f2 로 고정 성분의 반대쪽에 위치한다. 도 5a 및 5b는 상이한 표지 배향에 의해 표지 성분 사이의 유사한 이격 거리가 달성될 수 있는 방법을 보여준다.
본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 성분 및/또는 표지 성분을 표시하기 위한 고도로 조정 가능한 플랫폼을 제공하도록 구성될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 조정 가능성은 프로브의 결합활성 및/또는 생성된 검출 가능한 신호의 강도를 맞춤형 및/또는 최적화하는 능력으로서 나타날 수 있다. 가변성은 하나 이상의 결합 성분에 부착될 수 있고/거나 프로브 상의 특정 위치에서 하나 이상의 표지 성분에 부착될 수 있는 맞춤형 고정 성분에서 발생할 수 있다.
본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 현저하게 증가된 결합활성을 갖는 것으로 특성화될 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 증가된 결합활성은 집합적으로 온 레이트(예를 들어, 증가된 해리 속도 상수, kon으로 표시됨)를 증가시키거나, 결합 파트너로부터의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 오프 레이트(예를 들어, 증가된 해리 속도 상수, koff로 표시됨)를 감소시키거나, 결합 성분이 결합 파트너에 다시 결합할 수 있기 전에 프로브가 결합 파트너로부터 멀리 확산될 가능성을 감소시키는 복수의 결합 성분의 존재로부터 유래할 수 있다. 놀랍게도, 본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물은 결합 파트너에 대해 해리 상수 또는 결합 온 레이트 또는 오프-레이트를 특징으로 하는 프로브에 부착된 복수의 결합 성분으로부터의 임의의 단일 결합 성분의 친화성보다 적어도 한 자릿수 더 큰 친화성을 나타낼 수 있다는 것이 밝혀졌다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 조정 가능한 특성은 부분적으로 프로브의 고정 성분에 대한 결합 성분의 부착을 맞춤화하는 능력으로부터 유래될 수 있다. 다음을 포함하는 몇 가지 요인이 결합활성 효과의 강도에 영향을 줄 수 있다: 1) 결합 성분의 총 수; 2) 결합 성분의 위치 및/또는 배향; 3) 결합 성분의 면적 또는 부피 밀도; 4) 복수의 결합 성분의 친화성; 5) 고정 성분의 구조; 및 6) 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 전체 크기. 더욱이, 기술된 프로브 구조의 설계 유연성은 결합 파트너 근처에서 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 일시적으로 국소화하기 위해 다른 인접한 엔티티와 약하게 상호작용할 수 있는 펜던트 테일과 같이 결합활성을 증가시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있게 한다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대한 결합활성 및/또는 관찰 가능성은 내부에 고정 성분의 설계 유연성을 활용하여 조정될 수 있다. 다음을 제공하는 고정 성분을 선택할 수 있다: 1) 결합 성분 표시를 위한 광범위한 잠재적 위치 및 배향을 제공하는 3차원 구조; 및 2) 결합 성분을 높은 특이성으로 원하는 위치에서 3차원 구조에 부착하는 능력. 특히 흥미로운 것은 결합 성분(및 표지 성분)에 대한 결합 위치가 정확하게 위치한 복잡한 3차원 구조를 생성하기 위해 핵산 혼성화의 특이성을 이용하는 핵산을 포함하는 고정 성분이다.
일부 구성에서, 핵산 구조(예를 들어, DNA 나노볼 또는 핵산 오리가미)는 고정 성분으로서 활용될 수 있다. 핵산 구조는 고정 성분에 추가되는 성분의 위치 및 배향에 대한 고도의 공간 제어를 제공하는 이점을 제공할 수 있다. 핵산 구조는 전형적으로 나선형 구조의 회전당 약 10 내지 11개의 염기쌍을 가질 수 있으며, 이는 이중 가닥 핵산 내의 각각의 고유한 물리적 위치가 관련 배향각을 갖는다는 것을 의미한다. 핵산의 이러한 특성은 결합 성분 및/또는 표지 성분과 같은 프로브 성분 사이의 이격 양을 맞춤화하기 위해 위치 및 배향을 많이 변화시킴으로써 핵산 기반 고정 성분의 조정 가능성을 용이하게 한다.
다른 구성에서, 고정 성분은 고정 성분 구조 및/또는 화학의 합리적인 제어 또는 변형에 의해 프로브 성분의 공간 및/또는 배향 제어가 제어될 수 있다. 비핵산 고정 성분은 프로브 성분 위치 및/또는 배향이 제어되거나 다양한 고정 성분을 생성하도록 조작 또는 변형될 수 있다. 일부 경우에, 프로브 성분의 위치 또는 배향은 비핵산 입자, 나노입자 또는 바디의 형상 또는 형태에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 쉘형 구조 또는 플레이트형 구조는 표지 성분에 대해 결합 성분이 차동 위치할 수 있는 다양한 특성을 지닌 다중 표면을 제공할 수 있다. 더욱이, 비핵산 고정 성분은 코팅과 함께 제공되거나 공간적으로 제어된 방식으로 복합체로 형성되어 부착 부위 및 배향에 대한 제어를 증가시킬 수 있다.
도 6a - 6f는 3차원 고정 성분 구조(예를 들어, DNA 오리가미, 탄소 나노입자, 실리콘 나노입자 등)에 의해 생성된 배열의 유연성을 입증하기 위해 검출 가능한 프로브 구성의 다양한 단순화된 형상을 도시한다. 도 6a는 직사각형 또는 타일형의 검출 가능한 프로브의 탑다운뷰(top-down view)를 도시한다. 프로브는 폭과 높이는 물론 깊이(도시되지 않음)를 갖는 고정 성분(610)을 함유하여 상부면(top face)(도시됨), 측면 및 바닥면(bottom face)(도시되지 않음)을 생성한다. 복수의 결합 성분(620)이 고정 성분(610)에 부착되며, 상기 결합 성분은 고정 성분의 측면을 따라 특정 위치에 있다. 표지 성분(630)은 검출 가능한 프로브의 상부면(및 선택적으로 바닥면)의 특정 위치에 위치한다. 도 6b는 도 6a에 나타낸 프로브로부터 역 부착 방식의 직사각형 또는 타일형 프로브의 탑다운뷰를 도시한다. 프로브는 폭과 높이는 물론 깊이(도시되지 않음)를 갖는 고정 성분(610)를 함유하여 상부면(도시됨), 측면 및 바닥면(도시되지 않음)을 생성한다. 복수의 결합 성분(620)은 검출 가능한 프로브의 상부면(및 선택적으로 바닥면)의 특정 위치에서 고정 성분(610)에 부착된다. 표지 성분(630)은 고정 성분의 측면을 따라 특정 위치에 위치한다. 도 6a에 도시된 프로브 형태는 고면적 상부면 상에 표지화를 위한 증가된 위치로 인해 더 큰 면적 또는 부피에 걸쳐 분포되는 검출 신호 또는 강한 검출 신호가 필요한 시스템에 바람직할 수 있다. 도 6b에 도시된 프로브 구성은 고면적 상부면에서 결합 성분의 밀도를 증가시킬 가능성으로 인해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 프로브 결합활성을 증가시키는 데 바람직할 수 있다.
도 6c 및 6d는 직사각형 또는 타일형의 검출 가능한 프로브의 사이드뷰(side-view) 형상을 도시하며, 프로브의 더 얇은 깊이 치수에 대한 프로브 성분의 배향을 나타낸다. 도 6c는 폭 및 높이(도시되지 않음)는 물론 깊이가 있어서 측면 및 상부면과 바닥면(도시되지 않음)을 생성하는 고정 성분(610)를 함유하는 검출 가능한 프로브를 보여준다. 복수의 결합 성분(620)이 고정 성분(610)에 부착되며, 상기 결합 성분은 검출 가능한 프로브 상부면의 특정 위치에 부착된다. 표지 성분(630)은 검출 가능한 프로브 바닥면의 특정 위치에 위치한다. 도 6d는 폭 및 높이(도시되지 않음)는 물론 깊이가 있어서 측면 및 상부면과 바닥면(도시되지 않음)을 생성하는 고정 성분(610)을 함유하는 검출 가능한 프로브를 보여준다. 복수의 결합 성분(620) 및 표지 성분(630)이 고정 성분(610)에 부착되며, 상기 결합 성분은 검출 가능한 프로브의 상부면 및 바닥면의 특정 위치에 부착된다. 도 6c의 프로브 형상은 큰 프로브가 표지 성분과 상호작용하는 결합 파트너의 일부 또는 전부를 차폐하여 결합 파트너 또는 이의 인접 환경에 의한 표지의 임의의 소광을 감소시키거나 완화시킬 수 있으므로 형광 검출 시스템에 유리할 수 있다. 도 6d의 프로브 형상은 검출 가능한 프로브를 결합 파트너와 접촉시킬 가능성을 증가시킴으로써 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 존재하는 결합 성분의 양을 최대화하는 데 유리할 수 있다.
도 6e 및 6f는 대안적인 고정 성분의 기하학적 구조를 도시한다. 도 6e는 원형 또는 구형 형상을 포함하는 검출 가능한 프로브를 도시한다. 상기 프로브는 프로브 성분의 부착을 위한 추가 위치를 제공하는 내부 구조를 선택적으로 포함하는 고정 성분(610)을 함유한다. 복수의 결합 성분(620)이 고정 성분(610)의 외부 둘레 또는 표면에 부착된다. 고정 성분(610)의 내부 영역은 복수의 표지 성분(630)을 포함한다. 도 6e에 나타낸 형상은 고정 성분(610) 상의 결합 성분(620)의 높은 커버리지로 인해 프로브가 결합 파트너의 위치를 찾을 가능성을 증가시킬 수 있고, 고정 성분(610)의 내부 공간에서 복수의 표지 성분(630)을 집중시킬 가능성으로 인해 높은 검출 가능한 신호를 추가로 제공할 수 있다. 도 6f는 하나 이상의 면에서 각도 오프셋을 특징으로 하는 고정 성분(610)을 갖는 프로브의 사이드뷰 또는 단면도를 도시한다. 고정 성분(610)의 한 면은 부착된 결합 성분(620)을 함유한다. 고정 성분(610)의 반대면은 부착된 표지 성분(630)을 함유한다. 도 6f에 나타낸 형상은 고정 성분(610)의 바닥면에 부착된 결합 성분(620)의 증가된 부피 밀도로 인해 결합활성을 증가시키는 데 유리할 수 있다. 더 복잡한 형상은 결합 파트너와 결합 성분(620)의 접촉을 증가시킬 수 있고 결합 파트너로부터의 프로브의 확산에 대한 저항을 증가시킬 수 있다. 당업자는 고정 성분의 수많은 잠재적인 디자인을 고려할 때 도 6a - 6f에 기술된 기하학의 무수한 변형이 존재할 수 있음을 인식할 것이다.
고정 성분은 주로 핵산으로 구성되지 않은 바디(예를 들어, 입자, 나노입자 또는 미세입자)를 포함할 수 있다. 고정 성분은 실리콘 또는 실리카 나노입자, 탄소 나노입자, 셀룰로오스 나노비드, PEG 나노비드, 중합체 나노입자(예를 들어, 폴리아크릴레이트 입자, 폴리스티렌 기반 입자, FluoSpheres™ 등) 또는 퀀텀닷과 같은 제조되거나 합성된 바디인 고정 성분을 이용하여 형성될 수 있다. 입자, 나노입자 또는 바디는 고체 물질 및 쉘형 물질(예를 들어, 탄소 나노구, 산화규소 나노쉘, 산화철 나노구, 폴리메틸메타크릴레이트 나노구 등)을 포함할 수 있다. 입자, 나노입자 또는 바디를 포함하는 고정 성분은 플레이트 또는 쉘과 같은 별개의 표면을 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 고정 성분 상의 별개의 표면은 성분(예를 들어, 제1 표면 상의 결합 성분, 제2 표면 상의 표지 성분)을 분리하기 위해 이용될 수 있다. 고정 성분은 성분이 부착되도록 직접 작용화되거나 변형될 수 있는 재료를 포함할 수 있다(예를 들어, 실리콘 또는 이산화규소 나노입자의 실란화). 고정 성분은 상업적으로 입수 가능한 입자, 나노입자 또는 바디를 포함할 수 있다. 고정 성분은 상업적으로 입수 가능한 입자, 나노입자 또는 바디를 변형하여 제조할 수 있다. 입자 및 나노입자와 같은 구조를 변형하기 위한 방법 및 화학은 당업계에 광범위하게 기술되어 있다.
도 31a - 31d는 입자 또는 나노입자로부터 고정 성분을 형성하기 위한 다양한 구성을 도시한다. 도 31a는 복수의 부착 부위(3120)로 직접 작용화된 표면을 갖는 고체 구형 입자(3110)를 도시한다. 부착 부위는 결합 성분 및/또는 표지 성분과 같은 검출 가능한 프로브 성분에 대한 공유 또는 비공유 부착을 형성하도록 구성될 수 있다. 도 31b는 불균일한 복수의 제1 부착 부위(3120) 및 제2 부착 부위(3125)를 포함하는 고체 구형 입자(3110)를 도시한다. 일부 구성에서, 동일한 수의 제1 부착 부위(3120) 및 제2 부착 부위(3125)가 있을 수 있다. 다른 구성에서, 상이한 수의 제1 부착 부위(3120) 및 제2 부착 부위(3125)가 있을 수 있다. 제1 부착 부위(3120) 및/또는 제2 부착 부위(3125)는 결합 성분 및/또는 표지 성분과 같은 검출 가능한 프로브 성분에 대한 공유 또는 비공유 부착을 형성하도록 구성될 수 있다. 도 31a 및 31b의 고체 구형 입자는 중공 입자로 쉽게 대체될 수 있다. 중공 입자에는 내부 표면에 부착 부위(3120 또는 3125)가 제공될 수 있다. 일부 구성에서, 중공 입자는 외부 표면에 제1의 복수의 부착 부위(3120) 및 내부 표면에 제2의 복수의 부착 부위(3125)를 포함하여 검출 가능한 프로브 성분을 상이한 표면에 분리할 수 있도록 할 수 있다.
도 31c 및 31d는 표면 코팅, 쉘 또는 층(예를 들어, 중합체, 하이드로겔 코팅 또는 작용성 그룹의 단일층)을 포함하는 고체 구형 입자로부터 형성된 고정 성분을 예시한다. 도 31c는 표면 코팅 또는 층(3130)을 포함하는 고체 구형 입자(3110)를 나타낸다. 코팅 또는 층(3130)에는 복수의 부착 부위(3120)가 제공된다. 부착 부위는 결합 성분 및/또는 표지 성분과 같은 검출 가능한 프로브 성분에 대한 공유 또는 비공유 부착을 형성하도록 구성될 수 있다 도 31d는 표면 코팅(3130)을 포함하는 구형의 검출 가능한 입자(3115)(예를 들어, FluoSphere™, 퀀텀닷)를 보여준다. 코팅 또는 층(3130)에는 복수의 부착 부위(3120)가 제공된다. 부착 부위는 결합 성분 및/또는 표지 성분과 같은 검출 가능한 프로브 성분에 대한 공유 또는 비공유 부착을 형성하도록 구성될 수 있다. 코팅 또는 층은 결합 성분 또는 다른 성분을 입자, 나노입자 또는 바디에 부착시키는 스캐폴드로서 기능할 수 있다. 당업자는 기술된 고정 성분이 비구형 입자, 나노입자, 또는 나노튜브, 플레이트, 보울, 로드(rod) 및 원뿔(cone)과 같은 바디에 쉽게 적용될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
도 34a - 34c는 공간적으로 제어되거나 분리된 프로브 성분을 갖는 비핵산 고정 성분의 다양한 구성을 예시한다. 도 34a는 공간적으로 분리된 결합 성분(3420) 및 표지 성분(3430)을 갖는 구형 입자, 나노입자 또는 바디(3410)를 보여준다. 도 34b는 외부에 부착된 결합 성분(3420)으로부터 표지 성분(3430)을 분리하기 위해 입자 또는 바디(3412)의 중공 내부 영역을 이용하는 중공 또는 쉘형 입자 또는 바디(3412)를 보여준다. 도 34c는 2개의 별개의 표면이 대략 180°의 각도 오프셋을 갖는 플레이트형 입자 또는 바디(3414)를 도시한다. 상부면은 복수의 표지 성분(3430)을 부착하는 데 사용될 수 있는 반면 바닥면은 복수의 결합 성분(3420)을 부착하는 데 사용될 수 있다.
2개의 결합 성분은 상대적 위치 측면에서 각도 오프셋을 갖는 방식으로 고정 성분에 부착될 수 있다. 예를 들어, 고정 성분의 평평한 면에 부착된 2개의 결합 성분의 각도 오프셋은 약 0도(°)이다. 또 다른 예에서, 큐브 유사 고정 성분의 반대쪽에 부착된 2개의 결합 성분의 각도 오프셋은 약 180°이다. 각도 오프셋은 인접한 결합 성분 사이의 접촉 또는 기타 상호작용을 제한하는 데 활용될 수 있다. 2개의 결합 성분의 상대적 각도 오프셋은 적어도 약 0°, 5°, 10°, 15°, 20°, 25°, 30°, 35°, 40°, 45°, 50°, 55°, 60°, 65°, 70°, 75°, 80°, 85°, 90°, 95°, 100°, 105°, 110°, 115°, 120°, 125°, 130°, 135°, 140°, 145°, 150°, 155°, 160°, 165°, 170°, 175° 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 2개의 결합 성분의 상대적 각도 오프셋은 약 180°, 175°, 170°, 165°, 160°, 155°, 150°, 145°, 140°, 135°, 130°, 125°, 120°, 115°, 110°, 105°, 100°, 95°, 90°, 85°, 80°, 75°, 70°, 65°, 60°, 55°, 50°, 45°, 40°, 35°, 30°, 25°, 20°, 15°, 10°, 5° 이하일 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 프로브의 전체 결합활성을 증가시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 도 7a 및 7b는 결합 성분의 표시를 위한 공간적 자유도를 증가시키기 위한 링커의 사용을 도시한다. 도 7a는 복수의 부착된 결합 성분(720) 및 복수의 표지 성분(730)을 갖는 고정 성분(710)을 포함하는 검출 가능한 프로브를 도시한다. 복수의 결합 성분(720)의 서브세트는 결합 성분(720)의 서브세트가 고정 성분(710)으로부터 확장되도록 하는 링커(740)(예를 들어, PEG, PEO, 알칸 사슬 등)에 의해 고정 성분(710)에 부착된다. 도 7b는 도 7a와 유사한 프로브 구성을 도시하지만, 상기 프로브는 두 가지 상이한 종의 결합 성분을 포함한다. 상기 프로브는 복수의 부착된 표지 성분(730)을 갖는 고정 성분(710)을 함유한다. 상기 프로브는 링커(740)에 의해 고정 성분(710)에 부착되는 제1의 복수의 부착된 결합 성분(720)(예를 들면, 항체 또는 항체 단편) 및 제2의 복수의 부착된 결합 성분(722)(예를 들면, 압타머)을 추가로 포함한다. 링커는 단위 시간당 더 큰 부피 영역에 걸쳐 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티의 감지 증가를 용이하게 함으로써 프로브 결합활성을 증가시키는 데 유리할 수 있다. 또한, 링커는 성분의 유연성 또는 분리를 제공할 수 있으며, 이는 프로브와 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티의 결합 속도를 높이고 프로브가 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티로부터 확산되는 것을 늦출 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 크기는 의도된 사용 방식에 맞게 구성될 수 있다. 사용 방식(예를 들어, 폴리펩티드 특성화, 비폴리펩티드 특성화, 치료, 진단)은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대한 결합활성 및/또는 관찰 가능성의 수준을 나타낼 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 의도된 사용 방식을 위해 충분한 수의 결합 성분 및/또는 표지 성분의 부착을 가능하게 하기에 충분한 크기일 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 크기는 고정 성분의 대략적인 길이, 면적 또는 부피를 지칭할 수 있다. 고정 성분에 부착된 성분(예를 들어, 결합 성분, 표지 성분, 링커, 차단 그룹)은 길이, 영역 크기 또는 부피 크기의 특성화를 더 어렵게 만드는 공간 자유도가 증가할 수 있다. 고정 성분은 크기가 더 규칙적이거나 덜 가변적이도록 구성될 수 있어서 고정 성분 크기를 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 크기에 대한 실행 가능한 프록시로 만든다.
검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이들의 고정 성분은 특징적인 길이일 수 있다. 특징적인 길이는 폭, 높이, 반경, 지름, 원주 또는 기타 치수에 대한 최대, 평균 또는 최소 길이를 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이들의 고정 성분은 특징적인 길이가 적어도 약 5nm, 10nm, 15nm, 20nm, 25nm, 30nm, 35nm, 40nm, 45nm, 50nm, 55nm, 60nm, 65nm, 70nm, 75nm, 80nm, 85nm, 90nm, 95nm, 100nm, 120nm, 140nm, 160nm, 180nm, 200nm, 250nm, 300nm, 350nm, 400nm, 450nm, 500nm, 600nm, 700nm, 800nm, 900nm, 1000nm 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이들의 고정 성분은 특징적인 길이가 약 1000nm, 900nm, 800nm, 700nm, 600nm, 500nm, 450nm, 400nm, 350nm, 300nm, 250nm, 200nm, 180nm, 160nm, 140nm, 120nm, 100nm, 95nm, 90nm, 85nm, 80nm, 75nm, 70nm, 65nm, 60nm, 55nm, 50nm, 45nm, 40nm, 35nm, 30nm, 25nm, 20nm, 15nm, 10nm, 5nm 이하일 수 있다.
검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이들의 고정 성분은 특징적인 풋프린트(예를 들어, 표면 상의 점유 영역)를 가질 수 있다. 풋프린트는 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이들의 고정 성분의 2차원 투영이 평면 표면에 생성하는 영역을 구성할 수 있다. 2차원 투영은 삼각형, 정사각형, 직사각형, 원, 오각형, 육각형, 팔각형 또는 타원형과 같은 규칙적인 형상 또는 대략 규칙적인 형상일 수 있다. 도 2a - 2b는 파선으로 도시된 이상적인 형상(각각 (220) 및 (225))과 함께 대략적인 형상의 고정 성분(210 또는 215)을 유지하기 위한 2차원 투영의 예를 표시한다. 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이들의 고정 성분은 점유 면적이 적어도 약 25㎚2, 100㎚2, 500㎚2, 1000㎚2, 2000㎚2, 3000㎚2, 4000㎚2, 5000㎚2, 5500㎚2, 6000㎚2, 6500㎚2, 7000㎚2, 7500㎚2, 8000㎚2, 8500㎚2, 9000㎚2, 10000㎚2, 15000㎚2, 20000㎚2, 25000㎚2, 50000㎚2, 100000㎚2, 1000000㎚2 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이들의 고정 성분은 점유 면적이 약 1000000㎚2, 100000㎚2, 50000㎚2, 25000㎚2, 20000㎚2, 15000㎚2, 10000㎚2, 9000㎚2, 8500㎚2, 8000㎚2, 7500㎚2, 7000㎚2, 6500㎚2, 6000㎚2, 5500㎚2, 5000㎚2, 4000㎚2, 3000㎚2, 2000㎚2, 1000㎚2, 500㎚2, 100㎚2, 25㎚2 이하일 수 있다. 점유 면적에 대한 상기 범위는 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이들의 고정 성분의 필요에 따라 모든 면에 대한 평균; 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이들의 고정 성분의 가장 작은 면; 또는 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이의 고정 성분의 가장 큰 면을 지칭할 수 있다.
고정 성분은 원하는 또는 최적의 간격으로 부착된 다른 성분(예를 들어, 결합 성분, 표지 성분 또는 기타 고정 성분)을 갖도록 구성될 수 있다. 결합 성분의 간격은 원치 않거나 유해한 상호작용(예를 들어, 압타머 미스폴딩; 형광단 자체 소광)을 줄이거나 없애기 위한 최소 간격을 기반으로 할 수 있다. 결합 성분의 간격은 결합활성 또는 검출 가능한 신호 강도와 같은 원하는 특성을 달성하기 위한 최대 간격을 기반으로 할 수 있다. 링커 또는 다른 유연한 부착 방법에 의해 고정 성분에 결합된 성분(즉, 움직임에 대한 추가 자유도를 갖는 성분)의 경우, 부착된 성분의 간격은 고정 성분 상의 부착 부위 사이의 간격으로 측정될 수 있다. 2개의 인접한 부착된 성분(예를 들어, 결합 성분, 표지 성분, 차단 그룹)은 특징적인 간격이 적어도 약 0.1㎚, 0.2㎚, 0.3㎚, 0.4㎚, 0.5㎚, 0.6㎚, 0.7㎚, 0.8㎚, 0.9㎚, 1.0㎚, 1.1㎚, 1.2㎚, 1.3㎚, 1.4㎚, 1.5㎚, 1.6㎚, 1.7㎚, 1.8㎚, 1.9㎚, 2㎚, 3㎚, 4㎚, 5㎚, 6㎚, 7㎚, 8㎚, 9㎚, 10㎚, 11㎚, 12㎚, 13㎚, 14㎚, 15㎚, 16㎚, 17㎚, 18㎚, 19㎚, 20㎚, 21㎚, 22㎚, 23㎚, 24㎚, 25㎚, 26㎚, 27㎚, 28㎚, 29㎚, 30㎚, 35㎚, 40㎚ 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 2개의 인접한 부착된 성분은 특징적인 간격이 약 40㎚, 35㎚, 30㎚, 29㎚, 28㎚, 27㎚, 26㎚, 25㎚, 24㎚, 23㎚, 22㎚, 21㎚, 20㎚, 19㎚, 18㎚, 17㎚, 16㎚, 15㎚, 14㎚, 13㎚, 12㎚, 11㎚, 10㎚, 9㎚, 8㎚, 7㎚, 6㎚, 5㎚, 4㎚, 3㎚, 2㎚, 1.9㎚, 1.8㎚, 1.7㎚, 1.6㎚, 1.5㎚, 1.4㎚, 1.3㎚, 1.2㎚, 1.1㎚, 1.0㎚, 0.9㎚, 0.8㎚, 0.7㎚, 0.6㎚, 0.5㎚, 0.4㎚, 0.3㎚, 0.2㎚, 0.1㎚ 이하일 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 고정 성분의 표면 또는 면에 부착된 복수의 결합 성분을 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 표면 상에 표시되는 결합 성분의 수는 결합활성을 증가시키거나 원치 않는 상호작용을 피하기 위해 결합 성분을 충분히 배치하도록 구성될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 표면 상의 결합 성분의 수는 평균 수 밀도(표면당 수) 또는 면적 밀도(면적당 수)로 특성화될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 2개의 상이한 표면 또는 면은 결합 성분의 수 또는 면적 밀도가 상이할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 평균 결합 성분 수 밀도가 표면당 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 평균 결합 성분 수 밀도가 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 이하일 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 평균 결합 성분 면적 밀도가 ㎚2당 적어도 약 0.00001, 0.0001, 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 평균 결합 성분 면적 밀도가 ㎚2당 약 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.009, 0.008, 0.007, 0.006, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002, 0.001, 0.0001, 0.00001 이하일 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 고정 성분의 표면 또는 면에 부착되는 복수의 표지 성분을 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 표면 상에 표시되는 표지 성분의 수는 관찰 가능성을 높이거나 원치 않는 상호작용을 피하기 위해 표지 성분을 충분히 배치하도록 최적화할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 표면 상의 표지 성분의 수는 평균 수 밀도(표면당 수) 또는 면적 밀도(면적당 수)로 특성화될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 2개의 상이한 표면 또는 면은 표지 성분의 수 또는 면적 밀도가 상이할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 평균 표지 성분 수 밀도가 표면당 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 평균 표지 성분 수 밀도가 표면당 약 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 이하 또는 2 미만일 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 평균 표지 성분 면적 밀도가 ㎚2당 적어도 약 0.00001, 0.0001, 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 평균 표지 성분 면적 밀도가 ㎚2당 약 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.009, 0.008, 0.007, 0.006, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002, 0.001, 0.0001, 0.00001 이하일 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 성분의 이종 혼합물을 포함할 수 있다. 결합 성분의 이종 혼합물은 상이한 유형 및/또는 종의 결합 성분의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 파트너에 대한 친화성이 상이한 항체의 혼합물을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 동일한 결합 파트너에 대해 친화성을 갖는 항체와 압타머의 혼합물을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 동일한 결합 파트너에 대해 친화성을 갖는 항체와 항체 단편의 혼합물을 포함할 수 있다. 결합 성분의 이종 혼합물은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성을 제어하는 데 유리할 수 있다. 결합 친화성이 상이한 결합 성분의 혼합물은 특정 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 비해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대한 결합 온 레이트 및/또는 결합 오프 레이트의 최적화를 용이하게 할 수 있다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 친화성을 갖는 복수의 제1 결합 성분 및 복수의 제2 경쟁자 결합 성분을 포함할 수 있다. 경쟁자 결합 성분은 증가된 해리 속도와 함께 감소된 친화성(예를 들어, 복수의 상이한 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티를 결합하는 것과 같은 증가된 결합 다중기능성)을 갖는 것으로 특성화될 수 있다(예를 들어, 많은 표적에 결합하지만 표적으로부터 쉽게 해리되는 결합 성분). 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 경쟁자 결합 성분은 다른 결합 성분에 의한 대체가 에너지적으로 및/또는 엔트로피적으로 유리한 결합 성분으로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 다수의 작고 친화성이 낮은 압타머 또는 미니-펩티드 결합제는 크고 친화성이 높은 항체로 쉽게 대체될 수 있으며, 이로써 다수의 결합 성분을 대체하는 엔트로피 증가로 인해 항체 결합이 선호된다. 경쟁자 결합 성분은 제1의 복수의 결합 성분이 친화성이 결여된 표적 모이어티와 짧고 약한 상호작용을 형성함으로써 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성을 추가로 증가시킬 수 있다. 이러한 짧고 약한 상호작용은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 사이의 결합 지속 시간을 증가시키는 것을 촉진할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 특정 환경 조건에서 구조적으로 안정할 수 있다. 특히 흥미로운 것은 결합 파트너로부터 결합된 프로브를 제거하기 위한 조건 하에서 구조적으로 안정한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 열 또는 분자간 상호작용을 방해하는 화학 조성, 예를 들어, 계면활성제 또는 변성제의 존재 하에서 안정할 수 있다. 구조 안정성은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 전체 조성 및 선택적으로 형상 또는 형태를 유지하는 것, 즉 결합 성분, 표지 성분 또는 기타 성분의 손실 없음; 성분의 손실 또는 분해 없음(예를 들어, DNA 오리가미 고정 성분으로부터의 핵산의 탈혼성화)을 지칭할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 주어진 온도에서 구조적으로 안정할 수 있다. 온도는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 사용하는 과정 중에 달라질 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합, 관찰 및 제거 단계 각각은 고유 및/또는 최적 온도에서 발생할 수 있다. 또한, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 주어진 저장 온도에서 구조적으로 안정할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 적어도 약 -100℃, -90℃, -80℃, -70℃, -60℃, -50℃, -40℃, -30℃, - 20℃, -10℃, -5℃, 0℃, 4℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 90℃ 이상의 온도에서 구조적으로 안정할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 약 90℃, 80℃, 75℃, 70℃, 65℃, 60℃, 55℃, 50℃, 45℃, 40℃, 35℃, 30℃, 25℃, 20℃, 15℃, 10℃, 4℃, 0℃, -10℃, -20℃, -30℃, -40℃, -50℃, -60℃, -70℃, -80℃, -90℃, 100℃ 이하에서 구조적으로 안정할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 특정 용액 또는 용매의 존재 하에서 구조적으로 안정할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 사용 방식에 따라 하나 이상의 용액 또는 용매와 접촉할 수 있다. 용액 또는 용매는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 사용 방식에 따라 조성이 다양할 수 있다. 용액 또는 용매는 프로브 제형화, 프로브 저장, 프로브-파트너 결합, 세척, 헹굼, 상호작용 검출, 프로브-파트너 분리, 프로브 포획(예를 들어, 사용 후 프로브 회수) 및 프로브 분석(예를 들어, 핵산 바코드의 처리 후 시퀀싱)과 같은 과정을 위해 사용될 수 있다. 용액 또는 용매는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 구조의 안정성을 유지하기 위해 제형화될 수 있다. 용액 또는 용매는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 안정성을 보장하기 위해 화학 조성, pH 및 이온 강도와 관련하여 제형화될 수 있다. 핵산을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 핵산을 안정화하기 위해 마그네슘염을 포함하는 용액 또는 용매에 존재할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 접촉하는 용액 또는 용매는 용액 또는 현탁액에 하나 이상의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 접촉하는 용액 또는 용매는 균질한 액체 매질이 되도록 제형화될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 접촉하는 용액 또는 용매는 단일상 액체 매질이 되도록 제형화될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 접촉하는 용액 또는 용매는 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼과 같은 다중상 액체 매질이 되도록 제형화될 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 접촉하는 용액 또는 용매는 용매 종, pH 버퍼 종, 양이온 종, 음이온 종, 계면활성제 종, 변성 종 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용매 종은 물, 아세트산, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로필 알코올, n-부탄올, 포름산, 암모니아, 프로필렌 카보네이트, 니트로메탄, 디메틸 설폭사이드, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 아세톤, 에틸 아세테이트, 테트라하이드로푸란, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 디메틸 에테르, 디에틸 에테르, 1-4, 디옥산, 톨루엔, 벤젠, 사이클로헥산, 헥산, 사이클로펜탄, 펜탄 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용매 또는 용액은 MES, Tris, Bis-tris, Bis-tris 프로판, ADA, ACES, PIPES, MOPSO, MOPS, BES, TES, HEPES, HEPBS, HEPPSO, DIPSO, MOBS, TAPSO, TAPS, TABS, POPSO, TEA, EPPS, Tricine, Gly-Gly, Bicine, AMPD, AMPSO, AMP, CHES, CAPSO, CAPS 및 CABS를 포함하지만 이에 제한되지 않는 버퍼 종을 포함할 수 있다. 용매 또는 용액은 Na+, K+, Ag+, Cu+, NH4 +, Mg2+, Ca2+, Cu2+, Cd2+, Zn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Cr2+, Mn2+, Ge2+, Sn2+, Al3+, Cr3+, Fe3+, Co3+, Ni3+, Ti3+, Mn3+, Si4+, V4+, Ti4+, Mn4+, Ge4+, Se4+, V5+, Mn5+, Mn6+, Se6+ 및 이들의 조합과 같은 양이온 종을 포함할 수 있다. 용매 또는 용액은 F-, Cl-, Br-, ClO3 -, H2PO4 -, HCO3 -, HSO4 -, OH-, I-, NO3 -, NO2 -, MnO4 -, SCN-, CO3 2-, CrO4 2-, Cr2O7 2-, HPO4 2-, SO4 2-, SO3 2-, PO4 3- 및 이들의 조합과 같은 음이온 종을 포함할 수 있다. 용매 또는 용액은 스테아르산, 라우르산, 올레산, 나트륨 도데실 설페이트, 나트륨 도데실 벤젠 설포네이트, 도데실아민 하이드로클로라이드, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, 폴리에틸렌 옥사이드, 노닐페닐 에톡실레이트, Triton X, 펜타프로필렌 글리콜 모노도데실 에테르, 옥타프로필렌 글리콜 모노도데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 라우라미드 모노에틸아민, 라우라미드 디에틸아민, 옥틸 글루코시드, 데실 글루코시드, 라우릴 글루코시드, Tween 20, Tween 80, n-도데실-β-D-말토시드, 노녹시놀 9, 글리세롤 모노라우레이트, 폴리에톡시화 탈로우 아민, 폴록사머, 디지토닌(digitonin), 조닐(zonyl) FSO, 2,5-디메틸-3-헥신-2,5-디올, Igepal CA630, Aerosol-OT, 트리에틸아민 하이드로클로라이드, 세트리모늄 브로마이드, 벤제토늄 클로라이드, 옥테니딘 디하이드로클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 아도겐(adogen), 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드, CHAPS, CHAPSO, 코카미도프로필 베타인, 아미도설포베타인-16, 라우릴-N,N-(디메틸암모니오)부티레이트, 라우릴-N,N-(디메틸)-글리신베타인, 헥사데실 포스포콜린, 라우릴디메틸아민 N-옥사이드, 라우릴-N,N-(디메틸)-프로판설포네이트, 3-(1-피리디니오)-1-프로판설포네이트, 3-(4-tert-부틸-1-피리디니오)-1-프로판설포네이트, N-라우릴사르코신 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 계면활성제 종을 포함할 수 있다. 용매 또는 용액은 아세트산, 트리클로로아세트산, 설포살리실산, 중탄산나트륨, 에탄올, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 우레아, 구아니디늄 클로라이드, 과염소산리튬, 나트륨 도데실 설페이트, 2-머캅토에탄올, 디티오트레이톨 및 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 변성 종을 포함할 수 있다.
pH 버퍼 종은 임의의 양으로 용매 또는 용액에서 제형화될 수 있다. pH 버퍼 종은 적어도 약 0.0001M, 0.001M, 0.01M, 0.02M, 0.03M, 0.04M, 0.05M, 0.06M, 0.07M, 0.08M, 0.09M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M, 0.9M, 1M, 1.1M, 1.2M, 1.3M, 1.4M, 1.5M, 1.6M, 1.7M, 1.8M, 1.9M, 2M, 2.1M, 2.2M, 2.3M, 2.4M, 2.5M, 2.6M, 2.7M, 2.8M, 2.9M, 3M, 3.1M, 3.2M, 3.3M, 3.4M, 3.5M, 3.6M, 3.7M, 3.8M, 3.9M, 4M, 4.1M, 4.2M, 4.3M, 4.4M, 4.5M, 4.6M, 4.7M, 4.8M, 4.9M, 5M, 5.1M, 5.2M, 5.3M, 5.4M, 5.5M, 5.6M, 5.7M, 5.8M, 5.9M, 6M, 7M, 8M, 9M 이상의 농도로 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 용매 조성물에 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, pH 버퍼 종은 약 10M, 9M, 8M, 7M, 6M, 5.9M, 5.8M, 5.7M, 5.6M, 5.5M, 5.4M, 5.3M, 5.2M, 5.1M, 5.0M, 4.9M, 4.8M, 4.7M, 4.6M, 4.5M, 4.4M, 4.3M, 4.2M, 4.1M, 4.0M, 3.9M, 3.8M, 3.7M, 3.6M, 3.5M, 3.4M, 3.3M, 3.2M, 3.1M, 3.0M, 2.9M, 2.8M, 2.7M, 2.6M, 2.5M, 2.4M, 2.3M, 2.2M, 2.1M, 2.0M, 1.9M, 1.8M, 1.7M, 1.6M, 1.5M, 1.4M, 1.3M, 1.2M, 1.1M, 1.0M, 0.9M, 0.8M, 0.7M, 0.6M, 0.5M, 0.4M, 0.3M, 0.2M, 0.1M, 0.09M, 0.08M, 0.07M, 0.06M, 0.05M, 0.04M, 0.03M, 0.02M, 0.01M, 0.001M, 0.001M 이하의 농도로 용매 또는 용액에 존재할 수 있다.
양이온 종은 임의의 양으로 용매 또는 용액에서 제형화될 수 있다. 양이온 종은 적어도 약 0.0001M, 0.001M, 0.01M, 0.02M, 0.03M, 0.04M, 0.05M, 0.06M, 0.07M, 0.08M, 0.09M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M, 0.9M, 1M, 1.1M, 1.2M, 1.3M, 1.4M, 1.5M, 1.6M, 1.7M, 1.8M, 1.9M, 2M, 2.1M, 2.2M, 2.3M, 2.4M, 2.5M, 2.6M, 2.7M, 2.8M, 2.9M, 3M, 3.1M, 3.2M, 3.3M, 3.4M, 3.5M, 3.6M, 3.7M, 3.8M, 3.9M, 4M, 4.1M, 4.2M, 4.3M, 4.4M, 4.5M, 4.6M, 4.7M, 4.8M, 4.9M, 5M, 5.1M, 5.2M, 5.3M, 5.4M, 5.5M, 5.6M, 5.7M, 5.8M, 5.9M, 6M, 7M, 8M, 9M 이상의 농도로 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 용매 조성물에 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 양이온 종은 약 10M, 9M, 8M, 7M, 6M, 5.9M, 5.8M, 5.7M, 5.6M, 5.5M, 5.4M, 5.3M, 5.2M, 5.1M, 5.0M, 4.9M, 4.8M, 4.7M, 4.6M, 4.5M, 4.4M, 4.3M, 4.2M, 4.1M, 4.0M, 3.9M, 3.8M, 3.7M, 3.6M, 3.5M, 3.4M, 3.3M, 3.2M, 3.1M, 3.0M, 2.9M, 2.8M, 2.7M, 2.6M, 2.5M, 2.4M, 2.3M, 2.2M, 2.1M, 2.0M, 1.9M, 1.8M, 1.7M, 1.6M, 1.5M, 1.4M, 1.3M, 1.2M, 1.1M, 1.0M, 0.9M, 0.8M, 0.7M, 0.6M, 0.5M, 0.4M, 0.3M, 0.2M, 0.1M, 0.09M, 0.08M, 0.07M, 0.06M, 0.05M, 0.04M, 0.03M, 0.02M, 0.01M, 0.001M, 0.001M 이하의 농도로 용매 또는 용액에 존재할 수 있다.
음이온 종은 임의의 양으로 용매 또는 용액에서 제형화될 수 있다. 음이온 종은 적어도 0.0001M, 0.001M, 0.01M, 0.02M, 0.03M, 0.04M, 0.05M, 0.06M, 0.07M, 0.08M, 0.09M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M, 0.9M, 1M, 1.1M, 1.2M, 1.3M, 1.4M, 1.5M, 1.6M, 1.7M, 1.8M, 1.9M, 2M, 2.1M, 2.2M, 2.3M, 2.4M, 2.5M, 2.6M, 2.7M, 2.8M, 2.9M, 3M, 3.1M, 3.2M, 3.3M, 3.4M, 3.5M, 3.6M, 3.7M, 3.8M, 3.9M, 4M, 4.1M, 4.2M, 4.3M, 4.4M, 4.5M, 4.6M, 4.7M, 4.8M, 4.9M, 5M, 5.1M, 5.2M, 5.3M, 5.4M, 5.5M, 5.6M, 5.7M, 5.8M, 5.9M, 6M, 7M, 8M, 9M 이상의 농도로 용매 또는 용액에 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 음이온 종은 약 10M, 9M, 8M, 7M, 6M, 5.9M, 5.8M, 5.7M, 5.6M, 5.5M, 5.4M, 5.3M, 5.2M, 5.1M, 5.0M, 4.9M, 4.8M, 4.7M, 4.6M, 4.5M, 4.4M, 4.3M, 4.2M, 4.1M, 4.0M, 3.9M, 3.8M, 3.7M, 3.6M, 3.5M, 3.4M, 3.3M, 3.2M, 3.1M, 3.0M, 2.9M, 2.8M, 2.7M, 2.6M, 2.5M, 2.4M, 2.3M, 2.2M, 2.1M, 2.0M, 1.9M, 1.8M, 1.7M, 1.6M, 1.5M, 1.4M, 1.3M, 1.2M, 1.1M, 1.0M, 0.9M, 0.8M, 0.7M, 0.6M, 0.5M, 0.4M, 0.3M, 0.2M, 0.1M, 0.09M, 0.08M, 0.07M, 0.06M, 0.05M, 0.04M, 0.03M, 0.02M, 0.01M, 0.001M, 0.001M 이하의 농도로 용매 또는 용액에 존재할 수 있다.
계면활성제 종은 임의의 양으로 용매 또는 용액에서 제형화될 수 있다. 계면활성제 종은 적어도 약 0.0001M, 0.001M, 0.01M, 0.02M, 0.03M, 0.04M, 0.05M, 0.06M, 0.07M, 0.08M, 0.09M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M, 0.9M, 1M, 1.1M, 1.2M, 1.3M, 1.4M, 1.5M, 1.6M, 1.7M, 1.8M, 1.9M, 2M, 2.1M, 2.2M, 2.3M, 2.4M, 2.5M, 2.6M, 2.7M, 2.8M, 2.9M, 3M, 3.1M, 3.2M, 3.3M, 3.4M, 3.5M, 3.6M, 3.7M, 3.8M, 3.9M, 4M, 4.1M, 4.2M, 4.3M, 4.4M, 4.5M, 4.6M, 4.7M, 4.8M, 4.9M, 5M, 5.1M, 5.2M, 5.3M, 5.4M, 5.5M, 5.6M, 5.7M, 5.8M, 5.9M, 6M, 7M, 8M, 9M 이상의 농도로 용매 또는 용액에 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 계면활성제 종은 약 10M, 9M, 8M, 7M, 6M, 5.9M, 5.8M, 5.7M, 5.6M, 5.5M, 5.4M, 5.3M, 5.2M, 5.1M, 5.0M, 4.9M, 4.8M, 4.7M, 4.6M, 4.5M, 4.4M, 4.3M, 4.2M, 4.1M, 4.0M, 3.9M, 3.8M, 3.7M, 3.6M, 3.5M, 3.4M, 3.3M, 3.2M, 3.1M, 3.0M, 2.9M, 2.8M, 2.7M, 2.6M, 2.5M, 2.4M, 2.3M, 2.2M, 2.1M, 2.0M, 1.9M, 1.8M, 1.7M, 1.6M, 1.5M, 1.4M, 1.3M, 1.2M, 1.1M, 1.0M, 0.9M, 0.8M, 0.7M, 0.6M, 0.5M, 0.4M, 0.3M, 0.2M, 0.1M, 0.09M, 0.08M, 0.07M, 0.06M, 0.05M, 0.04M, 0.03M, 0.02M, 0.01M, 0.001M, 0.001M 이하의 농도로 용매 또는 용액에 존재할 수 있다.
변성 종은 임의의 양으로 용매 또는 용액에서 제형화될 수 있다. 변성 종은 적어도 약 0.0001M, 0.001M, 0.01M, 0.02M, 0.03M, 0.04M, 0.05M, 0.06M, 0.07M, 0.08M, 0.09M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M, 0.9M, 1M, 1.1M, 1.2M, 1.3M, 1.4M, 1.5M, 1.6M, 1.7M, 1.8M, 1.9M, 2M, 2.1M, 2.2M, 2.3M, 2.4M, 2.5M, 2.6M, 2.7M, 2.8M, 2.9M, 3M, 3.1M, 3.2M, 3.3M, 3.4M, 3.5M, 3.6M, 3.7M, 3.8M, 3.9M, 4M, 4.1M, 4.2M, 4.3M, 4.4M, 4.5M, 4.6M, 4.7M, 4.8M, 4.9M, 5M, 5.1M, 5.2M, 5.3M, 5.4M, 5.5M, 5.6M, 5.7M, 5.8M, 5.9M, 6M, 7M, 8M, 9M 이상의 농도로 용매 또는 용액에 존재할 수 있다. 변성 종은 약 10M, 9M, 8M, 7M, 6M, 5.9M, 5.8M, 5.7M, 5.6M, 5.5M, 5.4M, 5.3M, 5.2M, 5.1M, 5.0M, 4.9M, 4.8M, 4.7M, 4.6M, 4.5M, 4.4M, 4.3M, 4.2M, 4.1M, 4.0M, 3.9M, 3.8M, 3.7M, 3.6M, 3.5M, 3.4M, 3.3M, 3.2M, 3.1M, 3.0M, 2.9M, 2.8M, 2.7M, 2.6M, 2.5M, 2.4M, 2.3M, 2.2M, 2.1M, 2.0M, 1.9M, 1.8M, 1.7M, 1.6M, 1.5M, 1.4M, 1.3M, 1.2M, 1.1M, 1.0M, 0.9M, 0.8M, 0.7M, 0.6M, 0.5M, 0.4M, 0.3M, 0.2M, 0.1M, 0.09M, 0.08M, 0.07M, 0.06M, 0.05M, 0.04M, 0.03M, 0.02M, 0.01M, 0.001M, 0.001M 이하의 농도로 용매 또는 용액에 존재할 수 있다.
용매 또는 용액은 pH가 특정 값 또는 특정 값 범위 내이도록 제형화될 수 있다. 용매 또는 용액은 pH가 적어도 약 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11.0, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4, 11.5, 11.6, 11.7, 11.8, 11.9, 12.0, 12.1, 12.2, 12.3, 12.4, 12.5, 12.6, 12.7, 12.8, 12.9, 13.0, 13.1, 13.2, 13.3, 13.4, 13.5, 13.6, 13.7, 13.8, 13.9, 14.0 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 용매 또는 용액은 pH가 약 14.0, 13.9, 13.8, 13.7, 13.6, 13.5, 13.4, 13.3, 13.2, 13.1, 13.0, 12.9, 12.8, 12.7, 12.6, 12.5, 12.4, 12.3, 12.2, 12.1, 12.0, 11.9, 11.8, 11.7, 11.6, 11.5, 11.4, 11.3, 11.2, 11.1, 11.0, 10.9, 10.8, 10.7, 10.6, 10.5, 10.4, 10.3, 10.2, 10.1, 10.0, 9.9, 9.8, 9.7, 9.6, 9.5, 9.4, 9.3, 9.2, 9.1, 9.0, 8.9, 8.8, 8.7, 8.6, 8.5, 8.4, 8.3, 8.2, 8.1, 8.0, 7.9, 7.8, 7.7, 7.6, 7.5, 7.4, 7.3, 7.2, 7.1, 7.0, 6.9, 6.8, 6.7, 6.6, 6.5, 6.4, 6.3, 6.2, 6.1, 6.0, 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4.4, 4.3, 4.2, 4.1, 4.0, 3.9, 3.8, 3.7, 3.6, 3.5, 3.4, 3.3, 3.2, 3.1, 3.0, 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4, 2.3, 2.2, 2.1, 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0 이하일 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 하나 이상의 추가 변형 그룹을 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 화학 또는 물리 특성을 변경하기 위해 변형 그룹이 포함될 수 있다. 소수성, 친수성, 양친매성, 전하, 자화율(magnetic susceptibility) 또는 임의의 다른 물리 특성과 같은 특성을 변경하기 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 변형 그룹이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 변형 그룹은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 용해도 또는 용액 안정성을 증가, 감소 또는 변경하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 전기적 반발 또는 입체 폐색과 같은 메커니즘에 의해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 분리를 유지하기 위해 변형 그룹을 사용할 수 있다. 일부 경우에, 변형 그룹을 사용하여 입자 사이의 인력을 높일 수 있다. 예를 들어, 변형 그룹은 검출 가능한 프로브 및/또는 친화성 시약 사이에 짧은 인력 상호작용을 형성하여 프로브의 응집 또는 침전을 일으키지 않고 다중 프로브 복합체를 생성할 수 있다.
고정 성분의 표면은 하나 이상의 변형 그룹을 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 표면 또는 계면 사이의 회합을 매개하면서 표면의 특성을 변경하기 위해 변형 그룹을 표면에 추가할 수 있다. 예를 들어, 소수성 변형 그룹은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 추가되어 프로브가 수중유 에멀젼의 유적(oil droplet)과 상호작용하도록 할 수 있다. 변형 그룹은 공유 또는 비공유로 부착될 수 있다. 변형 그룹은 고정 성분 조립 전, 도중 또는 후에 고정 성분에 커플링될 수 있다. 표면 변형 그룹은 전기적으로 하전된 모이어티, 자성 모이어티, 입체 모이어티, 양친매성 모이어티, 소수성 모이어티 및 친수성 모이어티를 포함할 수 있다. 전기적으로 하전된 모이어티는 본질적인 양전하 또는 음전하를 가질 수 있거나 해리 조건 하에서 전하를 가질 수 있는 작용성 그룹을 포함할 수 있다(예를 들어, 카복실산, 니트레이트, 설폰, 포스페이트, 포스포네이트 등). 자성 모이어티는 나노입자(예를 들어, 가돌리늄, 망간, 산화철, 비스무트, 금, 은, 코발트 나노입자 등)와 같은 상자성(paramagnetic), 반자성(diamagnetic) 및 강자성(ferromagnetic) 입자를 포함할 수 있다. 입체 모이어티는 중합체 및 바이오중합체(예를 들어, PEG, PEO, 알칸 사슬, 덱스트란, 전단된 핵산)를 포함할 수 있다. 양친매성 모이어티는 인지질(예를 들어, 포스파티딘산, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜이노시톨 포스페이트, 포스파티딜이노시톨 바이포스페이트, 포스파티딜이노시톨 트리포스페이트, 세라마이드 포스포릴콜린, 세라마이드 포스포릴에탄올아민, 세라마이드 포스포릴리피드), 당지질(예를 들어, 글리세로당지질, 스핑고당지질, 람노리피드 등) 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤, 캄페스테롤(campesterol), 시토스테롤(sitosterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 에르고스테롤(ergosterol) 등)을 포함할 수 있다. 소수성 모이어티는 스테로이드(예를 들어, 콜레스테롤), 포화 지방산(예를 들어, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 리그노세르산(lignoceric acid), 세로트산(cerotic acid) 등) 및 불포화 지방산(예를 들어, 미리스톨레산, 팔미톨레산, 사피엔산(sapienic acid), 올레산(oleic acid), 엘라이드산(elaidic acid), 바센산(vaccenic acid), 리놀레산(linoleic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 에루크산(erucic acid), 도코사헥산산(docosahexanenoic acid) 등)을 포함할 수 있다. 친수성 화합물은 하전된 분자 및 극성 분자(예를 들어, 글리콜, 사이클로덱스트린, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드 등)를 포함할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 표면은 하나 이상의 변형 그룹을 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 표면은 적어도 약 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 50000, 1000000개 이상의 변형 그룹을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 표면은 약 1000000, 500000, 100000, 50000, 10000, 5000, 1000, 500, 100, 50, 10개 이하의 변형 그룹을 포함할 수 있다.
복수의 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 둘 다는 다중 프로브 복합체로 조립될 수 있다. 다중 프로브 복합체는, 예를 들어, 복수의 검출 가능한 프로브, 복수의 친화성 시약, 친화성 시약 및 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 및 복수의 검출 가능한 프로브, 또는 복수의 친화성 시약 및 검출 가능한 프로브를 포함할 수 있다. 강화된 결합활성 및/또는 강화된 관찰 가능성과 같은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 바람직한 특성을 추가로 강화하기 위해 다중 프로브 복합체를 제조할 수 있다. 일부 구성에서, 다중 프로브 복합체는 단일 복합체로 형성되는 유사하거나 동일한 구성의 다중 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 다수의 유사하거나 동일한 프로브를 포함하는 다중 프로브 복합체는 결합 파트너와 상호작용할 때 프로브의 전체 밝기를 증가시키기 위해 형성될 수 있거나, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 단독에 의해 관찰되는 결합활성에 비해 결합활성을 증가시키기 위해 증가된 수의 친화성 시약을 제공할 수 있다. 다른 구성에서, 다중 프로브 복합체는 단일 복합체에 부착된 상이하거나 유사하지 않은 구성의 다수의 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 다중 프로브 복합체는 다중 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 동시에 결합하기 위해 또는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 인식할 수 있는 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티의 수를 증가시킴으로써 결합 상호작용을 형성할 가능성을 증가시키기 위해 형성될 수 있는 상이하거나 유사하지 않은 구성의 다중 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 다중 프로브 복합체는 1가 복합체(예를 들어, 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티의 단일 종에만 결합하도록 구성됨) 또는 다가 복합체(예를 들어, 다양한 상이한 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 결합하도록 구성됨)로서 거동할 수 있다. 다중 프로브 복합체는 공유 또는 비공유 상호작용에 의해 부착될 수 있다. 2개의 검출 가능한 프로브 사이, 2개의 친화성 시약 사이 또는 프로브와 시약 사이의 공유 결합은, 예를 들어, 클릭 반응에 의해 형성될 수 있다. 프로브 및/또는 시약 사이의 비공유 상호작용은, 예를 들어, 핵산 혼성화 또는 스트렙트아비딘-비오틴 커플링에 의해 형성될 수 있다.
다중 프로브 복합체는 2개 이상의 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 둘 다를 함께 커플링하여 형성될 수 있다. 다중 프로브 복합체는 검출 가능한 프로브(들) 및/또는 친화성 시약(들)의 직접 부착에 의해(예를 들어, 핵산 혼성화, 가교결합 등에 의해) 형성될 수 있다. 일부 구성에서, 다중 프로브 복합체는 구조화 핵산 입자 또는 나노입자와 같은 하나 이상의 2차 고정 성분 사이의 부착에 의해 형성될 수 있다. 2차 고정 성분은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 조정 가능한 위치 및/또는 배향을 제공하는 경우 특히 중요할 수 있다. 일부 구성에서, 2차 고정 성분은 변형 그룹, 결합 성분 또는 표지 성분과 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 도 39a - 39b는 2차 고정 성분을 포함하는 다중 프로브 복합체의 예시적인 구성을 보여준다. 도 39a는 내향으로 부착된 2개 이상의 부착된 검출 가능한 프로브(3920)를 포함하는 2차 고정 성분(3910)(예를 들어, 구조화 핵산 입자, 나노입자)을 보여준다. 2차 고정 성분(3910)은 복수의 부착된 표지 성분(3930)을 추가로 포함한다. 도 39b는 내향 결합 성분의 다중 포켓을 형성하도록 커플링된 복수의 검출 가능한 프로브(3920)를 포함하는 2개 이상의 개별 입자(3910)(예를 들어, SNAP, 나노입자)를 포함하는 2차 고정 성분을 보여준다. 2개 이상의 입자(3910)를 포함하는 2차 고정 성분은 2차 고정 성분에 부착된 복수의 표지 성분(3930)을 추가로 포함한다. 다른 구성에서, 다중 프로브 복합체는 다중 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 중합체, 금속, 세라믹, 반도체, 유리, 섬유, 수지 또는 이들의 조합과 같은 구조화되지 않은 물질 또는 그룹에 커플링하거나 부착함으로써 형성될 수 있다. 구조화되지 않은 물질은 무정형, 구형, 다공성 또는 이들의 일부 조합일 수 있다. 구조화되지 않은 물질은 복수의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 부착될 수 있는 복수의 부착 부위를 포함할 수 있다.
도 35a - 35c는 다중 프로브 복합체의 다양한 구성을 도시한다. 도 35a는 연결 그룹(3520)(예를 들어, 공유 또는 비공유 연결 그룹)에 의해 연결되는 2개의 동일하거나 유사한 타일형 핵산 검출 가능한 프로브(3510)를 도시한다. 검출 가능한 프로브(3510)는 단일 표적 또는 표적 그룹(예를 들어, 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티)에 대한 친화성을 가질 수 있다. 도 35b는 압타머 결합 성분(3515)을 갖는 제2의 타일형 검출 가능한 프로브에 연결 그룹(3520)(예를 들어, 공유 또는 비공유 연결 그룹)에 의해 연결된 항체 결합 성분(3510)을 갖는 제1의 타일형 핵산 검출 가능한 프로브를 도시한다. 검출 가능한 프로브(3510 및 3515)는 친화성이 상이할 수 있으며, 이에 따라 검출 가능한 프로브가 하나 초과의 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 동시에 결합할 수 있다. 도 35c는 정전 또는 자기 상호작용과 같은 비공유 인력 상호작용에 의해 연결되는 한 쌍의 비핵산 기반 검출 가능한 프로브(3530)(예를 들어, 입자, 나노입자 등)를 도시한다. 비핵산 기반 검출 가능한 프로브(3530)는 유사하거나 유사하지 않은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티를 갖는 결합 성분을 포함할 수 있다.
일부 구성에서, 다중 프로브 복합체는 제어된 기하학적 구조를 가진 복합체를 형성하도록 구성될 수 있다. 증가된 결합활성을 위해 결합 성분을 더욱 유리하게 배향하기 위해 제어된 기하학적 구조를 사용할 수 있다. 다중 프로브 복합체는 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티와의 결합 상호작용을 형성할 때 형상 또는 형태를 변경하도록 구성될 수 있다. 다중 프로브 복합체는 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 결합 성분의 접촉 또는 근접성을 증가시키기 위해 형상 또는 형태의 변화에 저항하도록 구성될 수 있다. 다중 프로브 복합체에 포함된 개별 프로브 또는 시약은 복합체 내에서 프로브의 상대적 배향에 영향을 미치는 다중 프로브 복합체 내 다른 프로브 또는 시약과 상호작용을 형성하는 변형 그룹을 가질 수 있다. 도 36a - 36b는 설계된 또는 구조화된 기하학적 구조의 검출 가능한 프로브의 구성을 도시한다. 도 36a는 링커(3620)에 의해 연결된 2개의 타일형 핵산 검출 가능 프로브(3610)를 도시한다. 각각의 프로브(3610)는 링커(3620)의 자유 운동에 대한 반발력 또는 방해를 생성하는 하나 이상의 변형 그룹(3630)(예를 들어, 동일한 전하, 동일한 자기 극성, 입체 그룹 등)을 포함한다. 변형 그룹(3630)은 프로브의 내향을 야기하여 프로브 복합체의 결합 성분 밀도를 증가시킨다. 도 36b는 링커(3620)에 의해 결합된 2개의 타일형 핵산 검출 가능한 프로브(3610)를 도시한다. 각각의 프로브(3610)는 프로브(3610)의 내향을 야기하여 프로브 사이의 인력을 생성하는 하나 이상의 변형 그룹(3640)(예를 들어, 소수성 그룹, 친수성 그룹 등)을 포함하며 이는 프로브 복합체의 결합 성분 밀도를 증가시킨다. 이러한 구성은 결합 파트너와의 결합 상호작용 동안 복합체의 변형에 저항할 수 있다.
다중 복합체는 단일 복합체에 부착된 2개 이상의 검출 가능한 프로브 및/또는 친화성 시약을 포함할 수 있다. 다중 프로브 복합체는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 이상의 검출 가능한 프로브 및/또는 친화성 시약을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 다중 프로브 복합체는 약 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 이하의 검출 가능한 프로브 및/또는 친화성 시약을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 폴리펩티드 또는 다른 분석물과 결합하거나 회합할 수 있는 결합 성분(결합 성분 또는 프로브 성분이라고도 함)을 회합하는(또는 회합하지 않는) 폴리펩티드 또는 다른 분석물의 확인을 용이하게 하기 위해 이러한 결합을 해석하도록 하는 방식으로 포함할 수 있다. 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 또한 폴리펩티드 또는 다른 분석물과 같은 표적 분석물과 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브의 결합 또는 회합을 관찰 또는 검출할 수 있는 표지 성분을 포함할 수 있다. 표지 성분은, 예를 들어, 표지 성분이 합성 링커 또는 부착 모이어티를 통해 부착되는 외인성 표지인 경우 프로브 성분으로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 표지 성분은 검출 가능한 질량, 전하 또는 광학 특성과 같은 프로브의 고유 특성일 수 있다. 어떤 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브가 샘플 내의 상이한 폴리펩티드 또는 다른 분석물에 결합하는지 확인함으로써, 그 샘플 내의 그러한 단백질 또는 폴리펩티드의 존재 및 잠재적인 양을 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 아미노산 서열을 확인하기 위한 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 실제로 본원에 기술된 방법에서 사용되는 것과 같이 서로 구별되지 않거나 구별할 수 없는 일단의 상이한 성분을 포함할 수 있다. 특히, 동일한 표적 아미노산 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있는 상이한 성분은 동일한 표적 아미노산 서열을 확인하기 위해 동일한 표지 모이어티를 사용할 수 있다. 예를 들어, 인접 서열에 관계없이 삼량체 아미노산 서열(AAA)에 결합하는 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 인접 서열로부터 어떠한 영향도 받지 않고 삼량체 AAA 서열에 결합하는 단일 결합 성분 또는 일단의 결합 성분(예를 들어, 400개의 결합 성분)을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 αAAAβ 형태의 상이한 5개의 아미노산 에피토프에 결합하며, 여기서 α 및 β는 임의의 아미노산일 수 있다. 두 번째 경우의 예에서 결합 성분은 조합된 효과를 가질 수 있다.
결합 및 결합활성
단일의 1가 친화성 시약의 경우, 친화성 시약과 결합 표적(예를 들어, 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티) 사이의 결합 상호작용의 강도는 친화성에 의해 특성화될 수 있다. 친화성은 해리 상수 또는 결합 상수의 형태로 정량적으로 표현될 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 결합된 복합체 AB를 형성하기 위한 친화성 시약 A와 결합 파트너 B 사이의 결합의 평형 분석으로부터 해리 상수 KD가 발생할 수 있다. A와 B 사이의 결합 속도 및 해리 속도는 각각 [A], [B] 및 [AB]로 표현되는 A, B 및 AB의 상대 농도에 따라 달라진다. 결합 속도(또는 온 레이트) ron은 다음과 같이 표현될 수 있다:
여기서 kon은 결합에 대한 속도 상수이다. 해리 속도(또는 오프 레이트) roff는 다음과 같이 표현될 수 있다:
여기서 koff는 해리에 대한 속도 상수이다. 온 레이트(1)와 오프 레이트(2) 사이의 평형에 기초하여 해리 상수는 다음과 같이 계산될 수 있다:
주어진 친화성 시약에 대해 KD 값이 작을수록 더 강한 결합을 나타내고 값이 클수록 더 약한 결합을 나타낸다.
복수의 결합 성분을 갖는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대해 겉보기 해리 상수를 결정할 수 있다. 겉보기 해리 상수는 1가 친화성 시약의 해리 상수와 유사하게 계산할 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 결합된 복합체 PB를 형성하기 위한 검출 가능한 프로브(또는 친화성 시약) P와 결합 파트너 B 사이의 결합의 평형 분석으로부터 겉보기 해리 상수 KD,a가 발생할 수 있다. P와 B 사이의 겉보기 결합 속도 및 해리 속도는 각각 [P], [B] 및 [PB]로 표현되는 P, B 및 PB의 상대 농도에 따라 달라질 수 있다. 겉보기 결합 속도(또는 겉보기 온 레이트) ron,a는 다음과 같이 표현될 수 있다:
여기서 kon,a는 결합에 대한 겉보기 속도 상수이다. 겉보기 해리 속도(또는 겉보기 오프 레이트) roff,a는 다음과 같이 표현될 수 있다:
여기서 koff,a는 해리에 대한 겉보기 속도 상수이다. 겉보기 온 레이트(1)와 겉보기 오프 레이트(2) 사이의 평형에 기초하여 겉보기 해리 상수는 다음과 같이 계산할 수 있다:
다가의 검출 가능한 프로브 또는 다가 친화성 시약의 경우, KD,a 값이 작을수록 더 강한 결합을 나타내고 값이 클수록 더 약한 결합을 나타낸다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성은 일반적으로 구성 결합 성분의 해리 상수에 비해 프로브에 대한 겉보기 해리 상수의 감소로서 설명될 수 있다. 예를 들어, N개의 결합 성분을 포함하는 프로브의 경우, 각각의 개별 결합 성분은 위의 등식 1-3에 의해 설명된 개별 해리 상수, 예를 들어, {KD,1, KD,2,...KD,N}를 가질 수 있다. N개의 결합 성분을 갖는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 전체로서 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대한 겉보기 해리 상수 KD,a가 N개의 결합 성분 각각에 대한 각각의 해리 상수 미만일 때, 예를 들어, KD,a < {KD,1, KD,2,…KD,N}일 때 증가된 결합활성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 해리 상수가 단순히 KD(즉, KD,1 = KD,2 = …. = KD,N = KD)인 동일한 유형 및 종의 복수의 N개의 결합 성분을 포함하면, 결합활성은 단순히 KD,a < KD로 정의될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 해리 상수가 {KD,1, KD,2,...KD,N}이고 가장 강력한 결합제가 KD,min인 상이한 유형 및/종의 복수의 N개의 결합 성분을 포함하면, 결합활성은 KD,a < KD,min으로 간단하게 정의할 수 있다.
본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 KD,min보다 상당히 더 작은 KD,a를 나타내는 경우, 예를 들어, KD,a < KD,min의 크기가 약 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010배 또는 1010배 초과인 경우 바람직할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 KD,a < KD,min의 크기가 적어도 약101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010배 또는 1010배 초과인 경우 특정 결합 표적에 대해 선택될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 KD,a < KD,min의 크기가 약 1010, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101배 이하 또는 101배 미만인 경우 특정 결합 표적에 대해 선택될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 KD,a < KD,min이 너무 큰 경우 매우 작은 오프 레이트로 표시되는 과도한 결합을 나타낼 수 있기 때문에 덜 유리할 수 있다.
검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이의 결합 성분의 해리 상수는 적어도 약 0.1nM, 0.5nM, 1nM, 5nM, 10nM, 15nM, 20nM, 25nM, 30nM, 35nM, 40nM, 45nM, 50nM, 55nM, 60nM, 65nM, 70nM, 75nM, 80nM, 85nM, 90nM, 95nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM, 300nM, 350nM, 400nM, 450nM, 500nM, 550nM, 600nM, 650nM, 700nM, 750nM, 800nM, 850nM, 900nM, 950nM, 1μM, 2μM, 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이의 결합 성분의 해리 상수는 약 10μM, 9μM, 8μM, 7μM, 6μM, 5μM, 4μM, 3μM, 2μM, 1μM, 950nM, 900nM, 850nM, 800nM, 750nM, 700nM, 650nM, 600nM, 550nM, 500nM, 450nM, 400nM, 350nM, 300nM, 250nM, 200nM, 150nM, 100nM, 95nM, 90nM, 85nM, 80nM, 75nM, 70nM, 65nM, 60nM, 55nM, 50nM, 45nM, 40nM, 35nM, 30nM, 25nM, 20nM, 15nM, 10nM, 5nM, 1nM, 0.5nM, 0.1nM 이하일 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 겉보기 또는 측정된 해리 상수가 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 부착되는 결합 성분에 대한 해리 상수보다 작을 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대한 더 낮은 해리 상수는 증가된 결합 온 레이트, 증가된 kon, 감소된 결합 오프 레이트, 감소된 koff, 또는 이들의 조합에 기인할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 부착되는 복수의 결합 성분 중 임의의 결합 성분에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 겉보기 또는 측정된 해리 상수의 감소는 N배 감소(즉, KD, 프로브 = (1/N)KD, 결합 성분)일 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 부착되는 복수의 결합 성분 중 임의의 결합 성분에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 겉보기 또는 측정된 해리 속도 상수의 감소는 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 25배, 50배, 100배, 250배 500배, 1000배 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 부착되는 복수의 결합 성분 중 임의의 결합 성분에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 겉보기 또는 측정된 해리 상수의 감소는 약 1000배, 500배, 250배, 100배, 50배, 25배, 20배, 15배, 10배, 9배, 8배, 7배, 6배, 5배, 4배, 3배, 2배 이하일 수 있다.
일부 경우에, 결합활성을 정량적으로 설명하는 것이 유용할 수 있다. 결합 표적에 대한 가장 강력한 결합제가 해리 상수 KD,min을 갖는 N개의 결합 성분 세트에 대해, 결합활성 AN은 다음과 같이 정의될 수 있다:
여기서 KD,a는 N개의 결합 성분의 세트를 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 겉보기 해리 상수이다. 일부 구성에서, 본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 AN이 1보다 클 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 AN은 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2500, 5000, 10000, 25000, 50000, 100000, 1000000, 10000000, 100000000, 1000000000, 10000000000 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 AN은 약 10000000000, 1000000000, 100000000, 10000000, 1000000, 100000, 50000, 25000, 10000, 5000, 2500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 125, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 이하일 수 있다.
결합활성은 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브가 결합 파트너와의 결합 상호작용을 형성하기 위한 다중 경로를 가질 때 결합 파트너에 대한 변경된 겉보기 친화성을 나타내는 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브의 능력을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 10개의 결합 성분을 포함하고 각각의 결합 성분이 결합 표적 X에 대한 친화성을 갖는 경우, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 표적 X와의 결합 상호작용을 형성하기 위한 10개의 가능한 경로를 가진다. 결합활성은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 복수의 결합 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 겉보기 친화성이 복수의 결합 성분 중 임의의 결합 성분의 친화성보다 더 강할 수 있는 증폭 효과일 수 있다. 예를 들어, 10개의 결합 성분을 갖는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 부착되는 가장 강력한 결합 성분이 단지 800나노몰(nM)의 해리 상수를 가질 때 50nM의 측정된 해리 상수를 가질 수 있다.
복수의 결합 성분의 존재하에 이전의 결합 상호작용이 파괴된 직후 새로운 결합 상호작용이 형성되는 경향으로 인해 결합활성이 발생할 수 있다. 결과적으로, 검출 가능한 프로브(또는 친화성 시약)와 결합 파트너 사이의 결합 상호작용은 단일 결합 성분과 결합 파트너 사이에서 관찰된 결합 상호작용보다 더 긴 시간 규모에 걸쳐 발생하는 것으로 관찰될 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 결합은 프로브의 열역학적, 동역학 및/또는 물질 전달 특성을 변경하기 위해 프로브 설계의 변형에 의해 조정 가능할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성은 다음을 포함하는, 결합 상호작용의 가능성을 변경하는 요인에 의해 영향을 받을 수 있다: 1) 프로브 상의 결합 성분 밀도; 2) 프로브 상의 결합 성분의 총 수; 3) 결합 성분의 유형 및/또는 종; 4) 결합 성분 결합 열역학; 6) 결합 성분 결합 동역학; 5) 프로브 크기 및/또는 중량; 6) 프로브 형상 및/또는 형태; 및 7) 2차 결합 상호작용 중재자.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 풀의 열역학적 및 동역학 결합 거동에 따라, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 증가된 농도는 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합을 촉진할 수 있다. 결합 검정에서 사용되는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 유효 또는 표적 농도는 프로브 자체, 프로브 상의 결합 성분의 총 수, 또는 이종 결합 성분 혼합물을 가진 프로브의 경우에 결합 성분의 특정 종의 수를 참조하여 계산할 수 있다. 예를 들어, 1:1의 항체/압타머 비율에서 프로브당 총 20개의 결합 성분을 함유하도록 제작된 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 0.1몰/리터(M)로 제공되는 용액은 결합 성분의 총 농도가 2M이거나 압타머 또는 항체의 농도가 1M일 것이다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 유효 또는 표적 농도는 질량 또는 몰 기준으로 결정될 수 있다. 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이의 결합 성분은 의도된 목적을 위해 바람직한 농도(예를 들어, 결합활성을 최적화하는 농도)로 제공될 수 있다.
검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이의 결합 성분은 적어도 약 1×10-15 M, 5×10-15 M, 1×10-14 M, 5×10-14 M, 1×10-13 M, 5×10-13 M, 1×10-12 M, 5×10-12 M, 1×10-11 M, 5×10-11 M, 1×10-10 M, 5×10-10 M, 1×10-9 M, 5×10-9 M, 1×10-8 M, 5×10-8 M, 1×10-7 M, 5×10-7 M, 1×10-6 M, 5×10-6 M, 1×10-5 M, 5×10-5 M, 1×10-4 M, 5×10-4 M, 1×10-3 M, 5×10-3 M, 1×10-2 M, 5×10-2 M, 1×10-1 M, 5×10-1 M, 1M 이상의 농도로 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이의 결합 성분은 약 1M, 5×10-1 M, 1×10-1 M, 5×10-2 M, 1×10-2 M, 5×10-3 M, 1×10-3 M, 5×10-4 M, 1×10-4 M, 5×10-5 M, 1×10-5 M, 5×10-6 M, 1×10-6 M, 5×10-7 M, 1×10-7 M, 5×10-8 M, 1×10-8 M, 5×10-9 M, 1×10-9 M, 5×10-10 M, 1×10-10 M, 5×10-11 M, 1×10-11 M, 5×10-12 M, 1×10-12 M, 5×10-13 M, 1×10-13 M, 5×10-14 M, 1×10-14 M, 5×10-15 M, 1×10-15 M 이하의 농도로 제공될 수 있다.
프로브의 크기는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성 특성에 영향을 미칠 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 물질 전달 특성은 프로브의 크기 및/또는 중량에 의해 영향을 받을 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 물질 전달 물리적 특성(예를 들어, 확산 계수)은 프로브의 크기 및/또는 중량에 따라 달라지는 물질 전달 물리적 특성에 대한 스케일링(scaling) 관계를 가질 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 프로브 분자량(즉, D ~ MW-2)에 대한 멱법칙(power law) 관계로 확장되는 물에서 단일 성분 확산 계수를 가질 수 있다. 더 크고/거나 무거운 친화성 시약 또는 감지 가능한 프로브는 용액 또는 용매에서 확산 속도가 감소할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 감소된 확산 속도는 프로브가 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티로부터 확산될 수 있기 전에 발생하는 결합 상호작용의 가능성 증가로 인해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 겉보기 결합활성의 감소로 관찰될 수 있다.
프로브는 특성화된 분자량이 적어도 약 1kDa, 10kDa, 50kDa, 100kDa, 500kDa, 1000kDa, 1500kDa, 2000kDa, 2500kDa, 3000kDa, 3500kDa, 4000kDa, 4500kDa, 5000kDa, 5500kDa, 6000kDa, 6500kDa, 7000kDa, 7500kDa, 8000kDa, 8500kDa, 9000kDa, 9500kDa, 10000kDa 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 프로브는 특성화된 분자량이 약 10000kDa, 9500kDa, 9000kDa, 8500kDa, 8000kDa, 7500kDa, 7000kDa, 6500kDa, 6000kDa, 5500kDa, 5000kDa, 4500kDa, 4000kDa, 3500kDa, 3000kDa, 2500kDa, 2000kDa, 1500kDa, 1000kDa, 500kDa, 100kDa, 50kDa, 10kDa, 1kDa 이하일 수 있다.
일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성은 2차 결합 상호작용에 의해 영향을 받을 수 있다. 2차 결합 상호작용은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 갖도록 설계된 2차 분자를 포함하는 약한 또는 단기 상호작용일 수 있다. 2차 결합 상호작용은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티로부터의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 겉보기 확산 속도를 감소시키는 2차 분자를 포함하는 약한 또는 단기 상호작용을 포함할 수 있다. 2차 결합 상호작용은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 친화성을 갖는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 결합 파트너와 함께 관찰되는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 가능성을 증가시킬 수 있다. 일부 구성에서, 2차 분자는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 상의 상보성 리간드 및/또는 모이어티와 약한 상호작용을 형성할 수 있는 하나 이상의 리간드 및/또는 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 2차 분자는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 핵산 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산 서열을 가질 수 있다. 이와 같이, 2차 분자 및 프로브는 두 서열의 혼성화를 통해 약한 상호작용을 형성하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 약한 상호작용은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 또는 2차 분자의 서열에서 헤어핀 또는 루프 구조의 사용으로 인한 상호작용과 같은 불완전하거나 불연속적인 혼성화, 그렇지 않으면 검출 가능한 프로브(또는 친화성 시약) 및 2차 분자의 상보성 영역에서의 불일치 뉴클레오티드, 또는 더 약한 염기쌍 결합을 생성하는 검출 가능한 프로브(또는 친화성 시약) 또는 2차 분자의 변형된 또는 비천연 뉴클레오티드로 인해 발생할 수 있다. 다른 구성에서, 2차 분자는 결합 파트너와 약한 상호작용을 형성할 수 있는 하나 이상의 리간드 및/또는 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브(또는 친화성 시약) 또는 2차 분자는 약한 결합 상호작용을 형성하도록 구성된 복수의 분자를 포함할 수 있다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 상호작용하는 2차 분자는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 예를 들어, 2차 분자는 고체 지지체에 부착되는 핵산 오리가미 또는 핵산 나노볼과 같은 SNAP일 수 있다. SNAP는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 하나 이상의 결합 성분에 대한 결합 파트너에 선택적으로 부착될 수 있다. 따라서, 2차 분자는 하나 이상의 결합 성분과 결합 파트너의 결합을 통해 고체 지지체와 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 회합을 매개할 수 있고 회합은 2차 분자와 SNAP 사이의 약한 상호작용에 의해 강화될 수 있다. 일부 구성에서, 복수의 SNAP가 어레이 형태의 고체 지지체에 부착된다. 어레이의 위치에는 공간적으로 분해된 결합 파트너에 부착된 SNAP가 있을 수 있으며, 결합 파트너 각각은 하나 이상의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 의해 인식될 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 방법에 유용하게 적용될 수 있는 예시적인 SNAP 및 고체 지지체는 각각 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 제17/062,405호(미국 특허 출원 공보 제2021/0101930 A1호로 공개됨) 및 WO 2019/195633 A1에 제시되어 있다.
도 8은 결합 파트너(830) 또는 결합 파트너(830) 내의 에피토프 또는 표적 모이어티와 상호작용을 형성하도록 구성된 검출 가능한 프로브(810)를 도시한다. 검출 가능한 프로브는 상호작용 영역(860)에서 상보성 분자(850)와 약한 상호작용을 형성하도록 구성된 펜던트 리간드(820)(예를 들어, 핵산)를 추가로 포함한다. 일부 구성에서, 2차 분자(850)는 앵커링 그룹(840), 결합 파트너(830) 또는 고체 지지체(870)에 결합되거나 회합될 수 있다. 일부 구성에서, 상호작용 영역(860)에서 펜던트 리간드(820)와 상보성 분자(850) 사이의 상호작용은 본질적으로 불안정하여 결합 파트너(830)로부터 검출 가능한 프로브(810)의 궁극적인 해리를 촉진할 수 있다. 다른 구성에서, 상호작용 영역(860)에서 펜던트 리간드(820)와 상보성 분자(850) 사이의 상호작용은 파괴되도록 구성될 수 있다(예를 들어, 변성제의 존재 시).
도 9a - 9b는 한 쌍의 상보성 핵산을 활용하여 검출 가능한 프로브와 2차 분자 사이에 약한 상호작용을 형성하기 위한 가능한 구성을 도시한다. 도 9a는 검출 가능한 프로브 또는 2차 분자에 커플링될 수 있는 제1 핵산(910) 및 검출 가능한 프로브-2차 분자 쌍의 반대 분자에 커플링될 수 있는 제2 핵산(920)을 도시한다. 제1 핵산(910)은 불완전하거나 불연속적인 방식으로 제2 핵산(920)에 혼성화하여 약한 상호작용 영역(930)을 형성하도록 구성된다. 일부 구성에서, 불완전하거나 불연속적인 혼성화는 헤어핀 또는 루프 구조, 불일치 뉴클레오티드, 또는 더 약한 염기쌍 결합을 생성하는 변형된 또는 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 도 9b는 검출 가능한 프로브와 짧은 혼성화 영역에 의해 두 핵산 사이에 형성되는 2차 분자 사이의 약한 상호작용을 나타낸다. 검출 가능한 프로브(940)는 제2 핵산(920)과 혼성화하도록 구성된 제1 핵산(910)을 포함할 수 있다. 제1 핵산(910)과 제2 핵산(920)은 제한된 수의 결합된 염기쌍을 함유하는 약한 상호작용 영역(930)에서 혼성화하여 염기쌍 결합이 어느 정도 가역성 또는 해리성을 갖도록 한다. 약한 상호작용 영역은, 예를 들어, 약 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2개 이하 또는 약 2개 미만의 뉴클레오티드와 같은 제한된 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 약한 염기쌍 상호작용 영역은 핵산의 말단 부분 또는 핵산 서열의 내부 부분에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 검출 가능한 프로브는 단일 가닥 영역을 갖는 부분적으로 혼성화되지 않은 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥 영역은 결합 파트너와 회합되는 상보성 핵산에 결합된다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥 영역은 상보성 프라이머 서열에 결합하도록 구성된 프라이머 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 서열은 토홀드 변위(toehold displacement) 반응을 일으키도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 프라이머 서열은 상보성 프라이머 서열에 결합할 때 헤어핀 또는 루프 구조를 형성하도록 구성된다.
도 10a - 10c는 2차 분자와 검출 가능한 프로브 사이에 약한 결합 상호작용을 형성하기 위한 토홀드 변위 전략을 도시한다. 도 10a는 토홀드 변위 반응의 제1 단계를 보여준다. 제1 핵산(1020)을 포함하는 검출 가능한 프로브(1010)는 2차 분자와 회합된 제2 핵산(1050)에 접근한다. 제1 핵산 분자(1020)는 토홀드 서열(1030) 및 프라이밍 서열(1040)을 함유하는 혼성화 서열을 포함한다. 제2 핵산(1050)은 상보성 토홀드 서열(1060) 및 상보성 프라이밍 서열(1070)을 포함하는 상보성 혼성화 서열을 포함한다. 제2 핵산(1050)은 혼성화 서열의 상보성 토홀드 서열(1060)에만 혼성화하는 토홀드 프라이머(1080)에 혼성화될 수 있다. 제1 핵산(1020)의 프라이밍 서열(1040)은 제2 핵산(1050)의 상보성 프라이밍 서열(1070)과 혼성화하여 검출 가능한 프로브(1010)와 2차 분자 사이에 초기 약한 결합 상호작용을 형성할 수 있다. 검출 가능한 프로브(1010)와 2차 분자 사이의 약한 결합 상호작용은 어느 정도의 가역성 또는 해리성을 가질 수 있다. 도 10b는 토홀드 변위 반응의 제2 단계를 보여준다. 제1 핵산(1020)의 토홀드 서열(1030)은 토홀드 프라이머(1080)를 대체하여 토홀드 서열이 제2 핵산(1050)의 상보성 토홀드 서열(1060)과 완전한 혼성화하도록 한다. 약한 결합 상호작용에 대해 인접한 용액 또는 용매 중 토홀드 프라이머(1080)의 지속적인 존재는 토홀드 프라이머(1080)에 의한 제2 핵산(1050)으로부터의 제1 핵산(1020)의 변위에 의해 토홀드 변위 반응의 역전을 야기할 수 있다.
도 10c는 검출 가능한 프로브와 2차 분자 사이에 약한 결합 상호작용을 형성하기 위한 대안적 접근법을 도시한다. 검출 가능한 프로브(1010)는 제2 핵산 가닥(1050) 상의 상보성 프라이밍 서열(1070)에 결합하는 프라이밍 서열(1040)을 함유하는 제1 핵산 가닥(1020)을 포함한다. 제2 핵산 가닥(1050)은 또한 제1 핵산 서열(1020)에 상보적이지 않은 상보성 토홀드 서열(1060)을 함유한다. 검출 가능한 프로브-2차 분자 복합체는 토홀드 서열(1030) 및 프라이밍 서열(1040)을 포함하는 토홀드 프라이머를 포함하는 용액 또는 용매와 접촉될 수 있다. 토홀드 프라이머는 프라이밍 서열(1040)과 상보성 프라이밍 서열(1070)의 염기쌍 결합을 파괴함으로써 제1 핵산 가닥(1020)을 가역적으로 대체할 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브의 결합과 변위 사이의 평형은 하나 이상의 토홀드 변위 반응물(예를 들어, 토홀드 프라이머, 검출 가능한 프로브)의 농도를 조정함으로써 제어될 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성은 친화성이 상이한 또 다른 결합 분자를 이용함으로써 증가될 수도 있다. 일부 구성에서, 친화성 시약은 하나 이상의 결합 성분, 예를 들어, 복수의 결합 성분에 부착된 고정 성분을 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 친화성 시약은 단일 결합 성분을 갖는다. 일부 구성에서, 결합 분자는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이다. 결합 분자는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약보다 낮은 친화성 및/또는 결합활성으로 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 결합하는 특성이 있을 수 있다. 결합 분자는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 커플링되어 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 결합 분자의 동시 결합이 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 관찰된 결합활성 또는 친화성의 명백한 증가를 생성하도록 할 수 있다.
도 11a - 11c는 결합 분자의 2차 결합 상호작용을 사용하여 검출 가능한 프로브의 결합활성을 증가시키는 시스템을 도시한다. 도 11a에 나타낸 바와 같이, 검출 가능한 프로브(1110)는 링커(1190)(예를 들어, 공유 이종이작용성 링커, 혼성화된 핵산 등)에 의해 결합 분자(1130)(예를 들어, 제2 검출 가능한 프로브)에 연결된다. 예를 들어, 링커는 유연할 수 있어 검출 가능한 프로브(1110)가 결합 분자(1130)와 직접 상호작용할 수 있다. 대안적으로 링커는, 예를 들어, 비교적 강성이어서 검출 가능한 프로브(1110)가 결합 분자(1130)와 직접 상호작용하는 것을 제한할 수 있다. 검출 가능한 프로브(1110)는 제1의 복수의 결합 성분(1120)을 포함하고, 결합 분자(1130)는 제2의 복수의 결합 성분(1140)을 포함한다. 검출 가능한 프로브(1110)와 결합 분자(1130)가 연결되어 형성된 복합체를 포함하는 조성물은 에피토프 또는 표적 모이어티(1160) 및 2차 결합 위치(1170)를 함유하는 결합 파트너(1150)와 접촉된다. 도 11b에 나타낸 바와 같이, 결합 상호작용은 제1의 복수의 결합 성분(1120)의 결합 성분과 에피토프 또는 표적 모이어티(1160)의 초기 결합에 의해 개시될 수 있다. 초기 결합 시, 결합 분자는 결합 파트너(1150)와 아직 2차 상호작용을 형성하지 않았을 수 있다. 도 11c에 나타낸 바와 같이, 결합 과정은 제2의 복수의 결합 성분(1140)의 결합 성분이 2차 결합 위치(1170)와 2차 결합 상호작용을 형성하여 검출 가능한 프로브(1110) 및 결합 분자(1130)를 결합 파트너(1150)에 결합시킬 때 완료될 수 있다. 결합 분자(1130)와 2차 결합 표적(1170) 사이의 약한 2차 결합 상호작용은 검출 가능한 프로브(1110)가 결합 파트너(1150)에 결합된 것으로 관찰될 가능성을 증가시킬 수 있다. 당업자는 결합 복합체의 결합 순서가 역전될 수 있음을, 예를 들어, 결합 분자(1130)가 먼저 2차 결합 부위(1170)에 결합한 다음, 검출 가능한 프로브(1110)가 에피토프 또는 표적 모이어티(1160)에 결합함을 쉽게 인식할 것이다.
도 11d - 11e는 결합 분자의 2차 결합 상호작용을 사용하여 검출 가능한 프로브의 결합활성을 증가시키기 위한 대체 시스템을 도시한다. 도 11d에 나타낸 바와 같이, 제1의 복수의 결합 성분(1120) 및 연결 영역(1192)을 포함하는 제1 연결 그룹(1191)을 포함하는 검출 가능한 프로브(1110)는 결합 파트너(1150)의 에피토프 또는 표적 모이어티(1160)에 결합된다. 결합 성분(1140) 및 상보성 연결 영역(1194)을 포함하는 제2 연결 그룹(1193)은 결합 파트너(1150)와 접촉한다. 도 11e에서, 복수의 결합 성분(1140)의 결합 성분은 결합 분자(1130)를 결합 파트너의 2차 결합 위치(1170)에 결합함으로써 약한 2차 결합 상호작용을 형성한다. 결합 분자(1130)의 결합 후에, 연결 영역(1192)과 상보적 연결 영역(1194)이 연결될 수 있고, 이로써 검출가능한 프로브(1110)와 결합 분자(1130) 사이에 링커를 형성할 수 있다. 결합 분자(1130)와 2차 결합 위치(1170) 사이의 약한 2차 결합 상호작용은 검출 가능한 프로브(1110)가 결합 파트너(1150)에 결합된 것으로 관찰될 가능성을 증가시킬 수 있다. 당업자는 결합 복합체의 결합 순서가 역전될 수 있음을, 예를 들어, 결합 분자(1130)가 먼저 2차 결합 부위(1170)에 결합한 다음, 검출 가능한 프로브(1110)가 에피토프 또는 표적 모이어티(1160)에 결합함을 쉽게 인식할 것이다. 제1 연결 그룹(1191) 및 제2 연결 그룹(1193)은 공유 또는 비공유 상호작용을 형성하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 제1 연결 그룹(1191)은 핵산 연결 영역(1192)을 포함할 수 있고, 제2 연결 그룹(1193)은 핵산 연결 영역(1192)에 혼성화하도록 구성된 상보성 핵산 연결 영역(1194)을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 연결 영역(1192)은 (예를 들어, 클릭 반응에 의해) 상보성 연결 영역(1194)의 작용성 그룹에 화학적으로 결합하도록 구성된 작용성 그룹(예를 들어, 클릭 반응기)을 포함할 수 있다.
많은 경우에, 친화성 시약, 검출 가능한 프로브 또는 이의 결합 성분은 선택된 결합 파트너(예를 들어, 더 큰 폴리펩티드 구조 내의 폴리펩티드 분자 또는 아미노산 에피토프)에 결합할 비무작위 확률을 가질 수 있으며, 이는 주어진 에피토프 또는 에피토프 세트에 대해 다른 것에 비해 "특이성"이라고도 하는 일정 수준의 강화된 친화성을 나타냄을 의미한다. 많은 경우에, 특이성은 이분법적이지 않을 수 있는데, 즉 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브가 강화된 특이성을 나타내는 것인, 주어진 에피토프에 결합하지 않는 것처럼 보일 수 있으며, 때로는 특이성을 나타내지 않는 것인, 특정 에피토프에 결합하는 것처럼 보일 수 있다. 많은 경우에, 주어진 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브가 상술된 바와 같이 주어진 에피토프 또는 결합 파트너에 대해 특이적인지 여부는 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브가 결합 검정 조건 하에서 주어진 에피토프 또는 결합 파트너에 결합할 확률과 상관관계가 있을 것이다. 예를 들어, 결합 확률이 확률 역치보다 크면 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 특정 에피토프 또는 결합 파트너에 대해 특이적인 것으로 간주될 수 있다. 확률 역치는 결합 검정을 수행하기 전에 알려질 수 있거나(즉, 역치가 사전 결정됨) 결합 검정 자체에서 결정될 수 있다(즉, 역치가 경험적으로 결정됨). 일부 경우에, 특이적 결합과 상관관계가 있는 확률 역치는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상일 수 있다. 일부 경우에, 특이적 결합과 상관관계가 있는 확률 역치는 1%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 40% 초과일 수 있다. 반대로, 주어진 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브가 주어진 세트의 상황 하에서 주어진 에피토프 또는 결합 파트너에 결합하지 않을 확률(예를 들어, 위음성 결합 결과 제공)은 일부 경우에 1% 미만에서 99% 초과일 수 있고, 이는 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브가 상보성 에피토프 또는 폴리펩티드에 결합하지 않을 상당한 가능성이 있을 수 있음을 의미한다. 일부 경우에, 비특이성 또는 비결합과 상관관계가 있는 확률 역치는 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 미만일 수 있다. 일부 경우에, 비특이성 또는 비결합과 상관관계가 있는 확률 역치는 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 미만일 수 있다.
일부 실시양태에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 다음 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다: 특정 아미노산 종에 특이적으로 결합할 수 있고 19개 초과의 다른 아미노산 종에 결합하지 않을 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 20개의 필수 아미노산 중 하나에 결합할 수 있지만 다른 19개의 필수 아미노산에는 결합하지 않을 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 αXβ 형태의 서열의 적어도 10%에 결합할 수 있으며, 여기서 X는 원하는 에피토프이고 α 및 β는 임의의 아미노산 잔기이다. 일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 적어도 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 또는 90%의 αXβ 형태의 서열에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 무작위 서열 풀에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 평균 KD 값보다 적어도 10배 낮은 KD 값을 갖는 αXβ 형태의 서열의 적어도 10%에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 무작위 서열 풀에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 평균 KD 값보다 적어도 100배 낮은 KD 값을 갖는 αXβ 형태의 서열의 적어도 10%에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 무작위 서열 풀에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 평균 KD 값보다 적어도 1000배 낮은 KD 값을 갖는 αXβ 형태의 서열의 적어도 10%에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 다음 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다: 특정 3개의 아미노산 서열을 갖는 원하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, 임의의 다른 3개의 아미노산 서열에 결합하지 않을 수 있으며, 원하는 에피토프를 둘러싸는 인접 서열에 관계없이 실질적으로 유사한 친화성을 갖는 원하는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 이러한 특성 중 일부, 그보다 많이 또는 전부를 가질 수 있다. 일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 에피토프의 서브세트에 결합하지 않을 수 있다. 본 개시내용의 또 다른 측면은 다른 에피토프에 비해 이들 에피토프에 대한 선호도가 결정되고 인접 아미노산 잔기에 영향을 받는 공지된 세트의 3개의 아미노산 에피토프에 우선적으로 결합할 수 있는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 제공한다.
일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 인간 프로테옴의 모든 단백질의 5% 내지 10%에 결합하는 전환 가능한 압타머(switchable aptamer)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 전환 가능한 압타머는 2개 이상의 형광 모이어티를 포함할 수 있다. 전환 가능한 압타머는 본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합 성분일 수 있다.
일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대한 KD 값이 무작위 서열을 갖는 단백질 풀에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 평균 KD 값보다 적어도 10, 100 또는 1000배 더 낮은 주어진 서열에 결합하도록 구성된다.
일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 하나 이상의 구조적 컨텍스트에 있는 원하는 에피토프에 결합하는 능력이 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 에피토프를 갖는 폴리펩티드가 변성된 컨텍스트, 천연 컨텍스트 또는 둘 다에 있을 때 원하는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 폴딩되거나 폴딩되지 않은 컨텍스트 내의 폴리펩티드의 원하는 에피토프에 결합하는 능력이 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 변성된 폴리펩티드는 폴리펩티드 내의 하나 이상의 마이크로폴드(microfold) 영역을 함유하거나 생성할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 변성된 후 폴딩되도록 허용된 폴리펩티드에서 원하는 에피토프에 결합하도록 설계될 수 있다. 생성된 폴리펩티드는 활성 폴딩 상태로 재생성되거나, 부분적으로 다시 폴딩되거나, 다른 상태로 폴딩될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 변성된 및/또는 변성된 상태로부터 폴딩되도록 허용된 폴리펩티드의 폴딩되거나 폴딩되지 않은 영역의 에피토프에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 원하는 에피토프 서열(예를 들어, AAA)을 인식하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 상기 에피토프 서열을 함유하는 모든 폴리펩티드에 동등하게 잘 결합하거나 거의 동등하게 잘 결합할 수 있다. 일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 에피토프의 서열 컨텍스트의 차이에 따라 상이한 친화성으로 원하는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 서열 컨텍스트에 관계없이 여러 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 서열 컨텍스트에 따라 상이한 친화성으로 여러 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 특성을 가진 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합 특성을 결정하기 위한 스크리닝 방법의 조합에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 공통 코어 서열을 제외하고 서로 상이한 폴리펩티드 서열 세트에 결합하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다(예를 들어, αAAAβ 형태의 아미노산 에피토프, 여기서 AAA는 공통 코어 서열 및 α 및 β는 임의의 아미노산일 수 있음).
일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 원하는 에피토프는 펩티드 서열일 수 있다. 일부 경우에, 여러 상이한 에피토프가 필요할 수 있다. 이 경우, 복수의 원하는 에피토프에 결합하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 선택될 수 있다. 일부 경우에, 원하는 에피토프 또는 에피토프를 X로 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 에피토프는 비연속적 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 에피토프는 폴리펩티드의 1차 서열 영역에서 2, 3 또는 4번째 아미노산 잔기마다 특정된 아미노산을 포함할 수 있다. 에피토프는 2개의 특정된 아미노산이 가변 아미노산에 의해 분리된 3개의 아미노산 서열(예를 들어, AαA, 여기서 A는 알라닌이고 α는 임의의 아미노산임), 2개의 특정된 아미노산이 2개의 가변 아미노산에 의해 분리된 4개의 아미노산 서열(예를 들어, AαβA, 여기서 A는 알라닌이고 α 및 β는 임의의 아미노산임), 2개의 특정된 아미노산이 3개의 가변 아미노산에 의해 분리된 5개의 아미노산의 서열 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 2개 이상의 비연속 에피토프의 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 에피토프는 잔기가 단백질 서열에서 근접하지 않더라도(즉, 단백질의 1차 구조에서 근접하지 않더라도) 단백질 2차 또는 3차 구조에서 서로 근접하게 위치하는 여러 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 에피토프는 특정된 아미노산의 연속 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 원하는 에피토프 X는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산의 짧은 아미노산 서열이다. 일부 경우에, X는 여러 상이한 짧은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 원하는 에피토프 X는 3개의 아미노산 서열 X 1 X 2 X 3 이다. 다양한 서열 컨텍스트에서 이 원하는 에피토프에 결합하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 원하는 에피토프를 포함하는 표적 폴리펩티드에 대한 결합을 스크리닝함으로써 확인될 수 있다.
표적은 원하는 서열 X를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 복수는 용액상의 폴리펩티드 풀, 고체 지지체 상의 폴리펩티드 어레이, 복수의 폴리펩티드 중 하나 이상을 각각 함유하는 용기 집합체 중에서 고체 지지체 상의 용기 등과 같은 다양한 형상 중 임의의 것일 수 있다. 일부 경우에, 표적은 서열 X 모두의 복수의 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서 표적은 서열 αXβ의 복수의 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서 X는 원하는 에피토프이고 α 및 β는 0개, 1개 또는 1개 초과의 아미노산의 임의의 서열일 수 있다. 예를 들어, 원하는 에피토프 X가 AAA이면 표적 폴리펩티드에서 발견될 수 있는 서열의 예는 AAAAA, AAAAC, CAAAA, CAAAC 및 CAAAD를 포함할 수 있다. 일부 경우에, α와 β는 각각 단일 아미노산일 수 있다. α에 대한 아미노산은 β에 대한 아미노산과 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 경우에, α 및 β 중 적어도 하나는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산일 수 있다. α에 대한 서열은 β에 대한 서열과 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 경우에, α 및 β 중 적어도 하나는 링커 또는 스페이서를 포함할 수 있다. 링커 또는 스페이서는 본원에 제시되거나 당업계에 공지된 임의의 링커 또는 스페이서일 수 있다. 일부 경우에, 링커는, 예를 들어, 아미노산 링커인 펩티드 백본을 갖는다. 일부 경우에, 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG 중합체 사슬이다. PEG 사슬은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50개 이상의 에틸렌 글리콜 단량체로 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 링커는 탄소 사슬일 수 있다. 폴리펩티드는 또한 N 말단 또는 C 말단 변형, 예를 들어, 캡핑을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는, 예를 들어, 말단 아미드화(C-말단) 또는 아세틸화(N-말단)와 같이 전하를 제거하기 위해 변형될 수 있다. 일부 경우에, αXβ 펩티드는 비천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 경우에, αXβ 펩티드는 링커와 작용성 그룹으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 분자는 F-L-αXβ 구조일 수 있으며, 여기서 F는 작용성 그룹이고 L은 링커이다. 다른 경우에, 분자는 αXβ-L-F 구조일 수 있으며, 여기서 F는 작용성 그룹이고 L은 링커이다. 작용성 그룹 F는 선택적으로 반응성 모이어티와 공유 결합을 형성하거나 수용체에 결합할 수 있다. 일부 경우에, α 및 β는 각각 글리신일 수 있거나, 각각 하나 이상의 글리신 잔기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기는 변형되어 이의 압타제닉성(aptagenicity)을 변경할 수 있다. 예를 들어, 잔기는 양전하 추가; 음전하 추가; 소수성 그룹 추가; 당을 추가하도록 변형; 또는 화학 다양성을 증가시키기 위한 기타 변형에 의해 변경될 수 있다.
당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 폴리펩티드를 합성할 수 있다. MultiPep RSi 합성기(Intavis, Germany)와 같은 폴리펩티드 합성을 위한 여러 상용 플랫폼이 존재한다. 폴리펩티드는 액상 또는 고상 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 합성된 폴리펩티드는 알려진 폴리펩티드 분석 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 질량 분석법, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass spectrometry), 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization), 가속 질량 분석법(Accelerator Mass Spectrometry, AMS), 가스 크로마토그래피-MS, 액체 크로마토그래피-MS, 유도 결합 플라즈마-질량 분석법(Inductively Coupled Plasma-Mass spectrometry, ICP-MS), 동위원소 비율 질량 분석법(Isotope Ratio Mass Spectrometry, IRMS), 이온 이동성 분석법(Ion Mobility Spectrometry)-MS, 탠덤 MS, 열 이온화 질량 분석법(Thermal Ionization-Mass Spectrometry, TIMS) 또는 스파크 소스 질량 분석법(Spark Source Mass Spectrometry, SSMS)를 사용하여 확인할 수 있다. 합성된 펩티드의 농도는 또한 분광법으로 평가할 수 있다.
도 48은 표적을 포함하는 폴리펩티드의 예시적인 목록과 함께 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 선택 또는 특성화를 위한 고정된 표적을 예시한다. 도 48의 예에서 원하는 에피토프는 AAA이고, 표적의 폴리펩티드는 서열 αAAAβ를 포함하며, 여기서 α 및 β는 각각 단일 아미노산이다. 이 예에서 표적은 αAAAβ의 각각의 가능한 서열을 나타내는 400개의 상이한 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 α 및 β는 각각 단일 아미노산이다.
이러한 방식으로, 임의의 주어진 3-mer 에피토프에 대해 5-mer 풀을 포함하는 표적은 400개의 상이한 서열(α에 대한 20개의 가능성 및 β에 대한 20개의 가능성, 여기서 각각의 α 및 β는 단일 아미노산임)을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 표적은 α 및 β 각각 또는 둘 다가 2개 이상의 아미노산을 포함할 수 있는 5개 아미노산보다 긴 폴리펩티드 풀을 포함할 수 있다. 일부 경우에, α 및 β 중 하나는 0개의 아미노산을 포함할 수 있고, α 또는 β 중 다른 하나는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적은 추가 아미노산 없이 서열 X의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 표적 서열 X는 더 긴 서열에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 표적 서열 X는 15-mer 폴리펩티드 분자에 삽입된 15개 미만의 아미노산의 코어 서열일 수 있다. 표적 서열 X는 15-mer 내의 임의의 위치에 삽입될 수 있으며, 예를 들어, 3개의 아미노산 표적 서열 X의 경우, 표적 서열 X는 15-mer의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13에 있을 수 있다. 삽입된 표적 서열을 포함하는 폴리펩티드는 용액에서 합성될 수 있거나, 예를 들어, PEPperPRINT 칩 또는 다른 펩티드 어레이와 같은 칩 상에서 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 삽입된 표적 서열을 포함하는 폴리펩티드는 단일 분자 단백질 어레이 상에 결합되거나 합성될 수 있다. 2차 구조를 형성하거나 2차 구조가 결여되도록 더 긴 서열을 선택할 수 있다. 이러한 2차 구조의 예는 알파 나선, 베타 시트, 프롤린 벤드, 회전, 루프 및 시스테인 브릿지를 포함한다. 일부 경우에, 더 긴 서열은 비천연 발생 아미노산 또는 다른 그룹을 포함할 수 있다.
초기 선택 단계는 원하는 에피토프를 포함하는 표적에 대해 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브의 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함할 수 있다. 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브 또는 프로브 라이브러리는 DNA, RNA 또는 임의의 서열을 갖는 펩티드 압타머 또는 공지된 단백질 결합 압타머의 서열과 유사한 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 라이브러리는 압타머 라이브러리일 수 있다. 일부 경우에, 압타머 라이브러리는 상용 라이브러리일 수 있다. 일부 경우에, 압타머 라이브러리는 기관, 대학, 학술 센터 또는 연구 센터에서 사용할 수 있다. 일부 경우에, 라이브러리는 비드 또는 기타 입자에 부착된 압타머 라이브러리를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 압타머 라이브러리는 알려진 서열의 라이브러리 또는 무작위 서열로부터 생성될 수 있다. 일부 경우에, 압타머 라이브러리는, 예를 들어, 스템 루프 라이브러리(stem loop library)와 같은 특정 구조의 압타머를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 압타머 라이브러리는 전환 가능한 압타머 - 두 입체형태 사이에서 전환 가능한 압타머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 압타머는 금속 이온 보조인자의 존재하에 제1 입체형태를 형성하고 상기 보조인자 부재하에 제2 입체형태를 형성할 수 있다. 따라서 EDTA 또는 EGTA와 같은 킬레이트제를 추가하면 금속 이온이 격리되고 압타머가 상이한 입체형태에 적응하도록 한다. 압타머 전환을 유도하는 데 사용할 수 있는 다른 요인으로는 빛, pH, 온도, 자기장 및 전류가 있다.
표적에 대한 압타머 라이브러리의 스크리닝은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 한 측면에서, 표적은 고체 지지체 상에 고정될 수 있고 압타머는 낮은 특이성을 갖는 압타머가 결합될 수 있는 조건 하에서 추가될 수 있다. 결합되지 않은 압타머는 점점 더 엄격해지는 일련의 세척으로 표적으로부터 세척될 수 있다. 세척 단계를 통해 표적에 결합된 상태로 남아 있는 압타머는 추가 선택 라운드를 위해 시퀀싱 및 증폭되거나 높은 서열 유사성을 가진 추가 압타머의 설계에 사용될 수 있다. 원하는 특이성과 결합 친화성의 압타머가 생성될 때까지 여러 라운드의 표적 결합, 세척, 시퀀싱 및 증폭 또는 새로운 압타머의 설계가 반복될 수 있다. 압타머 라이브러리는 다수의 압타머 카피를 각각 포함하는 비드를 활용하는 비드 기반 접근법을 사용하여서도 스크리닝할 수 있다. 압타머 라이브러리는 어레이 기반 접근 방식을 사용하여서도, 예를 들어, 라이브러리의 각각의 압타머의 다중 카피를 어레이 상에 스팟팅한 다음 표적이 결합하는 스팟을 평가함으로써 스크리닝할 수 있다. 압타머 라이브러리는 입자 디스플레이 방식을 사용하여 스크리닝할 수도 있다. 예를 들어, 압타머에 부착된 비드 또는 기타 입자를 지지체 상에 배열하여 어레이를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 라이브러리는 단일 분자 단백질 어레이를 사용하여 스크리닝할 수 있다.
일부 경우에, 확인된 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 결합하는 표적의 분율 또는 백분율은, 예를 들어, 결합에 이용 가능한 폴리펩티드의 수와 프로브의 결합된 카피의 수를 비교함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 표적을 포함하는 폴리펩티드의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 이상에 결합할 수 있다. 추가로, 특정 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 확인되고 선택되면 검증될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 결합하는 것으로 특성화되는 에피토프를 함유하는 복수의 서열에 대해 검증될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 단일 분자 단백질 어레이 상의 복수의 단백질 서열에 대해 선택된 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 평가함으로써 검증될 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 선택 및 특성화 단계 전 또는 후에 검출 가능한 표지에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 초기 선택 단계 전에 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 표지(들)에 부착할 수 있다. 일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 초기 선택 단계 후 및 특성화 단계 전에 표지(들)에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 선택 및 특성화 단계 후에 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 표지(들)에 부착할 수 있다. 일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 선택 단계를 위해 제1 표지에 부착되고 특성화 단계를 위해 제2 표지에 부착될 수 있다. 제2 표지는 제1 표지와 함께 추가되거나 제1 표지 대신 추가될 수 있다. 일부 경우에, 제1 표지는 선택 및 특성화 단계에 사용될 수 있고 제2 표지는 최종 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브를 생성하는 데 사용될 수 있다.
검출 및 관찰 가능성
본 개시내용의 검출 가능한 프로브는 프로브에 관찰 가능성을 부여하는 검출 가능한 신호를 제공하도록 구성될 수 있다. 관찰 가능성은 검출 시스템의 배경이나 노이즈를 초과하는 수준에서 검출 장치가 쉽게 감지할 수 있는 물리적 신호를 생성하는 특성을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 형광 프로브는 배경 형광 신호 강도를 역치량, 예를 들어, 10%, 50%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배 이상을 초과하는 형광 신호 강도를 생성하는 경우 관찰 가능한 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 예에서, 핵산 바코드 신호는 증폭 여부에 관계없이 (예를 들어, 차세대 시퀀싱 또는 어레이 기반 혼성화에 의해) 역치 수의 서열 갯수를 생성하는 경우, 예를 들어, 10라운드의 신호 증폭 후에 1000개 이상의 서열 갯수를 생성하는 경우 관찰 가능한 것으로 간주될 수 있다. 일반적으로, 관찰 가능성은 다음을 포함하는 여러 요인에 의해 영향을 받을 수 있다: 1) 검출 가능한 프로브가 표적에 결합할 가능성; 2) 배경 신호의 강도; 및 3) 신호 감쇠 메커니즘. 검출 가능한 프로브가 표적에 결합할 가능성에 영향을 미칠 수 있는 요인은 위에 제시된 요인을 포함할 수 있다.
배경 신호는 원하는 신호와 비교하여 동일하거나 유사한 특성의 검출 가능한 신호를 의미할 수 있다. 예를 들어, 형광 표지 시스템에서, 배경 신호는 형광 표지로부터 예상되는 형광 신호와 동일한 파장 또는 방사선 파장 범위 내의 검출된 방사선을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 배경 형광 신호는 Alexa-Fluor® 488 염료를 관찰하려고 할 때 485nm 내지 495nm에서 검출될 수 있다. 방사 신호의 경우, 자연 형광, 자연 발광 또는 물질의 자가형광, 검출된 파장에서 외부 방사선의 투과, 반사 또는 굴절, 또는 이전 검출 공정으로부터 형광 프로브에 의해 남겨진 잔류 신호로 인해 배경 신호가 발생할 수 있다.
배경 방사 신호는 공간적으로 균일하거나 공간적으로 이질적일 수 있다. 일부 특성화 검정의 경우, 분석 전, 도중 또는 후에 방사 배경 신호를 측정할 수 있다. 예를 들어, 물질의 공간 구성은 하나 이상의 검출 가능한 프로브를 물질에 적용하는 다중 사이클이 특징일 수 있다. 연속적인 사이클 동안 검출 가능한 잔류 프로브가 물질에 무작위로 남아 연속적인 검출 사이클 동안 이질적인 배경 신호를 생성할 수 있다. 잔류 검출 가능한 프로브는 결국 해리될 수 있으며, 이는 배경 신호가 공간적 및 시간적 이질성을 가질 수 있음을 의미한다. 또 다른 예에서, 상술한 것과 동일한 물질 특성화 검정이 광학적으로 밀봉되지 않은 검출 시스템에서 발생할 수 있으므로 일부 외부 방사선이 시스템에서 검출될 수 있다. 외부 방사선은 물질에 걸쳐 균일하게 분포되지 않으므로 배경 신호에서 비균질 기울기 또는 방사선 분포를 검출할 수 있다. 외부 방사선은 시간이 지남에 따라 변하지 않을 수 있으므로 공간적으로는 이질적이지만 시간적으로는 균일한 배경을 유발한다.
검출 가능한 프로브는 배경 신호 역치를 초과하는 검출 가능한 신호를 생성하는 것이 특징일 수 있다. 발광 표지된 검출 가능한 프로브는 배경 형광 신호를 초과하는 형광 신호(또는 다른 유형의 발광 신호)를 갖는 것이 특징일 수 있다. 발광 신호는 배경 신호 또는 검출된 프로브 신호를 얻기 위해, 예를 들어, 고정된 기간에 걸친 총 광자 수에 의해 정량화될 수 있다. 정량화된 발광 신호는 지점, 위치 또는 어드레스에서 또는 복수의 지점, 위치 또는 어드레스를 포함하는 영역에 걸쳐 측정될 수 있다. 검출 가능한 프로브는 전체 영역에 대한 평균 신호 또는 영역 내의 최대 신호와 같은 임계 배경 신호 레벨을 초과하는 검출 가능한 신호를 갖도록 구성될 수 있다. 검출 가능한 프로브로부터의 신호의 전체 강도는 검출 가능한 프로브에 부착된 신호 표지(예를 들어, 형광단)의 총 수에 의해 제어될 수 있다. 프로브의 공간 강도(즉, 특정 위치에서의 신호 강도)는 프로브에 부착된 신호 표지(예를 들어, 형광단)의 밀도에 의해 제어될 수 있다.
검출 가능한 프로브는 예상되거나 관찰된 배경 신호를 초과하는 검출 가능한 신호를 생성하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 물질에 또는 물질 상의 결합 파트너에 결합하도록 구성된 검출 가능한 프로브는 물질에 의해 생성된 측정된 배경 신호를 초과하는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다. 검출 가능한 프로브는 배경 신호를 특정 양만큼 초과하는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다. 반대로, 검출 가능한 프로브는 신호 감지 모드에 따라 검출 가능한 한계보다 작은 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다. 검출 가능한 프로브는 배경 신호 강도를 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 75배, 100배 이상 초과하는 검출 가능한 신호 강도를 생성할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브는 배경 신호 강도를 약 100배, 75배, 50배, 40배, 30배, 25배, 20배, 19배, 18배, 17배, 16배, 15배, 14배, 13배, 12배, 11배, 10배, 9배, 8배, 7배, 6배, 5배, 4배, 3배, 2배, 1.5배 이하로 초과하는 검출 가능한 신호 강도를 생성할 수 있다.
방사 신호(예를 들어, 형광)의 경우, 방사 신호를 제거하거나 간섭하는 하나 이상의 메커니즘으로 인해 신호 감쇠가 발생할 수 있다. 예시적인 신호 감쇠 메커니즘은 소광, 자체 소광, 광표백 및 표지 손실을 포함할 수 있다. 방출을 억제하거나 방출된 광자를 흡수하는 화학종의 존재로 인해 소광이 발생할 수 있다. 특성화 시스템의 일부 종은 본질적으로 방출된 광자를 흡수하여 방사 신호를 감소시키거나 소멸시킬 수 있다. 일부 구성에서, 방사 신호를 소멸시킬 수 있는 종의 형성을 억제하는 검출 시스템(예를 들어, 아스코르베이트와 같은 산소 스캐빈저)에 특정 종이 추가될 수 있다. 소광의 특정 형태는 발광단으로부터의 발광 신호가 동일하거나 유사한 종의 제2 발광단에 의해 소광될 수 있는 자체 소광이다. 자체 소광은 인접한 발광단 사이의 간격 및 발광단의 상대적 배향과 같은 표지 간 구성과 관련될 수 있다. 일부 구성에서, 인접한 발광단 사이의 간격이 감소함에 따라 발광 신호가 감소할 수 있다. 다른 구성에서, 인접한 발광단 사이의 간격이 감소함에 따라 발광 신호가 증가할 수 있다(예를 들어, 포스터 공명 에너지 전달).
소광, 자체 소광 및 관련 광학 현상은 유효 양자 수율로 특성화될 수 있다. 개별 형광단은 특징적인 또는 측정된 양자 수율을 가질 수 있다. 복수의 형광단을 포함하는 검출 가능한 프로브 조성물의 유효 양자 수율은 검정 조건 하에서 측정되거나 특성화된 양자 수율일 수 있다. 검출 가능한 프로브 조성물은 유효 양자 수율이 적어도 약 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.51, 0.52, 0.53, 0.54, 0.55, 0.56, 0.57, 0.58, 0.59, 0.60, 0.61, 0.62, 0.63, 0.64, 0.65, 0.66, 0.67, 0.68, 0.69, 0.70, 0.71, 0.72, 0.73, 0.74, 0.75, 0.76, 0.77, 0.78, 0.79, 0.80, 0.81, 0.82, 0.83, 0.84, 0.85, 0.86, 0.87, 0.88, 0.89, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 조성물은 유효 양자 수율이 약 0.99, 0.98, 0.97, 0.96, 0.95, 0.94, 0.93, 0.92, 0.91, 0.90, 0.89, 0.88, 0.87, 0.86, 0.85, 0.84, 0.83, 0.82, 0.81, 0.80, 0.79, 0.78, 0.77, 0.76, 0.75, 0.74, 0.73, 0.72, 0.71, 0.70, 0.69, 0.68, 0.67, 0.66, 0.65, 0.64, 0.63, 0.62, 0.61, 0.60, 0.59, 0.58, 0.57, 0.56, 0.55, 0.54, 0.53, 0.52, 0.51, 0.50, 0.45, 0.4, 0.35, 0.3, 0.25, 0.2, 0.15, 0.1 이하일 수 있다.
복사 신호는 또한 광표백(photo-bleaching) 또는 표지 손실과 같은 화학 메커니즘에 의해 약해지거나 그렇지 않으면 감소될 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 형광 표지와 같은 표지에 비가역적인 화학 변화로 인해 광표백이 발생할 수 있다. 광표백은 형광단과 광자의 상호작용, 형광단을 손상시킬 수 있는 종(예를 들어, 삼중항 산소와 같은 자유 라디칼)과 광자의 상호작용, 및 형광단을 변경하거나 손상시키는 화학 종과 형광단 사이의 상호작용을 포함하는 임의의 알려진 메커니즘으로 인할 수 있다. 광표백 및 다른 형태의 신호 감쇠는 일시적이거나 시간 관련 현상일 수 있다. 예를 들어, 조사로 인한 광표백은 총 시간 또는 총 조사 시간에 비례하여 증가할 수 있다. 마찬가지로, 파괴적인 화학 변형 종의 총량 또는 농도는 광표백 속도에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 광자 수 또는 광자 밀도가 증가함에 따라 광표백 심각도가 증가할 수 있다. 광표백 또는 다른 화학 메커니즘으로 인한 신호 손실률은 시간에 따라 일정하거나 가변적(예를 들어, 지수(exponential), 대수(logarithmic))일 수 있다.
검출 가능한 프로브 조성물은 소광, 자체 소광, 광표백, 표지 손실 또는 기타 메커니즘으로 인해 시간 경과에 따라 가변적이거나 증가하는 신호 손실을 경험할 수 있다. 검출 가능한 프로브 조성물은 신호 손실률이 적어도 약 0.001%/분, 0.01%/분, 0.1%/분, 0.5%/분, 1%/분, 2%/분, 3%/분, 4%/분, 5%/분, 6%/분, 7%/분, 8%/분, 9%/분, 10%/분, 15%/분, 20%/분, 25%/분, 30%/분, 35%/분, 40%/분, 45%/분, 50%/분, 55%/분, 60%/분, 65%/분, 70%/분, 75%/분, 80%/분, 85%/분, 90%/분, 95%/분 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 조성물은 신호 손실률이 약 95%/분, 90%/분, 85%/분, 80%/분, 75%/분, 70%/분, 65%/분, 60%/분, 55%/분, 50%/분, 45%/분, 40%/분, 35%/분, 30%/분, 25%/분, 20%/분, 15%/분, 10%/분, 9%/분, 8%/분, 7%/분, 6%/분, 5%/분, 4%/분, 3%/분, 2%/분, 1%/분, 0.5%/분, 0.1%/분, 0.01%/분, 0.001%/분 이하일 수 있다.
검출 가능한 프로브는, 예를 들어, 배경 신호를 초과하는 강도를 갖거나 배경 신호로부터 분해되는 검출 가능한 특성을 가짐으로써 배경과 구별할 수 있는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다. 검출 가능한 프로브는 광표백 및 표지 손실과 같은 신호 저하 메커니즘에도 불구하고 주어진 시간 동안 배경 신호를 초과하는 신호 강도를 생성하는 것으로 특성화될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 형광 프로브는 적어도 10분의 연속 또는 비연속 여기 동안 배경 형광 신호를 초과하는 형광 신호를 가질 수 있다. 관찰 가능 시간은 검출 가능한 프로브가 국소 또는 평균 배경 신호와 구별할 수 있는 검출 가능한 신호를 생성하는 최소 길이의 시간으로 정의될 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브의 총 표지 성분 수를 늘려 관찰 가능 시간을 늘릴 수 있다. 관찰 가능 시간은 검출 가능한 프로브에 부착된 표지 성분의 수에 비례하여 늘어날 수 있다. 검정 전반에 걸쳐 검출 가능성을 보장하기 위해 검출 가능한 프로브의 관찰 가능 시간을 늘리거나 최대화할 수 있다. 검출 가능한 프로브의 관찰 가능 시간은 광표백과 같은 의도된 신호 제거를 가능하게 하기 위해 특정 값 내로 제한될 수 있다. 검출 가능한 프로브는 적어도 약 1초, 15초, 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 30분, 45분, 60분, 90분, 120분 이상 동안 관찰되거나 관찰 가능 시간이 상기와 같을 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브는 약 120분, 90분, 60분, 45분, 30분, 20분, 15분, 10분, 9분, 8분, 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분, 1분, 30초, 15초, 1초 이하 동안 관찰되거나 관찰 가능 시간이 상기와 같을 수 있다.
검출 가능한 프로브는 배경 신호를 충분히 초과하는 검출 가능한 신호를 생성함으로써 결합 상호작용의 관찰 가능성을 향상시킬 수 있다. 또한, 검출 가능한 프로브는 검출 가능한 신호의 공간 분해능을 개선하여 결합 상호작용의 관찰 가능성을 증가시킬 수 있다. 검출 가능한 프로브는 다음을 포함하는 여러 방법으로 검출 가능한 신호의 공간 분해능을 제공하도록 구성될 수 있다: 1) 광학적으로 조밀한 신호 소스를 생성하기 위해 고정 성분의 작은 영역 내에 표지를 집중시킴; 2) 광학적으로 균일한 신호 소스를 생성하기 위해 고정 성분의 넓은 영역에 걸쳐 표지를 분포함; 또는 3) 광학적으로 조밀하고 균일한 신호 소스를 생성하기 위해 고정 성분의 전체 또는 대부분에 걸쳐 표지를 집중시킴. 도 12a-12b는 검출 가능한 프로브를 이용하는 발광 신호(예를 들어, 형광 신호) 공간 분해능의 예를 도시한다. 도 12a는 복수의 형광단을 포함하는 단일 결합 성분이 영역의 중앙에 있는 결합 파트너에 결합될 때 배경 형광 카운트를 포함하는 영역(예를 들어, 물질의 표면)에 걸친 형광 카운트 데이터를 도시한다. 영역은 9개의 소구역(subregion)으로 균일하게 분할될 수 있으며 각 소구역은 형광에 대해 개별적으로 정량화될 수 있다(예를 들어, 각 소구역은 센서 픽셀에 해당할 수 있음). 친화성 시약에 부착된 형광단의 수는 친화성 시약의 구조 및 친화성으로 인해 제한될 수 있다. 도 12a의 형광 카운트는 아마도 친화성 시약과 결합 파트너 사이의 결합 상호작용으로 인해 중앙 소구역의 형광 카운트의 약간의 증가를 나타내지만, 신호 강도는 8개의 주변 소구역의 배경 카운트보다 충분히 높지 않아 결합 상호작용이 발생할 수 있다. 도 12b는 도 12a와 유사한 상황을 도시하지만 도 12a에 대해 기술된 친화성 시약보다 상당히 많은 수의 형광단을 포함하는 검출 가능한 프로브를 갖는다. 중앙 소구역에서 관찰된 현저하게 증가된 형광 신호는 (아마도 중앙 소구역으로부터의 신호 누화로 인한) 주변 소구역으로부터의 신호 증가와 함께 관찰된 신호가 결합 파트너와 검출 가능한 프로브의 결합 상호작용으로 인한 것이라는 신뢰도를 높인다.
검출 가능한 프로브는 고체 지지체, 표면 또는 시야의 영역에 걸쳐 검출 가능한 신호를 제공하도록 크기가 조정될 수 있다. 검출 가능한 프로브가 신호를 제공하는 영역의 크기는 영역 내의 특징부의 크기에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브는 결합 파트너(예를 들어, 폴리펩티드)가 점유하는 영역보다 더 큰 영역에 걸쳐 신호를 제공하도록 크기가 조정될 수 있다. 검출 가능한 프로브는, 예를 들어, 결합 파트너 또는 결합 파트너에 인접한 물질로부터의 자가형광을 감소시킴으로써 배경 신호를 감소시키기 위해 결합 파트너보다 더 크게 설계될 수 있다. 대안적으로, 검출 가능한 프로브는 검출 가능한 프로브로부터의 검출 가능한 신호의 공간 분해능을 증가시키기 위해 결합 파트너보다 작게 설계될 수 있다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 조성물은 검출 가능한 프로브가 결합하거나 친화성을 가질 수 있는 결합 파트너보다 더 큰 고체 지지체, 표면 또는 시야의 영역에 걸쳐 검출 가능한 신호를 생성하도록 설계될 수 있다. 특정 영역에 걸친 프로브의 관찰 가능성은 검출 가능한 프로브의 표면에 걸쳐 표지 성분의 분포 및/또는 농도를 증가시킴으로써 개선될 수 있다. 프로브는 검출 가능한 프로브에 의해 제공되는 검출 가능한 신호를 강화하는 추가 검출 분자를 포함함으로써 비교적 넓은 영역에 걸쳐 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다. 도 13은 인식하는 결합 파트너에 의해 점유된 면적에 비해 넓은 면적에 걸쳐 검출 가능한 신호를 생성하기 위한 검출 가능한 프로브 조성물을 예시한다. 검출 가능한 프로브(1310)는 선택적으로 고정 그룹(1340)(예를 들어, 구조화 핵산 입자와 같은 핵산 또는 작용성 그룹 연결)에 의해 표면 또는 고체 지지체(1370)에 고정된 결합 파트너(1330)(예를 들어 폴리펩티드)에 결합한다. 검출 가능한 프로브(1310)에 의해 생성된 검출 가능한 신호의 영역은 검출 가능한 프로브(1310)를 추가 검출 분자(1320)와 연결함으로써 증가된다. 검출 분자(1320)는 고정 성분 및 복수의 표지 성분(예를 들어, 형광단)을 포함할 수 있다. 검출 분자(1320)의 고정 성분은 결합 성분에 부착될 필요가 없다. 그러나 검출 분자(1320)의 고정 성분은 검출 가능한 프로브(1310)에 존재하는 것 이외의 결합 성분에 부착될 수 있다. 검출 분자(1320)는 링커(1325)에 의해 검출 가능한 프로브(1310)에 연결된다. 링커(1325)는 영구 링커(예를 들어, 이종이작용성 링커, 클릭 반응 생성물, 스트렙트아비딘-비오틴 연결) 또는 비영구적 링커(예를 들어, 혼성화된 핵산)일 수 있다. 링커는, 예를 들어, 검출 분자(1320)와 검출 가능한 프로브(1310) 사이의 직접적인 상호작용이 가능하게 가요성일 수 있다; 또는 링커는, 예를 들어, 검출 분자(1320)가 검출 가능한 프로브(1310)와 상호작용하는 것을 제한하는 강성일 수 있다. 검출 가능한 프로브(1310)와 검출 분자(1320)에 의해 형성된 복합체는 검출 가능한 프로브(1310)와 결합 파트너(1330)의 결합 전에 형성될 수 있거나 검출 가능한 프로브의 결합에 이어 검출 분자(1320)와 검출 가능한 프로브(1310)의 접촉에 의해 형성될 수 있다.
결합 파트너와 결합하도록 구성된 검출 가능한 프로브는 폴리펩티드의 크기에 비해 더 작거나 더 클 수 있다. 크기는 부피, 분자량, 최장 치수, 유효 지름, 회전 반경, 유체역학적 반경, 돌출부(예를 들어, 풋프린트) 등으로 측정할 수 있다. 대안적으로, 한 부위(예를 들어, 폴리펩티드 어레이 내의 한 부위)에서 결합 파트너와 결합하도록 구성된 검출 가능한 프로브는 부위의 크기에 비해 더 작거나 더 클 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 검출 가능한 프로브를 포함하는 복합체는 결합 파트너 또는 부위의 크기와 비교하여 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 이상의 크기일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 검출 가능한 프로브 또는 검출 가능한 프로브를 포함하는 복합체는 결합 파트너 또는 부위의 크기와 비교하여 약 1000%, 900%, 800%, 700%, 600%, 500%, 400%, 300%, 250%, 200%, 175%, 150%, 140%, 130%, 120%, 110%, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이하의 크기일 수 있다.
검출 가능한 프로브의 표지 성분은 검출 가능한 프로브 상에 하나 초과의 유형 또는 종의 표지 성분을 포함함으로써 다중 검출을 위해 구성될 수 있다. 복수의 결합 성분을 검출 가능한 프로브에 부착하는 능력은 멀티플렉싱을 위한 검출 가능한 프로브의 동적 유연성을 추가한다. 검출 가능한 프로브는 검출 가능한 프로브에 대한 고유한 핑거프린트 또는 시그니처를 구성하는 고유한 표지 성분 조합을 가질 수 있다. 결합 풀은 관찰된 특정 결합 상호작용이 시그니처 또는 핑거프린트의 관찰을 통해 결정될 수 있도록 특정 프로브 시그니처 또는 핑거프린트에 의해 표시되는 결합 특이성이 상이한 검출 가능한 프로브의 혼합물로부터 생성될 수 있다. 시그니처 또는 핑거프린트는 결합 성분의 유형 또는 종의 수는 물론 검출 가능한 프로브에 부착된 표지 성분의 비율을 변경하여 만들 수 있다. 검출 가능한 프로브는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 종의 표지 성분을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 멀티플렉싱 조성물에 대한 검출 가능한 프로브는 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 이하의 상이한 종의 표지 성분을 포함할 수 있다. 표지 성분의 제1 종 대 표지 성분의 제2 종의 비율은 적어도 약 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 표지 성분의 제1 종 대 표지 성분의 제2 종의 비율은 약 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1.1:1 이하일 수 있다.
멀티플렉싱된 프로브 조성물은 결합 친화성이 상이한 복수의 검출 가능한 프로브를 포함할 수 있으며, 임의의 주어진 검출 가능한 프로브의 결합 친화성은 검출 가능한 프로브 상의 표지 성분의 고유한 핑거프린트 또는 시그니처에 의해 결정될 수 있다. 멀티플렉싱된 프로브 조성물에서 검출 가능한 프로브의 고유한 유형의 수는 결합 상호작용을 관찰하기 위해 사용되는 검출 시스템의 유형 및 프로브 시그니처 또는 핑거프린트의 차이를 구별하기 위한 검출 시스템의 민감도에 의해 결정될 수 있다. 형광 표지의 경우, 형광 검출 시스템은 검출 가능한 프로브의 형광단의 형광 파장을 기반으로 제한된 수의 검출 채널을 가질 수 있다. 각 검출 채널 내의 검출 범위는 또한 검출 가능한 프로브에 추가되는 각 형광단의 양을 제한할 수 있다.
멀티플렉싱된 프로브 조성물은 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 고유한 유형의 검출 가능한 프로브를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 멀티플렉싱된 프로브 조성물은 약 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 이하의 고유한 유형의 검출 가능한 프로브를 포함할 수 있다. 고유함은 프로브에 존재하는 결합 성분의 수 또는 다양성, 프로브에 존재하는 표지 성분의 수 또는 다양성, 프로브에 존재하는 고정 성분의 수 또는 다양성 및/또는 프로브에 존재하는 태그 또는 바코드의 수 또는 다양성과 같이 검출 가능한 프로브에 존재하는 성분의 수 또는 다양성에서 명백할 수 있다.
검출 가능한 프로브는 포스터 공명 에너지 전달(FRET)에 의해 검출되도록 구성될 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브는 FRET 메커니즘에 의해 검출되도록 구성된 부착된 형광단 쌍을 함유할 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 효율적인 FRET 검출은 에너지가 형광단 사이에서 효율적으로 전달될 수 있도록 충분한 거리 내에 위치하는 흡수체 형광단 및 방출체 형광단을 이용할 수 있다. 일부 구성에서, FRET는 주어진 여기 소스를 사용하여 서로 구별될 수 있는 프로브의 수를 늘리는 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 제1 프로브는 여기 소스에 의해 여기될 때 제1 파장에서 방출하는 형광단 성분 D를 포함할 수 있다. 제2 프로브은 형광단 성분 D 및 형광단 성분 A를 포함할 수 있으며, 여기 소스에 의한 형광단 성분 D의 여기는 결국 제2 파장에서 방출하는 형광단 성분 A로의 에너지 전달을 야기한다. 2개의 방출 파장은 2개의 프로브를 서로 구별하기 위해 표준 광학을 사용하여 분해할 수 있다.
도 14a - 14b는 FRET 메커니즘에 의해 검출될 수 있는 검출 가능한 프로브에 대한 다양한 구성을 도시한다. 도 14a는 핵산의 나선형 구조를 이용하여 FRET 형광단 쌍을 생성하여 임계 페어링 거리 Δs FRET 에서 도너 형광단 및 억셉터 형광단을 위치시키기 위한 구성을 도시한다. 고정 성분은 연속 핵산 가닥(1410)을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드(1420)는 연속 핵산 가닥(1410)에 혼성화되어 이중 가닥 핵산 및 단일 가닥 핵산(1425)의 영역을 생성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 Δs FRET 의 적절한 간격에서 FRET 형광단 쌍을 생성하기 위해 패턴을 번갈아 가며 도너 형광단(1430) 또는 억셉터 형광단(1432)을 포함할 수 있다. 도 14b는 검출 가능한 프로브에 혼성화하도록 구성된 결합 분자를 이용하여 FRET 형광단 쌍을 생성하는 대안적 방법을 도시한다. 검출 가능한 프로브(1440)는 결합 분자(1445)와 결합하도록 구성된 검출 가능한 프로브(1440)의 일부를 따라 복수의 도너 형광단(1430)을 포함할 수 있다. 결합 분자(1445)는 검출 가능한 프로브(1440)와 결합하는 결합 분자(1445)의 가장자리를 따라 정렬된 복수의 억셉터 형광단(1432)을 포함한다. 검출 가능한 프로브(1440)와 결합 분자(1445)의 접촉은 결합 영역(1450)이 형성되게 할 수 있고, 도너 형광단(1430)과 수용체 형광단(1432)을 정렬하여 Δs FRET 의 적절한 FRET 간격 내에 FRET 형광단 쌍을 형성할 수 있다. 일부 구성에서, 결합 분자(1445)는 결합 파트너에 또는 결합 파트너가 위치하는 위치에 커플링될 수 있으며, 이로써 검출 가능한 프로브(1440)가 결합 파트너에 결합한 다음 결합 분자(1445)가 검출 가능한 프로브(1440)에 결합할 때 FRET 상호작용이 일어날 수 있다. 일부 구성에서, 결합 분자(1445)는 검출 가능한 프로브(1440)에 부착된 하나 이상의 결합 성분에 대한 결합 파트너에 부착된 SNAP 또는 다른 물질일 수 있다. 따라서, 프로브와 결합 파트너의 결합은 도너 형광단(1430)과 수용체 형광단(1432) 사이의 FRET 관찰을 기반으로 결정될 수 있다.
검출 가능한 프로브 조성물은 도너 및 억셉터 발광단의 커플링된 쌍을 포함할 수 있다. 허용 가능한 도너/억셉터 쌍은 Cy2/Cy3, Cy3/Cy5, FITC/TRITC, PE/APC, Alexa-Fluor® 488/Alexa-Fluor® 514, Alexa-Fluor® 488/Alexa-Fluor® 532, Alexa-Fluor® 488/Alexa-Fluor® 546, Alexa-Fluor® 488/Alexa-Fluor® 610, Alexa-Fluor® 647/Alexa-Fluor® 680, Alexa-Fluor® 647/Alexa-Fluor® 700, Alexa-Fluor® 647 /Alexa-Fluor® 750, Cyan FP/YFP, Cerulean FP/YFP, GFP/YFP, GFP/mRFP 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
FRET 염료 쌍은 구조화 핵산 입자의 일부를 형성하는 올리고뉴클레오티드 또는 스캐폴드 가닥과 같은 핵산에 커플링될 수 있다. FRET 염료 쌍을 포함하는 핵산은 FRET 상호작용이 일어나도록 충분히 간격을 두고 염료가 부착된 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 적절한 간격은 올리고뉴클레오티드가 스캐폴드 가닥에 혼성화될 때 발생하는 천연 발생 나선형 구조에 의해 결정될 수 있다. FRET 쌍에서 2개의 인접한 염료는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 뉴클레오티드 간격일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, FRET 쌍에서 2개의 인접한 염료는 약 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4개, 3개 이하의 뉴클레오티드 간격일 수 있다.
형광단 이외의 표지 성분을 사용하여 검출 가능한 프로브와 관련된 결합 상호작용을 관찰할 수 있다. 검출 가능한 프로브는 바코드 표지 성분(예를 들어, 핵산 바코드)을 포함할 수 있다. 바코드 표지 성분은 해독될 때 검출 가능한 프로브 종을 확인하는 정보를 제공하는 고유한 서열(예를 들어, DNA, RNA, 아미노산)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 복수의 동일한 검출 가능한 프로브는 각각 동일한 종의 바코드(즉, 동일한 서열을 갖는 바코드)로 표지될 수 있고, 이로써 특정 검출 가능한 프로브에 대한 결합 상호작용의 균일한 단일 신호를 제공할 수 있다. 검출 가능한 프로브와 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 사이의 상호작용의 관찰을 얻기 위해 차세대 시퀀싱과 같은 방법에 의해 바코드 신호가 검출되고 해독될 수 있다.
도 15a - 15d는 검출 가능한 프로브와 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 사이의 결합 상호작용을 기록하기 위해 핵산 바코드를 활용하는 시스템을 도시한다. 도 15a는 링커(1520)에 의해 검출 가능한 프로브(1510)에 연결된 핵산 바코드 서열을 포함하는 검출 가능한 프로브(1510)를 함유하는 시스템을 도시한다. 핵산 바코드 서열은 2개의 프라이밍 서열(1522) 및 2개의 프라이밍 서열(1522) 사이에 확인 서열(1525)을 포함한다. 검출 가능한 프로브(1510)는 고체 지지체(1570)에 선택적으로 결합된 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티(1530)에 결합한다. 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티(1530)는 고정 그룹(1540)(예를 들어, SNAP 또는 화학 링커)에 의해 고체 지지체(1570)에 결합될 수 있다. 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티(1530)는 (예를 들어, 고체 지지체(1570), 고정 그룹(1540) 또는 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티(1530)에 부착된) 회합된 링커(1550)를 가질 수 있다. 회합된 링커(1550)는 검출 가능한 프로브(1510) 핵산 바코드의 프라이밍 서열(1522)과 혼성화 결합을 형성하는 상보성 프라이밍 서열(1522)로 종결될 수 있다. 검출 가능한 프로브(1510) 및 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티(1530)에 의해 형성된 복합체는 핵산에 결합하도록 구성된 폴리머라제 효소(1560)와 접촉된다. 도 15b는 확장 반응을 개시하기 위한 프라이밍 서열(1522) 및 상보성 프라이밍 서열(1552)의 연결에 의해 형성된 혼성화된 핵산 서열과 폴리머라제(1560)의 결합을 보여준다. 도 15c는 확장 반응의 최종 단계를 도시한다. 확인 서열(1525) 및 프라이밍 서열(1522)은 확장에 의해 회합된 링커(1550)의 말단 서열에 추가되어 상보성 확인 서열(1555) 및 추가의 상보성 프라이밍 서열(1552)을 추가하였다. 도 15d는 검출 가능한 프로브(1510) 결합 및 프라이머 확장의 다중 사이클 후의 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티(1530)를 도시한다. 각각의 프로브는 링커(1550) 끝에 있는 서열에 고유한 확인 서열(예를 들어, 1555, 1556, 1557)을 추가한다. 각각의 확인 서열(1555, 1556, 1557) 끝에 상보성 프라이밍 서열(1552)을 추가하면 링커(1550)와 검출 가능한 프로브가 후속 결합할 수 있다. 검출 가능한 프로브(1510)는 선택적인 복수의 표지 성분(6개의 뾰족한 별로 표시됨)과 함께 나타나 있다. 예를 들어, 확인 서열이 표적 모이어티(1530)에 대한 결합 이력을 결정하기 위해 해독되는 구성에서 검출 가능한 프로브는 표지를 포함할 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 친화성 시약은 도 15a - 15d에 예시된 바와 같이 구성되거나 사용될 수 있다.
본 개시내용의 친화성 시약에 부착될 수 있는 태그의 다른 예 및, 예를 들어, 폴리펩티드를 검출, 시퀀싱 또는 정량화하기 위한 검정에서 태그를 사용하고 검출하는 방법은 각각 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 공보 제2020/0348308 A1호, 제2020/0348307 A1호 또는 제2019/0145982 A1호에 제시되어 있다.
검출 가능한 프로브 및 친화성 시약의 제작 방법
본 개시내용에 기술된 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 제조는 다음 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 1) 복수의 결합 성분 및/또는 복수의 표지 성분을 부착하도록 구성된 고정 성분을 생성하는 단계; 2) 하나 이상의 결합 성분을 고정 성분에 부착하는 단계; 3) 하나 이상의 표지 성분을 고정 성분에 부착하는 단계; 및 4) 추가 성분을 고정 성분에 부착하는 단계.
고정 성분은 제조 공정을 통해 얻을 수 있다. 비핵산 고정 성분(예를 들어, 중합체, 금속, 세라믹, 탄소 또는 반도체 나노입자)은 벌크 제조 및/또는 정제 공정을 통해 제조될 수 있다. 비핵산 고정 성분의 생산 후, 고정 성분에 하나 이상의 표면 작용성 그룹을 추가하기 위해 하나 이상의 처리 단계가 발생할 수 있다. 작용성 그룹은 고정 성분 용매 용해도 특성을 개선하거나 결합 성분 및/또는 표지 성분에 대한 부착 부위를 제공할 목적으로 추가될 수 있다. 표면 작용성 그룹은 결합 성분 및/또는 표지 성분을 부착하도록 구성된 작용성 그룹(예를 들어, 클릭 반응을 겪도록 구성된 작용성 그룹), 또는 부착된 결합 성분 및/또는 표지 성분을 함유하는 상보성 핵산과 혼성화하도록 구성된 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 규소 또는 이산화규소 나노입자를 포함하는 고정 성분은 실란화된 화합물로 작용화되어 입자의 규소 함유 표면에 복수의 작용성 그룹을 공유적으로 추가할 수 있다. 비핵산 고정 성분의 작용화 후, 친화성 그룹이 클릭 반응 또는 핵산 혼성화와 같은 임의의 적합한 기술에 의해 고정 성분에 결합될 수 있다.
핵산 고정 성분(예를 들어, 핵산 오리가미, 핵산 나노볼)의 제조는 통상적인 기술에 의해 형성될 수 있다. 핵산 나노볼은 복수의 결합 성분 및/또는 표지 성분을 부착하기 위해 추가로 변형될 수 있는 스캐폴드 가닥을 생성하기 위한 회전 환 증폭과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다. 핵산 나노볼을 제조하는 예시적인 방법은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제8,445,194호에 기술되어 있다. 핵산 오리가미를 포함하는 핵산 고정 성분은, 예를 들어, 각각 본원에 참고로 포함된 Rothemund, Nature 440:297-302 (2006), 및 미국 특허 제8,501,923호 및 제9,340,416호에 기술되어 있다.
도 21a는 핵산 고정 성분으로 검출 가능한 프로브를 형성하는 제1 경로를 보여준다. 부착된 결합 성분(2120)이 있는 올리고뉴클레오티드 및 부착된 표지 성분(2130)이 있는 올리고뉴클레오티드는 고정 성분이 조립되기 전에 제조된다. 부착된 결합 성분(2120)이 있는 올리고뉴클레오티드 및 부착된 표지 성분(2130)이 있는 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 스캐폴드(2110)(예를 들어, M13 파지 DNA, 플라스미드 DNA) 및 추가 구조 핵산(2140)과 접촉된다. 핵산은 적합한 DNA 버퍼 중 승온(예를 들어, 적어도 약 50℃, 60℃, 70℃, 80℃ 또는 90℃)에서 접촉된 다음 냉각된다. 올리고뉴클레오티드는 적절한 서열 의존적 위치에서 스캐폴드 가닥(2110)에 혼성화하여 검출 가능한 프로브(2150)를 형성할 것이다.
도 21b는 핵산 고정 성분으로 검출 가능한 프로브를 형성하기 위한 대체 경로를 보여준다. 결합 성분(2125)을 부착하도록 구성된 핸들이 있는 올리고뉴클레오티드 및 표지 성분(2135)를 부착하도록 구성된 핸들이 있는 올리고뉴클레오티드는 고정 성분을 조립 전에 제조한다. 결합 성분(2125)을 부착하도록 구성된 핸들이 있는 올리고뉴클레오티드 및 표지 성분(2135)을 부착하도록 구성된 핸들이 있는 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 스캐폴드(2110)(예를 들어, M13 파지 DNA 또는 플라스미드 DNA) 및 추가 구조 핵산(2140)과 접촉된다. 핵산은 적합한 버퍼 중 승온(예를 들어, 적어도 약 50℃, 60℃, 70℃, 80℃ 또는 90℃)에서 접촉된 다음 냉각된다. 냉각 후, 복수의 결합 성분 및/또는 표지 성분을 결합하도록 구성된 고정 성분(2155)이 형성된다. 고정 성분(2155)은 적합한 부착 버퍼에서 고정 성분(2155) 상의 핸들에 상보적인 핸들을 갖는 복수의 결합 성분(2128) 및/또는 표지 성분(2138)과 접촉된다. 복수의 결합 성분(2128) 및/또는 복수의 표지 성분(2138)의 부착 후, 검출 가능한 프로브(2150)가 형성된다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 다른 분자 또는 그룹과 결합을 형성하도록 구성된 작용성 그룹의 반응, 예를 들어, 생물직교 반응 또는 클릭 화학(예를 들어, 각각 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제6,737,236호 및 제7,427,678호 참조); 구리 촉매를 사용하는 아지드 알킨 휘스겐(Huisgen) 첨가 환화 반응(예를 들어, 각각 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제7,375,234호 및 제7,763,736호 참조); 알데히드 모이어티에 연결될 수 있는 변형된(strained) 알킨 또는 트리아진-하이드라진 모이어티, 아민 모이어티에 연결될 수 있는 트리아진 클로라이드 모이어티, EDC와 같은 커플링 시약을 사용하여 아민 모이어티에 연결될 수 있는 카복실산 모이어티, 티올 모이어티에 연결될 수 있는 티올 모이어티, 딜스-알더(Diels-Alder) 반응을 통해 커플링되는 디알켄 모이어티에 연결될 수 있는 알켄 모이어티, 및 티오포스페이트 모이어티에 연결될 수 있는 아세틸 브로마이드 모이어티(예를 들어, 참고로 포함된 WO 2005/065814 참조)를 사용하는 무구리 휘스겐 반응("금속 비함유 클릭")(예를 들어, 참고로 포함된 미국 특허 제7,259,258호 참조)에 의한 결합 성분 및/또는 표지 성분의 부착에 의해 형성될 수 있다. 작용성 그룹은 클릭 반응(예를 들어, 금속 촉매화된 아지드-알킨 첨가 환화, 변형 촉진된 아지드-알킨 첨가 환화, 변형 촉진된 아지드-니트론 첨가 환화, 변형된 알켄 반응, 티올-엔 반응, 딜스-알더 반응, 역 전자 요구(inverse electron demand) 딜스-알더 반응, [3+2] 첨가 환화, [4+1] 첨가 환화, 친핵성 치환, 디하이드록실화, 티올-인 반응, 광클릭, 니트론 쌍극자 첨가 환화, 노르보르넨 첨가 환화, 옥사노보르나디엔 첨가 환화, 테트라진 결찰, 테트라졸 광클릭 반응)을 통해 반응하도록 구성될 수 있다. 예시적인 실란 유도체 클릭 반응물은 알켄, 알킨, 아지드, 에폭사이드, 아민, 티올, 니트론, 이소니트릴, 이소시아나이드, 아지리딘, 활성화된 에스테르 및 테트라진(예를 들어, 디벤조사이클로옥틴-아지드, 메틸테트라진-트랜스사이클로옥틸렌, 에폭사이드-티올 등)을 포함할 수 있다. 클릭 반응은 온화한 조건(예를 들어, 실온, 수성 용매)하에 결합을 빠르게 형성하는 유리한 방법을 제공할 수 있다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 고정 성분 또는 기타 성분은 다른 종의 작용성 그룹을 포함할 수 있다. 상이한 작용성 그룹을 사용하면 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 부착될 다양한 성분의 수 및 위치에 대한 제어 수준을 제공할 수 있다. 특정 구성에서 상이한 작용성 그룹은 직교 반응성을 나타내며, 이에 의해 제1 성분은 프로브 상의 제1 작용성 그룹에 대해 반응성이지만 프로브 상의 제2 작용성 그룹과 실질적으로 반응하지 않는 모이어티를 갖고 제2 성분은 제2 작용성 그룹에 대해 반응성이지만 제1 작용성 그룹에 반응하지 않는 모이어티를 갖는다. 따라서, 상이한 결합 성분의 수 및 그 위치는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 상의 직교 작용성 그룹의 적절한 사용에 의해 조정될 수 있거나, 상이한 표지 성분의 수 및 그 위치는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 상의 직교 작용성 그룹의 적절한 사용에 의해 조정될 수 있다. 더욱이, 결합 성분은 각각 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 상의 직교 작용성 그룹을 적절히 사용함으로써 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 상의 표지 성분과 상이하게 위치할 수 있다.
비핵산을 포함하는 고정 성분은 적절한 방법으로 형성될 수 있다. 프로브 조립 동안 고정 성분에 결합 성분, 표지 성분 또는 기타 성분을 부착할 때 어느 정도의 공간 제어를 가능하게 하는 방법이 특히 중요하다. 공간 제어는 프로브 성분을 분리하거나 떼어놓거나 프로브 성분의 배향을 변경하는 능력을 포함할 수 있다. 예를 들어, 공간 제어는 결합 성분 및/또는 표지 성분을 인접한 또는 이웃하는 결합 성분 및/또는 표지 성분으로부터 분리하는 것을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 공간 제어는 부착된 표지 성분의 영역으로부터 부착된 결합 성분의 영역을 분리하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 공간 조절은 결합 성분 및/또는 표지 성분의 상대적 분산 또는 분포를 조절하는 것, 예를 들어, 결합 성분 및 표지 성분을 고정 성분의 영역에 10:1의 비율로 제공하는 것을 포함할 수 있다.
도 32a - 32b는 비핵산 고정 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 조립 동안 프로브 성분 위치를 제어하기 위한 도식을 도시한다. 도 32a는 다상(multiphase) 경계(예를 들어, 공기/액체 계면, 오일/물 계면)와 같은 계면(3220)과 회합하도록 구성된 복수의 입자(3210)(예를 들어, 나노입자, 나노비드, 나노구 등)를 도시한다. 계면(3220)은 제1 유체 매질(3222)과 제2 유체 매질(3224) 사이에 형성된다. 복수의 입자(3210)의 각 입자의 부분은 제1 액체 매질(3222) 또는 제2 액체 매질(3224)에 대한 노출에 따라 상이한 변형 화학에 노출된다. 제1 액체 매질(3222)에 노출된 복수의 입자(3210)의 각각의 입자 부분은 입자의 표면 상에 제1의 복수의 작용성 그룹(3235)을 형성한다. 제2 액체 매질(3224)에 노출된 복수의 입자(3210)의 각각의 입자 부분은 입자의 표면 상에 제2의 복수의 작용성 그룹(3230)을 형성한다. 제1의 복수의 작용성 그룹(3235)은 제1 유형의 프로브 성분(예를 들어, 결합 성분)에 대한 부착 부위를 제공할 수 있고, 제2의 복수의 작용성 그룹(3230)은 제2 유형의 프로브 성분(예를 들어, 표지 성분)에 대한 부착 부위를 제공할 수 있다.
도 32c - 32e는 비핵산 고정 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 조립 동안 프로브 성분 위치를 제어하기 위한 도식을 도시한다. 도 32c는 매질(3226) 내에 부분적으로 매립되거나 고정된 복수의 입자(3210)(예를 들어, 나노입자, 나노비드, 나노구 등)를 도시한다. 코팅 또는 층(3240)(예를 들어, 금속, 금속 산화물, 중합체 또는 하이드로겔)은 복수의 입자(3210) 중 각 입자의 노출된 부분에 도포된다. 도 32d에 나타낸 바와 같이, 코팅 또는 층(3240)이 복수의 입자(3210)에 도포된 후, 매질(3226)이 제거될 수 있고, 이로써 부분 코팅 또는 층(3240)이 있는 복수의 입자(3210)를 제공된다. 도 32e에 나타낸 바와 같이, 복수의 입자(3210)의 코팅되지 않은 부분과 코팅된 부분의 상이한 표면 화학은 부분 코팅 또는 층(3240)으로 복수의 입자(3210)를 차별적으로 기능화하는 데 사용될 수 있다. 코팅 또는 층(3240)에는 제1 유형의 프로브 성분(예를 들어, 결합 성분)에 대한 부착 부위를 제공할 수 있는 제1의 복수의 작용성 그룹(3235)이 제공될 수 있다. 각각의 입자의 코팅되지 않은 부분에는 제2 유형의 프로브 성분(예를 들어, 결합 성분)에 대한 부착 부위를 제공할 수 있는 제2의 복수의 작용성 그룹(3230)이 제공될 수 있다.
비핵산 고정 성분 상의 결합 성분 및/또는 표지 성분의 위치 또는 배치는 또한 비핵산 고정 성분의 표면 상의 부착 부위의 공간적 밀도 또는 표면 밀도를 제어함으로써 제어될 수 있다. 도 33은 입자 또는 나노입자 보유 그룹을 위한 제조 공정을 도시한다. 입자 또는 나노입자(3310)는 결합 성분 부착 위치(3320), 표지 성분 부착 부위(3330) 또는 변형 그룹(3340)과 같이 입자 또는 나노입자(3310) 표면에 부착될 모이어티의 혼합물과 결합된다. 모이어티의 혼합물은 입자 또는 나노입자 표면의 비례적 변형을 보장하기 위해 균형을 이룬다. 최종 결과는 모이어티 혼합물의 성분 농도에 기초하여 입자 또는 나노입자(3310) 표면에 걸쳐 각 성분이 균질하거나 거의 균질하게 분포된 고정 성분이다. 대안적으로, 제1 유형의 부착 부위 및 차단 그룹으로 이루어진 2성분 혼합물을 초기에 추가함으로써 성분을 순차적으로 추가할 수 있다. 표면 작용화 후, 차단 그룹은 완전히 또는 부분적으로 제거되어 다른 유형의 부착 부위를 부착하기 위한 표면 위치를 제공할 수 있다.
복수의 친화성 시약, 복수의 검출 가능한 프로브, 또는 적어도 하나의 친화성 시약과 적어도 하나의 검출 가능한 프로브의 조합이 접합되어 다중 프로브 복합체를 형성할 수 있다. 유사하게, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 하나 이상의 다른 시약 또는 프로브에 대한 시약 또는 프로브의 부착을 가능하게 하는 하나 이상의 커플링 그룹으로 구성될 수 있다. 커플링 그룹은 공유 상호작용, 비공유 상호작용, 정전기 상호작용, 자기 상호작용, 또는 검출 가능한 프로브 친화성 시약 또는 둘 다 사이에 회합을 형성하는 임의의 다른 상호작용을 형성하도록 구성될 수 있다. 다중 프로브 복합체에서 2개 이상의 프로브 간의 회합은 약하거나 일시적이거나 가역적일 수 있다. 다중 프로브 복합체에서 2개 이상의 프로브 사이의 회합은 강력하거나 영구적이거나 비가역적일 수 있다. 일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 상보성 핵산 가닥 또는 스트렙트아비딘-비오틴 커플링 그룹의 혼성화에 의해 커플링될 수 있다. 다른 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은, 예를 들어, 클릭 반응 또는 가교결합(예를 들어, 화학 또는 광 개시된 가교결합)에 의해 공유적으로 커플링될 수 있다.
다중 프로브 복합체는 프로브 합성 공정의 일부로 형성될 수 있다. 프로브 또는 고정 성분의 형성은 결합 성분 및/또는 표지 성분과 같은 프로브 성분의 위치, 배향 및 부착을 용이하게 할 수 있다. 도 37a - 37c는 비핵산 고정 성분 상의 결합 성분의 위치를 조정하기 위해 복합체를 이용하는 과정을 도시한다. 도 37a는 제1 매질(3722)과 제2 매질(3724) 사이에 형성된 상 경계(3720)와 회합을 형성하는 2개의 입자 고정 성분(3710)(예를 들어, 나노입자)을 도시한다. 고정 성분(3710)은 입자 사이의 인력 상호작용(예를 들어, 정전기 또는 자기 인력, 혼화성 표면 작용성 그룹 등)에 의해 복합체를 형성하도록 구성된다. 고정 성분(3710)은 입자(3710) 상의 부착 부위에 부착하도록 구성된 제2 매질(3724) 내의 복수의 결합 성분(3730)과 접촉된다. 도 37b는 복수의 결합 성분(3730)이 제2 매질(3724) 내의 입자 표면에 부착된 후의 복합 입자(3710)를 도시한다. 결합 성분(3730)은 제1 매질(3722) 내 표면적의 제외 및 입자 간 결합 영역 근처의 표면 제외로 인해 입자(3710) 표면의 특정 영역으로 제한되었다. 도 37c는 입자들 사이의 상호작용이 파괴되어 개별 검출 가능한 프로브(3740)를 방출하는 선택적 과정을 나타낸다. 다른 구성에서, 입자는 다중 프로브 복합체로서 유지될 수 있다.
핵산 기반 고정 성분(예를 들어, 미국 가출원 제63/112,607호에 제시된 바와 같은 스캐폴드)은 표준 핵산 합성 화학을 통해 합성될 수 있고, 예를 들어, 사전 표지된 뉴클레오티드의 혼입을 통해 또는 후속적으로 추가될 표지 그룹에 대한 부착 부위를 제공함으로써, 예를 들어, 사이드 작용성 그룹은 물론 결합 성분에 대한 커플링을 위한 하나 이상의 부위를 제공함으로써 특정 표지 그룹과 함께 제공될 수 있다. 마찬가지로, PEG 스캐폴드는 결합 성분 또는 표지 성분 중 하나 또는 둘 다의 부착을 가능하게 할 작용성 그룹으로 합성되고 작용화될 수 있다. 또 다른 예에서, 프로브 성분 또는 표지 성분 중 하나 또는 둘 다의 부착을 가능하게 할 그룹을 포함하는 폴리펩티드 스캐폴드가 합성될 수 있다. 일부 경우에, 고정 성분은 부착된 표지보다 상당히 클 수 있다. 다른 경우에, 고정 성분은 부착된 표지 성분과 비슷한 크기일 수 있다. 또 다른 경우에, 표지 성분은 부착된 고정 성분보다 클 수 있다.
일부 경우에 핵산 스캐폴드와 같은 고정 성분은 결합 성분에서 직접 합성될 수 있다. 예를 들어, 고정 성분의 합성에 사용되는 시약은 결합 성분을 포함할 수 있다. 일부 경우에 핵산 스캐폴드와 같은 고정 성분은 결합 성분에 부착될 링커 분자에서 직접 합성될 수 있다. 예를 들어, 고정 성분의 합성에 사용되는 시약은 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고정 성분은 혼입될 뉴클레오티드의 일부 또는 전부가 표지 또는 표지 성분을 부착하기 위한 작용성 모이어티를 갖는 뉴클레오티드 혼합물을 사용하는 주형 매개 폴리머라제 확장 반응에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 확장 동안 폴리머라제에 의해 사용되는 3개의 뉴클레오티드 종은 표지되지 않을 수 있고(/거나 작용성 그룹이 결여될 수 있고), 네 번째 뉴클레오티드 종은 형광 모이어티 또는 다른 표지 모이어티로 표지될 수 있다(또는 네 번째 뉴클레오티드는 작용성 그룹일 수 있다). 이 예에서, 네 번째 뉴클레오티드의 상보성 염기는 주형에서 사전 결정된 패턴으로 나타날 수 있다. 예를 들어, 네 번째 뉴클레오티드의 상보성 염기는 본원의 다른 곳에 제시된 뉴클레오티드 간격에서 발생할 수 있다.
도 49a에 나타낸 바와 같이, 핵산 압타머로서 본원에 예시된 결합 성분은 하나의 말단, 예를 들어, 3' 말단에 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 프라이머 서열에 상보적인 서열 세그먼트를 포함하는, 예를 들어, 상술된 바와 같은 주형 핵산은 결합 성분의 프라이머 세그먼트에 혼성화될 수 있다(도 49b, 단계 1 참조). 이어서, 예를 들어, 상술된 바와 같은 표지되지 않은 뉴클레오티드와 표지된 뉴클레오티드의 존재하의 결합 성분 상의 프라이머 서열의 폴리머라제 매개 주형 기반 확장은 혼입된 표지를 갖는 고정 성분의 핵산을 포함하는 표지 성분(표지된 뉴클레오티드와의 폴리머라제 반응의 확장 생성물)과 함께 결합 성분(예를 들어, 압타머)을 포함하는 친화성 프로브를 초래한다(도 49b, 단계 2 참조). 일부 경우에, 주형은 원하는 간격 또는 원하는 위치에 특정 뉴클레오티드 종, 예를 들어, 구아노신 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 확장 반응은 표지되지 않은 아데노신, 티미딘 및 구아노신 트리포스페이트, 및 표지된 시토신 트리포스페이트의 존재하에 수행된다. 이것은 표지된 시토신 뉴클레오티드를 확장 생성물 스캐폴드에 주기적으로 혼입시키는 결과를 낳는다. 예를 들어, 주형의 모든 제3, 제4, 제5 등의 위치에 구아노신 뉴클레오티드가 있는 주형을 포함함으로써, 고정 성분의 모든 제3, 제4, 제5 등의 위치에서 표지된 시토신의 통합을 가능하게 할 수 있다. 이해되는 바와 같이, 혼입된 표지의 특정 표지된 뉴클레오티드 또는 주기성은 분석의 특정 필요성에 따라 선택될 수 있다. 일부 경우에, 이 합성 후, 주형 핵산은, 예를 들어, 본원의 다른 곳에 제시된 바와 같이 친화성 프로브의 이중 가닥 표지 부분을 제공하기 위해 제자리에 남아 있을 수 있다.
일부 경우에, 스캐폴드용 주형은 원형 핵산을 포함할 수 있으며, 프라이머 서열의 확장은, 예를 들어, 회전 환 증폭을 통해 복제된 서열 세그먼트를 갖는 확장된 쇄상체를 생성한다. 선택적 형식에서, 결합 성분에 커플링된 주형 서열이 제공될 수 있다. 프라이머는 주형에 혼성화될 수 있고 표지된 뉴클레오티드와 표지되지 않은 뉴클레오티드의 존재하에 중합에 의해 확장될 수 있어, 상술된 바와 같은 표지 그룹을 포함하는 제2의 회합된 가닥을 생성한다.
일부 경우에, 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 최종 생성물 표지된 프로브의 더욱 표적화된 조정이 가능한 모듈 형식을 사용하여 구성될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에는 압타머 또는 항체와 같은 결합 성분이 표지되지 않은 라이브러리로서 생성되고 유지될 수 있다. 그러한 경우에, 이러한 결합 성분은 주어진 실험을 위한 원하는 표지화 프로토콜에 따라 결합 성분에 표지 성분을 커플링하기 위한 부착 영역과 함께 유지될 수 있다. 그러한 부착 영역은 화학 커플링 모이어티, 예를 들어, NHS 에스테르, "클릭" 화학 성분(예를 들어, H. C. Kolb; M. G. Finn; K. B. Sharpless (2001), "Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions" Angewandte Chemie International Edition. 40 (11): 2004-2021 참조) 및 다른 통상의 화학 커플링 접근법을 포함할 수 있으며, 표지화 성분은 임의의 필요한 상보성 커플링 모이어티를 포함한다. 이 모듈성의 장점은 동일하거나 유사한 고정 성분을 사용하여 다양한 상이한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 쉽게 형성할 수 있다는 것이다. 따라서, 복수의 상이한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 하나 이상의 갯수의 표지 성분, 다양한 표지 성분, 결합 성분의 수, 및 다양한 결합 성분과 관련하여 상이할 수 있지만, 통상의 구조 특징을 공유하는 고정 성분을 갖는다. 통상의 구조 특징은, 예를 들어, 고정 성분의 크기, 고정 성분의 형상, 고정 성분의 화학 조성, 고정 성분의 핵산 서열, 고정 성분 내 오리가미의 3차원 구조, 고정 성분 내 오리가미의 스캐폴드의 3차원 구조 등일 수 있다. 일부 구성에서, 복수의 상이한 검출 가능한 프로브는 오리가미 구조에서 어닐링된 스테이플 올리고뉴클레오티드의 수, 하나 이상의 스테이플 올리고뉴클레오티드가 오리가미 구조 내 스캐폴드 가닥에 어닐링되는 위치, 오리가미 구조에서 스캐폴드 가닥에 어닐링된 하나 이상의 스테이플 올리고뉴클레오티드의 길이, 오리가미 구조 내 스캐폴드 가닥에 어닐링된 하나 이상의 스테이플 올리고뉴클레오티드의 서열, 또는 오리가미 구조 내 작용성 그룹의 수, 유형 또는 위치와 관련하여 상이하다.
일부 경우에, 결합 성분은 결합 또는 커플링 쌍(예를 들어, 수용체)의 한 구성원을 포함할 수 있는 반면, 표지 성분은 결합 또는 커플링 쌍의 상보성 구성원(예를 들어, 수용체에 대한 리간드)을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 표지 성분이 단일 가닥에 상보적인 서열을 갖는 제2 가닥에 커플링되는 동안 결합 성분은 단일 가닥 핵산 서열에 커플링될 수 있다. 그러한 경우에, 커플링은 표지 결합된 핵산 가닥을 결합 성분 결합된 핵산 가닥에 혼성화함으로써 수행될 수 있다. 알 수 있는 바와 같이, 압타머 결합 성분의 경우에, 압타머 및 표지 커플링 성분의 생성은, 예를 들어, 단일 가닥 프로브 및 표지 커플링 성분의 PCR 증폭에 이어서 표지 성분의 혼성화전 상보성 가닥의 제거를 사용하여 생성될 수 있다.
임의의 상기 맥락에서, 표지 성분 및 고정 성분은 결합 성분과 별도로 합성될 수 있고, 표지화 그룹이 부착되거나, 표지 성분이 후속적으로 커플링 전 또는 후에 결합 성분에 부착될 수 있는 작용화된 고정 성분으로서 합성될 수 있다. 핵산 기반 고정 성분의 경우, 이러한 구조는 일반적으로 폴리뉴클레오티드 구조를 구축하기 위해 공지된 뉴클레오티드가 연속적으로 추가되는 잘 알려진 고상 핵산 합성 기술을 통해 또는 스캐폴드 서열의 폴리머라제 연쇄 반응 증폭을 통해 합성될 수 있다. 언급한 바와 같이, 그러한 과정은 원하는 형태로 다중 표지된 프로브를 구축하기 위해 합성 동안 표지된 뉴클레오티드의 주기적인 도입을 사용할 수 있다. 대안적으로, 변형된 뉴클레오티드는 합성 후 표지 성분을 쉽게 추가할 수 있도록 합성 중에 통합될 수 있다.
또 다른 성분(예를 들어, 결합 성분, 표지 성분 또는 다른 고정 성분)으로의 별도로 합성된 고정 성분의 공유 부착은 화학적 또는 생화학적 접근법을 통해, 예를 들어, 결합 성분에 대한 핵산 스캐폴드의 화학적 커플링을 통해, 예를 들어, 클릭 화학과 같은 공지된 화학적 커플링 기술을 사용하여, 또는 결합 성분의 핵산 성분에 대한 핵산 스캐폴드의 결찰과 같은 생화학적 방법을 통해 달성될 수 있다. 대안적으로, 고정 성분은 결합 성분에 이미 커플링된 상보성 핵산 성분에 대한 혼성화를 통해 결합 성분에 비공유적으로 부착될 수 있다. 그러한 부착의 예는 도 51에 개략적으로 예시되어 있다. 도시된 바와 같이, 결합 성분(400)은 이것에 부착된 핵산 프로브 서열(400b)을 포함한다. 이어서 프로브 서열(400b)에 상보적인 서열을 갖는 별도로 합성된 표지된 핵산 고정 성분(401)은 결합 성분에 혼성화되어 표지된 친화성 프로브를 제공한다.
임의의 다양한 공유 또는 비공유 화학이 본원에 제시된 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 성분을 부착하거나 연결하는 데 사용될 수 있다. 고정 성분을 다른 성분에 부착하는 것과 관련하여 본원에 제시된 화학반응 및 방법은 또한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 결합 파트너(예를 들어, 폴리펩티드), 표면, 고체 지지체, 어레이 위치 또는 입자와 같은 다른 기재에 부착하는 데 사용될 수 있다. 또한, 화학반응 및 방법은 고정 성분, 결합 성분 또는 표지 성분을 합성하거나 이러한 성분에 작용성 그룹 또는 링커를 추가하는 데 사용될 수 있다.
폴리펩티드 기반 결합 성분, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편을 사용하는 일부 구성에서, 단일 커플링 그룹을 주어진 폴리펩티드에 혼입함으로써 단일 표지 성분만을 단일 결합 성분에 커플링시키기 위해 커플링 접근법이 사용될 수 있다. 특히, 항체 또는 항체 단편과 같은 결합 성분은 제1 커플링 핸들 또는 작용성 그룹과 함께 제공될 수 있는 반면, 별도의 표지 성분(또는 용이하게 표지화될 수 있는 성분)은 결합 성분과 표지 성분 사이의 부착을 달성하기 위해 제1 커플링 모이어티와 반응하거나 이에 결합하는 제2 커플링 핸들 또는 작용성 그룹과 함께 제공된다.
그러한 접근법의 한 예는 표지화에 대한 SpyTag/SpyCatcher 접근법이다(예를 들어, Zakeri B, Fierer JO, Celik E, Chittock EC, Schwarz-Linek U, Moy VT, Howarth M (March 2012). "Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (12): E690-7 참조). 이 접근법에서는 13개의 아미노산 태그 폴리펩티드(SpyCatcher)가 제1 커플링 핸들을 형성하고 12.3kDa 단백질(Spy Tag)이 다른 커플링 핸들을 형성한다. 예로서, Spy Catcher는 재조합 융합 단백질로서 제1 성분(예를 들어, 결합 성분 또는 표지 성분)에 통합될 수 있다. Spy Catcher 성분은 이소펩티드 결합을 통해 Spy 태그에 비가역적으로 결합하며, 이는 형광적으로 또는 검출을 위해 표지화될 수 있다. 이해되는 바와 같이 상기 Tag 또는 Catcher는 제1 성분과 통합될 수 있다.
일부 경우에, 클릭 화학을 사용하여 서로 상이한 성분을 부착할 수 있다. 핵산 모이어티를 갖는 성분의 경우 이를 결찰 및/또는 혼성화를 사용하여 부착할 수 있다. 일부 경우에, 부착에 링커가 사용된다. 링커의 예는 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA 또는 상이한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 링커는 또한 생접합(bioconjugation)이 가능한 작용성 그룹을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 부착은 화학 접합, 생접합, 효소 접합, 광접합, 열접합 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다. (본 개시 내용을 위해 참조로 포함된 Spicer, C. D., Pashuck, E. T., & Stevens, M. M., Achieving Controlled Biomolecule-Biomaterial Conjugation. Chemical Reviews., 2018, 118, 페이지 7702-7743, 및 Greg T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press; 3rd Edition, 2013). 예를 들어, 생접합은 두 분자 사이에 공유 결합을 형성하는 데 사용될 수 있으며, 그 중 적어도 하나는 생체분자이다. 일부 경우에, 서로 부착될 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 2개의 성분이 작용화될 수 있다. 두 파트너를 작용화하면 부착(예를 들어, 접합) 반응의 효율성 또는 속도가 향상될 수 있다. 예를 들어, 압타머, 생물학적 또는 화학 엔티티의 화학 활성 부위의 설프하이드릴 그룹(-SH) 또는 아민(-NH2)은 부착 반응의 반응성 또는 효율성이 더 크도록 작용화될 수 있다. 다양한 설프하이드릴 반응성(또는 티올 반응성) 또는 아민 접합 화학반응 중 임의의 것이 화학 모이어티를 설프하이드릴 또는 아민 그룹에 결합시키는 데 사용될 수 있다. 예로는 할로아세틸, 말레이미드, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴화제, 비닐설폰, 피리딜 디설파이드, TNB-티올 및/또는 다른 설프하이드릴 반응성/아민 반응성/티올 반응성 작용제의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 그룹 중 다수는 알킬화(예를 들어, 티오에테르 또는 아민 결합 형성에 의함) 또는 디설파이드 교환(예를 들어, 디설파이드 결합 형성에 의함)을 통해 설프하이드릴 그룹에 부착된다. 생접합에 대한 반응에 관한 더 많은 전략과 세부 사항은 아래에 기술되어 있으며 다른 적절한 분자로 확장될 수 있다.
부착은 생체분자 또는 다른 물질 상의 화학 활성 부위와 화학 모이어티 또는 링커 분자의 화학 반응에 의해 부분적으로 달성될 수 있다. 화학 접합은 아미드 형성 반응, 환원적 아미노화 반응, N-말단 변형, 티올 마이클 첨가 반응(thiol Michael addition reaction), 디설파이드 형성 반응, 구리(Ⅰ) 촉매된 알킨-아지드 첨가 환화(copper(I)-catalyzed alkyne-azide cycloaddition, CuAAC) 반응, 변형 촉진된 알킨-아지드 첨가 환화(strain-promoted alkyne-azide cycloaddtion, SPAAC) 반응, 변형 촉진된 알킨-니트론 첨가 환화(SPANC), 역 전자 요구 딜스-알더(inverse electron-demand Diels-Alder, IEDDA) 반응, 옥심/하이드라존 형성 반응, 자유 라디칼 중합 반응 또는 이들의 조합을 통해 진행될 수 있다. 효소 매개 접합은 트랜스글루타미나제, 퍼옥시다제, 소르타제, SpyTag-SpyCatcher 또는 이들의 조합을 통해 진행될 수 있다. 광접합 및 활성화는 광아크릴레이트 가교결합 반응, 광티올-엔 반응, 광티올-인 반응 또는 이들의 조합을 통해 진행될 수 있다. 일부 경우에, 부착 또는 접합은 비공유 상호작용을 통해 진행될 수 있으며, 이는 자가 조립 펩티드, 결합 서열, 호스트-게스트 화학, 핵산 또는 이들의 조합을 통해 이루어질 수 있다.
일부 경우에, 부착 효율, 사용 용이성 및/또는 재현성을 증가시키기 위해 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 또는 이들의 성분의 반응 모이어티를 변형하기 위해 부위 선택성 방법이 사용될 수 있다. 부위 선택성 부착을 위해 세 가지 일반적인 전략을 사용할 수 있다: (ⅰ) 일반적인 작용성 그룹 또는 모이어티를 표적으로 하기보다는 많은 모티프 중에서 단일 모티프를 선택할 수 있는 변형 전략. 이것은 주변 서열, 국소 환경 또는 반응성의 미묘한 차이에 의해 결정될 수 있다. 단백질 서열 내의 특정 아미노산 또는 단일 위치의 글리칸을 변형시키는 효소의 능력이 특히 두드러진다. 단백질 N-말단의 독특한 반응성 또는 글리칸의 아노머 위치를 표적으로 하는 반응과 같이 절묘한 화학 선택성을 나타내는 반응도 이 범주에 속한다. (ⅱ) 천연 생합성 경로를 하이재킹함으로써 비천연 작용성 그룹의 부위 특이적 통합이 활용될 수 있다. (ⅲ) 화학 합성을 통한 고유 반응성의 설치가 활용될 수 있다. 폴리펩티드 및 올리고뉴클레오티드의 전체 또는 부분 합성은 특히 고상 접근법을 사용하여 널리 퍼져 있다. 이러한 기술을 통해 최대 100개의 아미노산 또는 200개의 뉴클레오티드 서열에 접근할 수 있으며 정확한 위치 제어를 통해 다양한 작용화된 단량체를 설치할 수 있다.
일부 경우에, 생체물질-생체분자 접합체와 같은 부착된 종을 생성하기 위해 화학 접합 기술이 적용될 수 있다. 부착에 사용되는 작용성 그룹은 변형될 물질(예를 들어, 변형될 생체분자)에 고유하거나 합성적으로 포함될 수 있다. 아래 그림에서 R 및 R'는 생체분자(예를 들어, SNAP, 단백질, 핵산 오리가미 또는 핵산 나노볼과 같은 핵산, 탄수화물, 지질, 대사산물, 소분자, 단량체, 올리고머 중합체이지만 이에 제한되지 않음), 친화성 시약, 검출 가능한 프로브, 결합 성분, 표지 성분, 고정 성분 및/또는 고체 지지체일 수 있다.
일부 경우에, 생접합을 통한 부착과 같은 부착을 위해 환원성 아민화가 이용될 수 있다. 아민은 알데히드와 가역적으로 반응하여 물이 제거되면서 일시적인 이민 모이어티를 형성할 수 있다. 이 반응은 높은 물의 농도로 인해 수성 조건에서 접합되지 않은 출발 물질이 강하게 선호되는 빠른 평형 상태에서 발생한다. 그러나 제2 단계에서 불안정한 이민은 나트륨 시아노보로하이드라이드 처리를 통해 상응하는 아민으로 비가역적으로 환원될 수 있다. 이 순한 환원 시약은 반응하지 않은 알데히드가 있는 경우에도 이민을 선택적으로 환원시킬 수 있다. 그 결과, 생체분자 또는 다른 물질의 비가역적 접합이 관심 생체물질과 같은 제2 물질에 점진적으로 일어날 수 있다. 대조적으로, 수소화붕소나트륨과 같은 더 강력한 환원제는 알데히드를 환원시킬 수도 있다. 이 2단계 환원성 아미노화 공정은 케톤의 변형에도 사용할 수 있다. 예를 들어, 환원성 아민화는 과요오드산나트륨으로 처리된 알기네이트와 키토산 스캐폴드의 변형에 주로 사용되었다. 열린 사슬 형태로 생성된 말단 알데히드/케톤을 이용하여 환원당의 부착에 대해 반응성 순서를 역전시킬 수도 있다. 예를 들어, 이 전략은 각각 말토스와 락토스의 환원적 아미노화를 통해 ECM에서 천연 콜라겐의 글루코실화 및 갈락토실화 패턴을 모방하기 위해 이용될 수 있다.
일부 경우에, 이소티오시아네이트가 물질을 서로 부착하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 이소티오시아네이트가 생접합에 이용될 수 있다. 이소티오시아네이트 모이어티는 아민, 설프하이드릴, 티로신 측쇄의 페놀레이트 이온 또는 다른 분자와 같은 친핵체와 반응하여 두 분자 사이에 안정한 결합을 형성할 수 있다.
일부 경우에, 이소시아네이트가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 이소시아네이트가 생접합에 이용될 수 있다. 예를 들어, 이소시아네이트는 아민 함유 분자와 반응하여 안정한 이소우레아 결합을 형성할 수 있다.
일부 경우에, 아실 아지드가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 아실 아지드가 생접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 아실 아지드는 1차 아민과 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있는 활성화된 카복실레이트 그룹이다.
일부 경우에, 아미드가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 아미드가 생접합에 이용될 수 있다. 예를 들어, 반응성 N-하이드록시석신이미드(NHS) 에스테르의 사용이 특히 널리 퍼져 있다. NHS-에스테르는 사전 형성될 수 있지만 종종 N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카보디이미드(EDC) 커플링 화학을 사용하여 현장에서 생성되고 관심 종에 직접 커플링된다. 활성화된 NHS-에스테르의 형성은 약산성 조건(pH ~5)에서 선호되지만, 후속 아미드 결합은 아민 커플링 파트너가 양성자화되지 않는 더 높은 pH에서 가속화된다. ~6.5의 중간 pH에서 한 단계 변형이 가능하다. 부착은 전형적으로 pH 5에서 활성 NHS-에스테르를 먼저 형성한 후 pH를 ~8로 높이고 2단계 절차로 아민 커플링 파트너를 첨가하여 수행된다. 일부 경우에, 수용성 유도체 설포-NHS가 대안으로 사용될 수 있다. 일부 경우에, 생체분자 또는 기타 물질의 NHS 에스테르는 N-말단 α-아민 및 라이신 측쇄 ε-아민과는 반대로 티로신, 세린 및 트레오닌 -OH 그룹과 반응하고 커플링할 수 있다.
일부 경우에, 설포닐 클로라이드가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 설포닐 클로라이드가 생접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 설포닐 클로라이드 화합물과 1차 아민 함유 분자의 반응은 염소 원자의 손실과 설폰아미드 결합의 형성으로 진행된다.
일부 경우에, 토실레이트 에스테르가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 토실레이트 에스테르가 생접합에 이용될 수 있다. 예를 들어, 토실레이트 에스테르를 포함하는 작용성 그룹은 4-톨루엔설포닐 클로라이드(토실 클로라이드 또는 TsCl라고도 함)와 하이드록실 그룹의 반응으로부터 형성되어 설포닐 에스테르 유도체를 생성할 수 있다. 설포닐 에스테르는 친핵체와 커플링하여 공유 결합을 생성할 수 있으며, 1차 아민과의 2차 아민 연결, 설프-하이드릴 그룹과의 티오에테르 연결 또는 하이드록실과의 에테르 결합을 생성할 수 있다.
일부 경우에, 카보닐이 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 카보닐이 생접합에 이용될 수 있다. 예를 들어, 알데히드, 케톤 및 글리옥살과 같은 카보닐 그룹이 아민과 반응하여 자유 형태와의 평형 상태에 있는 쉬프 염기 중간체를 형성할 수 있다. 일부 경우에, 수소화붕소나트륨 또는 나트륨 시아노보로하이드라이드를 알데히드 화합물 및 아민 함유 분자를 함유하는 반응 매질에 첨가하면 쉬프 염기 중간체 및 공유 결합 형성이 감소되어 두 분자 사이에 2차 아민 결합이 생성된다.
일부 경우에, 에폭사이드 또는 옥시란이 두 물질의 부착에 사용할 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 에폭사이드 또는 옥시란이 생접합에 이용될 수 있다. 예를 들어, 에폭사이드 또는 옥시란 그룹은 개환 과정에서 친핵체와 반응할 수 있다. 반응은 1차 아민, 설프하이드릴 또는 하이드록실 그룹과 함께 일어나 2차 아민, 티오에테르 또는 에테르 결합을 각각 생성할 수 있다.
일부 경우에, 카보네이트가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 카보네이트가 생접합에 이용될 수 있다. 예를 들어, 카보네이트는 친핵체와 반응하여 카바메이트 연결을 형성할 수 있으며, 디석신이미딜 카보네이트는 하이드록실 함유 분자를 활성화하여 아민 반응성 석신이미딜 카보네이트 중간체를 형성하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 이 카보네이트 활성화 절차는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 단백질 및 기타 아민 함유 분자에 결합하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 단백질의 1차 아미노 그룹과 같은 친핵체는 석신이미딜 카보네이트 작용성 그룹과 반응하여 안정한 카바메이트(지방족 우레탄) 결합을 제공할 수 있다.
일부 경우에, 아릴 할라이드가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 아릴 할라이드가 생접합에 이용될 수 있다. 예를 들어, 플루오로벤젠 유도체와 같은 아릴 할라이드 화합물은 단백질과 같은 아민 함유 분자와 공유 결합을 형성하는 데 사용될 수 있다. 티올, 이미다졸릴 및 페놀레이트 그룹과 같은 다른 친핵체도 반응하여 안정한 결합을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 플루오로벤젠 유형의 화합물이 동종이작용성 가교결합제에서 작용성 그룹으로 사용되었다. 예를 들어, 아민과의 반응은 치환된 아릴 아민 결합을 생성하는, 불소 원자의 아민 유도체로의 친핵성 치환을 포함한다.
일부 경우에, 이미도에스테르가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 이미도에스테르가 생접합에 이용될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 α-아민 및 ε-아민은 동종이작용성 이미도에스테르와 반응하여 표적화되고 가교결합될 수 있다. 일부 경우에, 두 단백질을 이작용성 이미도에스테르 가교결합제와 접합한 후, 과잉 이미도에스테르 작용성 그룹이 에탄올아민으로 차단될 수 있다.
일부 경우에, 카보디이미드가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 카보디이미드는 생접합에 사용될 수 있다. 일반적으로, 카보디이미드는 각각 카복실레이트 그룹과 아민 사이 또는 포스페이트와 아민 사이의 아미드 또는 포스포르아미데이트 연결의 형성을 매개하는 데 사용될 수 있는 0-길이 가교결합제이다. 카보디이미드는 이러한 결합을 형성할 때 접합 분자 사이에 추가 화학 구조가 도입되지 않기 때문에 0-길이 시약이다. 일부 경우에, N-치환된 카보디이미드가 카복실산과 반응하여 반응성이 높은 O-아실이소우레아 유도체를 형성할 수 있다. 이 활성 종은 1차 아민과 같은 친핵체와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 설프하이드릴 그룹이 활성 종을 공격하고 티오에스테르 연결을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 카보디이미드 매개 반응을 사용하여 하이드라지드 함유 화합물도 카복실레이트 그룹에 커플링될 수 있다. 이작용성 하이드라지드 시약을 사용하여 카복실레이트는 다른 카보닐 화합물과 접합할 수 있는 말단 하이드라지드 그룹을 갖도록 변형될 수 있다.
일부 경우에, 포스페이트가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 5' 포스페이트 또는 폴리펩티드의 포스포릴화 아미노산과 같은 포스페이트 그룹을 함유하는 생체분자도 카보디이미드 매개 반응을 사용하여 아민 함유 분자에 접합될 수 있다. 예를 들어, 생체 분자의 카보디이미드는 카복실레이트와의 반응과 유사한 중간 포스페이트 에스테르로 포스페이트를 활성화할 수 있다. 아민의 존재하에 에스테르가 반응하여 안정한 포스포르아미데이트 결합을 형성한다.
일부 경우에, 산 무수물이 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 산 무수물이 생접합에 이용될 수 있다. 무수물은 친핵체에 대한 반응성이 매우 높으며 단백질 및 기타 분자의 여러 중요한 작용성 그룹을 아실화할 수 있다. 예를 들어, 무수물과 반응할 수 있는 단백질 작용성 그룹은 N-말단의 α-아민, 라이신 측쇄의 ε-아민, 시스테인 설프하이드릴 그룹, 티로신 잔기의 페놀레이트 이온 및 히스티딘의 이미드-아졸릴 고리를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 단백질 분자에서 무수물에 대한 반응성 부위는 임의의 부착된 탄수화물 사슬의 변형이다. 일부 경우에, 폴리펩티드 사슬의 아미노 그룹 변형 외에도 당단백질이 다당류 하이드록실 그룹에서 변형되어 에스테르화 유도체를 형성할 수 있다.
일부 경우에, 플루오로페닐 에스테르가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 플루오로페닐 에스테르가 생접합에 이용될 수 있다. 플루오로페닐 에스테르는 단백질 및 기타 분자와 아미드 결합을 형성할 수 있는 그룹을 생성하는 플루오로페놀 화합물의 에스테르로 이루어진, 아민과 반응할 수 있는 또 다른 유형의 카복실산 유도체일 수 있다. 일부 경우에, 플루오로페닐 에스테르는 펜타플루오로페닐(PFP) 에스테르, 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르 또는 설포-테트라플루오로-페닐(STP) 에스테르일 수 있다. 일부 경우에, 플루오로페닐 에스테르는 약알칼리성 pH 값에서 아민 함유 분자와 반응하여 NHS 에스테르와 동일한 아미드 결합 연결을 제공한다.
일부 경우에, 하이드록시메틸 포스핀이 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 하이드록시메틸 포스핀이 생접합에 이용될 수 있다. 하이드록시메틸 그룹 치환을 갖는 포스핀 유도체는 커플링 또는 가교결합 목적을 위한 부착제로 작용할 수 있다. 예를 들어, 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THP) 및 β-[트리스(하이드록시메틸)포스-피노] 프로피온산(THPP)은 아민과 같은 친핵체와 자발적으로 반응하여 공유 연결을 형성하는 작은 삼작용성 화합물이다.
일부 경우에, 티올이 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 티올 반응성이 생접합을 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 시스테인의 티올 그룹은 20개의 단백질 생성(proteinogenic) 아미노산 중에서 발견되는 가장 친핵성인 작용성 그룹이다. 신중한 pH 제어를 통해 라이신과 같은 다른 친핵성 아미노산 잔기에 대한 선택적 변형을 쉽게 달성할 수 있다. 또 다른 예는 올리고뉴클레오티드의 티올 변형이 유도체화를 가능하게 하는 데 사용될 수 있지만, 화학 직교성이 강화된 대체 작용성 그룹이 용이하게 설치될 수 있기 때문에 생체물질 접합에 대한 사용이 제한된다. 추가로, α,β-불포화 카보닐에 대한 티올의 접합체 첨가(마이클 첨가라고도 함)는 조직 공학, 작용성 물질 및 단백질 변형 분야에서 폴리펩티드 접합체를 형성하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 반응 속도와 접합 효율은 주로 세 가지 요인에 의해 제어되며 필요에 따라 수정될 수 있다: (ⅰ) 티올의 pK a ; (ⅱ) 마이클-억셉터의 친전자성; (ⅲ) 촉매의 선택. (ⅰ)에 대하여: 티올레이트 음이온은 마이클 첨가 동안 활성 친핵체이며, 티올이 탈양성자화되는 경향은 티올레이트 농도와 이에 따른 반응 속도를 결정할 수 있다. 예를 들어, 방향족 티올의 pK a 가 낮을수록 지방족 티올에 비해 약염기가 촉매 작용을 하는 데 사용되는 반응 속도가 더 빨라진다. 결과적으로, 국소 구조가 특히 폴리펩티드 기재에 대한 접합 효율을 크게 변경할 수 있다. 시스테인 함유 펩티드의 pK a 및 반응성은 주변 아미노산의 합리적인 선택을 통해 상당히 변경될 수 있으며, 라이신 및 아르기닌과 같은 양으로 하전된 아미노산의 존재는 티올 pK a 를 낮추어 반응성을 향상시키는 역할을 한다. (ⅱ)에 대하여: 마이클-억셉터는 더 많은 전자가 부족해지고 친핵성 공격에 대해 더 활성화되어 반응 속도가 증가한다. 생체물질 분야에서 가장 널리 사용되는 억셉터 내에서 반응성 경향은 말레이미드 > 비닐 설폰 > 아크릴레이트 > 아크릴아미드 > 메타크릴레이트로 일반화될 수 있다. (ⅲ)에 대하여 마이클 첨가는 염기성 또는 친핵성 촉매작용에 의해 가속될 수 있다(둘 다 활성 티올레이트의 농도를 증가시킴으로써 작용함).
일부 경우에, 티올의 고유한 친핵성은 다수의 대체 친전자체와의 선택적 반응을 위해 이용될 수 있으며, 이는 효율적이고 선택적인 부착이 달성되도록 한다. 예를 들어, 그러한 그룹 중 하나는 α-할로카보닐을 포함하며, 요오도아세트아미드 기반 시약이 특별히 유용하다. 더 높은 티올 선택성은 덜 친전자성인 브로모- 및 심지어 클로로- 유도체를 사용하여 달성될 수 있지만 반응성도 크게 감소한다. 더 최근에는 메틸설포닐 헤테로방향족 유도체가 티올 특이적 접합을 위한 유망한 시약으로 부상하였다. 다른 경우에, 디설파이드-브릿징 피리다진디온, 카보닐아크릴 시약 및 사이클로프로페닐 케톤과 같은 대안적인 티올 작용성 그룹이 생접합에 사용될 수 있다.
일부 경우에, 설프하이드릴이 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 설프하이드릴이 생접합에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 세 가지 형태의 활성화 할로겐 유도체를 사용하여 할로아세틸, 벤질 할라이드 및 알킬 할라이드와 같은 설프하이드릴 반응성 화합물을 생성할 수 있다. 이러한 화합물 각각에서, 할로겐 그룹은 공격 친핵성 물질에 의해 쉽게 대체되어 HX(여기서 X는 할로겐이고 수소는 친핵체에서 나온다)의 손실과 함께 알킬화 유도체를 형성할 수 있다. 할로아세틸 화합물 및 벤질 할라이드는 전형적으로 요오드 또는 브롬 유도체인 반면, 할로-머스타드는 주로 염소 및 브롬 형태를 사용한다. 요오도아세틸 그룹이 또한 친화성 리간드를 크로마토그래피 지지체에 커플링시키는 데 성공적으로 사용되었다.
일부 경우에, 말레이미드가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 말레이미드가 생접합에 사용될 수 있다. 말레이미드의 이중 결합은 안정한 티오에테르 결합을 형성하기 위해 설프하이드릴 그룹과 알킬화 반응을 겪을 수 있다.
일부 경우에, 아지리딘이 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 아지리딘이 생접합을 위해 사용될 수 있다. 이 헤테로사이클 고리의 고도 장애 특성은 친핵체에 대한 강한 반응성을 제공한다. 예를 들어, 설프하이드릴은 개환 과정에서 아지리딘 함유 시약과 반응하여 티오에테르 결합을 형성한다. 가장 단순한 아지리딘 화합물 에틸렌이민이 이용 가능한 설프하이드릴 그룹을 아민으로 변환하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 치환된 아지리딘이 동종이작용성 및 삼작용성 가교결합제를 형성하는데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 티올-말레이미드 반응은 낮은 농도에서 접합을 수행하거나 생체분자 기재의 가치로 인해 극도로 높은 효율을 요구할 때 특히 유용하다. 부착을 위한 말레이미드의 사용은 통상 약어 SMCC로 지칭되는 이작용성 시약 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)로 아민을 변형함으로써 광범위한 물질에 쉽게 도입될 수 있기 때문에 더욱 증가된다. 예를 들어, 이 시약은 우선 선택한 생체물질에 말레이미드 작용성 그룹을 도입한 다음 생리활성 스캐폴드를 생성하기 위해 펩티드와 성장 인자 모두를 부착할 수 있도록 널리 사용되었다.
일부 경우에, 아크릴로일이 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 아크릴로일이 생접합에 이용될 수 있다. 반응성 이중 결합은 설프하이드릴 그룹과 추가 반응을 겪을 수 있다. 일부 경우에, 아크릴로일 화합물과 설프하이드릴 그룹의 반응이 안정적인 티오에테르 결합을 생성하면서 발생한다. 일부 경우에, 아크릴로일은 설프하이드릴 반응성 형광 프로브인 6-아크릴로일-2-디메틸아미노나프탈렌의 설계에 사용된다.
일부 경우에, 아릴 그룹이 두 물질의 부착을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 아릴 그룹이 설프하이드릴 그룹과의 생접합에 사용될 수 있다. 아릴 할라이드는 일반적으로 아민 함유 분자를 변형하여 아릴 아민 유도체를 형성하는 데 사용되지만, 설프하이드릴 그룹과도 매우 쉽게 반응할 수 있다. 예를 들어, 플루오로벤젠 유형 화합물은 동종이작용성 가교결합제에서 작용성 그룹으로 사용되어 왔다. 친핵체와의 반응은 불소 원자를 설프하이드릴 유도체로 대체하고 치환된 아릴 결합을 생성하는 이중분자 친핵성 치환을 포함한다. 설프하이드릴 그룹으로 형성된 접합체는 과잉 티올(예를 들어, DTT)을 사용한 절단에 의해 가역적이다.
일부 경우에, 디설파이드가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 디설파이드 그룹이 생접합에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 디설파이드 그룹을 함유하는 화합물이 다른 티올과의 디설파이드 교환 반응에 참여할 수 있다. 디설파이드 교환(교환이라고도 함) 공정은 디설파이드의 티올을 공격하여 -S-S- 결합을 끊고 원래 디설파이드 화합물의 일부를 포함하는 새로운 혼합된 디설파이드를 형성한다. 티올 함유 환원제를 사용하여 단백질의 디설파이드 그룹을 설프하이드릴로 환원시키는 것은 혼합된 디설파이드의 중간 형성을 통해 진행된다. 일부 경우에, 가교결합 또는 변형 반응에서 디설파이드 교환 공정을 사용하여 설프하이드릴 함유 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
일부 경우에, 디설파이드 결합이 생접합과 같은 부착에 이용될 수 있다. 예를 들어, 디설파이드 교환 반응의 사용은 관심 폴리펩티드를 변형하는 데 선호될 수 있다. 조직 조작에서 가장 일반적으로 사용되는 시약은 반응성 피리딜티오-디설파이드를 기반으로 하며, 이는 친핵성이 낮고 분광학적으로 활성이 낮은 2-머캅토피리딘을 방출하기 위해 빠른 티올 교환을 겪는다. 또한, 디설파이드 결합 형성의 가역적 특성으로 인해 디티오트레이톨(DTT) 또는 글루타티온과 같은 환원제를 첨가하여 절단을 일시적인 정밀도로 제어할 수 있다.
일부 경우에, 피리딜 디티올이 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 피리딜 디티올 작용성 그룹이 가교결합제 또는 생접합을 위한 변형 시약의 구성에 사용될 수 있다. 피리딜 디설파이드는 4,4'-디피리딜 디설파이드와 협력하여 2-이미노티올란의 반응을 통해 분자 상의 이용 가능한 1차 아민으로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 단백질 또는 다른 분자, 2-이미노티올란 및 4,4'-디피리딜 디설파이드 사이의 동시 반응은 단일 단계로 반응성 피리딜 디설파이드 그룹을 포함하는 변형을 생성한다. 피리딜 디설파이드는 자유 설프하이드릴과의 교환 반응을 쉽게 진행하여 단일 혼합된 디설파이드 생성물을 생성한다.
일부 경우에, 이탈 그룹 5-티오-2-니트로벤조산으로 활성화된 설프하이드릴 그룹은 본원에 기술된 바와 같이 피리딜 디설파이드와 유사한 디설파이드 교환에 의해 유리 티올을 커플링하는 데 사용될 수 있다. 엘만(Ellman) 시약의 디설파이드는 유리 설프하이드릴과 쉽게 디설파이드 교환을 거쳐 5-티오-2-니트로벤조산(TNB)이라고도 하는 발색 물질 5-설피도-2-니트로벤조에이트의 한 분자의 동시 방출과 함께 혼합된 디설파이드를 형성한다. TNB-티올 그룹은 다시 설프하이드릴 함유 표적 분자와의 교환을 거쳐 디설파이드 가교결합을 생성할 수 있다. 설프하이드릴 화합물과 결합하면 TNB 그룹이 해제된다.
일부 경우에, TCEP, DTT, 2-머캅토에탄올 또는 2-머캅토에틸아민과 같은 티올 함유 화합물을 사용하여 디설파이드 환원을 수행할 수 있다.
일부 경우에, 비닐 설폰이 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 비닐 설폰 그룹이 생접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자-물질 접합체를 형성하기 위해 활성화된 비닐 설폰에 티올을 마이클 첨가하는 것은 시스테인 캡핑된 펩티드가 비닐-설폰 작용화된 멀티암 PEG를 가교결합하여 프로테아제 반응성 하이드로겔을 형성하여 조직 성장 동안 세포 침입을 가능하게 할 수 있음을 입증하는 데 사용되었다. 일부 경우에, 티올 외에도 비닐 설폰 그룹이 더 높은 pH 조건에서 아민 및 하이드록실과 반응할 수 있다. 티올과 비닐 설폰의 반응 생성물은 단일 입체이성질체 구조를 제공한다. 또한, 비닐 설폰을 함유하는 가교결합제 및 개질 시약을 사용하여 티올 반응성 그룹을 함유하도록 표면 또는 분자를 활성화할 수 있다.
일부 경우에, 티올 함유 분자는 금속 이온 및 금속 표면과 상호작용하여 생접합을 위한 배위 결합을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 산소 및 질소 함유 유기 또는 생체분자가 다양한 란타나이드 킬레이트, 이작용성 금속 킬레이트 화합물 및 FeBABE와 같은 금속 이온을 킬레이트화하는데 사용될 수 있다. 또한, 단백질의 아미노산 측쇄와 보결 그룹(prosthetic group)은 금속 이온을 활성 중심의 일부로 배위하여 생무기 모티프(bioinorganic motif)를 형성하는 경우가 많다.
일부 경우에, 티올 유기 화합물이 금속 표면 또는 입자를 코팅하여 생체적합성 층을 형성하거나 생체분자와 같은 물질의 추가 접합을 위한 작용성 그룹을 생성하기 위해 일상적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 티올 함유 지방족/PEG 링커는 평면 금 표면 및 입자에 자기 조립 단층(self-assembled monolayer, SAM)을 형성하는 데 사용되었다.
일부 경우에, 물질 사이의 부착 또는 생체분자 작용화를 위해 다수의 대안적 커플링 시스템이 사용될 수 있다. 여기에는 O-니트로페닐 에스테르(수성 조건에서 감소된 안정성을 가짐) 또는 1,1'-카보닐디이미다졸(CDI)을 사용하여 아미드 대신 아민 브릿징 카바메이트 결합을 형성하는 것이 포함된다. 하이드라진은 EDC/NHS 매개 커플링 중에 아민 대신 사용할 수도 있다. 하이드라진 작용화된 펩티드는 pH 5-6에서 단일 단계로 생체물질에 커플링될 수 있다. 그렇게 함으로써, 존재하는 라이신 잔기에 대해 어느 정도의 부위 선택성이 달성될 수 있다.
일부 경우에, 생체분자의 N-말단 변형이 생접합에 이용될 수 있다. 예를 들어, 2-피리딘카복스알데히드 변형된 아크릴아미드 하이드로겔은 ECM 단백질의 N-말단과 특이적으로 반응하여 인접한 아미드 결합과 함께 고리형 이미다졸리디논 생성물을 형성하고 이러한 주요 생체유익 모티프(bioinstructive motif)의 방향성 표시를 가능하게 한다.
일부 경우에, 생체분자 또는 고체 지지체와 같은 물질의 아크릴레이트, 아크릴아미드 및 메타크릴레이트를 부착에 사용할 수 있다. 일부 경우에, 생체분자 또는 고체 지지체와 같은 물질의 티올린(thiolyne)이 생접합에 사용될 수 있다.
일부 경우에, 천연 화학적 결찰(native chemical ligation, NCL)과 같은 티올 반응성 접합은 펩티드 결합 형성을 통해 물질을 부착하기 위해, 예를 들어, 펩티드 및 단백질을 생체물질 스캐폴드에 부착하기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, C-말단 티오에스테르를 갖는 펩티드는 다른 펩티드의 N-말단 시스테인 잔기와 반응하여 트랜스-티오에스테르화 반응을 일으켜 시스테인 티올과 중간체 티오에스테르를 형성한다.
일부 경우에, 소분자 비오틴에 대한 (스트렙트)아비딘의 강한 결합이 부착에 사용될 수 있다. 일부 경우에, (스트렙트)아비딘이 제1 물질에 부착될 수 있고 비오틴이 제2 물질에 부착될 수 있어 물질들이 (스트렙트)아비딘과 비오틴의 결합을 통해 부착될 수 있다. 일부 경우에, 변형 시약은 작용성 비오틴 그룹을 단백질, 핵산 및 기타 분자에 첨가할 수 있다. 일부 경우에, 비오티닐화(biotinylation) 화합물에 존재하는 작용기에 따라, 항체 또는 다른 단백질의 특정 작용성 그룹이 변형되어 (스트렙트)아비딘 결합 부위를 생성할 수 있다. 아민, 카복실레이트, 설프하이드릴 및 탄수화물 그룹은 비오틴 유도체의 적절한 선택을 통해 비오티닐화를 위해 특별히 표적화될 수 있다. 일부 경우에, 변형을 위한 편리한 작용성 그룹을 함유하지 않는 분자에 비오틴 그룹을 비선택적으로 첨가하는데 광반응성 비오티닐화 시약이 사용된다. 일부 경우에, 비오틴 결합 단백질은 비오티닐화 분자의 커플링에 사용하기 위해 표면, 크로마토그래피 지지체, 미세입자 및 나노입자에 고정될 수 있다. 일부 경우에, 일련의 (스트렙트)아비딘-비오틴 상호작용이 서로를 기반으로 하여 각각의 사량체 (스트렙트)아비딘 분자의 다가 특성을 활용하고 표적에 대한 검출 능력을 강화시킬 수 있다. 일부 경우에, 비오틴의 발레르산 측쇄에 작용성 그룹을 함유할 수 있는 아민 반응성 비오티닐화 시약이 단백질 및 기타 분자에서 1차 아민과 공유 결합을 형성할 수 있다. 일부 경우에, NHS 에스테르가 아민과 자발적으로 반응하여 아미드 연결을 형성하는 반면 카복실레이트 함유 비오틴 화합물은 EDC를 사용하여 카보디이미드 매개 반응을 통해 아민에 결합될 수 있다. 일부 경우에, NHS-이미노비오틴을 사용하여 아민 함유 분자를 이미노비오틴 태그로 표지하여 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 가역적 결합 가능성을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 설포-NHS-SS-비오틴(NHS-SS-비오틴이라고도 함)은 아민 함유 단백질 및 기타 분자를 변형하는데 사용될 수 있는 긴 사슬 절단 가능한 비오티닐화 시약인 설포석신이미딜-2-(비오틴아미도)에틸-1,3-디티오프로피오네이트이다. 일부 경우에, 확장된 스페이서 암 끝에 말레이미드 그룹을 함유하는 비오티닐화 시약인 1-비오틴아미도-4-[4'-(말레이미도메틸)사이클로헥산-카복사미도]부탄이 단백질 및 기타 분자의 설프하이드릴 그룹과 반응하여 안정한 티오에테르 결합을 형성한다. 일부 경우에, N-[6-(비오틴아미도)헥실]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드 시약은 비오틴의 발레르산 측쇄에 부착된 1,6-디아미노헥산 스페이서 그룹을 함유하고, 상기 스페이서의 말단 아미노 그룹은 SPDP의 산 전구체와의 아미드 연결을 통해 추가로 변형되어 말단 설프하이드릴 반응성 그룹을 생성할 수 있다. 비오틴-HPDP의 피리딜 디설파이드 말단은 단백질 및 기타 분자의 유리 티올 그룹과 반응하여 피리딘-2-티온의 손실과 함께 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
일부 경우에, 카복실레이트가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 카복실레이트가 생접합에 이용될 수 있다. 일부 경우에, 디아조메탄 및 기타 디아조알킬 유도체를 사용하여 카복실레이트 그룹을 표지화할 수 있다. 일부 경우에, N,N'-카보닐 디이미다졸(CDI)을 사용하여 비수성 조건하에 카복실산과 반응하여 반응성이 높은 N-아실이미다졸을 형성할 수 있다. 활성 카복실레이트는 아민과 반응하여 아미드 결합을 형성하거나 하이드록실 그룹과 반응하여 에스테르 결합을 형성할 수 있다. 또한, CDI를 사용한 스티렌/4-비닐벤조산 공중합체의 활성화는 효소 리소자임 또는 다른 분자를 이용 가능한 아미노 그룹을 통해 매트릭스 상의 카복실 그룹에 고정하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 카보디이미드는 부착을 위한 아민 함유 화합물과의 커플링을 위해 카복실레이트 그룹을 활성화할 수 있는 길이가 0-길이 가교결합제로서 기능한다. 일부 경우에, 카보디이미드는 카복실레이트와 아민 또는 포스페이트와 아민 사이의 아미드 또는 포스포르아미데이트 연결의 형성을 매개하는 데 사용된다.
일부 경우에, N,N'-디석신이미딜 카보네이트 또는 N-하이드록시석신이미딜 클로로포르메이트는, 예를 들어, 생접합을 통해 종을 부착하는 데 사용될 수 있다. N,N'-디석신이미딜 카보네이트(DSC)는 본질적으로 2개의 NHS 에스테르를 함유하는 카보닐 그룹으로 이루어진다. 이 화합물은 친핵체에 대해 매우 반응성이 높다. 수용액에서 DSC는 가수분해되어 N-하이드록시석신이미드(NHS) 분자 2개를 형성하고 CO2 분자 1개를 방출한다. 비수성 환경에서 상기 시약을 사용하여 하이드록실 그룹을 석신이미딜 카보네이트 유도체로 활성화할 수 있다. DSC 활성화 하이드록실 화합물은 아민 함유 분자와 접합하여 안정한 가교결합된 생성물을 형성하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 과요오드산나트륨이 인접 탄소 원자 상의 하이드록실 그룹을 산화하여 부착을 위해, 예를 들어, 생접합을 통한 부착을 위해 아민 또는 하이드라지드 함유 분자와 커플링하기에 적합한 반응성 알데히드 모이어티를 형성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 반응은 환원적 아미노화에 의해 아민 함유 분자의 후속 접합을 위해 탄수화물 또는 당단백질에서 가교결합 부위를 생성하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 효소는 하이드록실 함유 탄수화물을 산화하여 생접합을 위한 알데히드 그룹을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 말단 갈락토스 또는 N-아세틸-d-갈락토스 모이어티에 대한 갈락토스 산화효소의 반응은 다당류 사슬에 C-6 알데히드 그룹을 형성하기 위해 진행된다. 그런 다음 이러한 그룹은 아민 또는 하이드라지드 함유 분자와의 접합 반응에 사용될 수 있다.
일부 경우에, 반응성 알킬 할로겐 화합물은 탄수화물, 중합체 및 부착을 위한 기타 물질에서 하이드록실 그룹을 특이적으로 변형시키는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 알데히드 또는 케톤이 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 알데히드 또는 케톤이 생접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 하이드라진의 유도체, 특히 카복실레이트 그룹으로부터 형성된 하이드라지드 화합물은 표적 분자의 알데히드 또는 케톤 작용성 그룹과 특이적으로 반응할 수 있다. 하이드라지드와 알데히드 사이의 결합을 추가로 안정화시키기 위해, 하이드라존은 나트륨 시아노보로하이드라이드와 반응하여 이중 결합을 환원시키고 안전한 공유 결합을 형성할 수 있다.
일부 경우에, 아미노옥시가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 또는 고체 지지체의 아미노옥시 그룹이 생접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 알데히드 그룹과 아미노옥시 그룹 사이에서 발생하는 화학선택적 결찰 반응은 많은 생접합 반응은 물론 표면을 포함하는 불용성 지지체로의 리간드의 커플링에서 사용된 옥심 연결(알독심)을 생성한다. 이 반응은 또한 케톡심이라는 옥심을 형성하는 케톤과 매우 효율적이다.
일부 경우에, 첨가 환화 반응이 생접합을 통한 부착과 같은 부착을 위해 이용될 수 있다. 첨가 환화 반응에서 2개 이상의 불포화 분자가 함께 모여 불포화도가 감소된 순환 생성물을 형성하고, 이러한 반응 파트너는 전형적으로 자연계에 존재하지 않으므로 접합을 위한 첨가 환화의 사용은 커플링 파트너 내에서 비천연 작용기의 도입을 이용한다.
일부 경우에, 구리 촉매화 아지드-알킨 첨가 환화(CuAAC)가 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, CuAAC가 생접합에 활용될 수 있다. 일부 경우에, 아지드와 알킨 사이의 (3 + 2) 첨가 환화가 고온(>90℃)에서 자발적으로 진행되어 2개의 트리아졸 이성질체의 혼합물을 생성한다. 일부 경우에, 이 반응은 실온, 주변, 산소 처리 및/또는 수성 환경에서 진행된다. 일부 경우에, 예를 들어, CuAAC에 의한 펩티드-물질 접합체의 형성, 알킨 캡핑된 펩티드를 사용하여 아지드 작용화된 PEG로 하이드로겔을 형성한다. 일부 경우에, CuAAC를 통해 접합을 달성하기 위해 구리(Ⅰ) 촉매를 직접 첨가하거나, 가장 일반적으로 아스코르브산을 사용하여 초기 구리(Ⅱ) 복합체를 환원시켜 현장에서 생성할 수 있다. 환원제의 첨가는 산소에 대한 CuAAC 결찰의 민감도를 추가로 감소시킨다. 트리아졸 형성에 추가 리간드가 필요하지 않지만, 3차 아민 기반 리간드의 첨가가 사용될 수 있다.
일부 경우에, 변형 촉진된 알킨-아지드 첨가 환화(SPAAC)는 두 물질의 부착에 활용될 수 있다. SPAAC는 생접합에 활용될 수 있다. 일부 경우에, 고도로 변형된 사이클로옥틴이 촉매를 첨가할 필요 없이 생리학적 조건에서 아지드와 쉽게 반응하여 트리아졸을 형성한다. 일부 경우에, 펩티드 접합에 SPAAC를 사용하는 것 외에도 많은 저명한 보고서에서 SPAAC를 사용하여 비천연 아지드 모티프를 단백질 커플링 파트너에 도입하여 사이클로옥틴 작용화된 생체물질에 단백질 기재를 부착하였다. 예를 들어, 일부 경우에 이것은 IFN-γ의 효소 매개 N-말단 변형을 통해 또는 다수의 단백질 기재에서 비천연 아미노산 4-아지도페닐알라닌으로 코돈 재할당(codon reassignment)을 통해 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)에 존재하는 천연 시스테인의 말레이미드 작용화를 포함함으로써 달성된다. 일부 경우에, 초분자(supramolecular) 호스트-게스트 상호작용을 사용하여 아지드-알킨 첨가 환화를 촉진할 수도 있다. 예를 들어, 두 반응 파트너가 cucurbit[6]uril 숙주의 공동 내에서 근접해짐으로써 단백질 표면에서 효율적인 첨가 환화가 달성될 수 있으며, 이 전략은 다른 적절한 분자로 확장될 수 있다.
일부 경우에, 역 전자 요구 딜스-알더(IEDDA) 반응이 생접합을 통한 부착과 같은 부착을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 1,2,4,5-테트라진과 변형된 알켄 또는 알킨 사이의 IEDDA 반응이 사용될 수 있다. 분자 접합을 수행하기 위한 광범위한 적합한 유도체가 보고되었으며, 예를 들어, 일련의 점점 변형된(따라서 반응성인) 트랜스-사이클로옥텐이 사용될 수 있다. 일부 경우에, IEDDA 반응을 수행하기 위해 작용화된 노르보르넨 유도체가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 트리아진이 사용될 수 있다. 일부 경우에, 스피로헥센이 사용될 수 있다. 이러한 전략은 다른 적절한 분자로 확장될 수 있다. 일부 경우에, 말레이미드와 푸란의 헤테로-딜스-알더 첨가 환화가 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 푸란 작용화된 RGDS 펩티드와 말레이미드 작용화된 PEG-하이드로겔의 커플링이 이용될 수 있고, 이 전략은 다른 적절한 분자로 확장될 수 있다. 일부 경우에, 푸란 작용화된 히랄루론산 하이드로겔이 딜스-알더 첨가 환화를 통해 디말레이미드 작용화된 펩티드와 가교될 수 있다.
일부 경우에, 옥심과 하이드라존이 두 물질의 부착에 사용될 수 있다. 예를 들어, 옥심 및 하이드라존 형성이 생접합에 이용될 수 있다. 일부 경우에, 하이드라존 형성을 통해 생체물질에 대한 펩티드 및 DNA의 안정적인 부착이 이작용성 가교결합을 통해 달성될 수 있으며, 이 전략은 다른 적절한 분자로 확장될 수 있다. 예를 들어, 단백질 가교결합된 하이드로겔은 단백질 N-말단과 C-말단 모두에서 옥심 변형을 통해 생성될 수 있다.
일부 경우에, 딜스-알더 반응은 디엔과 알켄의 공유 결합으로 이루어져 부착을 위한 6원 고리 복합체를 형성한다.
일부 경우에, 전이 금속 착물이 생접합을 통한 부착과 같은 부착을 위해 활용될 수 있다. 후기 전이 금속의 성질은 불포화 및 편극성 작용성 그룹(올레핀, 알킨, 아릴 요오다이드, 아릴보론산 등)의 조작에 매우 적합한 전이 금속 복합체를 만들 수 있다. 예를 들어, Pd(0) 작용화된 고체 지지체는 세포질에서 알릴 카바메이트 탈보호 및 스즈키-미야우라(Suzuki-Miyaura) 교차 결합을 매개할 수 있다. 다른 예에서, 루테늄 촉매는 살아 있는 세포 내부에 갇힌 형광단의 알릴 카바메이트 탈보호를 매개하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 세포 배양에서 팔라듐 기반 적용의 적용에는 무구리 소나가시라(Sonagashira) 커플링, 대장균(E. coli) 세포 표면의 세포외 스즈키 커플링 및 알릴 셀레노설페이트염과 티올 그룹의 접합이 포함된다. 일부 경우에, 올레핀 복분해가 생접합에 활용될 수 있다. 예를 들어, 루테늄 복합체의 경우, S-알릴시스테인은 데하이드로알라닌으로의 알릴 티올의 접합 첨가, 시스테인의 직접 알릴화, 알릴 디설파이드의 탈황, 또는 메티오닌 영양요구성 대장균(methionine auxotrophic E. coli)에서 메티오닌 대용물로서의 대사적 혼입을 포함하는 다양한 방법에 의해 단백질에 쉽게 도입될 수 있다.
일부 경우에, 보론산 유도체와의 복합체 형성이, 예를 들어, 생접합을 통한 물질 부착에 활용될 수 있다. 예를 들어, 보론산 유도체는 1,2- 또는 1,3-디올, 1,2- 또는 1,3-하이드록시산, 1,2- 또는 1,3-하이드록실아민, 1-2- 또는 1,3-하이드록시아미드, 1,2- 또는 1,3-하이드록시옥심은 물론 이러한 종을 함유하는 다양한 당 또는 생체분자로 이루어진 인접한 작용성 그룹을 갖는 다른 분자와 고리 구조를 형성할 수 있다.
일부 경우에, 효소 매개 접합을 이용하여 물질을 부착할 수 있다. 예를 들어, 트랜스글루타미나제 효소 계열은 라이신 측쇄의 1차 아민과 상보성 글루타민 잔기의 아미드 결합 사이의 이소펩티드 결합 형성을 촉매하며, 이 전략은 다른 적절한 분자로 확대될 수 있다. 다른 경우에, 접합을 위해 퍼옥시다제 매개 접합이 활용될 수 있다. 예를 들어, 호스래디시 퍼옥시다제(HRP)는 티로신의 페놀 그룹과 같은 광범위한 유기 기재를 산화하여 2개의 티로신 잔기 사이에 오르토 탄소-탄소 결합을 형성하는 자발적 이량체화를 겪는 반응성이 높은 라디칼 또는 퀴논 중간체를 생성하는 데 활용될 수 있고, 이 전략은 다른 적절한 분자로 확대될 수 있다. 일부 경우에, 짧은 펩티드 태그가 생접합에 활용될 수 있다. 이러한 펩티드 태그는 5개 아미노산만큼 짧을 수 있으며 후속 변형을 가능하게 하는 폴리펩티드에 부착될 수 있다.
일부 경우에, 저분자량 단량체의 중합이, 예를 들어, 생접합을 통한 물질의 부착에 활용될 수 있다. 중합은 연쇄 성장(chain-growth) 또는 단계 성장의 두 가지 메커니즘 중 하나를 통해 진행되는 것으로 분류될 수 있다. 연쇄 성장 중합 동안, 성장하는 중합체 사슬의 "활성" 엔드에 단량체가 추가되어 전환율이 낮더라도 고분자량 물질이 형성된다. 단계 성장 중합 동안 짧은 올리고머 사슬이 커플링하여 중합체 종을 형성하는데, 고분자량에 도달하기 위해서는 높은 변환이 필요하다. 두 기술 모두 생체분자-고분자 접합체와 같은 접합체를 형성하는 데 사용할 수 있다. 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 단량체의 중합은 특히 유익한 것으로 입증되었다. 예를 들어, 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 변형된 단백질은 쉽게 중합될 수 있다. 마찬가지로, 합성 올리고뉴클레오티드 포스포르아미다이트 빌딩 블록 "아크리다이트(Acrydite)"의 이용 가능성, 자유 라디칼 중합은 DNA 및 RNA 작용화된 물질을 형성하는 가장 일반적인 방법 중 하나로 남아 있다. 공단량체의 존재하에 중합을 수행하면 분자 표시 밀도를 쉽게 조정할 수 있어 입체 장애로 인한 잠재적인 어려움을 극복할 수 있다. 중합 개시는 열, UV 및 가시광선, 산화환원 반응 및 전기화학을 포함한 다수의 수단에 의해 촉발될 수 있다. 아크릴레이트 변형된 단백질은 생물학적 활성을 유지하면서 작용성 물질을 생성하기 위해 중합될 수도 있다. 일부 경우에 리빙 라디칼 중합(living radical polymerization, LRP)이 생접합에 활용될 수 있다. 예를 들어, 생접합체의 형성을 위해 가장 일반적으로 사용되는 LRP는 원자 이동 라디칼 중합(atom-transfer Radical Polymerization, ATRP), 가역적 첨가 분열 연쇄 이동(reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT) 중합 및 니트록사이드 매개 중합(Nitroxide-Mediated Polymerization, NMP)을 포함한다.
일부 경우에, 광접합이, 예를 들어, 생접합을 통한 물질의 부착에 활용될 수 있다. 일부 경우에, 라디칼 종의 생성에 의해 중합이 시작된 다음 결합 형성을 통해 전파되어 활성 중합체 사슬을 생성한다. 개시 단계는 많은 자극을 통해 유도될 수 있으며, 열 분해, 산화환원 활성화 및 개시 종의 전기화학 이온화가 가장 일반적이다. 대안적으로, 많은 개시제는 광 유도된 광분해 결합 파괴(유형 Ⅰ) 또는 공동 개시제로부터 양성자의 광활성화 추상화(유형 Ⅱ)를 통해 활성화될 수 있다. 광개시화는 사용된 개시제에 따라 좁고 조정 가능한 활성화 파장을 사용하고 라디칼을 빠르게 생성하며 광원을 제거하여 중합을 제어할 수 있는 능력을 사용하여 넓은 온도 범위에 적용할 수 있는 이점을 제공한다. 중요한 것은 산소에 대한 중합 내성이 크게 향상되어 세포와 조직 존재하에서의 중합이 가능하다는 것이다. 광중합 동안 아크릴레이트 작용화된 펩티드 및 단백질의 혼입은 생체 재료 접합체를 생성하는 방법으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 사전 형성된 물질 상의 펜던트 비닐 그룹으로의 폴리펩티드의 광개시 부착도 널리 보고되었고 최근에는 2-광자 여기를 통한 3D 패터닝에 사용된다. 광범위한 광개시제가 광접합 접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 에오신(Eosin) Y, 2,2-디메톡시-2-페닐-아세토페논, Igracure D2959, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 및 리보플라빈이 광개시제로 사용될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 광개시제는 일반적으로 빛을 흡수하여 광반응 과정을 개시한다. 일부 경우에, 광접합은 광 티올-엔 반응을 활용할 수 있다. 티올은 또한 자유 라디칼 메커니즘을 통해 알켄과 반응할 수 있다. 티올 라디칼은 먼저 알켄과 반응하여 탄소 중심 라디칼을 생성한 다음, 다른 티올로부터 양성자를 추출하여 반응을 전파할 수 있다. 광 티올-엔 반응은 티올-수소를 빠르게 추출할 수 있는 불안정한 탄소 라디칼 중간체를 생성하는 전자 풍부 알켄에 의해 가속화될 수 있다. 이 규칙에 대한 예외는 노르보르넨 유도체인데, 여기서 반응성은 티올 추가 시 고리 변형의 해제에 의해 대신 구동된다. 이는 노르보르넨 > 비닐 에테르 > 프로페닐 > 알릴 에테르 > 아크릴레이트 > 말레이미드의 반응성의 일반적인 경향으로 이어진다. 노르보르넨 및 알릴옥시카보닐(알록 그룹)은 각각 거의 무시할 수 있는 연쇄 이동 기여와 펩티드 합성 중 도입의 용이성으로 인해 펩티드/단백질-생체 물질 작용화에 특히 널리 사용되어 왔다. 예를 들어, 고상 펩티드 합성 동안 직교 라이신 보호 그룹으로서 전형적으로 사용되는 알록 그룹은 효율적인 광 티올-엔 작용성 그룹이다. 다른 예에서, 노르보넨 광 티올-엔 반응은 생체활성 펩티드 및 성장 인자 단백질의 테더링(tethering) 및 공간 패터닝에 사용될 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 알록 및 노르보르넨 작용성 그룹 외에도 다른 알켄도 생체물질 작용화에 사용되었다. 예를 들어, 코돈 재할당은 알릴-시스테인 잔기를 단백질에 부위별로 통합하는 데 사용되었으며, 이후 광 티올-엔 반응의 사용을 통해 접합될 수 있다. 대안적으로, 아크릴레이트는 시스테인 캡핑된 펩티드의 존재 하에서 혼합 모드 광중합을 겪을 수 있는 반면, 알릴 디설파이드 구조는 공액 티올의 가역적이고 제어된 교환을 겪는 것으로 최근에 밝혀졌다.
일부 경우에, 아릴 아지드 또는 할로게네이트 아릴 아지드를 사용하여 물질을 부착할 수 있다.
일부 경우에, 벤조페논과 같은 광반응성 그룹이 물질 부착에 활용될 수 있다.
일부 경우에, 광반응성 그룹 안트라퀴논이 생접합을 통한 부착과 같은 물질 부착에 활용될 수 있다. 일부 경우에, 광 티올-인 반응은 생접합을 통한 부착과 같은 물질 부착에 활용될 수 있다. 광 티올-인 반응의 대부분의 예는 간단한 프로파길-에테르 또는 -아민 작용성 그룹을 이용하였다.
일부 경우에, 반응성 작용기의 광케이징(photocaging) 및 활성화가 생접합을 통한 부착과 같은 물질 부착에 활용될 수 있다. 일반적으로, 아크릴레이트인지 또는 티올 유도된 라디칼인지 여부에 관계없이 일시적인 반응성 종이 형성된다. 일부 경우에, 노출되는 것이 바람직할 때까지 작용성 그룹을 차폐하거나 보호하기 위해 광케이징을 사용할 수 있다. 일부 경우에, 가장 널리 사용되는 케이지는 o-니트로벤질 및 쿠마린 발색단을 기반으로 한다. 예를 들어, 니트로벤질 캡핑된 시스테인 잔기는 325nm UV 광 조사에 의해 분해될 수 있으며, 방출된 티올은 마이클 첨가를 통해 말레이미드 작용화된 펩티드와 반응하여 세포 이동을 안내할 수 있는 패턴화된 하이드로겔을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 6-브로모-하이드록시쿠마린이 티올 케이징에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 광친화성 프로브가 생접합에 활용될 수 있으며, 조사 시 반응성이 높은 중간체가 높은 공간 정밀도로 가장 가까운 접근 가능한 작용성 그룹과 빠르게 반응한다. 일부 경우에, 가장 일반적으로 사용되는 것은 페닐아지드, 벤조페논 및 페닐-디아지린이다. 일부 경우에, 광케이징된 첨가 환화가 사용될 수 있다. 예를 들어, 테트라졸의 UV 조사는 아크릴레이트 또는 아크릴아미드와 같은 전자 결핍 알켄과의 급속한 첨가 환화를 겪을 수 있는 반응성 니트릴-이민 중간체를 생성하는 것으로 나타났다. 일부 경우에, 티올과의 니트릴-이민 부반응성은 테트라졸 작용화된 표면에 대한 시스테인 함유 단백질의 부위 특이적 접합에 활용될 수 있다.
일부 경우에, 비공유 상호작용이 생접합을 통한 부착과 같은 물질의 부착을 위해 활용될 수 있다. 일부 경우에, 관심 생체분자에 대한 결합 친화성을 나타내는 비공유 서열은 제작 후 변형(postfabrication modication)을 가능하게 하거나 고유 생체분자가 생물학적 샘플 내에서 주변 환경으로부터 단순히 격리되도록 한다. 유용한 결합 서열은 생체 내에 존재하거나 파지 디스플레이(phage display)와 같은 기술을 통해 결정되는 공지된 단백질 결합 도메인을 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래된 7 내지 20개의 아미노산 길이의 짧은 펩티드이다. 일부 경우에, 압타머는 사이토카인 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor, PDGF)를 포함한 다양한 단백질 기재는 물론 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)와 같은 세포 표면 단백질을 결합하는 데 사용될 수도 있다. 일부 경우에, 결합 서열은 또한 헤파린과 같은 천연 생체중합체에 대한 친화성을 가진 생체물질에 도입될 수도 있다. 일부 경우에, 먼저 생체중합체 결합을 유도함으로써 첨가된 또는 내인성 성장 인자 또는 신호 단백질이 생체물질 스캐폴드에 흡착되는 것을 제어할 수 있다. 일부 경우에, 아미노산 수준의 결합 친화성을 이용하여 특정 생체물질 기재에 대한 펩티드 및 단백질 접합을 가능하게 할 수도 있다. 예를 들어, 비천연 카테콜 기반 아미노산의 결합을 사용하여 생체유리(bioglass) 및 금속 임플란트를 함유하는 금속 산화물로의 결합을 유도하여 이러한 중요한 기술의 생체활성을 향상시킬 수 있다.
일부 경우에, 자가 조립 펩티드가 생접합을 통한 부착과 같은 물질의 부착에 활용할 수 있다. 예를 들어, 천연 펩티드와 단백질은 개별 서열을 안정화하고 단백질 간 응집을 제어할 수 있는 β-시트 및 α-나선을 포함한 일련의 2차 구조를 채택한다. 일부 경우에, 자가 조립 펩티드가 하이드로겔과 섬유질 물질을 조립하는 데 광범위하게 사용되었다. 이러한 많은 구조에서 생물학적 에피토프 또는 작용성 그룹은 시스템에 원하는 생체활성을 추가하기 위해 펩티드 합성 중에 펩티드 빌딩 블록의 일부 또는 전부에 첨가될 수 있다. 단순한 접착 모티프에서 라미닌(laminin) 유래된 에피토프 및 성장 인자 모방체에 이르는 펩티드-리간드가 모두 자가 조립 피브릴의 표면에 표시되었다. 대안적으로, 글리코펩티드를 조립하여 세포외 신호전달 단백질 및 성장 인자를 모집하거나, 히알루론산 내 글리코실화 패턴을 모방하거나, 글리코사미노글리칸 스캐폴드에서 최적의 설폰화 비율을 조사할 수 있다. 일부 경우에, 자가 조립 도메인이 전체 길이 단백질에 첨가되어 하이드로겔 형성 중에 펜던트 기능이 통합될 수도 있다. 일부 경우에, 2차 구조를 형성하는 펩티드의 성향이 비자가 조립 스캐폴드 내에서도 활용되었다. 이것은 PEG의 상호침투 네트워크와 같은 비상호작용 중합체로 또는 추가 전하 상호작용이, 예를 들어, 양으로 하전된 펩티드와 음으로 하전된 알기네이트 사이에서 최종 작제물을 추가로 안정화시키는 시스템으로 구성된 공유 하이드로겔에 자가 조립 펩티드를 혼합함으로써 달성될 수 있다. 대안으로서, 펜던트 나선 그룹은 공유 물질에 부착될 수 있으며 자가 조립을 통해 성장 인자와 같은 생체활성 그룹의 코일드 코일 삼중 나선(coiled-coil triple helices)으로의 비공유 결합을 구동하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 호스트-게스트 화학이 생접합을 통한 부착과 같은 물질 부착에 활용될 수 있다. 예를 들어, β-사이클로덱스트린 변형된 알기네이트 스캐폴드의 접착 특성은 게스트 나프틸 작용화된 RGDS 펩티드의 첨가 및 후속적으로 더 높은 호스트 결합 상수를 갖는 비-세포 접착성 아다만탄-RGES 펩티드의 도입을 통해 현장에서 제어될 수 있고, 섬유아세포 세포 부착의 동적 변조(dynamic modulation)가 가능해졌다. 사이클로덱스트린과 나프틸 또는 아다만탄 작용화된 펩티드 사이의 호스트-게스트 상호작용은 알기네이트 작용화를 가능하게 하며, 이는 다른 적절한 분자에 적용될 수 있다.
일부 경우에, 핵산이 생접합을 통한 부착과 같은 물질 부착에 활용될 수 있다. 일부 경우에, 자가 조립 펩티드와 유사한 방식으로 핵산도 조립된 물질 자체를 형성하여 분자 표시를 위한 조정 가능한 플랫폼을 생성할 수 있다. 일부 경우에, DNA 태그된 폴리펩티드가 적절하게 작용화된 물질에 접합될 수 있다.
일반적으로, 작용성 그룹의 통합이 물질의 부착에 활용될 수 있다. 예를 들어, 고유한 반응성 모티프를 분자에 도입하면 단일 부위 선택성 또는 특이성을 달성할 수 있는 화학 "태그"가 제공된다. 일부 경우에, 폴리펩티드 또는 핵산은 고상 합성(solid phase synthesis, SPS)을 통해 생성될 수 있다. 유기 합성의 다재다능함은 본원에 기술된 바와 같이 이용 가능한 광범위한 적절하게 작용화된 아미노산 및 뉴클레오티드를 사용하여 작용성 그룹 통합의 어려움을 극복할 수 있게 한다. 일부 경우에, 원하는 작용성 그룹을 보유하는 비천연 아미노산(unnatural amino acid, UAA)을 도입하는 것이 대안적 접근 방식이다. 이는 아민 반응성 유도체를 이용한 라이신 잔기의 변형을 통해 달성될 수 있다. 일부 경우에, 특정 아미노산을 생합성할 수 없어 성장 배지에서 섭취해야 하는 영양요구성 박테리아 균주를 사용한다. 천연 아미노산의 박테리아를 굶기고 구조적으로 관련된 비천연 유사체를 보충함으로써, 박테리아 세포는 번역 중에 UAA를 통합하도록 유도될 수 있다. 이 기술은 CuAAC 및 SPAAC 반응을 수행하기 위한 작용성 그룹의 통합으로 이어지는, 메티오닌의 아지드 및 알킨 기반 모방체를 설치하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 번역 중에 UAA를 선택적으로 인식하고 충전하는 직교 tRNA 및 tRNA 합성효소 쌍을 사용하는 코돈 재할당을 사용한다. 일부 경우에, 이것은 택일적 킹덤으로부터 숙주 세포로 tRNACUA/tRNA 합성효소 쌍을 통합하여 앰버 정지 코돈(amber stop-codon) UAG를 재할당함으로써 달성할 수 있다. 이 쌍은 원하는 UAA를 설치할 수 있지만 내인성 세포 조직에는 효과적으로 보이지 않는다. 그 결과, 부위 특이적 돌연변이유발을 사용하여 암호 DNA의 원하는 위치에 단일 TAG 코돈을 도입하여 높은 특이성과 선택성으로 UAA의 단일 도입을 유도할 수 있다.
조성물 및 키트
본 개시내용에 기술된 바와 같이 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포함하는 조성물 또는 키트가 형성될 수 있다. 조성물과 관련하여 몇 가지 구성이 아래에 제시되어 있다. 키트가 유사하게 구성될 수 있음을 이해할 것이다. 조성물은 용액 또는 용매 및 기타 구성 성분과 함께 하나 이상의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물의 특정 제형은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 의도된 용도 및 조성물 내의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 특정 조성에 따라 달라질 수 있다. 조성물은 1) 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대한 안정성 및 저장 요건; 2) 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 특성 및/또는 특징; 및 3) 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대한 사용 모드를 포함하는 몇몇 인자에 기초하여 제형화될 수 있다. 안정성 및/또는 저장 고려 사항은 고정 성분, 결합 성분 및/또는 표지 성분 안정성을 유지하기 위한 조건을 포함할 수 있다. 특성 또는 특징 고려 사항은 친화성 및/또는 결합활성 특징, 프로브 해리 및 표지 성분 특징을 포함할 수 있다. 사용 모드 고려 사항은 검출 방법, 멀티플렉싱 및 2차 결합 상호작용을 포함할 수 있다.
일반적으로, 조성물은 액체 매질에 하나 이상의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 액체 매질은 수성이거나 그렇지 않으면 물을 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 액체 매질은 극성 용매 또는 비극성 용매와 같은 비수성 용매를 포함할 수 있다. 액체 매질은 pH 버퍼 용액을 포함할 수 있다. pH 버퍼 용액은, 예를 들어, 고정 성분 또는 결합 성분의 안정성을 유지하기 위해, 또는 결합 성분 결합 상호작용의 강도를 중재하기 위해 원하는 범위 내에서 용액 pH를 유지하도록 제형화될 수 있다. 액체 매질은 하나 이상의 염을 추가로 포함할 수 있다. 액체 매질의 염은 액체 매질의 이온 강도를 변경하기 위해 첨가될 수 있다. 예를 들어, 고정 성분 또는 결합 성분의 안정성을 유지하거나 결합 성분 결합 상호작용의 강도를 중재하기 위해 이온 강도를 조정할 수 있다. 프로브 조성물은 에멀젼 또는 콜로이드 현탁액, 예를 들어, 유중수 에멀젼 또는 수중유 에멀젼을 포함할 수 있다.
핵산(예를 들어, DNA 오리가미, DNA 나노볼, 압타머)을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 핵산 안정성을 유지하기 위해 특별히 제형화된 조성물에 제공될 수 있다. 일부 구성에서, 핵산을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 마그네슘염(예를 들어, MgCl2)을 포함하는 액체 매질에 제공될 수 있다. 마그네슘염은 핵산 안정성(예를 들어, 염기쌍 결합, 나선형 구조 등)을 유지하기에 충분한 농도로 제공될 수 있다. 마그네슘염은 농도가 적어도 약 10mM, 50mM, 100mM, 120mM, 140mM, 160mM, 180mM, 200mM, 220mM, 240mM, 260mM, 280mM, 300mM, 350mM, 400mM, 500mM 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 마그네슘염은 농도가 약 500mM, 400mM, 350mM, 300mM, 280mM, 260mM, 240mM, 220mM, 200mM, 180mM, 160mM, 140mM, 120mM, 100mM, 50mM, 10mM 이하일 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포함하는 액체 매질은 스캐빈저 종을 추가로 포함할 수 있다. 스캐빈저는 자유 라디칼 스캐빈저, 산소 스캐빈저 및 금속 킬레이트제와 같이 화학적으로 해롭거나 손상을 주는 화학종을 제거하기 위한 화학종을 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에서 가능한 스캐빈저는 하이드라진, 아스코르브산, 토코페롤, 나린제닌(naringenin), 글루타티온(glutathione), 스타넨(stannene) 및 EDTA와 같은 종을 포함할 수 있다. 스캐빈저는 검정 또는 다른 사용 모드 전에 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물을 저장하기 위한 액체 매질에 포함될 수 있다.
일부 구성에서, 액체 매질을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물은 유중수 에멀젼 또는 수중유 에멀젼과 같은 다상 액체로 제형화될 수 있다. 다상 액체 매질은 사용 모드 전 또는 사용 모드 동안 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 국소화 및/또는 제한을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 방출은 에멀젼을 파괴하고 이에 따라 에멀젼 내에 갇힌 프로브가 방출됨으로써 제어될 수 있다. 추가로, 다상 제형은 혼합된 화학적 특징(예를 들어, 소수성 및 친수성 성분) 또는 수성 화학에 대한 민감성(예를 들어, 가수분해 민감성)을 갖는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 안정성을 증가시킬 수 있다.
일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물은 경쟁자 종을 포함하도록 제형화될 수 있다. 경쟁자 종은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 결합하도록 구성된 친화성 시약 또는 기타 분자를 포함할 수 있다. 경쟁자 종은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 낮은 친화성을 특징으로 할 수 있다. 일부 구성에서, 경쟁자 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대한 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티와 동일한 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 낮은 친화성을 특징으로 할 수 있다. 다른 구성에서, 경쟁자 종은 복수의 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 낮은 친화성(예를 들어, 감소된 결합 특이성)을 특징으로 할 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 경쟁자 종은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티로부터의 대체가 결합의 깁스 자유 에너지의 증가에 의해 유도되는 결합 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 경쟁자 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약보다 결합 파트너에 대해 더 큰 결합 엔탈피를 가질 수 있으므로 경쟁자를 대체하고 프로브에 결합하는 것이 에너지적으로 유리하다. 마찬가지로, 경쟁자 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 위해 결합 파트너로부터 해리함으로써 시스템의 엔트로피를 증가시킬 수 있다. 경쟁자 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에서 조정 가능한 결합활성을 생성하는 데 유리할 수 있는데 그 이유는 1) 경쟁자 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 결합하는 것을 열역학적으로 촉진할 수 있고, 2) 경쟁자 종은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대한 농도 의존적 경쟁을 제공함으로써 프로브 결합 동역학에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 도 20a - 20b는 결합을 촉진하기 위한 결합 경쟁자를 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 경쟁의 사용을 도시한다. 도 20a는 에피토프 또는 표적 모이어티(2020)를 포함하는 결합 파트너(2010)를 검출 가능한 프로브(2040)와 접촉시키는 것을 보여준다. 결합 파트너(2010)의 표면은 이 표면에 비특이적으로 결합하는 복수의 경쟁자 친화성 시약(2030)과 결합될 수 있다. 도 20b는 검출 가능한 프로브(2040)와 에피토프 또는 표적 모이어티(2020)의 결합에 의해 대체되는 자유 경쟁자 친화성 시약(2035)을 보여준다. 경쟁자 친화성 시약의 대체는 검출 가능한 프로브와 결합 파트너(2010)의 결합을 에너지적으로 또는 엔트로피적으로 장려할 수 있다.
경쟁자 종은 압타머, 펩타머, 설계된 안키린 반복 단백질(designed ankyrin repeat protein, DARPin), 항체 또는 항체 단편과 같은 친화성 시약을 포함할 수 있다. 경쟁자 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 성분으로서 또는 임의의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 별개의 종으로서 제공될 수 있다. 도 16a - 16b는 경쟁자 종을 포함하는 검출 가능한 프로브 조성물을 예시한다. 도 16a는 유리 용액에 경쟁자 종을 포함하는 검출 가능한 프로브 조성물을 예시한다. 상기 조성물은 복수의 부착된 결합 성분(1620)(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)을 함유하는 검출 가능한 프로브(1610)를 포함한다. 상기 조성물은 프로브(1610)로부터 분리되어 있어서 용액에서 자유로운 경쟁자 친화성 시약(1630)(예를 들어, 압타머)을 추가로 포함한다. 경쟁자 종(1630)은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티와 자유롭게 회합할 수 있지만 경쟁자는 종은 분리 가능하며 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에서 해리될 수 있다. 도 16b는 검출 가능한 프로브에 부착된 경쟁자 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브 조성물을 예시한다. 검출 가능한 프로브(1610)는 복수의 부착된 결합 성분(1620)(예를 들어, 항체 또는 항체 단편) 및 복수의 부착된 경쟁자 성분(1630)(예를 들어, 압타머)을 포함한다. 부착된 경쟁자 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물은 최강 결합제가 임의의 주어진 시간에 표적에 결합될 가능성의 순 감소로 인해 결합된 친화성 시약의 해리를 느린 오프 레이트로 촉진하는 데 유리할 수 있다.
대안적으로, 경쟁자 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 결합하기 위해 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티와 경쟁하는 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 경쟁자 종은 용액에 없는 표적 서열을 함유하는 짧은 펩티드 서열(예를 들어, 2-15개의 아미노산 잔기)일 수 있다. 자유 펩티드는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 경쟁적으로 결합할 수 있으며, 이로써 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티와의 결합 상호작용에 대한 경쟁자와 유사한 방식으로 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 겉보기 결합활성을 변경할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티와 접촉할 때 경쟁자 종이 존재할 수 있다. 경쟁자 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티와 접촉하기 전 또는 후에 도입될 수 있다. 조성물에서 경쟁자 종에 대한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 비율은 조성물의 결합활성 특징을 맞추도록 조정될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물은 원하는 수준의 결합활성을 달성하기 위해 프로브 온 레이트 또는 오프 레이트와 같은 결합 특징을 맞추도록 조정될 수 있다. 경쟁자 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대해 질량 또는 몰 기준으로 적어도 약 1:1000000, 1:100000, 1:10000, 1:1000, 1:100, 1:10, 1:5, 1:2, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 100:1, 1000:1, 10000:1, 100000:1, 1000000:1 이상의 비율로 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 경쟁자 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대해 질량 또는 몰 기준으로 약 1000000:1, 100000:1, 10000:1, 1000:1, 100:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000, 1:1000000 이하의 비율로 존재할 수 있다.
예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에서 경쟁자 성분 형태의 경쟁자 종의 존재는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합 또는 친화성 특징에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에서 경쟁자 성분 형태의 경쟁자 종의 존재는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 오프 레이트, 온 레이트, 해리 상수 또는 결합활성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에서 경쟁자 성분 형태의 경쟁자 종의 존재는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 오프 레이트, 온 레이트, 해리 상수 또는 결합활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에서 경쟁자 성분 형태의 경쟁자 종의 존재는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 오프 레이트, 온 레이트, 해리 상수 또는 결합활성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 경쟁자 성분 형태의 경쟁자 종의 존재는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 오프 레이트, 온 레이트, 해리 상수 또는 결합활성을 적어도 약 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000배 이상 증가 또는 감소시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 예를 들어, 경쟁자 성분 형태의 경쟁자 종의 존재는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 오프 레이트, 온 레이트, 해리 상수 또는 결합활성을 약 1000000, 500000, 100000, 50000, 10000, 5000, 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2배 이하로 증가 또는 감소시킬 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합 특성을 변경하도록 구성된 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 성분은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물의 온 레이트, 오프 레이트, 해리 상수 및/또는 결합활성을 증가시키기 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에 첨가될 수 있다. 성분은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물의 온 레이트, 오프 레이트, 해리 상수 및/또는 결합활성을 감소시키기 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에 첨가될 수 있다. 성분은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 사이의 결합 상호작용을 화학적으로 변경함으로써(예를 들어, 결합 성분의 형태를 변경함으로써, 결합 성분과 결합 파트너 간의 정전기적 상호작용을 약화시킴으로써) 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 친화성 또는 결합활성에 영향을 미칠 수 있다. 성분은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 약한 2차 결합 상호작용을 생성함으로써 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 친화성 또는 결합활성에 영향을 미칠 수 있다.
성분은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물과 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 사이의 결합 상호작용을 변경하기 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에 첨가될 수 있다. 첨가된 성분은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티를 변경하거나, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 변경하거나, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물과 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 사이의 결합 상호작용을 변경함으로써 결합 상호작용을 변경할 수 있다. 첨가된 성분은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약, 결합 성분 및/또는 결합 상호작용의 가능성 및/또는 강도를 증가시키거나 감소시키는 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에서 구조적 변화를 일으킬 수 있다. 첨가된 성분은, 예를 들어, 결합 상호작용을 정전기적으로 스크리닝하거나 결합 상호작용을 형성하기 위해 경쟁함으로써 결합 상호작용을 변경할 수 있다.
변성제, 계면활성제 또는 카오트로픽제(chaotropic agent)는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 사이의 결합 상호작용을 변경하기 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에 첨가될 수 있다. 변성제, 계면활성제 또는 카오트로픽제는 온 레이트, 오프 레이트, 해리 상수 또는 결합활성과 같은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합 특징을 변경하기 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에 첨가될 수 있다. 변성제, 계면활성제 또는 카오트로픽제는 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티로부터 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 제거를 촉진할 수 있다. 변성제, 계면활성제 또는 카오트로픽제는 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티로부터 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 제거를 용이하게 하기 위해 프로브 결합 후에 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에 도입될 수 있다. 변성제, 계면활성제 또는 카오트로픽제의 존재하에 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 결합할 때 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 온 레이트를 감소시킬 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물 내의 변성제, 계면활성제 또는 카오트로픽제의 농도는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 친화성 특징을 조정하기 위해 조정될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물 내의 변성제, 계면활성제 또는 카오트로픽제의 농도는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약, 또는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 성분(예를 들어, DNA 오리가미 성분)을 불안정화하는 것을 피하기 위해 제한될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물 내의 변성제, 계면활성제 또는 카오트로픽제는 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티로부터 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 제거를 용이하게 하기 위해 열과 조합될 수 있다.
금속 염과 같은 염이 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 간의 결합 상호작용을 변경하기 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에 첨가될 수 있다. 염 또는 염을 포함하는 이온 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 사이의 결합 상호작용의 화학을 변경하는, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약, 또는 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티와 상호작용을 형성할 수 있다. 염 또는 염을 포함하는 이온 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 사이의 결합 상호작용의 화학 성질을 방해할 수 있다. 염 또는 염을 포함하는 이온 종은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티 사이의 결합 상호작용을 촉진할 수 있다. 일부 구성에서, 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티로부터 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 제거를 용이하게 하기 위해 염이 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에 첨가될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물의 염은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티로부터 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 제거를 용이하게 하기 위해 열과 조합될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티의 결합 상호작용을 변경하기 위해(예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 제거하기 위해) 프로브 결합 후에 염이 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에 도입될 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성 및/또는 관찰 가능성을 변경하는 결합 분자를 추가로 포함할 수 있다. 결합 분자는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 가역적 또는 비가역적 결합 상호작용을 형성하도록 구성된 분자를 포함할 수 있다. 결합 분자는 결합 파트너, 에피토프, 표적 모이어티 또는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 약한 결합 상호작용을 형성하여 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 가능한 표적 근처에 유지함으로써 결합 상호작용이 발생할 가능성을 증가시킬 수 있다. 결합 분자는 결합 상호작용이 발생할 때 생성되는 신호를 증가시키는 추가 표지 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 결합 분자는 본원의 다른 곳에 기술되어 있다. 결합 분자는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티와 접촉하기 전, 접촉하는 동안 또는 접촉한 후에 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물에 제공될 수 있다.
본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물은 필요한 경우 적합한 포장재(packaging material)를 포함하는 키트 형태로 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물은, 예를 들어, 용액 또는 현탁액으로 제공되는 복수의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물은, 예를 들어, 결정 또는 동결건조된 고체와 같은 고체로 제공되는 복수의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 방법과 관련하여 본원에 이전에 제시된 것과 같이, 본 개시내용의 방법에 유용한 시약 또는 성분의 임의의 조합이 본 개시내용에 의해 제공되는 키트에 포함될 수 있다. 제한 없이, 이러한 시약 또는 성분은 버퍼, 염, 안정제, 고정 성분, 결합 성분, 표지 성분 및 경쟁자 친화성 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 안정화 계면활성제 및 산소 스캐빈저를 함유하는 저장 버퍼에 제공된 복수의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "포장재"라는 어구는 검출 가능한 프로브, 친화성 시약 등과 같이 키트의 내용물을 수납하는 데 사용되는 하나 이상의 물리적 구조를 지칭한다. 포장재는 잘 알려진 방법에 의해 구성될 수 있으며, 바람직하게는 오염되지 않은 무균 환경을 제공한다. 본원에서 사용되는 포장재는, 예를 들어, 친화성 시약 시스템에서 통상적으로 사용되는 것을 포함할 수 있다. 예시적인 포장재는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물과 같은 본 발명의 방법에 유용한 성분을 고정되게 한정하여 보유할 수 있는 유리, 플라스틱, 종이, 호일 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
포장재는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 특정 방법에 사용될 수 있음을 나타내는 표지를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표지는 키트가 특정 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티를 검출하는 데 유용하여 폴리펩티드 검정 동안 특성화를 제공한다는 것을 나타낼 수 있다. 다른 예에서, 표지는 키트가 치료 또는 진단 목적에 유용함을 나타낼 수 있다.
포장된 시약 또는 성분의 사용 설명서도 전형적으로 본 개시 내용의 키트에 포함된다. "사용 설명서"는 전형적으로 시약 또는 성분 농도, 또는 혼합될 키트 성분 및 샘플의 상대적 양, 시약/샘플 혼합물의 유지 기간, 온도, 버퍼 조건 등과 같은 적어도 하나의 검정 방법 매개변수를 설명하는 실질적 표현을 포함한다.
키트 또는 조성물은 부착된 결합 성분(들)의 수 또는 유형과 관련하여 상이한 복수의 상이한 검출 가능한 프로브 및/또는 상이한 친화성 시약을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 키트 또는 조성물은 상이한 표지 성분에 각각 부착된 복수의 상이한 검출 가능한 프로브 및/또는 상이한 친화성 시약을 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 성분의 수 또는 유형에 관하여 또는 표지 성분의 수 또는 유형에 관하여 상이하지만, 그럼에도 불구하고 실질적으로 동일한 유형의 고정 성분을 가질 수 있다. 예를 들어, 복수의 상이한 검출 가능한 프로브 및/또는 상이한 친화성 시약은 핵산 오리가미 기반 고정 성분을 함유할 수 있으며, 상기 오리가미의 구조 또는 상기 오리가미에서의 스캐폴드의 구조는 모든 상이한 프로브 및/또는 작용제에 대해 동일하다. 복수의 상이한 검출 가능한 프로브 및/또는 상이한 친화성 시약은 적어도 약 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000개 이상의 상이한 검출 가능한 프로브 및/또는 상이한 친화성 시약을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 복수의 상이한 검출 가능한 프로브 및/또는 상이한 친화성 시약은 최대 약 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 4, 3, 2개 이하의 검출 가능한 프로브 및/또는 상이한 친화성 시약을 포함할 수 있다.
사용 방법
본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 검정을 포함하는 광범위한 용도에 활용될 수 있다. 일반적으로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물의 활용은 1) 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대한 결합 파트너를 갖는 용액 및/또는 고체 지지체와 접촉시키는 단계; 2) 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 용액 또는 고체 지지체 상의 결합 파트너와 결합하도록 하는 단계; 3) 용액 및/또는 고체 지지체로부터 결합되지 않은 프로브를 헹구는 단계; 4) 하나 이상의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약으로부터 신호를 검출하기 위해 용액 및/또는 고체 지지체를 관찰하는 단계; 5) 결합 파트너로부터 하나 이상의 결합 프로브 또는 시약을 제거하는 단계; 6) 선택적으로 1) - 5) 단계 중 하나 이상을 반복하는 단계; 및 7) 용액 및/또는 고체 지지체 상의 결합 파트너의 존재 및/또는 부재를 예측하기 위해 하나 이상의 프로브 또는 시약으로부터의 신호의 존재 및/또는 부재를 사용하는 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 결합 파트너 사이의 결합 상호작용을 관찰하는 방법은 임의의 다양한 특성화에 활용될 수 있다. 일부 경우에, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 폴리펩티드 특성화 검정을 용이하게 하는데 활용될 수 있다. 상기 검정은 하나 이상의 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 특성(예를 들어, 크기, 동일성, 아이소타입 등)을 결정하거나 예측하도록 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 검정은 샘플에서 하나 이상의 폴리펩티드의 양을 결정하거나 예측하도록 구성된 검정일 수 있다. 폴리펩티드 특성화 검정 또는 정량화 검정은 하나 이상의 폴리펩티드 분자가 개별적으로 분해되는 단일 분자 검출을 위해 구성될 수 있다. 예를 들어, 멀티플렉스 형식에서 하나 이상의 특성 및/또는 양은 개별적으로 폴리펩티드의 검출을 기반으로 복수의 폴리펩티드의 각 폴리펩티드에 대해 예측 또는 결정될 수 있다. 일부 구성에서, 폴리펩티드 검정은 복수의 폴리펩티드에서 하나 이상의 에피토프(예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 사량체 아미노산 서열; 번역 후 변형 등)의 존재를 결정하기 위해 폴리펩티드의 단일 분자 특성화 또는 정량화를 포함할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 결합 표적에 대한 강한 결합활성과 강한 신호 출력으로 인해 폴리펩티드 특성화 검정에 유리할 수 있으며, 이에 따라 높은 신뢰도의 결합 상호작용 데이터를 제공한다.
폴리펩티드 또는 기타 분석물은 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브에 결합될 때 구조화 핵산 입자(SNAP)에 부착될 수 있다. 도 58a는 SNAP(5850)에 부착된 폴리펩티드(5840)를 보여준다. 폴리펩티드(5840)는 예시적인 분석물이며 다른 관심 분석물로 대체될 수 있다. SNAP(5850)는 폴리펩티드(5840)에 대한 고정 성분으로서 기능하고 친화성 시약 및 검출 가능한 프로브와 관련하여 본원에 제시된 고정 성분으로 대체되거나 변형될 수 있다. 예를 들어, SNAP(5850)는 핵산 오리가미일 수 있거나 형광 입자로 대체될 수 있다. 폴리펩티드(5840)는 SNAP(5850)에 공유적으로 또는 비공유적으로 부착될 수 있다. 폴리펩티드(5840)는 SNAP 기반 고정 성분(5810), 하나 이상의 표지 성분(5820) 및 하나 이상의 결합 성분(5830)을 갖는 검출 가능한 프로브와 접촉될 수 있다. 선택적으로, SNAP(5810)는 친화성 시약 및 검출 가능한 프로브와 관련하여 본원에 제시된 고정 성분으로 대체되거나 변형될 수 있다. 예를 들어, SNAP(5810)는 핵산 오리가미일 수 있거나 형광 입자로 대체될 수 있다. 폴리펩티드(5840)는 하나 이상의 결합 성분(5830)에 대한 결합 파트너이기 때문에 복합체가 형성된다. 복합체는 폴리펩티드(5840)에 부착된 SNAP(5850) 및 하나 이상의 결합 성분(5830)에 부착된 SNAP(5810)를 포함하며, 이들 중 적어도 하나는 폴리펩티드(5840)에 결합되고, SNAP(5810)는 또한 적어도 하나의 표지 성분(5820)에 부착된다. 선택적으로, SNAP(5810)는 어레이의 한 위치와 같은 고체 지지체에 부착할 수 있다. SNAP는 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브의 성분을 서로 부착하는 맥락에서 본원에 제시된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 공유 또는 비공유 화학을 사용하여 고체 지지체에 부착될 수 있다.
일부 구성에서, 폴리펩티드 검정은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 복수의 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함할 수 있으며, 복수의 폴리펩티드의 각각의 폴리펩티드는 폴리펩티드 어레이의 한 부위와 같은 독특하고 광학적으로 관찰 가능한 공간 위치에서 고체 지지체에 결합된다. 주어진 공간 위치에서 신호의 검출은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 공간 위치에서 폴리펩티드에 결합하여 공간 위치의 폴리펩티드에서 특정 에피토프 또는 표적 모이어티의 존재를 암시한다는 증거일 수 있다. 예측되거나 결정된 하나 이상의 에피토프 또는 표적 모이어티의 존재 또는 부재는 주어진 공간 위치에서 결합된 폴리펩티드에 대한 특성을 예측하거나 결정할 수 있다. 또한, 샘플 내 특정 폴리펩티드의 양은 주어진 공간 위치로부터의 신호 강도 및/또는 특정 프로브(또는 일련의 프로브)가 결합되었음을 나타내는 신호를 생성하는 어레이의 위치 수에 기초하여 예측되거나 결정될 수 있다.
멀티플렉스 결합 반응은 도 58b에 도시되어 있다. 상기 반응은 폴리펩티드 분석물에 대해 예시되어 있지만 당업계에 공지되거나 본원에 제시된 다른 분석물로 수행될 수 있다. 폴리펩티드 어레이(5800)는 4개의 상이한 폴리펩티드(5841) 내지 (5844)를 포함한다. 각각의 폴리펩티드는 SNAP(5851)에 부착된다. 부착은 공유 또는 비공유일 수 있다. 어레이(5800)는 복수의 검출 가능한 프로브와 접촉한다. 각각의 프로브는 적어도 하나의 표지 성분 및 적어도 하나의 결합 성분에 부착된 SNAP 기반 고정 성분(5811)을 포함한다. 적어도 하나의 표지 모이어티(5821) 및 적어도 하나의 결합 모이어티(5831)에 부착된 SNAP(5811)를 갖는 제1 프로브, 적어도 하나의 표지 모이어티(5822) 및 적어도 하나의 결합 모이어티(5832)에 부착된 SNAP(5811)를 갖는 제2 프로브, 및 적어도 하나의 표지 모이어티(5823) 및 적어도 하나의 결합 모이어티(5833)에 부착된 SNAP(5811)를 갖는 제3 프로브를 포함하는 3개의 상이한 검출 가능한 프로브가 도시되어 있다. 결합 반응의 생성물은 어레이(5800) 상의 각각의 폴리펩티드에 대한 제1 프로브 및 제3 프로브의 결합이다. 폴리펩티드(5841)는 하나 이상의 결합 성분(5831)에 대한 결합 파트너이기 때문에 제1 복합체가 형성된다. 제1 복합체는 폴리펩티드(5841)에 부착된 SNAP(5851) 및 하나 이상의 결합 성분(5831)에 부착된 SNAP(5811)를 포함하며, 상기 결합 성분(5831) 중 적어도 하나는 폴리펩티드(5841)에 결합되고, SNAP(5811)는 또한 적어도 하나의 표지 성분(5821)에 부착된다. 폴리펩티드(5843)는 하나 이상의 결합 성분(5833)에 대한 결합 파트너이기 때문에 어레이(5800)에서 제2 복합체가 형성된다. 제1 복합체는 폴리펩티드(5843)에 부착된 SNAP(5851)와 하나 이상의 결합 성분(5833)에 부착된 SNAP(5811)를 포함하며, 상기 결합 성분(5833) 중 적어도 하나는 폴리펩티드(5843)에 결합되고, SNAP(5811)는 또한 적어도 하나의 표지 성분(5823)에 부착된다. 이 예에서, 폴리펩티드(5842 및 5844)는 어떠한 검출 가능한 프로브와도 결합 파트너가 아니기 때문에 결합되지 않은 상태로 유지된다. 또한, 적어도 하나의 결합 성분(5832) 및 적어도 하나의 표지 성분(5822)에 부착된 SNAP(5811)를 포함하는 제3 검출 가능한 프로브는 어레이(5800)에 결합 파트너가 없으며 결합되지 않은 상태로 유지된다. 제1 및 제2 검출 가능한 프로브는 어레이에서 검출될 수 있으며 여기서 공간적으로 분해되고 상이한 표지 유형을 기반으로 추가로 구별되고 확인될 수 있다. 따라서, 어레이 부위로부터 검출된 신호는 각각의 검출 가능한 프로브에 대한 결합 특성 및 각각의 검출 가능한 프로브와 관련된 표지 유형에 대한 지식에 기초하여 폴리펩티드를 확인하는데 사용될 수 있다.
도 58b의 예에서, 폴리펩티드는 어레이(5800) 상의 개별 부위로 분리되지만 공통 구조를 갖는 SNAP에 부착된다. 예를 들어, SNAP(5851)는 핵산 오리가미일 수 있고 폴리펩티드는 스캐폴드 폴딩이 서로 동일한 오리가미에 부착될 수 있다. 오리가미에서 하나 이상의 스테이플의 하위세트는, 예를 들어, 상이한 폴리펩티드의 부착을 수용하기 위해 오리가미 간에 상이할 수 있다. 일반적인 SNAP 구조 또는 해당 문제에 대한 다른 고정 성분을 사용하면 어레이에 폴리펩티드를 편리하게 로딩할 수 있다. 예를 들어, 어레이에 대한 폴리펩티드의 부착을 달성하기 위해 SNAP의 균일한 구조적 요소와 상호작용하는 균일한 부위를 갖도록 어레이를 구성할 수 있다. 공통 고정 성분 구조는 복수의 상이한 검출 가능한 프로브 또는 복수의 상이한 친화성 시약에도 사용될 수 있다. 도 58b에 예시된 바와 같이, 3개의 검출 가능한 프로브는 SNAP(5811)에 부착된 표지 성분 및 결합 성분에 대해 상이하다. 그러나 3개의 친화성 프로브는 실질적으로 동일한 SNAP 구조를 갖는다. 예를 들어, SNAP(5811)는 3개의 검출 가능한 프로브 각각에 대해 스캐폴드 폴딩이 동일한 핵산 오리가미일 수 있다. 오리가미에서 하나 이상의 스테이플의 하위세트는, 예를 들어, 상이한 표지 성분 또는 상이한 결합 성분의 부착을 수용하기 위해 상이한 검출 가능한 프로브 간에 상이할 수 있다. 비록 도 58b는 상이한 분석물에 부착된 공통 SNAP 및 상이한 검출 가능한 프로브에 부착된 공통 SNAP로 예시되지만, SNAP는 대신 구조가 상이할 수 있음이 이해될 것이다. 더욱이, SNAP는 검출 가능한 프로브마다 상이하거나 폴리펩티드마다 상이한 서열 태그를 포함할 수 있다. 태그는 혼합물에서 개별 프로브를 확인하거나 어레이에서 개별 폴리펩티드를 확인하는 데 사용할 수 있다.
어레이는 분석물의 다중 처리에 사용될 수 있으며, 이에 따라 다수의 상이한 유형의 분석물이 병렬로 조작되거나 검출된다. 특히 유용한 분석물은 폴리펩티드, 핵산 등과 같은 본원에 제시된 친화성 시약에 대한 결합 파트너를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 제시된 방법의 하나 이상의 단계를 사용하여 상이한 유형의 분석물을 연속적으로 처리하는 것도 가능하지만, 병렬 처리가 비용 절감, 시간 절약 및 조건의 균일성을 제공할 수 있다. 어레이는 적어도 2, 10, 100, 1000, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109개 이상의 상이한 분석물 부위를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 어레이는 최대 1×109, 1×108, 1×107, 1×106, 1×105, 1×104, 1000, 100, 10, 2개 이하의 상이한 분석물 부위를 포함할 수 있다. 상이한 분석물은 선택적으로 공통 구조를 갖는 구조화 핵산 입자 또는 고정 성분을 통해 부위에 부착될 수 있다. 이와 같이, 어레이의 부위는 구조가 서로 실질적으로 동일한 구조화 핵산 입자 또는 고정 성분에 부착될 수 있고, 어레이 내의 각각의 구조화 핵산 입자 또는 고정 성분은 상이한 분석물에 부착될 수 있다.
어레이는 플로우 셀 벽의 내부 표면 또는 플로우 셀 내부의 고체 지지체에 부착될 수 있다. 플로우 셀 또는 고체 지지체는 분석 생화학에 사용되는 다양한 재료로 제조될 수 있다. 적합한 재료는 유리, 중합체 재료, 실리콘, 석영(융합 실리카), 보로플로트 유리(borofloat glass), 실리카, 실리카 기반 재료, 탄소, 금속, 광섬유 또는 광섬유 다발, 사파이어 또는 플라스틱 재료를 포함할 수 있다. 재료는 특정 용도에 필요한 특성에 따라 선택할 수 있다. 예를 들어, 원하는 방사선 파장에 투명한 재료는 해당 파장의 방사선을 이용하는 분석 기술에 유용하다. 반대로, 특정 파장의 방사선을 통과시키지 않는 재료(예를 들어, 불투명, 흡수 또는 반사)를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 이용될 수 있는 재료의 다른 특성은 본원에 제시된 것과 같은 다운스트림 공정에서 사용되는 특정 시약에 대한 비활성 또는 반응성, 또는 조작의 용이성 또는 낮은 제조 비용이다.
폴리펩티드 또는 다른 분석물은 단일 분자 수준에서 검출을 제공하는 방식으로 지지체에 부착될 수 있다. 예를 들어, 다수의 상이한 폴리펩티드는 지지체 상의 개별 폴리펩티드 부위에 결합하는 개별 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 어레이 상의 인접 부위가 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 결합하더라도 모든 인접 부위와 구별될 수 있는 방식으로 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이와 같이, 하나 이상의 상이한 폴리펩티드(또는 본원에 제시된 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 대한 다른 결합 파트너)는 각각의 단일 폴리펩티드 분자가 물리적으로 단리되고 단일 분자가 고체 지지체의 다른 모든 분자에서 분해되는 방식으로 검출되는 형식으로 고체 지지체에 부착될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법은 하나 이상의 앙상블에 대해 수행될 수 있으며, 앙상블은 공통 서열을 갖는 핵산 또는 폴리펩티드의 집단과 같이 실질적으로 동일한 유형의 분석물의 집단이다.
도 22는 폴리펩티드 검정의 구성을 예시한다. 복수의 폴리펩티드는 선택적으로 고정 그룹(2230)(예를 들어, SNAP 또는 화학 링커)에 의해 고체 지지체(2210)에 결합된다. 검출 가능한 프로브(2240)는 복수의 폴리펩티드와 접촉하여 검출 가능한 프로브(2240)가 이용 가능한 결합 표적과 결합하도록 한다. 접촉 후, 검출 가능한 프로브(2240)는 제1 폴리펩티드(2221) 및 제4 폴리펩티드(2224)에 결합하고 제2 폴리펩티드(2222) 또는 제3 폴리펩티드(2223)에는 결합하지 않는다. 형광 현미경과 같은 적절한 검출 시스템으로 관찰하면, 검출 가능한 신호는 제1 폴리펩티드(2221) 및 제4 폴리펩티드(2224)의 위치에 상응하는 고체 지지체(2210) 상의 공간적 위치에서 관찰될 수 있다.
폴리펩티드는 천연 또는 합성 기원일 수 있다. 폴리펩티드는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 하나 이상의 번역 후 변형이 폴리펩티드에 없을 수 있다. 일부 경우에, 번역 후 변형을 제거, 역전 또는 변경하기 위해 폴리펩티드를 처리할 수 있다. 예를 들어, 번역 후 변형을 제거, 역전 또는 변경하기 전후에 하나 이상의 폴리펩티드를 검출하기 위해 본원에 제시된 폴리펩티드 검정을 수행할 수 있다. 전후 결과를 비교하면 폴리펩티드에 대한 번역 후 변형의 수 또는 유형을 확인하는 데 있어 증가된 신뢰와 같은 이점을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 번역 후 변형을 생성하도록 처리될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제시된 폴리펩티드 검정은 번역 후 변형을 만들기 전후에 하나 이상의 폴리펩티드를 검출하기 위해 수행될 수 있다. 역으로, 번역 후 변형을 제거하기 전후에 하나 이상의 폴리펩티드를 검출하기 위해 본원에 제시된 폴리펩티드 검정을 수행할 수 있다. 전후 결과를 비교하면 폴리펩티드가 민감한 번역 후 변형 또는 합성 후 변형의 수 또는 유형을 확인하는 것과 같은 이점을 얻을 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 적어도 일부를 제거하기 위해 단백질분해될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제시된 폴리펩티드 검정은 단백질분해 전후에 하나 이상의 폴리펩티드를 검출하기 위해 수행될 수 있다. 전후 결과를 비교하면 폴리펩티드에서 단백질 분해 부위의 위치에 비해 폴리펩티드에서 에피토프 또는 표적 모이어티의 위치를 찾는 것과 같은 이점을 제공할 수 있다. 전후 결과를 비교하는 추가 이점은 단백질 분해에 민감한 폴리펩티드에서 번역 후 변형의 수 또는 유형을 더 쉽게 확인할 수 있다는 것이다.
번역 후 변형은 미리스토일화(myristoylation), 팔미토일화(palmitoylation), 이소프레닐화(isoprenylation), 프레닐화(prenylation), 파르네실화(farnesylation), 게라닐게라닐화(geranylgeranylation), 리포일화(lipoylation), 플라빈 모이어티 부착(flavin moiety attachment), 헴 C 부착(Heme C attachment), 포스포판테테이닐화(phosphopantetheinylation), 레티닐리덴 쉬프 염기 형성(retinylidene Schiff base formation), 디프타미드 형성(dipthamide formation), 에탄올아민 포스포글리세롤 부착(ethanolamine phosphoglycerol attachment), 하이푸신, 베타-라이신 첨가(hypusine, beta-Lysine addition), 아실화, 아세틸화, 탈아세틸화(deacetylation), 포르밀화(formylation), 알킬화, 메틸화, C-말단 아미드화(C-terminus amidation), 아르기닐화(arginylation), 폴리글루타밀화(polyglutamylation), 폴리글리클리화(polyglyclyation), 부티릴화(butyrylation), 감마-카복실화(gamma-carboxylation), 글리코실화(glycosylation), 당화(glycation), 폴리시알화(polysialylation), 말로닐화(malonylation), 하이드록실화, 요오드화, 뉴클레오티드 첨가, 포스포에이트 에스테르 형성(phosphoate ester formation), 포스포라미데이트 형성(phosphoramidate formation), 포스포릴화, 아데닐화(adenylylation), 유리딜화(uridylylation), 프로피오닐화(propionylation), 피로글루타메이트 형성(pyrolglutamate formation), S-글루타티온화(S-glutathionylation), S-니트로실화(-nitrosylation), S-설페닐화(S-sulfenylation), S-설피닐화(S-sulfinylation), S-설포닐화(S-sulfonylation), 석시닐화(succinylation), 황산화(sulfation), 당화, 카바밀화(carbamylation), 카보닐화(carbonylation), 이소펩티드 결합 형성(isopeptide bond formation), 비오티닐화, 카바밀화, 산화, 환원, 페길화(pegylation), ISGylation, 수모화(SUMOylation), 유비퀴틴화, 네딜화(neddylation), 퓨필화(pupylation), 시트룰린화(citrullination), 탈아미드화(deamidation), 엘미닐화(elminylation), 디설파이드 브릿지 형성, 단백질분해 절단(proteolytic cleavage), 이소아스파르테이트(isoaspartate) 형성, 라세미화(racemization) 및 단백질 스플라이싱(protein splicing)을 포함할 수 있다. 특히 흥미롭고 유용한 번역 후 변형은 부위 특이적(즉, 특정 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열에서 발생) 또는 비-부위 특이적일 수 있는 단백질분해이다. 번역 후 변형은 생물학적 효소, 화학 작용제, 또는 당업자에게 공지된 것과 같은 물리적 조작을 사용하여 폴리펩티드로부터 역전되거나 제거될 수 있다. 폴리펩티드는 생물학적 효소, 화학 작용제, 또는 당업자에게 공지된 것과 같은 물리적 조작을 사용하여 번역 후 변형될 수 있다.
특성화된 폴리펩티드는 특정 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 적어도 약 0.1달톤(Da), 0.5Da, 1Da, 5Da, 10Da, 50Da, 100Da, 200Da, 300Da, 400Da, 500Da, 600Da, 700Da, 800Da, 900Da, 1킬로달톤(kDa), 1.5kDa, 2kDa, 2.5kDa, 3kDa, 3.5kDa, 4kDa, 4.5kDa, 5kDa, 6kDa, 7kDa, 8kDa, 9kDa, 10kDa, 15kDa, 20kDa, 25kDa, 30kDa, 40kDa, 50kDa, 60kDa, 70kDa, 80kDa, 90kDa, 100kDa, 200kDa, 300kDa, 400kDa, 500kDa, 600kDa, 700kDa, 800kDa, 900kDa, 1000kDa, 1200kDa, 1400kDa, 1600kDa, 1800kDa, 2000kDa, 2500kDa, 3000kDa, 3500kDa, 4000kDa 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 폴리펩티드는 약 4000kDa, 3500kDa, 3000kDa, 2500kDa, 2000kDa, 1800kDa, 1600kDa, 1400kDa, 1200kDa, 1000kDa, 900kDa, 800kDa, 700kDa, 600kDa, 500kDa, 400kDa, 300kDa, 200kDa, 100kDa, 90kDa, 80kDa, 70kDa, 60kDa, 50kDa, 40kDa, 30kDa, 25kDa, 20kDa, 15kDa, 10kDa, 9kDa, 8kDa, 7kDa, 6kDa, 5kDa, 4.5kDa, 4kDa, 3.5kDa, 3kDa, 2.5kDa, 2kDa, 1.5kDa, 1kDa, 900Da, 800Da, 700Da, 600Da, 500Da, 400Da, 300Da, 200Da, 100Da, 50Da, 10Da, 5Da, 1Da, 0.5Da 이하일 수 있다. 폴리펩티드는 최소 또는 최대 개수의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 30000, 40000개 이상의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 폴리펩티드는 약 40000, 30000, 20000, 15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 250, 200, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 이하의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.
폴리펩티드 검정은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 함유하는 유체, 및 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 관련된 결합 상호작용을 매개하는 유체(예를 들어, 헹굼 유체, 제거 시약)를 포함하는 하나 이상의 유체 전달 작업을 포함할 수 있다. 유체 전달 작업은 유체가 플로우 셀 또는 칩과 같은 유체 장치 내로 전달되거나 그 외부로 전달될 때 발생할 수 있다. 폴리펩티드 특성 검정은 고체 지지체에 결합된 복수의 폴리펩티드가 항상 유체 매질과 접촉하는 것을 요구할 수 있다. 유체 전달 작업은 항상 복수의 폴리펩티드를 포함하는 고체 지지체와 접촉하는 유체의 존재를 보장하기 위해 플로우 셀로부터 제1 유체 매질을 변위시키기 위해 제2 유체 매질을 이용할 수 있다.
샘플이 폴리펩티드 검출 시스템 또는 방법에 제공될 수 있다. 샘플은, 예를 들어, 복수의 폴리펩티드 또는 기타 분석물을 포함하는 분획으로서 제공될 수 있다. 샘플은 복수의 폴리펩티드 접합체 또는 다른 분석물 접합체를 포함하는 분획으로서 제공될 수 있다. 분석물 접합체는 구조화 핵산 입자, 중합체 또는 단백질 모이어티와 같은 링커 모이어티를 통해 고체 지지체에 직접 부착된 분석물(예를 들어, 폴리펩티드 분석물)을 포함할 수 있다. 샘플은 액체 매질(예를 들어, 수성 pH 버퍼 매질)에서 검출 시스템 또는 방법에 제공될 수 있다. 샘플은 검출 시스템 또는 방법에 고체(예를 들어, 동결건조, 침전 또는 결정화된 샘플)로서 제공될 수 있다. 고체는 검출 시스템 또는 방법에 첨가되기 전, 도중 또는 후에 액체 매질에 용해되거나 현탁될 수 있다. 샘플은 시스템에 제공된 후 검출 시스템에 저장될 수 있다.
폴리펩티드 또는 기타 분석물을 포함하는 샘플은 유체 장치의 고체 지지체에 결합될 수 있다. 샘플을 포함하는 유체는 유체 장치 내의 고체 지지체를 포함하는 플로우 셀 또는 웰과 같은 검출 챔버로 유체 시스템을 통해 펌핑되거나 유동될 수 있다. 샘플을 포함하는 유체는 분석물을 고체 지지체에 부착시키기에 충분한 시간 동안 고체 지지체와 접촉할 수 있다. 선택적으로 분석물은 고체 지지체에 대한 분석물의 부착을 매개하는 구조화 핵산 입자와 같은 물질에 접합될 수 있다. 일부 경우에, 고체 지지체에 대한 분석 물질의 결합을 용이하게 하기 위해 추가 유체가 샘플 유체와 혼합될 수 있다. 샘플이 폴리펩티드를 포함하는 경우, 고체 지지체의 표면에 폴리펩티드 연결 그룹을 침착시키기에 충분한 시간 동안 고체 지지체를 폴리펩티드 연결 그룹(예를 들어, 구조화 핵산 입자, 중합체, 단백질)을 포함하는 유체와 먼저 접촉시킬 수 있다. 고체 지지체가 폴리펩티드 연결 그룹으로 침착된 후, 샘플을 포함하는 유체 매질이 유체 장치에서 고체 지지체를 함유하는 검출 챔버로 펌핑되거나 유동될 수 있다. 폴리펩티드와 폴리펩티드 연결 그룹 사이의 부착 반응은 폴리펩티드를 연결 그룹에 부착시키기에 충분한 시간 동안 일어나도록 할 수 있다. 반응물 및/또는 촉매와 같은 하나 이상의 시약을 유체 장치에 첨가하여 폴리펩티드 부착 반응을 촉진할 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드 및 폴리펩티드 연결 그룹은 "클릭" 반응과 같은 자발적 부착 반응을 통해 반응하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는, 예를 들어, 폴리펩티드 상의 작용성 그룹과 고체 지지체 상의 작용성 그룹 사이의 결합에 의해 고체 지지체에 직접 부착될 수 있다. 부착 반응 후, 고체 지지체는 고체 지지체에 결합된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 것이다.
분석물(예를 들어, 폴리펩티드)이, 예를 들어, 유체 장치 내에서 고체 지지체에 부착된 후, 유체 장치의 검출 챔버를 한 번 이상 헹굴 수 있다. 헹굼 공정은 함께 또는 연속적으로 유체 장치로 펌핑되거나 유동되는 하나 이상의 세척 또는 헹굼 시약을 활용할 수 있다. 유체 장치에 제공되는 헹굼 유체의 부피는 고체 지지체를 포함하는 검출 챔버의 총 부피를 초과할 수 있다. 헹굼 단계는 결합되지 않은 폴리펩티드, 폴리펩티드 접합체 또는 기타 시약의 일부 또는 전부를 제거할 수 있다. 유체 장치로의 헹굼 유체의 유속은 고체 지지체로부터 부착된 분석물의 이탈을 방지하기 위해 제한될 수 있다.
선택적으로, 부착된 분석물(예를 들어, 접합된 폴리펩티드)은 분석물의 구조를 변경하는 하나 이상의 공정을 거칠 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 분석물은, 예를 들어, 유체 장치로의 변성 유체의 첨가에 의해 부분적으로 또는 완전히 변성될 수 있다. 변성 유체는 폴리펩티드의 완전한 변성을 촉진하기에 충분한 시간 동안 고체 지지체에 접촉될 수 있거나, 폴리펩티드의 부분적 변성을 야기하기 위해 고체 지지체에 잠깐 접촉될 수 있다. 폴리펩티드는 또한, 예를 들어, 효소(리가제, 키나제, 글리코실라제, 포스파타제, 프로테아제 등), 산화제 또는 환원제와 같은 변경 시약을 고체 지지체에 적용함으로써 변경될 수 있다. 유체 장치는 구조 변경 시약을 추가한 후 헹굼 과정을 거쳐 유체 장치로부터 잔류 시약을 제거할 수 있다. 일부 경우에, 고체 지지체는 친화성 시약이 유체 장치에 도입될 때까지 변경제(예를 들어, 변성제)와 접촉 상태로 유지될 수 있다. 일부 경우에, 구조 변경 공정 후에 폴리펩티드가 부분적으로 또는 완전히 다시 폴딩될 수 있다.
친화성 시약은, 예를 들어, 유체 장치에서 복수의 폴리펩티드(예를 들어, 폴리펩티드 어레이) 또는 다른 분석물을 포함하는 고체 지지체와 접촉할 수 있다. 일부 구성에서, 친화성 시약은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약으로 제공될 수 있다. 검출 가능한 프로브와 같은 친화성 시약은 유체 장치로 펌핑되거나 유동되는 유체 매질에 제공될 수 있다. 유체 매질은 단일 종의 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브를 포함할 수 있거나, 상이한 종의 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유체 매질은 에피토프-결합 특이성이 상이한 적어도 2개의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포함할 수 있다. 또는 유체 매체는 상이한 유형의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약인 적어도 2개의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약, 예를 들어, 1개의 압타머 프로브 및 1개의 항체 프로브를 포함할 수 있다. 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 적어도 하나의 분석물(예를 들어, 폴리펩티드의 아미노산 서열 에피토프)에 존재하는 에피토프 또는 표적 모이어티로의 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브의 결합을 촉진하기에 충분한 시간 동안 유체 장치의 고체 지지체에 접촉될 수 있다.
결합 검정에 사용되는 친화성 시약 또는 결합 성분은 결합 특이성의 특성으로 구별될 수 있다. 특히, 친화성 시약은 확률적 방식으로 특성화된 에피토프 결합 특이성을 가질 수 있다. 본 개시내용의 친화성 시약은 이원 방식(예를 들어, 친화성 시약 A는 에피토프 X에 결합하고, 에피토프 Y에는 결합하지 않음)으로 특성화되기보다는 복수의 결합 가능성에 의해 특성화될 수 있다. 예를 들어, 8000개의 가능한 삼량체 아미노산 서열(20×20×20)에 걸쳐 친화성 시약에 대한 0이 아닌 결합 확률은 8000개 서열의 일부 또는 전부에 대해 알려지거나 측정되거나 추정될 수 있다. 일부 경우에, 친화성 시약은 제1 에피토프에 대해 알려진, 측정된 또는 추정된 결합 확률이 높은(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999% 초과의 결합 확률) 경우 및 제2 에피토프에 대해 알려진, 측정된 또는 추정된 결합 확률이 낮은(예를 들어, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001%, 0.00001%, 0.000001% 미만의 결합 확률) 경우 본 개시내용에 유용할 수 있다. 일부 경우에, 친화성 시약은 에피토프 패밀리에 대해 높은 알려진, 측정된 또는 추정된 결합 확률(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999% 초과의 결합 확률) 및 다른 에피토프에 대해 낮은 알려진, 측정된 또는 추정된 결합 확률(예를 들어, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001%, 0.00001%, 0.000001% 미만의 결합 확률)을 포함할 수 있다. 에피토프 패밀리는 아미노산 서열(예를 들어, A가 알라닌이고 X가 임의의 아미노산일 수 있는 아미노산 서열 AXA; α 및 β가 독립적으로 임의의 가능한 아미노산 인접 서열인 아미노산 서열 αAAAβ)에 의해 관련된 에피토프를 포함할 수 있거나 화학 특성(예를 들어, 비극성, 극성, 양으로 하전됨, 음으로 하전됨, 번역 후 변형 등)과 관련될 수 있다.
검출 가능한 프로브와 같은 친화성 시약이 유체 장치에서 분석물(예를 들어, 폴리펩티드 분석물)에 결합하기에 충분한 시간이 주어진 후, 상기 장치의 검출 챔버는 1회 이상의 세척 또는 헹굼을 거쳐 결합되지 않은 친화성 시약을 제거한다. 폴리펩티드 특성 검정은 분석물-친화성 시약 상호작용이 중단될 가능성을 최소화하기 위해 친화성 시약 결합 후 단일 헹굼 단계만 사용할 수 있다. 유체 장치로부터의 친화성 시약 헹굼 유체는 헹굼 공정 후에 광학 이미징 버퍼와 같은 물리적 측정을 수행하도록 구성된 매질에 의해 대체될 수 있다.
분석물:친화성 시약 또는 분석물:프로브 상호작용은 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브가 고체 지지체에 결합된 복수의 분석물과 접촉된 후에 측정될 수 있다. 검출 가능한 프로브의 표지 성분 검출과 같은 물리적 측정은 정지 유체 조건에서 발생할 수 있다. 유체는, 예를 들어, 밸브를 닫아 모든 입구 및 출구 포트를 격리함으로써 유체 내에서 정적으로 유지될 수 있다. 유체는 하나, 일부 또는 모든 고유한 광학적으로 관찰 가능한 공간 위치의 이미징이 가능한 충분한 시간 동안 유체 장치에 유지될 수 있다.
분석물:친화성 시약 또는 분석물:프로브 상호작용의 결합 및/또는 물리적 측정 후, 결합된 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 유체 장치에 파괴 매질(disrupting medium)을 첨가하여 분석물로부터 제거할 수 있다. 파괴 매질은 분석물:친화성 시약 또는 분석물:프로브 상호작용을 방해할 가능성이 있는 변성제, 카오트로프(chaotrope) 또는 기타 화학 엔티티를 포함할 수 있다. 파괴 매질은 정지 또는 유동 조건 하에서 분석물과 접촉할 수 있다. 파괴 매질이 분석물과 접촉한 후, 유체 장치를 헹구거나 헹굼 매질로 1회 이상 세척하여 임의의 결합되지 않은 친화성 시약 또는 결합되지 않은 검출 가능한 프로브를 유체 장치로부터 제거할 수 있다.
일부 경우에, 분석물(예를 들어, 폴리펩티드 분석물)은 결합 측정 동안 또는 후에 고체 지지체의 표면에서 제거될 수 있다. 예를 들어, 다수의 폴리펩티드는 어떤 폴리펩티드가 글리코실화되었는지 결정한 후 모든 비글리코실화 폴리펩티드의 고체 지지체로부터 방출되는 것을 결정하기 위해 특성화될 수 있다. 일부 경우에, 유체 장치의 재사용을 가능하게 하기 위해 특성화 검정이 완료된 후 모든 분석물이 고체 지지체에서 방출될 수 있다. 분석물 또는 분석물-접합체는 스트리핑 유체(stripping fluid)를 첨가함으로써 고체 지지체로부터 방출시킬 수 있다. 스트리핑 유체는 고체 지지체로부터 분석물의 변위를 유발하도록 특성 검정 동안 사용되는 다른 헹굼 매질보다 더 엄격한 세척을 제공할 수 있다. 고체 지지체로부터 분석물의 변위는, 예를 들어, 분석물과 고체 지지체 사이의 광활성화 가능한 링커를 절단함으로써 열 또는 빛과 같은 물리적 조건을 이용할 수도 있다.
고체 지지체로부터 분석물을 변위시키는 동안 또는 변위시킨 후, 변위된 분석물을 제거하기 위해 헹굼 매질이 유체 장치를 통해 유동할 수 있다. 고체 지지체는 표면으로부터의 분석물의 변위를 결정하거나 확인하기 위해 물리적 측정 방법으로 후속적으로 관찰할 수 있다.
상술된 특이성에 관계없이, 일부 경우에 해당 단백질에 결합하거나 결합하지 않는 상이한 프로브의 일련의 관찰을 기반으로 특정 폴리펩티드 분석물을 확인할 수 있다. 이러한 시리즈는 주어진 단백질 또는 폴리펩티드를 확인하는 주어진 시리즈의 확률을 평가하기 위해 확률적 모델링을 활용하는 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 평가될 수 있다. 멀티플렉싱된 구성에서, 결합 및 비결합 패턴에 대해 복수의 상이한 폴리펩티드가 관찰될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 어레이로 표시될 수 있고, 어레이는 개별적으로 분해 가능한 부위로 구성되며 각 부위에는 폴리펩티드 중 하나가 있다. 상이한 프로브가 결합하는지 또는 결합하지 않는지에 대해 각 부위에 대해 일련의 관찰을 수행할 수 있다. 각 부위에서 폴리펩티드의 정체는 각 부위에서 일련의 관찰로부터 결정될 수 있다. 각 부위에서 일련의 관찰에 대한 전체 패턴은 어레이 전체에서 여러 폴리펩티드를 확인하는 데 유용할 수 있다. 단백질을 확인하는 데 유용한 소프트웨어 알고리즘, 방법 및 구성의 예는, 예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함된 공개된 국제 특허 출원 번호 WO 2019/133892, 미국 특허 제10,473,654호 또는 미국 특허 출원 공보 제2020/0286584 A1호에 기술되어 있다.
일부 경우에, 폴리펩티드의 검출, 확인 또는 특성화는 본원에 제시된 친화성 시약을 활용할 수 있다. 본 개시내용의 친화성 시약은 샘플에서 하나 초과의 폴리펩티드와 상호작용(예를 들어, 결합)할 가능성이 있는 잡다한 또는 광범위한 친화성 시약일 수 있다. 일부 경우에, 친화성 시약은 샘플에서 구조적으로 유사하지 않은 두 가지 이상의 독특한 단백질과 상호작용할 가능성이 있다. 예를 들어, 친화성 시약은 유사하지 않은 단백질 내의 구조적 유사성 영역에 기초하여 특정 막 단백질 및 특정 세포질 단백질에 거의 동일한 확률로 결합할 수 있다. 일부 경우에, 결합 친화성 시약은 서열 컨텍스트(예를 들어, 에피토프로부터의 아미노산 서열 업체인(upchain) 및/또는 다운체인(downchain))에 관계없이 특정 아미노산 에피토프 또는 에피토프 패밀리에 결합할 가능성이 있을 수 있다.
본 개시내용의 친화성 시약은 확인, 결정 또는 평가된 확률 기반 결합 프로필을 갖도록 특성화될 수 있다. 친화성 시약은 약 50% 초과(예를 들어, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999% 또는 약 99.999% 초과)의 확인, 결정 또는 평가된 결합 확률로 제1 폴리펩티드에 결합하는 특성을 가질 수 있고 약 50% 미만(예를 들어, 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001% 이하 또는 약 0.001% 미만)의 확인, 결정 또는 평가된 결합 확률로 제2의 구조적으로 동일하지 않은 폴리펩티드에 결합하는 특성을 가질 수 있다. 특정 경우에, 제1 및 제2 폴리펩티드에 대한 친화성 시약의 관찰된 결합 확률의 차이는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드에서 특정 에피토프 또는 에피토프 패밀리의 존재, 부재 또는 접근 불가로 인한 것일 수 있다. 확률적 친화성 시약 결합 프로필은 시험관 내 측정 또는 인실리코 예측에 의해 결정되거나 확인될 수 있다.
대안 및 추가 실시양태 및 실시예
당업자는, 예를 들어, 조정 가능한 결합활성 및 관찰 가능성 특성을 포함하여 본 개시내용의 검출 가능한 프로브 및 친화성 시약의 유용성을 쉽게 인식할 것이다. 본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 조성물은 마이크로 규모 및 단일 분자 시스템 및 컨텍스트에서 고해상도 공간 특성화를 제공하는 데 유용할 수 있다. 기술된 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 진단 및 치료 적용과 같은 생물학적 상황에 대한 유용한 특성도 제공할 수 있다.
본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 세포 및 조직 구조의 설명과 같은 목적을 위해 면역조직화학을 용이하게 할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 특정 세포 성분(예를 들어, 표면 바이오마커, 다당류, 구조 단백질, 소기관 단백질(organelle protein) 등)에 대해 특이성이 높은 복수의 결합 성분에 부착될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 세포(예를 들어, 미생물) 또는 조직 샘플(예를 들어, 조직 절편, 냉동 조직 샘플, 포르말린 고정 파라핀 포매 샘플(formalin-fixed paraffin-embedded sample))에 직접 접촉하고 처리된 세포 또는 조직 샘플을 형성하기 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 세포 또는 조직 처리된 표적 사이의 결합 상호작용이 가능한 충분한 시간 동안 배양할 수 있다. 처리된 세포 또는 조직 샘플은 적절한 방법(프로브 의존적 - 예를 들어, 형광 현미경, 섬광 계수(scintillation counting) 등)으로 직접 관찰할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 높은 결합 결합활성 및 높은 관찰 가능성으로 인해 면역조직화학 적용에 유리할 수 있다. 결합 데이터의 분석은 세포 및/또는 조직 샘플의 바이오마커 또는 생체분자 양과 분포에 대한 고해상도 공간 데이터를 제공할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 풀다운(pull-down) 또는 포획 시약으로 활용될 수 있다. 높은 결합활성은 종의 이종 혼합물로부터 표적 종의 포획 및 유지를 용이하게 할 수 있다. 친화성 시약은 용액에서 자유로울 수 있거나 결합 파트너에 결합하는 동안 또는 결합한 후에 고체 지지체(예를 들어, 비드, 칩 또는 크로마토그래피 수지)에 부착될 수 있다. 결합 파트너를 포함할 수 있는 이종 혼합물과 친화성 시약의 접촉은 상기 혼합물의 적어도 하나의 다른 성분으로부터 결합 파트너의 분리를 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체에 부착된 친화성 시약은 결합 파트너가 친화성 시약을 통해 고체 지지체에 결합되도록 샘플과 접촉할 수 있고, 고체 지지체는 샘플로부터 분리될 수 있으며, 고체 지지체는 선택적으로 세척하여 고체 지지체로부터 잔류 샘플 성분을 제거할 수 있다. 또 다른 예에서, 친화성 시약은 결합 파트너가 친화성 시약에 결합되도록 샘플과 접촉될 수 있고, 생성된 친화성 시약-결합 파트너 복합체는 고체 지지체에 부착될 수 있으며, 고체 지지체는 샘플로부터 분리될 수 있고, 고체 지지체는 선택적으로 세척하여 고체 지지체로부터 잔류 샘플 성분을 제거할 수 있다. 두 예에서 친화성 시약의 후속 수집 및 분리 또는 결합 파트너의 방출은 샘플(예를 들어, 이종 혼합물)로부터 결합 파트너의 분리에 영향을 미칠 수 있다. 선택적으로, 상기 방법에 의해 포획된 하나 이상의 결합 파트너는 이후 본원의 다른 곳에 제시된 검출 검정에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드의 하위세트는 샘플로부터 다른 폴리펩티드가 제거되도록 샘플로부터 포획될 수 있고, 이어서 폴리펩티드의 하위분획이 본원에 제시된 폴리펩티드 검정을 사용하여 정량화되거나 특성화될 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 친화성 크로마토그래피 컬럼과 같은 분리 시스템 내의 성분으로 활용될 수 있다. 친화성 크로마토그래피 시스템은 다공성 매트릭스 또는 수지 내의 하나 이상의 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 대해 친화성이 특정한 다수의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 부착하도록 제형화될 수 있다. 예시적인 분석물로서 폴리펩티드를 취하면, 폴리펩티드를 포함하는 혼합물(예를 들어, 세포 용해물, 합성 단백질 또는 펩티드의 샘플, 가능한 생물학적 오염을 함유하는 비생물학적 샘플 등)이 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 포함하는 컬럼에 적용되어 표적화된 폴리펩티드(예를 들어, 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티를 포함하는 것)와 비표적화된 폴리펩티드 사이의 분리에 영향을 미칠 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 친화성 크로마토그래피 시스템은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 수지 또는 매트릭스에 영구적으로 또는 비가역적으로 접합시켜 상기 시스템의 재사용을 가능하게 하는 수지 또는 매트릭스를 포함할 수 있다. 포획된 폴리펩티드는 혼합물의 비표적화된 분획은 컬럼을 통과한 후 컬럼에서 용출될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약 친화성 크로마토그래피 시스템은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 수지 또는 매트릭스에 가역적으로 부착하여 시스템으로부터 포획된 표적을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 방출을 가능하게 하는 수지 또는 매트릭스를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 친화성 크로마토그래피 시스템은 프로브가 시스템에서 용출될 때 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약으로부터의 신호 검출을 가능하게 하는 검출 시스템(예를 들어, 형광 측정, IR, UV)을 포함할 수 있다. 검출 시스템은 수지 또는 매트릭스로부터 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 배경 또는 의도하지 않은 방출의 측정은 물론 매트릭스 또는 수지로부터 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 의도된 방출의 모니터링을 가능하게 할 수 있다. 혼합물로부터 표적 폴리펩티드를 포획한 후, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 방출에 의해 폴리펩티드가 시스템으로부터 용출될 수 있다. 일부 경우에, 방출된 검출 가능한 프로브-폴리펩티드 복합체(또는 친화성 시약-폴리펩티드 복합체)를 수집한 다음 폴리펩티드 특성화 검정 또는 결합 리간드 검정과 같은 폴리펩티드 검정을 위한 고체 지지체에 둘 수 있다.
도 17a - 17c는 포획제로서 친화성 시약을 활용하기 위한 도식을 도시한다. 도 17a에 나타낸 바와 같이, 친화성 시약(1710)이 제공되며, 친화성 시약은 포획 핸들(1720) 및 표적 결합 파트너(1730)에 대해 결합 특이성이 높은 복수의 결합 성분을 포함한다. 포획 핸들은 포획 태그(예를 들어, 비오틴), 핵산 또는 작용성 그룹(예를 들어, 클릭 작용성 그룹)과 같은 임의의 적합한 핸들을 포함할 수 있다. 친화성 시약(1710)은 표적 결합 파트너(1730) 및 복수의 비표적 종(1735)을 포함하는 이종 혼합물과 접촉되어, 표적 결합 파트너(1730)에 대한 친화성 시약(1710)의 결합을 촉진한다. 선택적으로, 캡처 핸들(1720)과 결합하도록 구성된 캡처 부위(1740)가 존재할 수 있다. 캡처 부위는, 예를 들어, 패턴화된 어레이 또는 무작위 어레이와 같이 고체 지지체에 생성될 수 있다. 도 17b에 나타낸 바와 같이, 이종 혼합물은 친화성 시약(1710) - 표적 결합 파트너(1730) 복합체로부터 분리된다. 고체 지지체(1750)가 존재하는 경우, 친화성 시약(1710) 및 표적 결합 파트너(1730)는 포획 부위(1740)에서 포획 핸들(1720)의 결합에 의해 생성된 앵커 포인트(1745)에서 고체 지지체에 결합될 수 있다. 고체 지지체(1750) 상의 친화성 시약(1710) 및 표적 결합 파트너(1730)는 포획된 표적 결합 파트너(예를 들어, 표적 폴리펩티드)의 무작위 또는 패턴화된 어레이를 생성할 수 있다. 대안적으로, 친화성 시약(1710) - 표적 결합 파트너(1730) 복합체는 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 중력 침강, 여과, (자성 또는 상자성 고체 지지체의) 자기 포획 또는 원심분리와 같은 분리 방법에 의해 자유 용액에서 분리될 수 있다.
도 17c는 선택적 최종 단계를 도시한다. 포획된 표적 결합 파트너(1730)는 검정 시약으로서 검출 가능한 프로브(1760)를 활용하는 특성화 또는 정량화 검정을 거칠 수 있다. 하나 이상의 검출 가능한 프로브(1760)는 포획된 표적 결합 파트너(1760)와 접촉하여 표적 결합 파트너(1730)와 검출 가능한 프로브(1760) 사이의 결합 상호작용의 존재 또는 부재를 특성화할 수 있다. 검출 가능한 프로브(1760)로부터의 검출 가능한 신호의 존재 또는 부재의 관찰은 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티가 고체 지지체(1750) 상의 관찰된 위치에 존재할 확률을 나타낼 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 공동 결합 검정에 사용될 수 있다. 공동 결합 검정은 다수의 친화성 시약 및/또는 검출 가능한 프로브가 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티와 동시에 접촉하여 결합 표적에서 둘 이상의 특성(예를 들어, 에피토프)의 존재를 동시에 결정하는 임의의 검정을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드에서 2개의 별개의 에피토프의 동시 존재를 결정하여 폴리펩티드 동일성에 대한 높은 신뢰도의 예측을 산출하기 위해 공동 결합 검정이 이용될 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 각각 고유한 검출 시그니처 또는 핑거프린트로 구별되는 2개 이상의 고유한 종의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 결합하여 공동 결합 검정을 위해 제형화할 수 있다(예를 들어, 제1 프로브는 Alexa-Fluor® 488을 사용하고, 제2 프로브는 Alexa-Fluor® 647 형광 염료를 사용함). 고유한 검출 시그니처 또는 핑거프린트의 동시 검출(또는 이의 결여)은 하나 이상의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 공간적 위치에서 결합 파트너, 에피토프 또는 표적 모이어티에 결합했는지 여부에 대한 증거를 제공할 수 있다.
대안적으로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 활용하는 공동 결합 검정은 핵산 바코드를 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약으로 수행될 수 있다. 도 18a - 18c는 바코드 검출 신호를 활용하여 공동 결합 검정을 수행하기 위한 도식을 도시한다. 도 18a는 제1 검출 가능한 프로브(1810) 및 제2 검출 가능한 프로브(1840)와 접촉하는 결합 파트너(1890)를 도시한다. 제1 검출 가능한 프로브(1810)는 제1 에피토프 또는 표적 모이어티(1870)와 결합하도록 구성되고 바코드 서열(1838) 및 말단 프라이밍 서열(1830)을 갖는 제1 링커(1820)를 포함한다. 제2 검출 가능한 프로브(1840)는 제2 에피토프 또는 표적 모이어티(1880)와 결합하도록 구성되고, 말단 상보성 프라이밍 서열(1860)을 갖는 제2 링커(1850)를 포함한다. 제1 검출 가능한 프로브(1810)와 제1 에피토프 또는 표적 모이어티(1870) 사이에 결합 상호작용이 발생하고 제2 검출 가능한 프로브(1840)와 제2 에피토프 또는 표적 모이어티(1880) 사이에 결합 상호작용이 발생하면, 말단 프라이밍 서열(1830) 및 상보성 프라이밍 서열(1860)은 핵산 염기 페어링에 의해 혼성화하기에 충분히 근접할 수 있다. 도 18b에 나타낸 바와 같이, 접촉된 폴리머라제 효소(1865)는 프라이밍 서열에서 혼성화된 핵산에 결합하여 확장 반응이 일어나도록 할 수 있다. 도 18c에 나타낸 바와 같이, 확장 반응 후, 상보성 바코드 서열(1868)이 상보성 프라이밍 서열(1860)에 추가된 후 제2 검출 가능한 프로브(1840)가 결합 파트너(1890)로부터 분리될 수 있다. 검출 가능한 프로브 바코드의 후속 분석은 전사된 바코드를 검출할 것이며, 이에 따라 2개의 검출 가능한 프로브가 결합 파트너(1890)를 동시에 결합한다는 것을 나타낸다.
본 개시내용의 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 진단 검정과 같은 의학적 진단 목적에 유용할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 시험관 내 및 생체 내 시스템 모두에 적용할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 이러한 검정에서 일반적으로 사용되는 항체를 대체하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 사용하는 웨스턴 블롯팅 및 ELISA와 같은 일반적인 시험관 내 검정에 적용될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 유체 또는 기타 생물학적 샘플로부터 단백질 또는 다른 바이오마커의 위치를 찾기 위한 포획 또는 풀다운 시약으로도 활용될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 혈액 또는 혈장과 접촉시켜 혈액 유래 바이오마커를 분리할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 PET 스캐닝과 같은 생체 내 검정에 활용될 수 있다. 일부 구성에서, 생체 내 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 방사성 추적자(radiotracer)로서 가능하도록 방사성표지(예를 들어, 15O, 18F, 68Ga, 89Zr, 82Rb)에 부착될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 결합활성이 높도록 구성된 바이오마커를 나타내는 조직을 관찰하기 위한 고해상도의 높은 신호 데이터를 제공할 수 있다. 마찬가지로, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 의료 절차를 위한 실시간 예후 또는 진단으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 종양 표면 바이오마커에 대한 결합활성이 높은 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 사용하여 실시간으로 방사선 또는 외과적 치료를 모니터링할 수 있다. 표면 바이오마커의 존재에 관한 고해상도 형광 데이터는 수술 절제면으로부터의 암 마커의 제거 및 방사선 또는 외과적 치료의 진행에 대한 피드백을 외과의에게 제공할 수 있다(형광 소광은 잔여 종양 조직의 파괴와 연관성이 있음).
친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 의료 적용을 위한 치료제로 활용될 수 있다. 결합활성이 높은 친화성 시약 또는 프로브는 생체 내 신호전달 및/또는 결합 과정의 논리적 파괴자 또는 프로모터를 구성할 수 있다. 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 생체 내 신호전달 또는 결합 시스템과의 상호작용을 촉진하기 위해 복수의 결합 리간드(예를 들어, 호르몬, 사이토카인 등) 또는 결합 표적(예를 들어, 표면 수용체)에 부착될 수 있다. 결합활성이 높은 친화성 또는 검출 가능한 프로브는 신호전달 또는 결합 수용체 시스템을 부분적으로 또는 완전히 차단하기에 충분한 양으로 생체 내 시스템에 제공되어 세포 반응을 감소 또는 증가시킬 수 있다. 결합활성이 높은 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 하나 이상의 신호전달 또는 결합 리간드를 부분적으로 또는 완전히 포획하기에 충분한 양으로 생체 내 시스템에 제공되어 생물학적 반응을 감소 또는 증가시킬 수 있다. 결합활성이 높은 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 항미생물 또는 항바이러스 조성물로서 유용할 수 있다. 예를 들어, 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 미생물 또는 바이러스가 재생산 주기를 시작하기 위해 활용하는 수용체 시스템에 결합하도록 구성될 수 있다. 또는, 친화성 시약 또는 검출 가능한 프로브는 미생물 또는 바이러스에 결합하도록(예를 들어, 바이러스 스파이크 단백질(viral spike protein)에 의해) 구성되어 미생물 또는 바이러스가 세포 표적과 결합하는 능력을 억제할 수 있다.
대체 결합 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 치료, 진단 또는 약물 발견에 유용할 수 있다. 복수의 부착된 친화성 시약 키메라를 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 치료 또는 약물 발견 목적에 유용할 수 있다. 친화성 시약 키메라는 소분자, 핵산, 펩티드 또는 단백질과 같은 2차 분자에 결합된 친화성 시약을 포함한 모든 복합체를 포함할 수 있다. 키메라는 안티센스 핵산, 엑손, 인트론, 전사 억제인자, 전사 프로모터, 수용체 결합 리간드, 효소 결합 리간드, 효소 기재 등과 같은 특정 생물학적 기능을 지닌 2차 분자를 포함할 수 있다. 친화성 시약 키메라는 압타머-siRNA 키메라, 항체-siRNA 키메라, 압타머-리간드 키메라 또는 항체-리간드 키메라를 포함할 수 있다. 표적 분자에 안티센스 RNA를 전달하기 위해 표적 분자를 결합시키는 것과 같이, 친화성 시약 키메라를 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 이용하여 2차 분자에 대한 표적의 위치를 찾을 수 있다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 프로브에 커플링된 복수의 친화성 시약, 및 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약에 결합된 추가의 복수의 2차 분자를 포함할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약이 약물 전달 플랫폼으로 활용될 수 있다. 본원에서 제공되는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 증가된 결합활성은 세포 흡수를 위한 막 수용체 또는 다른 표적 가능한 시스템에 대한 고도의 결합을 허용할 것이다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 콜로이드 입자 또는 코팅된 약제학적 제형과 같은 약물 전달 제형과 회합될 수 있다. 도 38a - 38d는 세포 약물 전달을 위한 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약의 사용을 도시한다. 도 38a는 소수성 표면 변형 그룹(3810)을 포함하는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약과 약물 제형(3830)을 포함하는 콜로이드 약물 입자(3820)의 결합을 보여준다. 도 38b에 나타낸 바와 같이, 콜로이드 입자(3820)와 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약(3810)의 소수성 변형 그룹 사이의 소수성 상호작용은 표적화된 약물 전달 복합체를 형성한다. 도 38c는 막 회합된 단백질(3845)과 표적화된 약물 전달 복합체 사이의 결합 상호작용으로 인한 세포(3840)의 세포막(3842) 내에 포매된 막 회합된 단백질(3845)(예를 들어, 세포 수용체)과 표적화된 약물 전달 복합체 사이의 상호작용을 도시한다. 도 38d는 표적화된 약물 전달 복합체가 표적화된 막 회합된 단백질(3845)과 상호작용하여 세포(3840)로 약물 제형(3830)을 방출한 후의 세포(3840)로의 약물 제형(3830)의 흡수를 도시한다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약(3810)은 콜로이드 입자(3820)를 흡수하는 동안 세포로 방출되거나 흡수된다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 비생물학적 물질을 특성화하는 데 유용할 수 있다. 결합활성이 높은 시약 또는 프로브는 비생물학적 표적(예를 들어, 나노입자, 중합체 구조 등)과 결합하도록 구성될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 비생물학적 물질의 구조의 고해상도 이미징을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 특정 나노입자 구조에 대한 결합활성이 있는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 사용하여 복합 촉매 물질의 구조, 분해 및 중독 과정을 연구할 수 있다. 마찬가지로, 특정 하전된 표면 활성 부위에 대한 결합활성이 있는 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 사용하여 물질 표면의 반응 부위 분포 및 이용 가능성에 대한 고해상도 데이터를 제공할 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 사용하여 합성 및 천연 텍스타일과 같은 중합체 시스템에서 마이크로 규모의 분해 및/또는 손상을 표적으로 삼고 그 위치를 찾을 수 있다. 높은 결합활성 프로브가 제공하는 분해능을 통해 다양한 물질에서 일반적인 광학 검사 공정에 대해 분명하지 않은 특징을 확인할 수 있다.
검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 추가의 폴리펩티드 특성화 방법에 적용될 수 있다. 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약은 단일 분자 검출 에드만(Edman) 분해 기술을 가능하게 하도록 구성될 수 있다. 일반적으로, 에드만 분해는 각 펩티드로부터 단일 아미노산 잔기의 단계적 제거 및 검출에 의해 복수의 펩티드에 대한 서열 판독을 생성할 수 있다. 에드만 분해에 대한 단일 분자 접근법은 말단 아미노산 또는 말단 아미노산 서열을 검출하기 위해 검출 가능한 프로브 또는 친화성 시약을 사용함으로써 촉진될 수 있다. 도 19a - 19d는 각각의 서열 판독의 신호 강도를 증가시키기 위해 검출 가능한 프로브를 활용하는 에드만 분해에 대한 가능한 접근법을 도시한다. 도 19a는 고체 지지체(1910)에 결합된 복수의 폴리펩티드가 있는 고체 지지체(1910)를 도시한다. 제1 폴리펩티드(1920)는 측쇄 R1이 있는 말단 아미노산 잔기를 갖고 제2 폴리펩티드(1930)는 측쇄 R2가 있는 말단 아미노산 잔기를 갖는다. 도 19b는 각각의 천연 말단 아미노산 잔기에 대해 결합 특이성이 높은 복수의 프로브 종(예를 들어, 적어도 20개의 고유한 프로브 종 포함)을 포함하는 검출 가능한 프로브 조성물과 복수의 펩티드의 접촉을 도시한다. 제1 폴리펩티드(1920)는 측쇄 R1에 대한 결합 특이성을 갖도록 구성된 검출 가능한 프로브(1940)에 의해 결합된다. 제2 폴리펩티드(1930)는 측쇄 R2에 대한 결합 특이성을 갖도록 구성된 검출 가능한 프로브(1950)에 의해 결합된다. 검출 가능한 프로브 조성물의 각각의 검출 가능한 프로브는 각각의 결합 이벤트가 고유하게 확인되도록 하는 고유한 검출 시그니처 또는 핑거프린트를 갖는다. 도 19c는 복수의 폴리펩티드의 각각의 펩티드가 이소티오시아네이트 화합물과 반응하여 절단 가능한 생성물을 형성한 후의 에드만 분해 공정의 전형적인 중간 단계를 도시한다. 제1 폴리펩티드(1925)는 측쇄 R1이 있는 말단 변형된 아미노산 잔기를 갖고, 제2 폴리펩티드(1935)는 측쇄 R2가 있는 변형된 말단 아미노산 잔기를 갖는다. 도 19d는 각각의 변형된 천연 말단 아미노산 잔기에 대해 결합 특이성이 높은 복수의 프로브 종(예를 들어, 적어도 20개의 고유한 프로브 종 포함)을 포함하는 검출 가능한 프로브 조성물과 복수의 변형된 펩티드의 접촉을 도시한다. 제1 변형된 폴리펩티드(1925)는 측쇄 R1에 대한 결합 특이성을 갖도록 구성된 검출 가능한 프로브(1945)에 의해 결합된다. 제2 변형된 폴리펩티드(1935)는 측쇄 R2에 대한 결합 특이성을 갖도록 구성된 검출 가능한 프로브(1955)에 의해 결합된다. 검출 가능한 프로브 조성물의 각각의 검출 가능한 프로브는 각각의 결합 이벤트가 고유하게 확인되도록 하는 고유한 검출 시그니처 또는 핑거프린트를 갖는다. 일부 구성에서, 검출 가능한 프로브 조성물은 서열 판독의 신뢰도를 증가시키기 위해 말단 아미노산 잔기의 변형 전후에 검출 가능한 프로브 조성물과 접촉될 수 있다.
당업자는 논의된 많은 실시양태가 도 15a - 15d에 도시된 연결 바코드의 사용이나 도 8, 9a 및 9b에 도시된 것과 같은 약한 2차 결합 상호작용을 형성하는 방법과 같이 위에서 논의된 다른 기술을 활용하도록 쉽게 구성될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
실시예
실시예 1: 고정 성분으로서 오리가미 타일(origami tile)을 갖는 친화성 시약의 설계 및 합성
오리가미 타일 기반 친화성 시약을 수반된 인하우스 파이썬 스크립트(in-house python script)와 함께 CADDNANO 소프트웨어를 사용하여 설계하였다. 타일은 단층으로 된 대략 정사각형 형상의 핵산 오리가미로 설계하였다. 타일은 타일의 윗면에 20개의 DNA 압타머 결합 부위와 타일 분자의 측면을 따라 균일하게 분포된 44개의 염료 분자 부착 부위를 갖도록 설계하였다. 도 23은 압타머 부착 부위를 나타내는 도트(2330) 및 염료 부착 부위를 나타내는 원(2320)이 있는 타일 기반 친화성 시약(2310)의 개략도를 도시한다. 타일은 측면 길이가 약 83나노미터(nm)가 되도록 설계하였다.
7249개의 뉴클레오티드를 함유하는 M13 단일 가닥 원형 DNA 가닥의 스캐폴드 가닥을 사용하여 오리가미 타일을 제조하였다. 217개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 타일 기반 친화성 시약의 조립을 허용하는 '스테이플'로서 스캐폴드 가닥과의 혼성화를 위해 설계하고 합성하였다.
스캐폴드 가닥을 217개의 올리고뉴클레오티드와 결합시켜 오리가미 타일을 조립하였다. DNA 가닥을 pH 8.0에서 5mM Tris-HCl, 5mM NaCl, 1mM EDTA, 12.5mM MgCl2를 함유하는 버퍼에서 90℃에서 결합시켰다. DNA 가닥 혼합물을 20℃의 온도로 냉각시키고 1.5시간 동안 어닐링시켰다.
어닐링된 타일 기반 친화성 시약을 HPLC 크기 배제 크로마토그래피 또는 100kDa 크기 컷오프 스핀 필터를 통해 정제하였다. 정제된 타일 기반 친화성 시약을 pH 8.0에서 5mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 1mM EDTA, 11mM MgCl2를 함유하는 버퍼에 재현탁시키고 4℃에서 보관하였다.
실시예 2: 오리가미 타일의 이미지 분석
실시예 1에 기술된 바와 같이 오리가미 타일 기반 친화성 시약을 제조하였다. 조립 방법의 성공을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)을 통해 타일 프로브를 이미지화하였다. 타일 프로브 용액을 글로우 방전 탄소 증착 구리 그리드에 스포팅하고 우라닐 포르메이트(uranyl formate)를 사용하여 네거티브 염색하였다.
타일 프로브를 120킬로볼트(kV)의 가속 전압하에 30,000배 배율의 FEI Tecnai T12 투과 전자 현미경에서 이미지화하였다. 타일 프로브는 예상대로 측면 길이가 약 83nm인 대략적인 정사각형 형상인 것으로 보인다.
실시예 3: 항체 기반 결합 성분을 갖는 타일 기반 친화성 시약의 설계 및 합성
항체 타일 검출 가능한 프로브를 수반된 인하우스 파이썬 스크립트와 함께 CADDNANO 소프트웨어를 사용하여 설계하였다. 오리가미 타일은 단층으로 된 대략 정사각형 형상이 되도록 설계하였다. 타일은 6개의 항체 결합 부위(타일의 윗면에 2개, 각 측면을 따라 1개)와 타일 분자의 측면을 따라 균일하게 분포된 40개의 염료 분자 부착 부위를 갖도록 설계하였다. 도 25는 타일 기반 친화성 시약(2510)의 개략도를 도시하며, 각각의 부착 부위에 항체 성분(2520)이 있고 표지 성분에 대한 부착 부위를 나타내는 원(2530)이 있다. 타일은 측면 길이가 약 83나노미터(nm)가 되도록 설계하였다.
7249개의 뉴클레오티드를 함유하는 M13 단일 가닥 원형 DNA 가닥의 스캐폴드 가닥을 사용하여 오리가미 타일을 제조하였다. 217개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 타일 프로브의 조립을 허용하는 스캐폴드 가닥과의 혼성화를 위해 설계하고 합성하였다. 6개의 올리고뉴클레오티드를 클릭 반응을 통해 항체 성분의 부착을 가능하게 하기 위해 트랜스사이클로옥텐 변형된 뉴클레오티드로 합성하였다.
스캐폴드 가닥을 217개의 올리고뉴클레오티드와 결합시켜 타일을 조립하였다. DNA 가닥을 pH 8.0에서 5mM Tris-HCl, 5mM NaCl, 1mM EDTA, 12.5mM MgCl2를 함유하는 버퍼에서 90℃에서 결합시켰다. DNA 가닥 혼합물을 20℃의 온도로 냉각시키고 1.5시간 동안 어닐링시켰다.
어닐링된 타일을 HPLC 크기 배제 크로마토그래피 또는 100kDa 크기 컷오프 스핀 필터를 통해 정제하였다. 정제된 타일을 pH 8.0에서 5mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 1mM EDTA, 11mM MgCl2를 함유하는 버퍼에 재현탁시켰다. 트랜스사이클로옥텐(TCO) - 메틸테트라진(mTz) 클릭 반응을 통해 항체를 타일에 부착하였다. 도 26은 오리가미 타일에 대한 항체(또는 다른 결합 성분)의 부착을 위한 예시적인 반응 도식을 도시한다. TCO 변형된 뉴클레오티드로 정제된 타일 로브를 mTz 변형된 10x 항-His 태그 항체와 20℃의 온도에서 결합시키고 6 내지 10시간 동안 반응시켰다. 클릭 반응 후, 타일 프로브를 HPLC 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제하였다.
도 27은 TCO-mTz 클릭 반응을 통해 생성된 정제된 항체-DNA 올리고 접합체에 대한 SDS-페이지 겔을 보여준다. 레인 A는 항체-DNA 올리고 접합체를 함유한다. 레인 B는 mTz 변형된 항체 음성 대조군을 함유한다. 레인 C는 변형되지 않은 항체 대조군을 함유한다. DNA 올리고에 대한 항체의 성공적인 부착을 확인해 주는 가장 위쪽의 어두운 밴드가 관찰된다.
실시예 4: 압타머 기반 결합 성분을 갖는 타일 기반 친화성 시약의 결합
실시예 1의 방법에 따라 4개의 상이한 종의 압타머 타일 프로브를 제조하였다. 타일 기반 친화성 시약의 각 종은 말단 히스티딘 태그에 대한 다양한 결합 친화성을 갖는 상이한 압타머를 함유하였다. 사용된 4개의 압타머는 B1(최고 친화성), A1(중간 친화성), D1(낮은 친화성) 및 SC2(친화성 없음)이다. 각각의 타일 기반 친화성 시약은 20개의 압타머와 40개의 Alexa-Fluor® 647 염료 분자로 조립하였다.
his 태그된 유비퀴틴의 단일 분자 어레이에 대한 결합에 대해 각각의 압타머를 스크리닝하였다. 유비퀴틴 접합체(구조화 핵산 입자에 부착된 유비퀴틴)의 10나노그램/마이크로리터 용액을 유체 칩에 증착하여 단백질 어레이를 제조하였다. 각 유체 칩에는 3개의 레인이 함유되어 있으며 각 레인에는 3-아미노프로필 트리에톡시실란(APTMS)의 블랭킷 코팅이 있는 유리 표면이 있다. 세 가지 상이한 유형의 단백질 어레이를 각 칩의 레인당 1개씩 제조하였다: his 태그된 유비퀴틴; flag 태그된 유비퀴틴(음성 대조군); 태그되지 않은 유비퀴틴(음성 대조군). 증착된 각 단백질 접합체는 Alexa-Fluor® 488 염료 분자를 함유하였다. 어레이에서 단백질 접합체 위치는 488nm 여기에서 형광 현미경검사를 통해 측정하였다. 친화성 시약 결합 전에, 유체 칩을 버퍼에 1% BSA, 2nM 비표지된 DNA 타일 및 100mg/ml 덱스트란 설페이트를 함유하는 용액으로 60분 동안 차단하였다.
결합을 테스트하기 위해, 15μl의 20nM 친화성 시약 용액을 유체 칩으로 흘렸다. 프로브는 10분 동안 결합되도록 허용되었다. 친화성 시약 결합 후, 유체 칩을 린스 용액으로 헹궜다. 20배 배율 및 647nm 여기에서 ThorLab 현미경을 사용하여 표면의 결합을 이미지화하였다. 647nm의 현미경 이미지를 488nm의 이미지와 비교하여 적용된 친화성 시약에 의해 결합된 단백질 분획을 결정하였다. 4개의 모든 친화성 시약 종을 3개의 어레이 각각에 대해 테스트하였다. 12개 실험의 각 세트를 중복하였다.
도 28a - 28d는 결합을 위한 점유율을 도시한다. 점유율은 알려진 단백질 접합체가 있는 전체 위치에 대한 결합이 검출된 관찰된 위치의 비율로 결정하였다. 도 28a는 A1 압타머 시약에 대한 점유율에 대조되는 B1 압타머 시약에 대한 점유율을 보여준다. 더 낮은 결합 친화성에도 불구하고, A1 압타머 시약은 거의 B1 압타머 시약만큼 점유율이 높은 것으로 나타났다. 도 28b는 D1 압타머 시약에 대한 점유율에 대조되는 B1 압타머 시약에 대한 점유율을 보여준다. 도 28c 및 28d는 각각 B1 대 SC2 및 D1 대 SC2에 대한 점유율을 비교한다. 도 28b 및 28d에 나타낸 바와 같이, his 태그된 단백질에 대한 낮은 결합 친화성에도 불구하고, D1 압타머 시약의 점유율은 B1 압타머 시약의 점유율의 거의 절반이고 음성 대조군 SC2 압타머 시약의 점유율보다 현저하게 높은 것으로 관찰되어, 검출 가능한 프로브가 결합활성 효과를 통해 약한 결합 압타머의 관찰된 결합 친화성을 크게 향상시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 5. 항체 기반 결합 성분을 갖는 타일 기반 친화성 시약의 결합
항체 기반 결합 성분을 갖는 타일 기반 친화성 시약을 실시예 2 및 3에 따라 제조하였다. 각각의 친화성 시약을 6개의 10x 항-His 항체 및 40개의 Alexa-Fluor® 647 염료 분자로 제조하였다. 0.5nM 프로브 용액을 사용하여 실시예 4에 기술된 방법을 통해 결합을 테스트하였다.
도 29a - 29c는 시약 결합에 대한 형광 현미경 이미지를 보여준다. 도 29a 및 29b는 각각 태그되지 않은 유비퀴틴 어레이와 플래그 태그된 유비퀴틴 어레이에 대한 시약의 결합을 보여준다. 도 29c는 his 태그된 유비퀴틴 어레이에 대한 시약의 결합을 보여준다. his 태그된 어레이에 대한 더 높은 수준의 프로브 결합이 관찰되었다.
도 30은 6개의 상이한 칩 상의 3개의 상이한 단백질 어레이에 대한 친화성 시약의 점유율을 보여준다. his 태그된 단백질 어레이에 대한 높은 점유율이 모든 6개의 칩에 대해 관찰되는 반면, 각각의 유체 칩 상의 다른 his 태그되지 않은 단백질에 대해서는 훨씬 더 낮은 점유율이 관찰된다.
실시예 6. 멀티플렉스 결합 검정
한 가지 또는 두 가지 유형의 형광단을 포함하는 검출 가능한 친화성 시약을 조립한다. 이용 가능한 형광단은 적색, 황색, 녹색 또는 청색 파장(R, Y, G, B)에서 발광한다. 각 형광단은 검출 가능한 프로브의 각 형광단의 총 수를 나타내기 위해 명명한다. 예를 들어, 10개의 적색 형광단과 10개의 황색 형광단이 있는 검출 가능한 친화성 시약의 이름은 "R10Y10"이다. 고유한 형광단 조합을 갖는 각각의 친화성 시약은 표적 모이어티에 대해 고유한 결합 특이성을 갖는 결합 성분의 고유한 종에 부착된다. 2개의 고유한 형광단 풀이 생성되며, 각 풀의 조성은 아래 표 1에 나열되어 있다.
친화성 시약의 풀을 제1 결합 파트너와 접촉시킨다. 형광 강도를 네 가지 가능한 형광단에 상응하는 파장에서 측정한다. 측정된 형광 강도는 이용 가능한 형광단 수와 관련이 있다. 표 2는 형광 강도를 기준으로 측정된 형광단 수는 물론 관찰된 형광 강도의 고유한 조합을 생성하는 각 풀의 결합된 프로브 조합을 표시한다.
관찰된 형광 강도에 기초하여, 결합 파트너에 대해 이용 가능한 표적 모이어티를 예측할 수 있다.
친화성 시약의 풀을 제2 결합 파트너와 접촉시킨다. 형광 강도는 네 가지 가능한 형광단에 상응하는 파장에서 측정한다. 측정된 형광 강도는 이용 가능한 형광단 수와 관련이 있다. 표 3은 형광 강도를 기준으로 측정된 형광단 수는 물론 관찰된 형광 강도의 고유한 조합을 생성하는 각 풀의 결합된 친화성 시약의 조합을 표시한다.
관찰된 형광 강도를 기반으로 결합 파트너에 대해 이용 가능한 표적 모이어티를 예측할 수 있다. 검출 가능한 친화성 시약의 다중 풀의 합리적인 조작은 결합 파트너 내에서 동시에 여러 표적 모이어티의 존재를 예측하는 고유한 결합 시그니처를 생성할 수 있다.
실시예 7. 친화성 크로마토그래피
3개의 친화성 크로마토그래피 컬럼을 준비한다. 제1 크로마토그래피 컬럼은 수지에 공유 결합된 친화성 시약을 포함하는 제1 크로마토그래피 수지를 포함한다. 제1 컬럼의 친화성 시약은 아미노산 서열에 관계없이 폴리펩티드에 대한 일반적인 결합 친화성이 있다. 제2 크로마토그래피 컬럼은 수지에 공유 결합된 친화성 시약을 포함하는 제2 크로마토그래피 수지를 포함한다. 제2 컬럼의 친화성 시약은 아미노산 서열 내에 라이신-아르기닌-알라닌(KRA) 아미노산 삼량체 서열을 포함하는 폴리펩티드에 대한 결합 친화성이 있다. 제3 크로마토그래피 컬럼은 올리고뉴클레오티드 혼성화에 의해 수지에 결합된 친화성 시약을 포함하는 제3 크로마토그래피 수지를 포함한다. 제3 컬럼의 친화성 시약은 아미노산 서열 내에 라이신-글루탐산-아스파라긴(KEN) 아미노산 삼량체 서열을 포함하는 폴리펩티드에 대한 결합 친화성이 있다.
3개의 친화성 크로마토그래피 컬럼을 순차적으로 배열한다. 미정제 세포 용해물을 제1 일반 분리 컬럼에 적용한다. 폴리펩티드는 미정제 세포 용해물에서 포획되는 반면 용해물의 비폴리펩티드 분획은 컬럼을 통과하여 폐기된다. 용해물의 비폴리펩티드를 버린 후, 제1 컬럼에 용출 버퍼를 적용하여 폴리펩티드 분획을 용출한다. 용출된 분획을 포획하여 제2 KRA 특이적 크로마토그래피 컬럼에 적용한다. 폴리펩티드의 제1 분획은 KRA 특이적 수지에 포획되는 반면 제2 분획은 컬럼을 통과하여 포획된다. 컬럼 끝에서 제2 분획을 수집한 후 용출 버퍼에 의해 폴리펩티드의 제1 분획을 컬럼으로부터 용출시키고 컬럼 끝에서 수집한다.
KRA 특이적 크로마토그래피 컬럼으로부터 수집된 제1 폴리펩티드 분획을 제3의 KEN 특이적 크로마토그래피 컬럼에 첨가한다. 폴리펩티드의 제1 분획은 KEN 특정 수지에 포획되고 제2 분획은 컬럼을 통과하여 포획된다. 컬럼의 끝에서 제2 분획을 수집한 후, 컬럼을 가열하여 올리고뉴클레오티드 혼성화물을 녹임으로써 컬럼으로부터 검출 가능한 프로브를 방출함으로써 폴리펩티드의 제1 분획을 컬럼으로부터 용출시킨다.
KEN 특이적 컬럼은 KEN 특이적 검출 가능한 친화성 시약의 새로운 배치로 재생되어 제1 분획의 분리로부터 방출된 친화성 시약을 보충한다. 이어서 KRA 특이적 컬럼에서 수집된 제2 분획에 대해 분리가 반복된다. 제1 통과 분획이 수집된 후 제2 포획 분획이 수집된다. KRA 특이적 컬럼으로부터 두 분획을 분리한 후, 총 4개의 분획이 형성된다. 도 40은 초기 세포 용해물로부터 하단에 나열된 4개의 분획의 예비 결정 특성이 있는 최종 4개의 폴리펩티드 분획까지의 크로마토그래피 공정의 개략도를 보여준다. 4개 분획의 예비 특성화는 각 분획의 크로마토그래피 거동을 기반으로 평가한다. 위음성 또는 위양성 포획 상호작용의 가능성으로 인해 특성화는 예비로 간주된다.
KEN 특이적 칼럼 상에 포획된 2개의 폴리펩티드 분획은 친화성 시약-폴리펩티드 복합체로 수집된다. 각각의 친화성 시약-결합 폴리펩티드 분획을 복수의 부착 부위를 포함하는 패턴화된 실리콘 고체 지지체에 순차적으로 적용하며, 각 부위는 친화성 시약을 포획하고 결합하도록 구성된다. 각각의 친화성 시약 결합된 분획을 칩에 적용한 후, 형광 현미경검사를 사용하여 고체 지지체 상의 각각의 점유된 부착 부위를 측정하고 기록한다.
KEN 특이적 칼럼으로부터의 2개의 포획되지 않은 분획은 구조화 핵산 입자에 부착된다. 각각의 포획되지 않은 분획을 실리콘 고체 지지체에 적용하며, 점유된 부착 부위는 포획된 분획과 마찬가지로 형광 현미경검사로 관찰한다. 4개의 모든 분획이 고체 지지체에 결합된 후, 폴리펩티드 검정을 위해 패턴화된 폴리펩티드 어레이가 생성되었다.
실시예 8. FluoSphere™ 기반 친화성 시약의 합성
변형 가능한 표면 화학을 포함하는 고형광 유기 나노입자를 사용하여 검출 가능한 친화성 시약을 제조하였다. 도 41은 FluoSphere™ 기반 프로브의 제조를 위한 계획을 예시한다. 40nm 또는 200nm 카복실레이트 작용화된 FluoSpheres™(Thermo-Fisher)를 폴리에틸렌 글리콜 모이어티로 변형하여 FluoSphere™ 입자를 둘러싸는 부동태화 층을 형성하였다. FluoSpheres™는 PEG 그룹으로 작용화하기 전에 NHS-EDC 활성화를 통해 활성화하였다. 카복실레이트 작용화된 FluoSpheres™를 NH2-PEG와 NH2-PEG-아지드의 95:5 혼합물과 배합하여 아지드 작용성 그룹을 함유하는 FluoSpheres™ 주위에 페길화된 표면 코팅을 형성하였다. 페길화된 FluoSpheres™를 3'-디벤조사이클로옥텐(DBCO) 말단 올리고뉴클레오티드와 인큐베이션하여 올리고뉴클레오티드를 페길화 층 표면의 아지드 말단 PEG 모이어티에 공유 부착시켰다. 인큐베이션은 약 24℃에서 밤새 포스페이트 버퍼 용액(pH 7.4)에서 이루어졌다.
FluoSpheres™에 대한 올리고뉴클레오티드의 부착 후, 친화성 시약의 커플링을 위한 부착 부위가 제공되었다. 올리고 작용화된 FluoSpheres™를 작용화된 올리고 핸들에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 결합하였다. 혼합물을 95℃로 5분 동안 가열한 다음 70℃에서 10분 동안 어닐링한 후 실온으로 냉각시켰다. 대안적으로, FluoSpheres™에 부착하기 전에 상보성 올리고뉴클레오티드를 DBCO 작용화된 올리고뉴클레오티드에 어닐링할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 표 4에 나열되어 있다.
실시예 9. 퀀텀닷 기반 친화성 시약의 합성
변형 가능한 표면 화학을 포함하는 고형광 무기 나노입자를 사용하여 검출 가능한 친화성 시약을 제조하였다. 15nm 카복실화된 퀀텀닷(Thermo Fisher)을 폴리에틸렌 글리콜 모이어티로 변형하여 퀀텀닷 입자를 둘러싸는 비접착층을 형성하였다. 상기 퀀텀닷을 NH2-PEG와 NH2-PEG-아지드의 75:25 혼합물과 배합하여 아지드 작용성 그룹을 함유하는 퀀텀닷 주위에 페길화된 표면 코팅을 형성하였다. 페길화된 퀀텀닷을 3'-DBCO 말단 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하여 올리고뉴클레오티드를 페길화된 층 표면 상의 아지드 말단 PEG 모이어티에 공유 부착시켰다. 인큐베이션은 약 24℃에서 밤새 포스페이트 버퍼 용액(pH 7.4)에서 이루어졌다.
퀀텀닷에 대한 올리고뉴클레오티드의 부착 후, 친화성 시약의 커플링을 위한 부착 부위가 제공되었다. 올리고 작용화된 퀀텀닷을 작용화된 올리고 핸들에 대한 상보성 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 결합하였다. 혼합물을 95℃로 5분 동안 가열한 다음 70℃에서 10분 동안 어닐링한 후 실온으로 냉각시켰다. 대안적으로, 퀀텀닷에 부착하기 전에 상보성 올리고뉴클레오티드를 DBCO 작용화된 올리고뉴클레오티드에 어닐링할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 표 4에 나열되어 있다.
실시예 10. FluoSphere™ 기반 친화성 시약의 최적화
최적의 페길화 전략을 결정하기 위해 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 친화성 시약의 다양한 구성을 조사하였다. 카복실화된 FluoSpheres™를 실시예 8에 기술된 방법에 따라 페길화하였다. 테스트되는 변수는 PEG 크기, PEG 유형 및 PEG 표면 밀도를 포함하였다.
페길화된 FluoSpheres™는 표면 패시베이션 정도를 결정하기 위해 제타 전위 측정으로 특성화하였다. 제타 전위 측정은 2% 포스페이트 버퍼 용액(PBS)에서 수행하였다. 도 42a는 PEG-NH2, PEG-OH 및 NHS 활성화된 FluoSpheres™로 페길화된 FluoSpheres™에 대해 측정된 제타 전위를 보여준다. PEG-NH2와 반응할 때 제타 전위의 크기 감소는 FluoSphere™ 표면의 성공적인 페길화 및 패시베이션을 나타낸다. 도 42b는 PEG 그룹의 추정된 표면 밀도의 함수로서 제타 전위를 보여준다. 0.5mM, 5.9mM 또는 59mM PEG-NH2의 다양한 PEG-NH2 농도를 갖는 FluoSpheres™를 실시예 8의 방법으로 제조하였다. 제타 전위는 추정된 PEG 표면 밀도가 증가함에 따라 크기가 감소하는 것으로 나타난다.
페길화된 FluoSpheres™는 결합 성분 커플링을 위한 부착 부위를 제공하기 위해 올리고뉴클레오티드에 커플링하였다. 첨부 부위를 제공하기 위한 전략은 실시예 8에 기술되어 있다. 도 42c는 올리고뉴클레오티드 및 부착 올리고뉴클레오티드가 FluoSphere™에 첨가됨에 따라 페길화된 FluoSpheres™에 대해 측정된 제타 전위를 보여준다. 제타 전위는 핵산이 첨가됨에 따라 크기가 증가하는 것으로 보이며, 이것으로 FluoSpheres™에 대한 올리고뉴클레오티드의 성공적인 커플링이 확인된다. 도 42d는 올리고 커플링된 FluoSpheres™에 대한 압타머 성분의 결합을 보여준다. FluoSpheres™는 폴리-T 올리고뉴클레오티드와 커플링되어 폴리-A 어닐링 서열을 나타내는 압타머 성분을 커플링하도록 구성된 부착 부위를 형성하였다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 평균 총 수는 압타머 성분의 어닐링 후 qPCR로 계산하였다. 도 42d는 폴리-A 함유 압타머 성분의 성공적인 커플링을 보여주며, 폴리-T 함유 압타머의 결합이 거의 관찰되지 않음을 보여준다.
다양한 크기의 PEG 그룹을 갖는 페길화된 FluoSpheres™를 준비하였다. 도 42e는 mPEG-12, mPEG-24, mPEG-36, mPEG-45 또는 mPEG-112로 페길화된 FluoSpheres™에 대해 측정된 제타 전위를 보여준다. 제타 전위는 PEG 그룹의 크기가 증가함에 따라 감소하는 것으로 보인다. 도 42f는 PEG 크기의 함수로서 페길화된 FluoSpheres™에 대한 다분산지수(polydispersity index, PDI)를 나타낸다. PDI는 동적 광산란으로 측정하였다. PEG 크기가 mPEG-36을 넘으면 PDI가 증가하는 것으로 관찰되며, 이는 콜로이드 안정성이 감소했음을 시사한다.
실시예 11. FluoSphere™ 기반 친화성 시약의 결합 특성화
표적 결합 특성을 평가하기 위해 FluoSphere™ 기반 친화성 시약의 결합을 테스트하였다. FluoSphere™ 기반 고정 성분을 실시예 8에 기술된 방법으로 제조하였다. 압타머를 부착 올리고뉴클레오티드와 함께 95℃에서 5분 동안 사전 어닐링한 다음 FluoSpheres™에 커플링하였다. 다음 압타머: P7-B1-P5(표적 히스티딘 태그), P7-H3T-P5(표적 히스티딘 태그) 및 P7-VEGF 압타머 89(표적 VEGF)를 갖는 FluoSpheres™를 제조하였다.
결합 연구를 위한 펩티드 표적은 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트에 비오티닐화된 삼량체 아미노산 서열을 고정하여 제조하였다. 도 43a는 다양한 압타머 제형의 결합을 보여준다(표적 상: P7-B1-P5-FS는 FluoSphere™ 프로브임, P7-B1-P5-스트렙은 스트렙트아비딘-Alexa-Fluor® 647로 표지됨; 표적 외: Her2-FS는 FluoSphere™ 프로브임, Her2-스트렙은 다양한 펩티드 트리머 표적에 대해 스트렙트아비딘 Alexa-Fluor® 647로 표지됨). P7-B1-P5 함유 FluoSphere™ 프로브는 P7-B1-P5-스트렙과 결합 프로필이 유사하고 Her2 특이적 친화성 시약과는 결합 프로필이 유사하지 않은 것으로 관찰된다.
다양한 표적에 대한 FluoSphere™ 기반 친화성 시약에 대한 해리 상수를 측정하였다. 표적은 비오티닐화된 표적(단백질 또는 펩티드)을 스트렙트아비딘 플레이트에 커플링하여 제조하였다. 도 43b는 히스티딘 태그된 Her2 단백질 표적에 대한 P7-B1-P5 압타머 함유 FluoSphere™ 친화성 시약에 대한 결합 측정을 나타낸다. EC50은 6.5nM로 측정되었으며 이는 FluoSphere™ 기반 P7-B1-P5 친화성 시약이 Her2-His 접합체의 히스티딘 태그에 성공적으로 결합할 수 있음을 시사한다. 도 43c는 HHH 삼량체 펩티드에 대한 P7-H3T-P5 압타머에 대한 결합 측정을 나타낸다. 측정된 EC50은 3.4nM이며, 이는 FluoSphere™ 기반 친화성 시약이 삼량체 표적에 결합할 수 있음을 시사한다. 도 43d는 VEGF 표적(표적 상) 및 미오글로빈(표적 외)에 대한 P7-VEGF-압타머 89-기반 FluoSphere™ 친화성 시약에 대한 프로브 농도의 함수로서 측정된 결합을 보여준다. 훨씬 더 높은 형광 강도가 VEGF와의 결합에 대한 친화성 시약 농도의 함수로서 측정되며, 이는 FluoSphere™ 기반 프로브가 의도한 표적에 대한 결합 친화성을 가지고 있음을 시사한다.
실시예 12. FluoSphere™ 기반 친화성 시약의 안정성 특성화
PBS 버퍼 중 4℃에서 연장 저장 후 친화성 시약의 결합 활성을 결정하기 위해 제조된 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 친화성 시약의 안정성을 테스트하였다. 검출 가능한 친화성 시약을 실시예 8에 기술된 방법으로 제조하였다. 검출 가능한 친화성 시약은 P7-B1-P5 압타머(표적 히스티딘 태그)로 제조하였다. 상업적으로 이용 가능한 형광 표지 스트렙트아비딘-Alexa Fluor® 647 접합체(Thermo Fisher) 및 스트렙트아비딘-APC(Thermo Fisher)에 커플링된 단일 P7-B1-P5 압타머에 대해서도 안정성 측정을 수행하였다. 도 44a - 44c는 지시된 시점에서 각각의 검출 가능한 친화성 시약에 대한 친화성 측정을 보여준다. 각 시간 간격에서 검출 가능한 친화성 시약의 친화성을 실시예 11에 기술된 바와 같이 평가하였다. FluoSphere™ 기반 검출 가능한 친화성 시약은 스트렙트아비딘 접합체보다 더 오랜 기간 동안 표적에 더 강한 친화성을 나타냈다. 놀랍게도 P7-B1-P5 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 프로브는 상용 형광 대안과 비교하여 안정성이 크게 향상되었다.
실시예 13. FluoSphere™ 기반 친화성 시약의 결합 특성화
단일 압타머 P7-B1-P5-형광단 접합체의 결합 친화성과 비교하여 P7-B1-P5 커플링된 FluoSphere™ 기반 친화성 시약의 결합 친화성을 측정하였다. P7-B1-P5 커플링된 FluoSphere™ 기반 검출 가능한 친화성 시약은 실시예 8의 방법에 따라 제조하였다. 다음 형광단에 대한 단일 압타머 P7-B1-P5 접합체도 제조하였다: 스트렙트아비딘-Alexa Fluor® 647(Thermo Fisher), 스트렙트아비딘-APC(Thermo Fisher) 및 SureLight™ APC(Columbia Biosciences). 다양한 농도의 프로브 또는 압타머를 사용하여 히스티딘(HHH) 펩티드에 대한 결합 곡선을 측정하였다. 결합 측정 데이터로부터 해리 상수(EC50)를 도출하였다.
도 45a - 45d는 각각 FluoSphere™ 기반 친화성 시약, Alexa Fluor® 압타머, APC 압타머 및 SureLight™ APC 압타머에 대한 해리 상수의 플롯을 보여준다. FluoSphere™ 기반 친화성 시약은 EC50이 약 2.2nM인 것으로 측정되었다. Alexa-Fluor® 및 APC 압타머는 EC50 측정값이 각각 28.0nM 및 29.9nM이었다. SureLight™ APC 압타머는 측정된 EC50이 2.3nM이었다. FluoSphere™ 기반 친화성 시약은 사용된 정확한 검출 가능한 프로브 시스템에 따라 동등하거나 우수하게 히스티딘 펩티드 표적에 결합하는 것으로 나타났다.
실시예 14. 퀀텀닷 기반 친화성 시약의 결합 특성화
고정 성분으로서 퀀텀닷 형광단을 함유하는 검출 가능한 친화성 시약을 실시예 9의 방법에 따라 제조하였다. 퀀텀닷 기반 친화성 시약을 P7-B1-P5 압타머(표적 히스티딘 태그)와 커플링하였다. 퀀텀닷 기반 친화성 시약의 결합 특성을 결정하기 위해 결합 측정을 수행하였다.
도 24a 및 24b는 P7-B1-P5-퀀텀닷 기반 친화성 시약에 대한 결합 측정 데이터를 나타낸다. 도 24a는 his 태그된 Her2 단백질(표적 상 결합) 및 미오글로빈(표적 외 대조군)과 접촉된 퀀텀닷 기반 P7-B1-P5 친화성 시약에 대한 형광 측정을 나타낸다. 형광 신호는 Her2-hi 표적에 대한 친화성 시약 농도가 증가함에 따라 증가하는 것으로 관찰된다. 친화성 시약이 미오글로빈 대조군에 접촉될 때 형광 신호에서 거의 변화가 관찰되지 않으며, 이는 퀀텀닷 기반 P7-B1-P5 압타머가 의도한 표적을 구별하고 결합할 수 있음을 시사한다. 도 24b는 퀀텀닷 기반 P7-B1-P5 친화성 시약에 대한 HHH 펩티드에 대한 EC50 측정 데이터를 나타낸다. EC50은 60nM로 측정되며, 이는 퀀텀닷 기반 친화성 시약이 의도한 표적과 결합함을 시사한다.
실시예 15. FluoSphere™ 기반 친화성 시약의 합성
작용화된 그룹과 작용화되지 않은 그룹의 비율이 다양한 FluoSphere™ 기반 친화성 시약을 제조하였다. 친화성 시약 표면 상의 작용화된 그룹의 작용화된 양의 최적량을 평가하기 위해 FluoSphere™ 기반 친화성 시약의 결합을 테스트하였다. mPEG-아민:아민-PEG-아지드 비율이 95:5, 99.5:0.5, 99.95:0.05 및 99.995:0.005인 FluoSphere™ 기반 친화성 시약을 제작하였다. 제작 후, 친화성 시약을 실시예 8에 기술된 바와 같이 B1 압타머에 부착시키고, 플레이트 기반 결합 연구로 평가하였다. 95:5의 비율은 99.5:0.5의 비율보다 약 1.5배 더 높은 신호를 보였다(도 46 참조). 이용 가능한 아지드 그룹(압타머가 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 부착을 위한 부착 그룹)의 양의 증가는 완전히 제작된 친화성 시약의 표적 상 결합의 양을 증가시킨다.
실시예 16. FluoSphere™ 기반 친화성 시약에 대한 친화성 시약의 직접 접합
FluoSphere™ 기반 친화성 시약을 작용화된 나노입자에 대한 결합 성분의 직접 접합을 통해 제조하였다. 5'-DBCO 작용성 그룹을 함유하는 B1 압타머를 표면에 표시된 mPEG-아지드 그룹을 함유하는 작용화된 FluoSpheres™와 접촉시켰다. 검출 가능한 친화성 시약을 아지드 모이어티와 DBCO 모이어티의 반응으로 형성시켰다. 직접 접합 전략으로 제조된 FluoSphere™ 기반 친화성 시약과 올리고뉴클레오티드 어닐링을 통해 제조된 FluoSphere™ 기반 친화성 시약(실시예 8 참조)의 결합을 Her2-his 태그 표적에 대해 비교하였다. 도 47은 직접 접합된 친화성 시약 및 어닐링된 친화성 시약에 대한 표적 Her2-his 결합 데이터는 물론 미오글로빈(표적 외) 대조군에 대한 두 친화성 시약 유형에 대한 결합을 나타낸다. 직접 접합된 친화성 시약의 관찰된 결합은 어닐링된 친화성 시약보다 낮은 것으로 관찰되었지만, 음성 대조군에 대해 관찰된 결합을 실질적으로 초과하였다.
실시예 17. 형광 dUTP 뉴클레오티드의 효소적 포함
AlexaFluor-647 dUTP 뉴클레오티드를 도 49b에 기술된 바와 같이 압타머의 3' 엔드 영역에 효소적으로 포함시켰다. 상기 압타머에 포함된 형광단은 형광단의 성공적인 포함을 보여주는 도 52에 도시된 바와 같이 647nm에서 가시화되었다.
실시예 18. 아미노알릴 dUTP에 대한 AlexaFluor-647 NHS 에스테르 접합
AAdUTP 뉴클레오티드를 도 49b에 기술된 방법을 사용하여 압타머에 포함시켰다. 생성된 표지된 압타머를 형광단에 화학적으로 접합시키고, 겔 상에서 실행시키고, SYBR로 처리하고, 이중 가닥 DNA를 보이기 위해 488nm에서 가시화하고(도 53a), 형광단의 존재를 나타내기 위해 647nm에서 가시화하였다(도 53b).
실시예 19. dsDNA-647 표지된 압타머 농도 측정
dsDNA-647 표지된 압타머 농도를 260nm에서의 흡광도를 사용하여 측정하였고, 그 결과는 도 54에 나타나 있다. 압타머에 대한 AlexaFluor-647의 접합 효율을 조사하기 위해 형광단 표준 곡선을 사용하여(도 55a), 형광단 농도를 결정하였다(도 55b). 형광단 농도 측정을 사용하여 도 56에 나타낸 바와 같이 표지화 정도를 추정하는 형광단:DNA 비율을 결정하였다.
실시예 20. dsDNA-647 표적 상 결합 및 이미징
표지된 압타머의 표적 결합 및 이미징을 평가하기 위해 에피토프 HHH에 특이적인 dsDNA-647 표지된 압타머를 사용하여 실험을 수행하였다. 도 57a에 나타낸 바와 같이, HHH 펩티드를 마이크로플레이트 표면에 고정하였고 표지된 압타머에 노출시켰다. 도 57b는 HHH 펩티드에 대한 표지된 압타머의 결합을 보여준다. 도 57c는 음성 대조군 펩티드인 MetGluThr에 대한 결합의 결여를 보여준다.
이미징을 평가하기 위해, 표지된 압타머를 도 57d에 나타낸 바와 같이 다양한 농도에서 주문형 20배 대물 표면형광 현미경에서 시각화하였다.
본 발명의 바람직한 실시양태를 여기에 나타내고 기술하였지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 본 명세서 내에 제공된 특정 예에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은 전술한 명세서를 참조하여 기술되었지만, 본원의 실시양태의 기재내용 및 예시는 제한적인 의미로 해석되는 것을 의미하지 않는다. 이제 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 수많은 변형, 변경 및 대체가 가능할 것이다. 또한, 본 발명의 모든 측면은 다양한 조건 및 변수에 의존하는 본원에 제시된 특정 묘사, 구성 또는 상대적 비율에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에 기술된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서 본 발명은 이러한 대안, 수정, 변경 또는 등가물도 포함하는 것으로 생각된다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이들 청구범위 및 그 등가물 범위 내의 방법 및 구조를 포함하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> NAUTILUS BIOTECHNOLOGY, INC. <120> AFFINITY REAGENTS HAVING ENHANCED BINDING AND DETECTION CHARACTERISTICS <130> G8066 <140> PCT/US2021/058851 <141> 2021-11-10 <150> 63/227,080 <151> 2021-07-29 <150> 63/132,170 <151> 2020-12-30 <150> 63/112,607 <151> 2020-11-11 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 1 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 2 Ala Ala Ala Ala Cys 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 3 Cys Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 4 Cys Ala Ala Ala Cys 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 5 Cys Ala Ala Ala Asp 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Arg Gly Glu Ser 1 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 8 atctcgtatg ccgtcttctg cttg 24 <210> 9 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 9 caagcagaag acggcatacg agatcatgct tccccaggga gatggtttgc cggtgggcag 60 gtttagggtc tgctcgggat tgcggaggaa catgcgtcgc aaacgtgtag atctcggtgg 120 tcgccgtatc att 133 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 10 Thr Ala Ala Ala Leu 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 11 Tyr Ala Ala Ala Ser 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 12 Met Ala Ala Ala Thr 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 13 Ala Ala Ala Ala Asp 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 14 Tyr Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 15 Tyr Ala Ala Ala Cys 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 16 Tyr Ala Ala Ala Asp 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target peptide sequence" <400> 17 Tyr Ala Ala Ala Tyr 1 5

Claims (46)

  1. 검출 가능한 프로브(detectable probe)로서,
    (a) 고정 성분(retaining component);
    (b) 표지 성분(label component); 및
    (c) 고정 성분에 부착된 2개 이상의 결합 성분(binding component)을 포함하며,
    검출 가능한 프로브는 결합 파트너에 대한 평형 해리 상수가 결합 파트너에 대한 2개 이상의 결합 성분 중 임의의 것의 평형 해리 상수 미만이거나, 검출 가능한 프로브는 결합 파트너에 대한 해리 속도 상수가 결합 파트너에 대한 2개 이상의 결합 성분 중 임의의 것의 해리 속도 상수 미만인 검출 가능한 프로브.
  2. 제1항에 있어서, 표지 성분이 고정 성분에 커플링되어 있는 검출 가능한 프로브.
  3. 제1항에 있어서, 고정 성분이 핵산을 포함하는 검출 가능한 프로브.
  4. 제3항에 있어서, 핵산이 핵산 오리가미(nucleic acid origami)를 포함하는 검출 가능한 프로브.
  5. 제1항에 있어서, 고정 성분이 형광 나노입자를 포함하는 검출 가능한 프로브.
  6. 제1항에 있어서, 고정 성분에 커플링된 2개 이상의 표지 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브.
  7. 제1항에 있어서, 결합 파트너를 추가로 포함하고, 결합 파트너는 2개 이상의 결합 성분 중 하나의 결합 성분을 통해 검출 가능한 프로브에 결합되는 검출 가능한 프로브.
  8. 제7항에 있어서, 결합 파트너가 고상 지지체에 부착되는 검출 가능한 프로브.
  9. 제8항에 있어서, 결합 파트너가 구조화 핵산 입자(structured nucleic acid particle)를 통해 고상 지지체에 부착되는 검출 가능한 프로브.
  10. 제1항에 있어서, 고정 성분이 2개 이상의 결합 성분 중 제1 결합 성분이 2개 이상의 결합 성분 중 제2 결합 성분과 접촉하는 것을 제한하는 검출 가능한 프로브.
  11. 제1항에 있어서, 고정 성분이 제2 면으로부터 오프셋(offset)된 제1 면을 갖는 3차원 구조를 포함하고, 2개 이상의 결합 성분이 제1 면에 존재하도록 제한되고 제2 면과의 접촉이 제한되는 검출 가능한 프로브.
  12. 제11항에 있어서, 표지 성분이 제2 면에 존재하도록 제한되고 제1 면과의 접촉이 제한되는 검출 가능한 프로브.
  13. 제1항에 있어서, 검출 가능한 프로브가 2개 이상의 표지 성분을 포함하는 검출 가능한 프로브.
  14. 제13항에 있어서, 고정 성분이 제2 면으로부터 오프셋된 제1 면을 갖는 3차원 구조를 포함하고, 2개 이상의 표지 성분이 제1 면에 존재하도록 제한되고 제2 면과의 접촉이 제한되는 검출 가능한 프로브.
  15. 제14항에 있어서, 2개 이상의 결합 성분이 제2 면에 존재하도록 제한되고 제1 면과의 접촉이 제한되는 검출 가능한 프로브.
  16. 제1항에 있어서, 고정 성분이 비드를 포함하는 검출 가능한 프로브.
  17. 제16항에 있어서, 표지 성분이 비드 내에 하나 이상의 형광 모이어티를 포함하는 검출 가능한 프로브.
  18. 다음을 포함하는 분석물 검출 방법:
    (a) 분석물을 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 검출 가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 분석물은 결합 파트너를 포함하는 단계; 및
    (b) 표지 성분으로부터 신호를 획득하여 분석물을 검출하는 단계.
  19. 다음을 포함하는 분석물 검출 방법:
    (a) 분석물을 제1 검출 가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 제1 검출 가능한 프로브는
    (ⅰ) 제1 고정 성분,
    (ⅱ) 표지 성분, 및
    (ⅲ) 고정 성분에 부착된 2개 이상의 결합 성분의 제1 세트를 포함하고, 제1 세트의 결합 성분 중 적어도 하나는 분석물 내 제1 에피토프에 결합하는 단계;
    (b) 제1 검출 가능한 프로브의 표지 성분으로부터 신호를 획득하는 단계;
    (c) 분석물을 제2 검출 가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 제2 검출 가능한 프로브는
    (ⅰ) 제1 고정 성분과 실질적으로 동일한 구조를 포함하는 제2 고정 성분,
    (ⅱ) 표지 성분, 및
    (ⅲ) 고정 성분에 부착된 2개 이상의 결합 성분의 제2 세트를 포함하고, 제2 세트의 결합 성분 중 적어도 하나는 분석물 내 제2 에피토프에 결합하고, 제2 에피토프는 제1 에피토프와 비교하여 상이한 화학 조성을 갖는, 단계; 및
    (d) 제2 검출 가능한 프로브의 표지 성분으로부터 신호를 획득하여 분석물을 검출하는 단계.
  20. 제19항에 있어서, 제1 고정 성분 및 제2 고정 성분이 실질적으로 동일한 구조를 갖는 구조화 핵산 입자를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 실질적으로 동일한 구조가 핵산 오리가미 스캐폴드(nucleic acid origami scaffold)인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 제1 검출 가능한 프로브의 표지 성분이 제2 검출 가능한 프로브의 표지 성분에 대한 구조와 실질적으로 동일한 구조를 포함하는 방법.
  23. 제19항에 있어서, 제1 검출 가능한 프로브의 표지 성분이 제2 검출 가능한 프로브의 표지 성분과 동일한 신호를 생성하는 방법.
  24. 제19항에 있어서, 제1 검출 가능한 프로브의 표지 성분이 제2 검출 가능한 프로브의 표지 성분의 구조와 상이한 구조를 포함하는 방법.
  25. 제19항에 있어서, 제1 검출 가능한 프로브의 표지 성분이 제2 검출 가능한 프로브의 표지 성분과 상이한 신호를 생성하는 방법.
  26. 제19항에 있어서, 단계 (c) 전에 분석물로부터 제1 검출 가능한 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제27항에 있어서, 분석물로부터 제1 검출 가능한 프로브를 제거하는 단계가 제1 검출 가능한 프로브를 절단하는 것을 포함하는 방법.
  28. (a) 결합 성분에 부착된 제1 구조화 핵산 입자를 포함하는 프로브; 및
    (b) 결합 성분에 대한 에피토프에 부착된 제2 구조화 핵산 입자를 포함하는 분석물을 포함하는 조성물로서,
    프로브는 결합 성분과 에피토프의 결합을 통해 분석물에 부착되어 있는 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 프로브가 제1 구조화 핵산 입자에 부착된 표지 성분을 추가로 포함하는 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 제2 구조화 핵산 입자가 고체 지지체에 추가로 부착되어 있는 조성물.
  31. 제28항에 있어서, 제2 구조화 핵산 입자가 어레이 내 부위에 추가로 부착되어 있는 조성물.
  32. 제28항에 있어서, 제1 구조화 핵산 입자가 핵산 오리가미를 포함하는 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 제2 구조화 핵산 입자가 핵산 오리가미를 포함하는 조성물.
  34. 조성물로서,
    (a) 복수의 상이한 프로브로서, 각각의 상이한 프로브는 결합 성분에 부착된 제1 구조화 핵산 입자를 포함하고, 각각의 상이한 프로브는 상이한 결합 성분을 포함하는 프로브; 및
    (b) 복수의 상이한 분석물로서, 각각의 상이한 분석물은 상이한 결합 성분에 대한 에피토프에 부착된 제2 구조화 핵산 입자를 포함하는 분석물을 포함하며,
    상이한 프로브는 복수의 상이한 프로브의 상이한 결합 성분과 복수의 상이한 분석물의 에피토프의 결합을 통해 상이한 분석물에 부착되어 있는 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 제1 구조화 핵산 입자가 상이한 프로브에 대해 실질적으로 동일한 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 제2 구조화 핵산 입자가 상이한 분석물에 대해 실질적으로 동일한 조성물.
  37. 제34항에 있어서, 제1 구조화 핵산 입자가 제2 구조화 핵산 입자와 실질적으로 동일한 조성물.
  38. 제34항에 있어서, 제1 구조화 핵산 입자가 상이한 프로브에 대해 상이한 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 제1 구조화 핵산 입자가 복수의 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 스캐폴드 가닥을 갖는 오리가미를 포함하는 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 스캐폴드 가닥이 상이한 프로브에 대해 동일하고 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가 상이한 프로브 간에 상이한 조성물.
  41. 제34항에 있어서, 제2 구조화 핵산 입자가 상이한 분석물에 대해 상이한 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 제2 구조화 핵산 입자가 복수의 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 스캐폴드 가닥을 갖는 오리가미를 포함하는 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 스캐폴드 가닥이 상이한 분석물에 대해 동일하고 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가 상이한 분석물 간에 상이한 조성물.
  44. 제34항에 있어서, 제1 구조화 핵산 입자가 제2 구조화 핵산 입자와 상이한 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 제1 및 제2 구조화 핵산 입자가 각각 복수의 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 스캐폴드 가닥을 갖는 오리가미를 포함하는 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 스캐폴드 가닥이 제1 및 제2 구조화 핵산 입자에 대해 동일하고 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가 제1 및 제2 구조화 핵산 입자 간에 상이한 조성물.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018353967B2 (en) * 2017-10-23 2024-02-29 Nautilus Subsidiary, Inc. Methods and systems for protein identification
EP4244382A1 (en) * 2020-11-11 2023-09-20 Nautilus Subsidiary, Inc. Affinity reagents having enhanced binding and detection characteristics
US20230070896A1 (en) 2021-09-09 2023-03-09 Nautilus Biotechnology, Inc. Characterization and localization of protein modifications
US20230314324A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Nautilus Subsidiary, Inc. Integrated arrays for single-analyte processes
US20240053333A1 (en) 2022-08-03 2024-02-15 Nautilus Subsidiary, Inc. Chemical modification of antibodies and functional fragments thereof
US20240093270A1 (en) * 2022-08-12 2024-03-21 Nautilus Subsidiary, Inc. Generation and selection of affinity reagents
WO2024059655A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Nautilus Subsidiary, Inc. Characterizing accessibility of macromolecule structures
WO2024072614A1 (en) 2022-09-27 2024-04-04 Nautilus Subsidiary, Inc. Polypeptide capture, in situ fragmentation and identification
WO2024073599A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Nautilus Subsidiary, Inc. Preparation of array surfaces for single-analyte processes

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5695934A (en) 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US20010014668A1 (en) * 1996-08-02 2001-08-16 Cassels Frederick J. Peptides responsive to antibodies against consensus peptide of the CS4-CFA/I family proteins
CA2277159A1 (en) 1997-01-08 1998-07-16 Wolfgang Pieken Bioconjugation of macromolecules
US5888737A (en) 1997-04-15 1999-03-30 Lynx Therapeutics, Inc. Adaptor-based sequence analysis
US20100081134A1 (en) * 1997-07-21 2010-04-01 Mirkin Chad A Bio-barcode based detection of target analytes
US7427678B2 (en) 1998-01-08 2008-09-23 Sigma-Aldrich Co. Method for immobilizing oligonucleotides employing the cycloaddition bioconjugation method
US6255469B1 (en) 1998-05-06 2001-07-03 New York University Periodic two and three dimensional nucleic acid structures
AU2001284899A1 (en) * 2000-08-11 2002-02-25 Qianjin Hu Methods and universal monoclonal antibody array
US20030049626A1 (en) * 2001-08-14 2003-03-13 Milagen, Inc. Antibody-based analysis of matrix protein arrays
CN100354430C (zh) * 2001-09-06 2007-12-12 基因描绘系统有限公司 一种检测样品中靶细胞或病毒的方法
US20030082560A1 (en) * 2001-10-29 2003-05-01 Yingjian Wang Method of making interactive protein arrays
US20040072274A1 (en) * 2002-05-09 2004-04-15 Lebrun Stewart J. System and method for visualization and digital analysis of protein and other macromolecule microarrays
CA2487424C (en) 2002-05-30 2011-01-04 The Scripps Research Institute Copper-catalysed ligation of azides and acetylenes
AU2003282832B2 (en) 2002-10-15 2009-09-10 Abmetrix, Inc. Sets of digital antibodies directed against short epitopes, and methods using same
US7259258B2 (en) 2003-12-17 2007-08-21 Illumina, Inc. Methods of attaching biological compounds to solid supports using triazine
EP2789383B1 (en) 2004-01-07 2023-05-03 Illumina Cambridge Limited Molecular arrays
WO2006085921A2 (en) 2004-06-10 2006-08-17 New York University Polygonal nanostructures of polynucleic acid multi-crossover molecules and assembly of lattices based on double crossover cohesion
GB0507835D0 (en) 2005-04-18 2005-05-25 Solexa Ltd Method and device for nucleic acid sequencing using a planar wave guide
US20090018028A1 (en) 2005-05-12 2009-01-15 Stuart Lindsay Self-Assembled Nucleic Acid Nanoarrays and Uses Therefor
US7842793B2 (en) 2005-06-14 2010-11-30 The California Institute Of Technology Methods of making nucleic acid nanostructures
EP2620510B2 (en) 2005-06-15 2020-02-19 Complete Genomics Inc. Single molecule arrays for genetic and chemical analysis
US7514952B2 (en) 2005-06-29 2009-04-07 Altera Corporation I/O circuitry for reducing ground bounce and VCC sag in integrated circuit devices
US7329860B2 (en) 2005-11-23 2008-02-12 Illumina, Inc. Confocal imaging methods and apparatus
US20070218503A1 (en) 2006-02-13 2007-09-20 Mitra Robi D Methods of polypeptide identification, and compositions therefor
US8241573B2 (en) 2006-03-31 2012-08-14 Illumina, Inc. Systems and devices for sequence by synthesis analysis
EP2484781B1 (en) * 2006-08-01 2017-08-23 Applied Biosystems, LLC Detection of analytes and nucleic acids
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
EP2639578B1 (en) 2006-12-14 2016-09-14 Life Technologies Corporation Apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US9102520B2 (en) 2008-08-13 2015-08-11 California Institute Of Technology Nanocomposite structures and related methods and systems
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US8309306B2 (en) * 2008-11-12 2012-11-13 Nodality, Inc. Detection composition
US9206394B2 (en) * 2010-02-03 2015-12-08 The University Of Tokyo Method for reconstructing immune function using pluripotent stem cells
WO2012061719A2 (en) * 2010-11-04 2012-05-10 President And Fellows Of Harvard College Dna origami devices
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
EP2739638B1 (en) 2011-08-05 2017-10-04 President and Fellows of Harvard College Compositions and methods relating to nucleic acid nano-and micro-technology
US9164053B2 (en) 2011-09-26 2015-10-20 The Regents Of The University Of California Electronic device for monitoring single molecule dynamics
WO2013119676A1 (en) 2012-02-06 2013-08-15 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Novel dna-origami nanovaccines
WO2013148186A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 President And Fellows Of Harvard College Lipid-coated nucleic acid nanostructures of defined shape
CA3138752C (en) 2012-04-03 2024-02-06 Illumina, Inc. Integrated optoelectronic read head and fluidic cartridge useful for nucleic acid sequencing
CN104781416B (zh) 2012-07-24 2017-07-04 哈佛学院院长及董事 核酸纳米结构的自装配
US9975916B2 (en) 2012-11-06 2018-05-22 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods relating to complex nucleic acid nanostructures
AU2013344340B2 (en) 2012-11-19 2019-09-19 Pacific Biosciences Of California, Inc. Digital analysis of molecular analytes using single molecule detection
US10829816B2 (en) 2012-11-19 2020-11-10 Apton Biosystems, Inc. Methods of analyte detection
WO2015017586A1 (en) * 2013-07-30 2015-02-05 President And Fellows Of Harvard College Quantitative dna-based imaging and super-resolution imaging
JP2015096846A (ja) * 2013-10-10 2015-05-21 シスメックス株式会社 被検物質検出方法、蛍光検出方法、並びにそれらの検出方法に用いる被検物質検出装置、蛍光検出装置
US9275871B2 (en) 2014-01-09 2016-03-01 Micron Technology, Inc. Nanostructures having low defect density and methods of forming thereof
TWI621584B (zh) 2014-05-22 2018-04-21 哈佛大學校長及研究員協會 可縮放核酸奈米製造技術
SG11201700348VA (en) 2014-07-15 2017-02-27 Illumina Inc Biochemically activated electronic device
CN117442748A (zh) 2014-10-02 2024-01-26 希望之城公司 多价中间表位、中间表位结合抗体及其用途
EP3237890A4 (en) 2014-12-16 2018-11-07 President and Fellows of Harvard College Triggered assembly of metafluorophores
AU2015364602B2 (en) 2014-12-18 2021-12-09 The Regents Of The University Of California Detection of nucleic acid polymerase conformational changes using a nanotube
US10550145B2 (en) 2015-03-07 2020-02-04 President And Fellows Of Harvard College Single-stranded DNA nanostructures
US10781446B2 (en) * 2015-03-09 2020-09-22 University Of Kentucky Research Foundation RNA nanoparticle for treatment of gastric cancer
US9330932B1 (en) 2015-03-31 2016-05-03 Micron Technology, Inc. Methods of fabricating features associated with semiconductor substrates
US9466504B1 (en) 2015-03-31 2016-10-11 Micron Technology, Inc. Methods of fabricating features associated with semiconductor substrates
US9881786B2 (en) 2015-04-02 2018-01-30 Micron Technology, Inc. Methods of forming nanostructures using self-assembled nucleic acids, and nanostructures thereof
JP6692831B2 (ja) 2015-05-12 2020-05-13 イラミーナ インコーポレーテッド 核酸をシーケンシングするための電界効果装置および方法
EP3314245A4 (en) 2015-06-25 2019-02-27 Roswell Biotechnologies, Inc BIOMOLECULAR SENSORS AND ASSOCIATED METHODS
US10125391B2 (en) 2015-08-06 2018-11-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Single molecule nanoFET sequencing systems and methods
US10597767B2 (en) 2016-02-22 2020-03-24 Roswell Biotechnologies, Inc. Nanoparticle fabrication
KR20230047506A (ko) 2016-05-02 2023-04-07 엔코디아, 인코포레이티드 암호화 핵산을 사용한 거대분자 분석
US9829456B1 (en) 2016-07-26 2017-11-28 Roswell Biotechnologies, Inc. Method of making a multi-electrode structure usable in molecular sensing devices
US11168320B2 (en) 2016-08-09 2021-11-09 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Structure assisted directed evolution of multivalent aptamers
EP3548652B1 (en) 2016-12-01 2024-04-03 Nautilus Subsidiary, Inc. Methods of assaying proteins
US10508296B2 (en) 2017-04-25 2019-12-17 Roswell Biotechnologies, Inc. Enzymatic circuits for molecular sensors
CN111566261A (zh) 2017-08-18 2020-08-21 诺迪勒思生物科技公司 选择结合试剂的方法
US11125748B2 (en) 2017-09-01 2021-09-21 University Of British Columbia Method for organizing individual molecules on a patterned substrate and structures assembled thereby
US11391734B2 (en) * 2017-09-25 2022-07-19 California Institute Of Technology Surface-immobilized bistable polynucleotide devices for the sensing and quantification of molecular events
US11214795B2 (en) 2017-09-25 2022-01-04 California Institute Of Technology Bistable polynucleotide devices for the sensing and quantification of molecular events
US11721412B2 (en) 2017-10-23 2023-08-08 Nautilus Subsidiary, Inc. Methods for identifying a protein in a sample of unknown proteins
AU2018353967B2 (en) 2017-10-23 2024-02-29 Nautilus Subsidiary, Inc. Methods and systems for protein identification
EP3704246A4 (en) 2017-10-31 2021-08-11 Encodia, Inc. PROCEDURES AND KITS USING NUCLEIC ACID ENCODING AND / OR MARKING
WO2019089846A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Encodia, Inc. Methods and compositions for polypeptide analysis
EP3704249A4 (en) 2017-10-31 2021-10-27 Encodia, Inc. ANALYSIS KITS USING A NUCLEIC ACID CODING AND / OR LABEL
US11162192B2 (en) 2017-12-01 2021-11-02 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Materials and methods relating to single molecule arrays
KR20200105497A (ko) 2017-12-29 2020-09-07 노틸러스 바이오테크놀로지, 인크. 단백질 식별을 위한 디코딩 접근법
CN112236528A (zh) 2018-04-04 2021-01-15 诺迪勒思生物科技公司 产生纳米阵列和微阵列的方法
GB201807409D0 (en) 2018-05-04 2018-06-20 Oxford Nanoimaging Ltd Assay
US20210239705A1 (en) 2018-06-06 2021-08-05 Nautilus Biotechnology, Inc. Methods and applications of protein identification
DE102018124984A1 (de) * 2018-10-10 2020-04-16 Friedrich-Schiller-Universität Jena Verfahren und Vorrichtung zur hochaufgelösten Fluoreszenzmikroskopie
JP2022513092A (ja) 2018-11-20 2022-02-07 ノーティラス・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド 親和性試薬の設計および選択
CA3135206A1 (en) * 2019-04-29 2020-11-05 Pierre Indermuhle Methods and systems for integrated on-chip single-molecule detection
US20220339181A1 (en) 2019-06-21 2022-10-27 Tilibit Nanosystems Gmbh Conditionally switchable nanostructure
US11708601B2 (en) * 2019-09-06 2023-07-25 Carnegie Mellon University Micromechanical DNA origami force sensor
IL293913A (en) 2019-10-16 2022-08-01 Illumina Cambridge Ltd Whisper systems and methods of many subjects
WO2021087402A1 (en) 2019-10-30 2021-05-06 Nautilus Biotechnology, Inc. Flow cell systems and methods
US20220333215A1 (en) * 2020-03-31 2022-10-20 The Hopes Institute Methods and compositions for detecting co-infection with sars-cov-2 and influenza a virus and/or influenza b virus
EP4244382A1 (en) * 2020-11-11 2023-09-20 Nautilus Subsidiary, Inc. Affinity reagents having enhanced binding and detection characteristics
AU2022232933A1 (en) * 2021-03-11 2023-09-07 Nautilus Subsidiary, Inc. Systems and methods for biomolecule retention
WO2023049073A1 (en) * 2021-09-22 2023-03-30 Nautilus Biotechnology, Inc. Methods and systems for determining polypeptide interactions

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