CN104781416B

CN104781416B - 核酸纳米结构的自装配

Info

Publication number: CN104781416B
Application number: CN201380047439.3A
Authority: CN
Inventors: 尹鹏; W·M·施; 柯勇刚; L·L·洪
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2012-07-24
Filing date: 2013-07-24
Publication date: 2017-07-04
Anticipated expiration: 2033-07-24
Also published as: EP2877600A1; EP2877600B1; HK1210628A1; WO2014018675A1; JP2015530874A; CN104781416A; JP6596336B2; KR20160073936A; US20150218204A1; US10604543B2

Abstract

本发明涉及具有受控的大小和形状且由多种寡核苷酸组成的核酸结构的合成。结构至少部分通过单链寡核苷酸的自装配形成。在所得的结构中每种寡核苷酸的位置是已知的。相应地，结构可以用特异性进行修饰。

Description

核酸纳米结构的自装配

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309和于2013年3月6日提交的美国临时申请号61/773,715的利益，所述美国临时申请各自通过引用全文并入本文。

政府支持

本发明在由美国国立卫生研究院授予的1DP2OD004641和1DP2OD007292，在由海军研究办公室(Office of Naval Research)授予的N000014091118和N000141010827，在由美国陆军研究处的多学科大学研究计划(Army Research Office MultidisciplinaryUniversity Research Initiative)授予的W911NF-12-1-0420和W911NF1210238，在由美国海军研究局青年研究奖(Office of Naval Research Young Investigator Program)授予的N000141110914，以及由美国国家科学基金会(National Science Foundation)授予的CCF1054898下，由政府支持进行。政府在本发明中拥有一定权利。

发明领域

本发明的方面和实施方案涉及核酸纳米技术领域。

发明背景

信息聚合物例如核酸(例如DNA和RNA)的自装配提供了用于构建尖端的合成分子纳米结构和装置的有效方法(N.C.Seeman，Nature421，427(2003))。用于设计自装配的核酸纳米结构的基本原理是核酸链中的序列互补性被这样编码，从而使得通过互补区段配对，核酸链在适当的生理条件下自组构成预定的纳米结构。根据该基本原理(N.C.Seeman，J.Theor.Biol.99，237(1982))，研究者已制备多种合成核酸纳米结构(N.C.Seeman(2003)；W.M.Shih，C.Lin，Curr.Opin.Struct.Biol.20，276(2010))，例如晶格(E.Winfree，等人Nature394，539(1998)；H.Yan，等人Science 301，1882(2003)；H.Yan，等人Proc.Natl.Acad.of Sci.USA 100，8103(2003)；D.Liu，等人J.Am.Chem.Soc.126，2324(2004)；P.W.K.Rothemund，等人PLoS Biology 2，2041(2004))、条带(S.H.Park，等人NanoLett.5，729(2005)；P.Yin，等人Science 321，824(2008))、管(H.Yan Science(2003)；P.Yin(2008))、具有限定形状的有限的二维(2D)和三维(3D)物体(J.Chen，N.C.Seeman，Nature 350，631(1991)；P.W.K.Rothemund，Nature 440，297(2006)；Y.He，等人Nature452，198(2008)；Y.Ke，等人Nano.Lett.9，2445(2009)；S.M.Douglas，等人Nature 459，414(2009)；H.Dietz，等人Science 325，725(2009)；E.S.Andersen，等人Nature 459，73(2009)；T.Liedl，等人Nature Nanotech.5，520(2010)；D.Han，等人Science 332，342(2011))和宏观晶体(J.P.Meng，等人Nature 461，74(2009))。已平行构建许多动态装置(J.Bath，A.J.Turberfield Nature Nanotech.2，275(2007))，包括镊子(B.Yurke，等人Nature 406，605(2000))、开关(H.Yan，等人Nature415，62(2002))、步行器(walkers)(W.B.Sherman，N.C.Seeman，Nano Letters 4，1203(2004)；P.Yin，等人Nature 451，318(2008)；T.Omabegho，等人Science 324，67(2009))和电路(P.Yin(2008)；G.Seelig，等人Science 314，1585(2006)；L.Qian，E.Winfree，Science 332，1196(2011))。另外，因为DNA和RNA可以以技术上相关方式与其他功能分子相互作用，所以合成的核酸纳米结构具有多种应用的希望。研究者使用合成的DNA/RNA纳米结构和装置来指导功能材料排列(EA.Aldaye，等人Science 321，1795(2008))，开发生物成像探针(H.M.T.Choi，等人NatureBiotechnol.28，1208(2010))，组构且调节活细胞中的分子途径(S.Venkataraman，等人Proc.Natl Acad.Sci.USA 107，16777(2010)；C.J.Delebecque，等人Science 333，470(2011))，并且促进核磁共振(NMR)蛋白质纳米结构测定(M.J.Berardi，等人Nature 476，109(2011))。

用于装配兆道尔顿纳米级别2D(P.W.K.Rothemund(2006))和3D形状(S.M.Douglas(2009)；E.S.Andersen(2009)；D.Han(2011))的有效方法是DNA折纸，其中长“支架”链经由与短“订书针”链的相互作用而折叠成预定的形状。长支架链组分(通常为病毒基因组DNA)的要求已限制DNA折纸纳米结构的序列和材料选择。此外，每种形状通常要求新支架路径选择且因此要求完全不同组的订书针链。

发明概述

本发明一般提供了用于具有已知的、预定的和因此受控的大小、形状和复杂性的核酸结构的自装配方法，以及核酸结构本身。更具体而言，在多个方面，本发明提供了使用限定的和预定的寡核苷酸的亚组用于产生复杂核酸结构的模块化方法，而无需DNA折纸方法中必需的较长支架链。本发明的核酸结构通常在一步退火反应中，以序列特异性方式通过局部相互作用而自装配。核酸结构和用于产生此类结构的单链寡核苷酸这样设计，从而使得在结构中的每个位置处的寡核苷酸和因此的核苷酸序列是已知的。该认知促进以限定的和受控的方式的结构修饰。

本发明部分提供了使用在已知位置处由已知寡核苷酸构成的具有所需高度、深度和宽度的3D画布作为理论起点，用于制备具有任意预定的形状和大小的三维(3D)核酸结构的方法。通过仅选择构成整个画布的寡核苷酸的亚组，最终用户可以生成事实上任何大小、形状和复杂性的核酸结构。

形成核酸结构的寡核苷酸通常由结构域组成。通常，一种寡核苷酸中的结构域与其他寡核苷酸中的结构域杂交。一些寡核苷酸是4结构域寡核苷酸，并且每个结构域与分开寡核苷酸中的结构域杂交。通过互补结构域的杂交形成双链体，每个结构域位于一种邻近寡核苷酸上(一种寡核苷酸上的一个结构域与另一种附近寡核苷酸中的另一个结构域结合)。通常，通过互补结构域的杂交形成大约90°二面角，每个结构域位于物理上分开的寡核苷酸上。本发明的核酸结构由核酸双链体(即，一对杂交或部分杂交的寡核苷酸)组成，其中邻近双链体通过单一磷酸键连接(即交叉)。通常，多种单链寡核苷酸退火，以形成邻近双链体。在一些情况下，在自装配期间，4结构域寡核苷酸采用螺旋构象，从而使得两个(四个中的)结构域位于一个双链体中，并且剩余两个结构域位于邻近双链体中。

本发明还提供了用于生成核酸结构的单链寡核苷酸。提供了不同的多种单链寡核苷酸，其中这些多种的性质和组成取决于所需结构的设计，包括形状、大小和复杂性。如本文更详细地说明的，这些多种通常包含2结构域或4结构域寡核苷酸(尽管，它们可以含有3个结构域或超过4个结构域)。在一些情况下，结构域具有相等核苷酸长度(例如8nt长度)。寡核苷酸的每个结构域可以是独特的(即，它可以具有每种寡核苷酸仅出现一次，或每种核酸结构仅出现一次的核苷酸序列)，或寡核苷酸中的仅一个、两个或三个或更多个结构域可以是独特的。核酸结构中的每种单链寡核苷酸可以是独特的(即，它可以每种结构仅出现一次)，或它可以出现一次、两次、三次或甚至更频繁。应当理解即使寡核苷酸的结构域中的一个或多个不是独特的，寡核苷酸在结构内也可以是独特的。

本发明的单链寡核苷酸和核酸结构在性质上是模块的。本发明的方法允许通过包括、排除和/或修饰(包括替换)已知寡核苷酸的亚组来制备多种形状的核酸结构。本文描述的方法考虑核酸结构彼此的模块装配，例如通过使此类结构基于序列特异性彼此退火。在这些实施方案的一些中，彼此退火的核酸结构可以共享共同形状(例如两者均可以为立方体或抽象形状)。该方法还考虑通过使用接头使两种或更多种核酸结构彼此连接的核酸结构，所述接头可以整合至或不整合至核酸结构。在这些实施方案中，彼此连接的核酸结构可以具有相同或不同形状。

本文还考虑了核酸结构的合成方法。合成方法可以包括在单一容器中组合多种已知单链寡核苷酸，并且允许寡核苷酸在合适条件下以预定的方式自装配。类似地，两种或更多种核酸结构可以在单一容器中组合，并且允许基于核苷酸序列互补性在合适条件下以预定的方式自装配，从而形成更大的核酸结构。

因此，在一个方面，本发明提供了包含各自包含至少四个结构域的两种单链寡核苷酸的核酸结构，所述结构域排列为通过两个互补结构域(在寡核苷酸各自中的一个)的杂交形成大约90°二面角。

在一些实施方案中，结构包含各自包含至少四个结构域的五种单链寡核苷酸，其中所述单链寡核苷酸中的四种与第五种单链寡核苷酸的分开结构域杂交，从而形成在每对杂交寡核苷酸之间的大约90°二面角。

在一些实施方案中，至少四个结构域具有相等的核苷酸长度。在一些实施方案中，每种寡核苷酸包含两个或更多个独特结构域。在一些实施方案中，至少一个结构域包含聚胸腺嘧啶(T)寡核苷酸。在一些实施方案中，至少两个结构域包含聚胸腺嘧啶(T)寡核苷酸。在一些实施方案中，每个结构域长度为8个核苷酸。在一些实施方案中，核酸结构进一步包含单链2结构域寡核苷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸是DNA寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是交联的。

在一些实施方案中，结构包含100、500或1000种单链寡核苷酸。在一些实施方案中，所有单链寡核苷酸在序列中都是独特的。在一些实施方案中，所有结构域在序列中都是独特的。在一些实施方案中，除了聚T结构域之外的所有结构域在序列中都是独特的。在另一个方面，本发明提供了多种前述核酸结构中的任一种。在一些实施方案中，核酸结构杂交以形成3D结构。在一些实施方案中，3D结构通过x方向中的“x”螺旋、y方向中的“y”螺旋和z方向中的“z”碱基(或碱基对)限定。在一些实施方案中，3D结构是长方体结构、圆柱体结构、片层、蜂窝结构或六角形晶格结构。在一些实施方案中，3D结构是Z晶体、ZX晶体、Y晶体、X晶体或XY晶体。

在一些实施方案中，多种结构中的每种单链寡核苷酸是独特的。

在另一个方面，本发明提供了包含多种前述核酸结构中的任一种的组合物。

在另一个方面，本发明提供了包含在容器中使各自包含至少四个结构域的多种独特的单链寡核苷酸退火的方法，所述结构域排列为通过两个互补结构域(各自在物理上分开的寡核苷酸中)的杂交形成大约90°二面角。在一些实施方案中，多种单链寡核苷酸包含4结构域和2结构域寡核苷酸。

在一些实施方案中，单链寡核苷酸以大约等摩尔的浓度存在。在一些实施方案中，退火通过经过一段时间的温度转变而发生。在一些实施方案中，温度转变是温度中从高温到约室温的变化。在一些实施方案中，温度转变是温度中从约90℃到约室温的变化。

在一些实施方案中，退火经过约12-24小时的时期发生。在一些实施方案中，寡核苷酸长度为至少32个核苷酸。在一些实施方案中，每个结构域长度为8个核苷酸。

在一些实施方案中，单链寡核苷酸是DNA寡核苷酸。在一些实施方案中，单链DNA寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。

在另一个方面，本发明提供了包括提供作为N_x×N_y×N_z体素排列的单链寡核苷酸的三维(3D)计算机生成的画布，其中N为包含来自分开的单链寡核苷酸的两个互补杂交结构域的单个8bp区域，所述两个互补杂交结构域在所述杂交后形成大约90°二面角，X是沿3D画布的x轴的任何数目，Y是沿3D画布的y轴的任何数目，并且Z是沿3D画布的z轴的任何数目；从3D计算机生成的画布中去除一个或多个体素，以产生所需形状和/或大小的3D核酸结构；并且鉴定3D核酸结构装配所需的单链寡核苷酸亚组。

在另一个方面，本发明提供了组合物，其包括包含与第二种核苷酸杂交的至少四个结构域的第一种寡核苷酸，其中所述第二种寡核苷酸在第一种寡核苷酸的四个结构域之一处杂交，从而形成在第一种和第二种寡核苷酸之间的90°二面角。

在一些实施方案中，第三种寡核苷酸在第一种寡核苷酸的剩余结构域之一处与第一种寡核苷酸杂交，从而形成在第一种和第三种寡核苷酸之间的90°二面角。在一些实施方案中，第四种寡核苷酸在第一种寡核苷酸的剩余结构域处与第一种寡核苷酸杂交，从而形成在第一种和第四种寡核苷酸之间的90°二面角。在一些实施方案中，各自来自物理上分开的寡核苷酸的两个互补结构域的杂交产生双螺旋。在一些实施方案中，第二种、第三种和第四种寡核苷酸由2个结构域、3个结构域、4个结构域或超过4个结构域组成。在一些实施方案中，第二种、第三种和第四种寡核苷酸各自与一种、两种、三种或更多种寡核苷酸杂交，从而形成在杂交的寡核苷酸之间的90°二面角。

应当理解前述概念和下文更详细地讨论的另外概念(条件是此类概念不会互相矛盾)的所有组合均视为本文公开的本发明主题的一部分。特别地，在本公开内容结束时出现的请求保护的主题的所有组合均视为本文公开的本发明主题的一部分。还应当理解还可以在通过引用并入的任何公开内容中出现的本文特别采用的术语应符合与本文公开的特定概念最一致的含义。

附图简述

应当理解附图不一定按比例，相反重点在于一般举例说明本文讨论的多种概念。

图1A是32核苷酸4结构域单链DNA寡核苷酸(在本文中也可互换地称为DNA“嵌段”或DNA“砖块(brick)”)的示意图。每个结构域长度为8个核苷酸。连接的结构域2和结构域3是“头结构域”；结构域1和结构域4是“尾结构域”。图1B是描述DNA嵌段及其结合相互作用的两种模型的示意图。图1C是分子模型的示意图，所述分子模型显示6H(helix)×6H×48B(bp)长方体三维DNA纳米结构的螺旋结构。每条链具有独特序列。插图显示一对X链和Y链。图1D是6H×6H×48B-长方体的模型的示意图。每个砖块具有独特序列。在每层的边界处存在半砖块(即2结构域寡核苷酸)。图1E是通过DNA砖块自装配的6H×6H×48B-长方体的示意图。因为每个砖块的序列独特性，所以砖块在自装配期间不可互换。使用6H×6H×48B作为3D“分子画布”，可以使用砖块的亚组构建更小的形状。图1F是由大的10×10×10体素“3D画布”设计且装配的复杂的任意3D形状的示意图。每个体素代表通过例如两种单链寡核苷酸的碱基配对形成的4结构域寡核苷酸的单个结构域(例如8核苷酸结构域)的双链体。

图2A是DNA嵌段纳米结构的自装配的一步热退火示意图。图2B显示关于6H×10H×128B纳米结构的琼脂糖凝胶电泳的图像。纳米结构在下述条件下自装配：24小时或72小时退火坡度(annealing ramp)，每种DNA链100nM或200nM，以pH 7.9的0.5×TE缓冲液，以10、20、30、40、50、60、70或80mM的MgC1₂浓度。对于每种琼脂糖凝胶，泳道M显示1kb梯状条带，泳道1-8显示与渐增MgC1₂浓度退火的6H×10H×128B结构。产物条带(由灰色箭头指出)与3kb标记条带(由黑色箭头指示)相比较，以估计每种条件的自装配得率。当200nM(每条链)链在40mM MgC1₂下退火72小时时，达到最大得率。图2C显示比较未纯化的6H×10H×128B结构和纯化的6H×10H×128B结构的琼脂糖凝胶电泳的图像。泳道M显示1kb梯状条带，泳道1显示在图2B和图2C中所示的最佳条件下退火的未纯化的6H×10H×128B结构。泳道2显示纯化的6H×10H×128B结构。灰色箭头指向6H×10H×128B产物条带。图2D显示纯化的6H×10H×128B结构的透射电子显微镜检查(TEM)图像。更高放大率的图像显示分别对应于6H×10H×128B的X-Y平面、X-Z平面和Y-Z平面投影的完整结构(在本文中也称为“颗粒”)的三个视图。计算机生成的投影视图显示在高放大率TEM图像的右侧。图2E显示多个维度的3D DNA嵌段纳米结构的示意性设计。图2F显示图2E中的3D DNA嵌段纳米结构的TEM图像。图2G显示关于3D DNA嵌段纳米结构的琼脂糖凝胶电泳的图像。对于每组纳米结构，泳道M显示1kb梯状条带；其他泳道由匹配其在图2E中的设计的编号标记。提取产物条带(由灰色箭头指示)用于纯化和TEM成像。

图3A是10体素×10体素×10体素三维画布的示意图。图3B是通过从3D画布中(在这种情况下，从内部)去除不需要的体素而设计的靶核酸结构的示意图。图3C是显示形成所需结构/形状所需的计算机生成的寡核苷酸链的列表。通过计算机程序分析结构，所述计算机程序识别剩余体素且生成必需寡核苷酸列表。液体处理自动机随后混合每种形状的链。图3D显示通过琼脂糖凝胶电泳(左)和TEM成像(右)表征的，在退火后的纳米结构图像。泳道M显示1kb梯状条带。主要产物条带由箭头指示。图3E显示多种示例纳米结构(具有特定形状)的图像。关于每种结构的上部图像描绘3D模型，随后为下部通过计算机生成的投影视图。由使用TEM和原始TEM图像显现的6种不同结构/颗粒对图像求平均值。一些结构用另外的透明3D视图描绘，其突出显示缺失的体素(即，缺失的寡核苷酸结构域)。用于产生图3E的100种不同核酸结构的个别寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.6842-11296(即分别为链0-4454)。(还参见通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表14。)表2显示对于每种形状使用的链总数目和每条链的列表(圆括号内的)。(还参见于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表15。)

图4A是与去除的下层具有交叉的图1中所示的6H×6H×64B结构上部的DNA链的示意图。图4B显示30H×1H×126B结构的TEM图像。右上插图显示设计的模型。右下插图含有纳米结构的更高放大率图像。图4C显示图4B中的30H×1H×126B结构的原子力显微镜检查(AFM)图像。插图含有结构的更高放大率图像。图4D是设计用于形成蜂窝晶格3D DNA纳米结构的四类链的示意图。图4E是84碱基对3D纳米结构的链图解的示意图。右下图像描绘成环的螺旋束的放大图像。图4F显示6H×6H×84B-HC(蜂窝晶格)3D DNA纳米结构的TEM图像。插图显示结构/颗粒的不同投影的放大图像。图4G是设计用于形成蜂窝晶格3D DNA纳米结构的两类链的示意图。图4H是54bp 3D纳米结构的链图解的示意图。右下图像描绘成环的螺旋束的放大图像。链颜色匹配图4D中所示的那些。图4I显示6H×7H x108B-HL(蜂窝晶格)3DDNA纳米结构的TEM图像。插图显示结构/颗粒的不同投影的放大图像。

图5A和5B显示区分DNA砖块内的每个结构域的样模型。图5A显示DNA砖块可以基于其方向指定为北砖块、西砖块、南砖块或东砖块。接头指示3'末端。图5B显示经由两个互补的8核苷酸结构域杂交而相互作用的两个砖块。图5C是图6中的4H×4H×64B-长方体的样模型。每个砖块具有如由不同颜色指示的独特序列。在Z+方向中，DNA砖块在每层内具有相同方向；DNA砖块沿Z+方向与每个相继层逆时针方向旋转90°。

图6A-6F显示DNA三维纳米结构的链图解。图6A显示4H×4H×64B-长方体3D纳米结构(或4体素×4体素×8体素)的圆柱体模型。每个体素代表通过一对X砖块和Y砖块的碱基配对形成的8碱基对双链体。图6B和6C显示3D链图解。每条链具有它的独特序列。图6D和6E显示以由我们定制的程序使用的caDNAno形式的螺旋和链图解。图6D显示从Z方向往下看的X-Y横截面。图E显示所有链的详细链图解。列中的数目代表螺旋。在顶部和底部处的数目指示沿Z轴的碱基对位置。X砖块由深灰色线表示，并且Y砖块由浅灰色线表示。箭头指示链的3'末端。图6F显示所有X砖块和Y砖块的3D链图解。

图7A-7F显示在X砖块和Y砖块之间的连接。图7A显示32核苷酸DNA砖块。图7B显示代表相同32nt链的另一个图。每个8核苷酸区段标记为A、B、C或D。图7C显示在X砖块与其四个附近Y砖块之间的相互作用。互补性通过相似颜色和相关符号指示。例如，区段A与区段A*互补；两个区段还通过匹配颜色显示。图7D显示X砖块，并且它的四个附近Y砖块紧密接近显示。图7E显示球棒模型，显示X砖块与其四个附近Y砖块之间的连接。它们形成四面体结构，其中X砖块在中心，并且四个Y砖块各自占据一个顶点。图7F显示DNA链大群体的连接模式类似菱形晶格。

图8A-8C显示具有随机序列和设计的序列的6H×6H×64B-长方体的自装配。图8A显示用于该实验的6H×6H×64B结构。所有样品均使用72小时退火方案进行自装配。图8B显示测定具有随机序列设计的6H×6H×64B结构的自装配的琼脂糖凝胶。泳道M显示1kb梯状条带。泳道1至泳道6显示以200nM浓度与10、20、30、40、50、60mM MgCl₂自装配的6H×6H×64B。将20μL样品装载到从1到6的每个泳道内。图8C显示测定具有设计的序列的6H×6H×64B的自装配的琼脂糖凝胶。泳道M显示1kb梯状条带。泳道1至泳道6显示以200nM浓度与10、20、30、40、50、60mM MgCl₂自装配的6H×6H×64B。将20μL样品装载到从1到6的每个泳道内。

图9A-9C显示48核苷酸边界链设计。图9A显示3D结构的5H×5H×48B圆柱体模型。图9B显示Y1层含有五个螺旋-X1、X2、X3、X4、X5。仅显示Y1层中的X砖块。在边界上的一些链(i、ii、iii、iv)形成短的16核苷酸边界链。图9C显示这些短的16核苷酸边界链中的大多数可以与其左侧上的32核苷酸链连接，以形成48核苷酸边界链。

图10A-10C显示具有48核苷酸边界链和不含边界链的6H×6H×64B-长方体的自装配。图10A显示用于测试16核苷酸段边界链和48核苷酸长边界链的6H×6H×64B结构。使用16核苷酸段边界链的设计指定为6H×6H×64B-S。用于产生本发明的6H×6H×64B-S核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.1-78、157-225和295-336。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表1。)使用48核苷酸边界链的设计指定为6H×6H×64B。用于产生本发明的6H×6H×64B核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.79-156和226-294。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表1。)所有样品均使用3天退火方案自装配。图10B显示测定6H×6H×64B-S结构的自装配的琼脂糖凝胶。泳道M显示1kb梯状条带。泳道1至泳道8显示以100nM浓度与10、20、30、40、50、60、70、80mM MgCl₂自装配的6H×6H×64B-S结构。泳道9至泳道16显示以200nM浓度与10、20、30、40、50、60、70、80mM MgCl₂自装配的6H×6H×64B-S结构。将20μL样品装载到从1到16的每个泳道内。图10C显示测定6H×6H×64B结构的自装配的琼脂糖凝胶。泳道M显示1kb梯状条带。泳道1至泳道8显示以100nM浓度与10、20、30、40、50、60、70、80mM MgCl₂自装配的6H×6H×64B结构。泳道9至泳道16显示以200nM浓度与10、20、30、40、50、60、70、80mM MgCl₂自装配的6H×6H×64B结构。将20μL样品装载到从1到16的每个泳道内。

图11显示基于琼脂糖凝胶电泳的6H×10H×128B结构的得率分析。200nM每条链使用72小时退火方案且在具有10、20、30、40、50、60、70、80mM MgCl₂的0.5×Tris缓冲液中自装配，使用72小时退火坡度。将10μL样品装载到每个泳道内。泳道M显示1kb梯状条带。左侧上的浅灰色框中的条带指示对应于60ng DNA的3000bp梯状条带。该条带用作标准以测量产物的得率。在40mM MgCl₂时形成的产物条带在框内标记。在每个产物条带下，显示产物条带的绝对质量值和得率百分比两者。

图12A-12C显示基于TEM图像，纯化的6H×10H×128B结构的琼脂糖凝胶电泳的得率分析。图12A是纯化的6H×10H×128B的代表性TEM图像。中灰色圆圈内的颗粒分类为没有可见缺陷的“良好”颗粒。浅灰色/白色圆圈内的颗粒/结构分类为具有较小缺陷的“较小缺陷”颗粒。深灰色圆圈内的颗粒分类为具有较大缺陷或甚至破坏的“较大缺陷”颗粒。图12B显示纯化的6H×10H×128B的“良好”、“较小缺陷”和“较大缺陷”颗粒的例子。图12C显示具有在“良好”、“较小缺陷”和“较大缺陷”下的数目的得率的数据，指示计数的颗粒数。

图13A-13C显示关于经修饰的3D结构的设计策略。图13A显示5H×5H×48B 3D结构的圆柱体模型。每个体素为8个碱基对。图13B显示使用原始策略设计的5H×5H×48B结构的X1层。仅显示X1层中的Y砖块。注意应用48核苷酸边界链(图10)。箭头和星号(*)指向其中去除交叉用于生成经修饰的形式的位置。图13C显示使用经修饰的设计的5H×5H×48B结构的X1层。与原始设计相比较，去除四个交叉，并且新链(i、ii、iii、iv、v)通过将位于相同双链体中的链对合并在一起而掺入。

图14A和14B显示6H×10H×128B-M结构的琼脂糖凝胶和TEM得率。图14A显示6H×10H×128B-M结构的琼脂糖凝胶测定法。泳道1显示作为对照样品的6H×10H×128B结构。泳道2显示6H×10H×128B-M结构。两种样品均在相同条件下退火(200nm/链，具有40mM MgCl₂的0.5×Tris缓冲液，72小时退火坡度)。6H×10H×128B-M设计生成是6H×10H×128B的2.9倍高的得率。图14B显示纯化的6H×10H×128B-M结构的代表性TEM图像和TEM得率。用于产生本发明的6H×10H×128B-M核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.337-590。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表6。)

图15显示3H×3H、4H×4H、6H×6H、6H×10H和8H×12H结构的琼脂糖凝胶得率分析。结构使用72小时退火坡度在具有40mM MgCl₂的0.5×Tris缓冲液中自装配。每条链的浓度为200nM。将10μL样品装载到每个泳道内。泳道M显示1kb梯状条带。对应于60ng DNA的3000碱基对条带用作标准以测量退火产物的得率，所述退火产物由箭头指示。在每个产物条带下，显示产物条带的绝对质量值和得率百分比两者。

图16A-16G显示用于由3D画布制备复杂形状的链的设计。图16A描述在该图中使用的符号。图16B显示具有四个8核苷酸随机序列结构域的典型链。每个8核苷酸结构域位于8碱基对体素-V1、V2、V3或V4内。V1和V2在相同螺旋上。V3和V4在另一个邻近螺旋上。图16C至16F显示衍生自具有四个8核苷酸随机序列结构域的链的其他类型的链。图16C显示当去除四个8碱基对体素之一时，对应于该8碱基对体素的8核苷酸结构域变成八个邻接T。图16D显示当去除四个8碱基对体素中的两个时，对应于该8碱基对体素的两个8核苷酸结构域变成八个邻接T或缺失。如果两个去除的8碱基对体素来自相同螺旋，则发生后面一种情况。图16E显示当去除四个8碱基对体素中的三个时，对应于来自相同螺旋的两个去除体素的两个8核苷酸结构域缺失。对应于第三个去除体素的另一个8核苷酸结构域变成八个邻接T。图16F显示对于B中所示的每条链，制备两类48核苷酸边界链。图16G显示每条链通过其覆盖的体素位置标记。每对数目代表一个体素。第一个数目指示螺旋，并且第二个数目指示螺旋上的体素位置。数目(0，0)意指具有八个邻接胸苷(T)的结构域或空结构域。

图17显示用于设计3D形状的工作流图解。

图18A-18C显示3D形状编辑界面的举例说明。图18A显示10×10×10体素3D画布。每个球体表示一个体素。图18B显示如何通过去除不需要的体素执行形状编辑。图18C和18B显示分别对应于图18A中的10×10×10体素3D画布和图18B中的形状的caDNAno概况。从3D描绘到caDNAno形式的转换通过定制程序完成。

图19A-19E显示具有交替链的3D结构设计。图19A显示4H×4H×64B-A(交替设计)结构的圆柱体模型。每个体素表示8个碱基对。图19B显示在4H×4H×64B-A结构中的链细节。链指向沿层的交替方向。例如，X1层中的Y砖块和X2层中的Y砖块指向相反方向，分别为-Z和+Z方向。相应地，每条链的方向描绘为“左”(L)或“右”(R)。图19C显示用于测试交替设计策略的6H×10H×64B-A结构。图19D显示琼脂糖凝胶电泳测定法的结果。泳道M显示1kb梯状条带。泳道1显示6H×10H×64B-A结构。结构在具有40mM MgCl₂的0.5×Tris缓冲液中自装配，使用72小时退火坡度。每条链的浓度为200nM。从凝胶中提取对应于产物的独特亮条带。图19E显示在琼脂糖凝胶纯化后的6H×10H×64B-A结构的TEM图像。比例尺条对于缩小图像为100nM，并且对于放大图像为20nm。

图20A显示与本发明提议的DNA晶体装配机制(底部)相比较，传统DNA装配方法提议的装配机制(顶部)。个别DNA链而不是预装配的多链砖块直接掺入生长中的DNA晶体内，允许用于构建具有预定的深度和三维特点的复杂晶体的一般和强壮的构架。图20B显示形成90°角的一对32核苷酸单链DNA砖块的链模型(顶部)和砖块模型(底部)。图20C，从左上顺时针方向，显示6H(螺旋)×6H×24B(碱基对)长方体结构的模型，以最详细到最不详细的次序：其中砖块用不同灰度阴影标记的链模型，其中砖块用不同灰度阴影标记的砖块模型，其中所有砖块均用浅灰色标记的砖块模型，和描绘DNA螺旋而不显示砖块的圆柱体模型。砖块具有不同序列。Z轴与DNA螺旋平行。图20D-20G显示由6H×6H×24B-长方体设计的一维(1D)、二维(2D)和三维(3D)的DNA砖块晶体。图20D显示沿Z轴生长的1D晶体。图20E显示沿Z轴和X轴生长的2D晶体。图20F显示沿Z轴和Y轴生长的2D晶体。图10H-20K显示具有通道、隧道和空腔的DNA晶体的圆柱体模型。图20H显示具有隧道和周期空腔的1D Z晶体。图20I显示具有两组平行隧道的2D ZX晶体。图20J显示具有周期空腔的2D XY晶体。图20K显示具有周期空腔的3D ZXY晶体。晶体的单胞使用蓝色框指示。箭头指示晶体生长方向。图20L显示在三维空间中的复杂DNA晶体。图20M显示与提议的DNA折纸晶体的装配机制相比较，本发明提议的DNA砖块晶体的装配机制。顶部：6H×6H×24B DNA砖块长方体延伸以形成二维生长晶体。砖块个别掺入晶体内。底部：6H×6H×24B DNA折纸长方体延伸以形成二维生长晶体。每个长方体需要正确形成且随后掺入晶体内。两种晶体的重复信息单位以深灰色指示。

图21A显示6H×6H、8H×8H和10H×10H DNA-束晶体，具有右手螺旋通道的8H×8HDNA-束晶体，具有三角形横截面的43H DNA-束晶体，和具有六角形横截面的44H DNA-束晶体的模型和TEM图像。图21B显示具有隧道的DNA-束晶体的模型和TEM图像：具有2H×4H隧道的8H×8H DNA-束晶体，具有2H×2H隧道和垂直8H×2H×24B隧道的8H×8H DNA-束晶体，具有6H×6H隧道的12H×12H DNA-束晶体。每个晶体的重复单位描绘为圆柱体模型中的深灰色区域。

图22A显示4层、6层、10层和20层ZX晶体的圆柱体模型。图22B显示图22A的ZX晶体的TEM图像。图22C显示图21A和21B的折叠晶体的TEM图像。箭头指示其中测量晶体厚度的位置。图22D显示具有2H×2H平行通道的6层晶体的圆柱体模型：(左到右)具有两组交叉通道–与DNA螺旋轴平行的2H×2H通道和与DNA螺旋轴垂直的2H×32B通道的6层晶体；具有2H×6H×32B孔的6层晶体；具有两组不接触隧道–与DNA螺旋轴平行的2H×2H隧道和与DNA螺旋轴垂直的2H×24B隧道的10层晶体。两组隧道通过两层DNA螺旋分开。每个晶体的重复单位指示为圆柱体模型中的深灰色区域。图22E显示图22D中的晶体的TEM图像。

图23A-23D显示固体XY晶体的模型：64bp(A)、128bp(B)、192bp(C)和256bp(D)。对于每种晶体显示圆柱体模型(顶部)和TEM图像(底部)。图23E显示具有2H×2H×64B平行孔的XY晶体的模型。图23F显示具有2H×2H×128B平行孔的XY晶体的模型。图23G显示XY-32H×64B-孔晶体的三个投影视图的cryo-EM 3D重建图像。图23H显示XY-32H×128B-孔晶体的三个投影视图的cryo-EM 3D重建图像。箭头指示其中测量晶体厚度的位置。图23I显示具有4H×32B平行通道的96bp晶体。图23J显示通过与管轴垂直的32-bp螺旋而形成的管晶体。晶体的单胞使用深灰色框指示。

图24A-D显示链图解，其显示如何由不连续物体而设计延伸晶体。(A)上左，6H×6H×24B-长方体不连续DNA砖块结构。下左，6H×6H×24B-长方体的相交。右，6H×6H×24B-长方体的详细链图解。左侧和右侧上的数目指示螺旋。顶部和底部上的数目指示沿Z轴的碱基对位置。X砖块由深灰色线表示，并且Y砖块由浅灰色线表示。(B)一维生长的连接模式：Z生长、X生长和Y生长。(C)二维生长的连接模式：ZX生长和XY生长。图24D显示Z-6H×6H×32B-长方体晶体的TEM图像。

图25A-25H显示Z晶体的TEM图像。(A)Z-8H×8H×32B-长方体晶体；(B)Z-10H×10H×32B-长方体晶体；(C)Z-6H×6H×128B-螺旋晶体；(D)Z-43H×32B-三角形晶体；(E)Z-44H×32B-六角形晶体；(F)Z-56H×32B-隧道晶体；(G)Z-60H×64B-隧道晶体；和(H)Z-108H×32B-隧道晶体。

图26A-25H显示ZX晶体的TEM图像。(A)ZX-4H×4H×32B-长方体晶体；(B)ZX-4H×6H×32B-长方体晶体；(C)ZX-4H×10H×32B-长方体晶体；(D)ZX-4H×20H×32B-长方体晶体；(E)ZX-32H×64B-通道晶体；(F)ZX-32H×64B-交叉通道晶体；(G)ZX-6H×6H×64B-孔晶体；和(H)ZX-96H×64B-交叉隧道晶体。

图27A-25I显示XY晶体的TEM图像。(A)XY-48H×64B-孔晶体；(B)XY-64H×64B-孔晶体；(C)XY-4H×4H×64B-长方体晶体；(D)XY-4H×4H×128B-长方体晶体；(E)XY-4H×4H×192B-长方体晶体；(F)XY-4H×4H×256B-长方体晶体；(G)XY-32H×64B-孔晶体；(H)XY-32H×128B-孔晶体；和(I)XY-8H×4H×96B通道晶体。

图28A显示XY-4H×4H×32B-长方体二维生长晶体设计(顶部)和结构如何可以用于形成管(底部)。图28B显示沿X轴扩展的4H×4H×32B-长方体重复单位。图28C显示4H×4H×32B-长方体重复单位的投影视图。沿Z轴，交叉不对称分布：一半交叉位于长方体的中点处，并且另一半位于长方体的左侧末端处。

图29显示XY-4H×4H×32B-管晶体的TEM图像。

图30显示在60mM MgCl₂中装配的XY-4H×4H×32B-管晶体的TEM图像。

图31显示使用交替DNA砖块的XY-4H×4H×32B-长方体晶体的TEM图像。

图32A显示X-6H×6H×64B-长方体晶体设计和TEM图像。图32B显示X-32H×64B-孔晶体设计和TEM图像。深色区域表示重复单位。

图33A显示偏移-ZX-6H×6H×64B-长方体晶体的设计。深色部分表示重复单位。图33B显示偏移-ZX-6H×6H×64B-长方体晶体的TEM图像。图33C显示偏移-ZX-6H×6H×64B-长方体晶体的链图解。

图34A显示在ZX-4H×6H×96-通道晶体上紧密堆积的10纳米金纳米颗粒的平行线模型。图34B显示在ZX-4H×6H×96-通道晶体上紧密堆积的10纳米金纳米颗粒的平行线的TEM图像。图34C显示金纳米颗粒的单链的高放大率TEM图像。图34D显示在XY-4H×4H×64B-长方体晶体的顶表面和底表面上形成的紧密堆积的金纳米颗粒单层的模型。图34E显示在XY-4H×4H×64B-长方体晶体的顶表面和底表面上形成的紧密堆积的金纳米颗粒单层的TEM图像。图34F显示在边缘上具有曲率的XY-4H×4H×64B-长方体晶体的高放大率TEM图像。浅灰色箭头指示其中两个金纳米颗粒单层可见的弯曲位置。

图35A显示ZX-4H×6H×96-通道晶体的设计。深色部分表示重复单位。图35B显示ZX-4H×6H×96-通道晶体的TEM图像。图35C显示ZX-4H×6H×96-通道晶体的链图解。

说明书进一步将作为分开的ASCII文本文件随同提交的序列表通过参考并入本文，所述ASCII文本文件命名为“H0498.70443WO00–Sequence Listing”，于2013年7月23日创建，并且具有2.34MB的大小。

发明详述

本发明在其最广泛的含义上涉及制备具有预定的和因此受控的形状、大小和复杂性的核酸结构的方法，如此制备的结构和在过程中使用的多种寡核苷酸。本发明部分以出乎意料的下述发现为前提：选择多种单链寡核苷酸可以自装配，以形成具有受控的形状、大小、复杂性和修饰的3D核酸结构。认为尤其令人惊讶的是，多种预定的形状和受控的大小的稳定3D核酸结构可以仅使用多种相对短的单链寡核苷酸而形成(例如与DNA折纸技术所需的支架链相比较)。

更特别地，本发明的多个方面涉及使用单链2或4结构域寡核苷酸(在本文中也称为“核酸砖块”或“DNA砖块”)的方法，所述寡核苷酸将核酸纳米结构的模块自装配延伸至三个维度。该方法的一般性通过成功设计且表征123种纳米结构得到证实，所述123种纳米结构包括两种8MDa长方体、102种由共同长方体“3D画布”构建的错综复杂的三维(3D)形状和19种由模块核酸基序装配的三维纳米结构，所述模块核酸基序遵循交替堆积几何学。本文还在多个方面提供的是计算机程序，其将简单的三维模型转变成生成所需相应的核酸结构需要的核酸链组。

本发明的核酸结构包含以预定的或已知方式排列(经由序列特异性退火)成三维形状的多种寡核苷酸。因此，结构中的每种寡核苷酸的位置是已知的。以这种方式，结构可以例如通过在特定位置处添加、去除或替换寡核苷酸进行修饰。结构还可以例如通过在特定位置处附着部分进行修饰。这可以通过使用经修饰的寡核苷酸作为原材料或通过在结构形成后修饰特定寡核苷酸来完成。因此，了解在起始寡核苷酸各自在所得的结构中的位置提供对结构的可寻址能力。

在一些情况下，本发明的核酸结构可以通过单链寡核苷酸的自装配过程进行制备。在这些自装配方法中，单链寡核苷酸在单一容器中组合且允许基于序列互补性彼此退火。在一些情况下，该退火过程涉及将寡核苷酸置于高温下且随后逐步降低温度，以便有利于序列特异性结合。如本文使用的，术语“自装配”指寡核苷酸(和在一些情况下，核酸结构)以序列特异性方式、以预测方式且无需外部控制(例如通过寡核苷酸或核酸结构的按顺序添加)而彼此退火的能力。

本发明因此尤其提供了包含本发明的单链寡核苷酸的组合物，制备具有多种预定的或已知的大小、形状、复杂性和修饰的核酸结构的方法，具有多种预定的或已知的大小、形状、复杂性和修饰的核酸结构，其中此类多种可以自装配以形成三维核酸结构，包含两种或更多种核酸结构的复合结构，和制备此类复合结构的方法。本发明还提供了使用本发明的核酸结构和复合结构的方法。本发明的这些方面和实施方案将在本文中更详细地描述。

核酸结构

本发明的核酸结构由多种寡核苷酸组成，所述多种寡核苷酸以序列特异性方式彼此结合，以形成3D形状。本发明的寡核苷酸可以具有四个结构域，尽管在一些实施方案中，寡核苷酸可以具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个结构域。结构域数目至少部分取决于寡核苷酸的长度。因此，大于200个核苷酸的较长寡核苷酸例如可以具有超过20个结构域。图1A和5A提供每个结构域具有八个核苷酸的4结构域寡核苷酸的示意图。在形成核酸结构的退火过程前，寡核苷酸采取单链形式。结构域和/或寡核苷酸的核苷酸序列可以是随机的(条件是发生在结构域之间的必要杂交)。如本文更详细地描述的，一些结构域具有聚T序列。因此，一些结构由随机序列结构域和聚T结构域组成。

寡核苷酸可以概念表达为具有例如四个邻接8核苷酸结构域，长度总计32个核苷酸的“砖块”(类似于砖块，参见下文)。结构域可以分别指定为1、2、3、4(图1A)。(为了清楚起见，在一些情况下，图可以提及X1、X2、X3和X4结构域，以指示“X”砖块的四个结构域，并且提及Y1、Y2、Y3和Y4结构域，以指示“Y”砖块的四个结构域。)在一些情况下，每个DNA砖块具有不同的核苷酸序列。当掺入靶结构内时，所有DNA砖块均采取相同的总体形状：通过单个磷酸键连接的两个16碱基对(16聚体)反向平行螺旋。与键邻近的两个结构域指定为“头”结构域，并且另外两个指定为“尾”结构域。具有序列“a”的尾结构域的DNA砖块可以以立体特异性方式与具有互补“a*”头结构域的附近砖块高效地相互作用。砖块间的每个配对限定堆积为产生90°二面角的三个平行螺旋(图1B，上)；该角度衍生自DNA的8个碱基对的3/4右手螺旋扭曲。

样模型在本文中可以用于以简单方式描述设计(图1B，下和图5)。模型忽略详细的螺旋结构和链极性，而是保存关于DNA砖块间的长宽比和相互作用的方向约束中的一些的信息：两个突出的圆形塞，指向与螺旋轴相同的方向，表示两个尾结构域；具有凹陷圆形洞的两个连接的立方体表示两个头结构域。砖块必须采取两类方向之一，水平或垂直(图1B)。两个砖块经由杂交连接以形成90°角，表示为塞插入洞内。插入仅在携带具有匹配极性的互补序列的塞和洞之间被允许(为了描述简单起见，其在目前模型中未图解描绘)。指定关于砖块间相互作用的链极性和立体特异性约束的更详细样模型显示于图5中。

图5显示沿相继8碱基对层的核酸砖块，其在本文中具有指定为北、西、南和东的方向。具有北和南方向的砖块可以局限于含有来自每个双螺旋的一个螺旋的亚组。类似地，具有西和东方向的砖块可以局限于螺旋的互补亚组(还参见图6)。因此，可以方便地将北和南方向的砖块一起分组为Y砖块，并且将西和东方向的砖块一起分组为X砖块。以结构域-结构域杂交的方式，在图5中的一种寡核苷酸上的尾结构域与另一种寡核苷酸的头结构域之间可以存在连接。此处，显示了模型，其使用不同的突出形状(对于尾结构域1和4)和匹配空腔(对于头结构域2和3)。证实尾结构域Y4和头结构域X2连接(图5B)。另外，形状和空腔设计为迫使一对砖块形成90°二面角。

设计的结构周期性可以在6H(螺旋)×6H(螺旋)×48B(碱基对)长方体纳米结构中举例说明(图1C，1D)。砖块可以分组为含有其头结构域的8碱基对层。砖块遵循沿相继8碱基对层的90°顺时针方向旋转，因此每四层为以砖块的方向和排列方式的重复单位。例如，图1D中的第一个和第五个8碱基对层可以共享相同的砖块排列。在8碱基对层内，所有砖块均可共享相同方向，并且与其限定线的洞的对形成链。这些链以交错排列侧向堆积，以平铺由层限定的平面。在每层的边界上，一些核酸砖块需要对分成半砖块(即2结构域寡核苷酸)，表示具有两个结构域的单个螺旋。长方体可以在一步反应中由核酸砖块自装配。在一些情况下，每个砖块可以携带独特序列，这指导其仅配合其预先设计的位置。由于其模块性，预先设计的核酸砖块纳米结构可以用于构建由砖块亚组装配的更小的定制和任意形状(图1E)。

Lego样模型可以进一步抽象化为仅含有每个8bp双链体的位置信息的3D模型。10H×10H×80B长方体概念表示为含有10×10×10体素的3D画布，每个体素对应于8bp双链体(图1E)。基于3D画布，计算机程序首先生成DNA砖块的完全集合，包括可以用于构建任何定制形状的全砖块和半砖块。使用3D建模软件，设计者随后仅需要通过从3D画布中去除不需要的体素来限定靶形状-类似3D雕刻的过程。随后，计算机程序可以分析形状且自动选择寡核苷酸(砖块)的正确亚组用于形状的自装配。

核酸结构可以在合成前进行设计，并且它的大小、形状、复杂性和修饰可以通过在合成过程中使用某些选择寡核苷酸进行预定和加以控制。每个结构域和每种寡核苷酸在结构中的位置是已知的且在合成特定形状的纳米结构前提供。

通常，寡核苷酸的每个结构域具有独特序列。一对附近寡核苷酸经由两个互补结构域(例如头结构域1和尾结构域3)的杂交形成双链体，所述结构域各自位于寡核苷酸之一中(图1B，上)。然而，在一些情况下，寡核苷酸的某些结构域可以不与核酸结构中的另一个结构域结合。在此类情况下，具有聚T结构域的寡核苷酸存在于结构中，优选在边界处和导致聚T结构域为单链的构型中。因此，在一些实施方案中，四个(或更多个)结构域寡核苷酸的至少一个或至少两个结构域可以是聚T结构域(例如由T核苷酸组成)。

在一些情况下，核酸结构中的至少一个结构域将是独特的，意指结构域在该结构中仅出现一次。结构可以由一个或多个独特结构域组成，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或更多个独特结构域。在一些实施方案中，结构中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、80％或90％结构域是独特的。例如，结构可以包含第一种多个结构域和第二种多个结构域，所述第一种多个结构域各自仅在结构中出现一次，并且这些独特结构域可以呈现结构中的总结构域的75％，所述第二种多个结构域各自在结构中出现超过一次，并且这些重复结构域可以代表结构中的总结构域的25％。显而易见的是其他百分比也是可能的。在一些实施方案中，结构中的每一个结构域均为独特的。在一些实施方案中，除了聚T结构域之外，结构中的每一个结构域均为独特的。复合结构(即，包含经由间隔物-接头彼此连接的两种或更多种核酸结构的结构)中的每一个结构域均可以是独特的或不是独特的。

在一些情况下，结构中的双螺旋中的至少一个结构域将是独特的，意指结构域在该双螺旋中仅出现一次。结构域可以存在于相同结构内的其他螺旋中，并且因此在一些情况下，它在整个核酸结构的情况下可能不是独特的。在螺旋中可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个结构域，其在该螺旋的情况下是独特的。螺旋中的独特结构域可以代表该螺旋中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、80％、90％或100％结构域。螺旋中的独特结构域可以位于结构末端处或附近。螺旋中的独特结构域可以彼此邻接，或它们可以彼此分散开。它们可以通过重复结构域(即，在螺旋中出现超过一次的结构域)彼此分开。

结构可以包含具有独特结构域的一个或多个螺旋。这类螺旋可以代表螺旋中存在的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或100％螺旋。如果超过一个该螺旋类型存在于结构中，则它们可以彼此邻近，或它们可以被其他螺旋(包括不含独特结构域的螺旋)而分开。例如，具有独特结构域的螺旋可以在结构中与缺乏独特结构域的螺旋交替。

因此，在一些情况下，核酸结构可以包含各自具有一个或多个独特结构域的两个或更多个螺旋，其中所述结构域在个别螺旋自身的情况下是独特的，并且在作为整体的结构情况下可能是独特的。个别螺旋中的独特结构域可以存在于结构中的其他螺旋中。个别螺旋中的独特结构域可以是结构中的其他螺旋中的一个或多个独特结构域。

在一些情况下，结构中的一个或多个螺旋各自可以完全由独特结构域组成，预期这些结构域各自仅出现一次/螺旋或仅出现一次/结构。

因此，在一些情况下，本发明的核酸结构包含至少一个独特双螺旋。独特双螺旋是具有不同于结构中的任何其他螺旋的结构域组成的螺旋。独特双螺旋因此还具有不同于结构中的任何其他螺旋的核苷酸序列。

在另外其他情况下，本发明的核酸结构可以这样设计，从而使得它们包含由独特结构域组成的一个区域和由非独特或重复结构域组成的另一个区域。

所述结构可以至少部分基于X方向中形成的螺旋数目、Y方向中形成的螺旋数目和此类螺旋的深度(由此类螺旋的碱基对数目指示)进行限定。应当理解如此形成(和提及)的螺旋可以是不连续螺旋(即，沿其长度在螺旋中可以存在双链切口)，因为它们包含来自分开寡核苷酸的多个杂交结构域。本发明的方法已用于生成多种大小的3D画布(由其可以形成多种任意形状的核酸结构)，包括长方体例如3H x 3H(x32b，x 64b，x 128b，x 256b，x512b，x 1024b)、4H x 4H(x 32b，x64b，x 128b，x 256b，x 512b)、6H x 6H(x 32b，x 64b，x128b，x256b)、12H x 12H x 48b，圆柱体例如6H x 10H(x 32b，x 64b，x128b)，链例如30H x1H x 126b，蜂窝晶格例如6H x 6H x 84b-HC和六角形晶格例如6H x 7H x 108b-HL。

结构至少部分通过使多种已知寡核苷酸在单一容器中退火来形成。图2A显示用于寡核苷酸砖块纳米结构自装配的一步热退火的示意图。该图显示预期的长方体结构的示意图。图2D显示在退火过程后，纯化的6H×10H×128B结构的透射电子显微镜检查(TEM)图像。更高放大率的图像显示完整纳米结构的三个视图，分别对应于6H×10H×128B的X-Y平面、X-Z平面和Y-Z平面投影。计算机生成的投影视图显示在放大的TEM图像的右侧。退火后过程的凝胶电泳分析显示在最佳条件下退火的未纯化的6H×10H×128B结构(泳道1)和纯化的6H×10H×128B结构(泳道2)。灰色箭头指向6H×10H×128B产物条带。从可以用于生成具有某一大小的三维形状的已知寡核苷酸库开始，选择寡核苷酸可以从库中排除，以便形成不同形状和/或大小的结构。

可以使用这些方法制备的多种结构显示于图3E中。还显示的是由此类方法产生的退火后产物。本发明考虑排除对于结构内部的寡核苷酸。例如，图3B举例说明具有内部空隙模式(即缺乏任何寡核苷酸的预定区域)的结构。

因此，在一些情况下，最终用户设计核酸结构，例如具有特定长度、宽度和深度维度的长方体，伴随在结构中的每个位置处存在的特定寡核苷酸的了解。事实上，最终用户具有指示结构内的每种寡核苷酸的精确位置的物理图谱。在图谱中(和因此在核酸结构中)的每个位置处的每种寡核苷酸身份的了解允许最终用户使用特定结构作为起点改造特定模式或形状。此类改造可以通过下述发生：从组合的寡核苷酸混合物中排除一种或多种已知寡核苷酸以形成核酸结构和/或包括另外的已知寡核苷酸。

因此，作为例子且如本文证实的，最终用户可以设计具有特定长度(Y轴)、宽度(X轴)和深度(Z轴)，并且由多种独特寡核苷酸组成的三维立方体。最终用户了解在晶格中的每个位置处的寡核苷酸身份。除了能够合成立方体自身外，最终用户还能够使用立方体作为起点设计且合成一种或多种其他核酸结构。如本文证实的，多种形状的核酸结构可以通过从用于制备整个立方体的库中排除一种和通常多种寡核苷酸来合成。这些形状包括但不限于图3E中所示的形状中的任一种。

本发明因此提供了用于合成许多不同核酸结构而无需从头设计每种结构的方法。相反，从起始核酸结构例如立方体开始，简单地通过排除预先选择的寡核苷酸和/或包括预先选择的寡核苷酸可以形成多种其他核酸结构。以这种方式，最终用户使用以模块方式的单链寡核苷酸，取决于所需核酸结构的最终形状和大小，包括或排除多种的成员。在多种的寡核苷酸成员之间的相互作用不预期相当大地改变，并且因此最终用户无需基本上从头开始设计每一种新的核酸结构。相反，最终用户制备每种寡核苷酸的库存，并且将多种库存以对应于其在结构中的相对频率的相对浓度并在单一容器中组合在一起，以便形成具有所需形状、大小和复杂性的核酸结构。

在具有所需形状和大小的核酸结构中的单链寡核苷酸的选择和排列可以人工或通过计算机算法完成。此类计算机算法的例子是Uniquimer，其对于公众可公开获得。

如本文的一些图中举例说明的，本发明的核酸结构的大小可以在退火过程期间加以控制。该大小控制通过设计具有一个或多个独特结构域或者一个或多个独特螺旋的结构且因此在退火过程中使用选择的寡核苷酸群体来实现。核酸结构的大小因此通常也是预定的。

核酸结构的大小可以通过其维度中的一个、两个或三个的距离表示。此类维度可以各自独立地在长度中是纳米或微米或更长。例如，结构可以包含一个、两个或三个维度，其各自具有在5-100纳米、5-500纳米、5-1000纳米，包括10-100纳米、10-500纳米或10-1000纳米范围内的长度、宽度和/或深度。在一些实施方案中，它们可以具有约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900nm或更多的一个或多个维度。

核酸结构的大小还可以通过双螺旋数目以及这些双螺旋的长度呈现。双螺旋的长度可以表示为螺旋中的螺旋转角的数目。应当理解本发明考虑制备在纳米和微米和更大规模内的结构。

在一些实施方案中，核酸结构可以包含2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、120、160、200、240、280、320或360个螺旋。例如，核酸结构可以呈现为6螺旋(H)×6H×64碱基对(bp)结构(即6H×6H×64B)。其他结构例子包括但不限于3H×3H×64B结构、3H×3H×128B结构、3H×3H×256B结构、3H×3H×512B结构、3H×3H×1024B结构、4H×4H×64B结构、4H×4H×128B结构、4H×4H×256B结构、4H×4H×512B结构、4H×4H×1024B结构、6H×6H×64B结构、6H×6H×128B结构、6H×6H×256B结构、6H×6H×512B结构、6H×6H×1024B结构、8H×8H×64B结构、8H×8H×128B结构、8H×8H×256B结构、8H×8H×512B结构、8H×8H×1024B结构、12H×12H×64B结构、12H×12H×128B结构、12H×12H×256B结构、12H×12H×512B结构或12H×12H×1024B结构。另外的例子包括但不限于6H×10H×64B、6H×10H×128B、4H×12H×120B、8H×12H×32B、8H×12H×64B、8H×12H×120B、4H×24H×120B、30H×1H×126B、6H×7H×108B的结构。

本发明的核酸结构可以采取任何形状或形式。可以使用本发明的方法制备的多种形状和形式的例子在图3A-3E、图21A-21C、图22A-22E和图23A-23D中举例说明。重要的是，使用本发明的方法学，伴随基于在结构的每一个位置中的寡核苷酸身份(和因此序列)的了解，能够预定且因此预先设计核酸结构的形状、形式和大小。

如本文讨论的，核酸结构可以通过在单一退火反应中使多种单链寡核苷酸组合且退火来合成，以获得具有所需形状、大小、复杂性和修饰的核酸结构。本发明还考虑通过使分开的较小核酸结构以模块方式彼此退火的核酸结构合成。

在一些实施方案中，核酸和/或结构通过对其实施高温和随后的缓慢冷却过程进行退火。高温可以是约50℃、约45℃或约40℃，并且冷却过程预期将溶液冷却至约室温(例如约25℃)。冷却期可以是几分钟，几小时包括2、3、4、5、6、7、8、9或10小时或更久，包括24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156或168小时。

在一些实施方案中，核酸结构是晶体样结构(在本文中被称为“晶体”)。晶体可以通过使用在不连续三维DNA砖块结构之间的“连接”砖块进行装配。在一些实施方案中，晶体的装配(也称为“生长”)可以是非分层的，而在其他实施方案中，晶体的装配可以是分层的。本文DNA砖块晶体的非分层生长指由个别DNA砖块的晶体装配，而无需首先形成重复功能单位。因此，在晶体生长时，个别DNA砖块个别掺入晶体内。在此类实施方案中，DNA砖块晶体可以基于重复单位进行设计，在所述重复单位中连接砖块在大小和功能中与其他砖块相同。相比之下，本文DNA砖块晶体的分层生长指由“预先形成的”重复功能单位(例如由DNA砖块预先形成的较大结构)的晶体装配。在一些实施方案中，在不连续的DNA砖块设计的表面上的DNA砖块可以进行修饰，以连接个别结构且沿X轴、Y轴和Z轴个别延伸晶体生长，以生成一维生长晶体。在一些实施方案中，在不连续的DNA砖块设计的表面上的DNA砖块可以进行修饰，以连接个别结构且沿X轴、Y轴和Z轴组合延伸晶体生长，以生成二维生长晶体或三维生长晶体。

为了实现沿Z轴的多聚化，第一层结构域的序列可以进行修饰，在一些实施方案中，以与最后一层结构域中的那些互补。沿X轴或Y轴的多聚化可以通过沿X轴或Y轴用新的32-nt砖块取代边界上的砖块来实现。这些新的32-nt砖块各自可以含有与长方体一侧互补的两个结构域和与长方体相对侧互补的另外两个结构域。因此，这些32-nt砖块可以连接长方体单体，以实现连续生长。

如本文使用的，“Z晶体”指沿Z轴延伸的一维晶体。类似地，“X晶体”或“Y晶体”分别指沿X轴或Y轴延伸的一维晶体。“ZX晶体”指沿Z轴和X轴延伸的二维晶体。“XY晶体”指沿X轴和Y轴延伸的二维晶体。图20F显示在三维空间中的复杂DNA晶体。使用重复单位的不同设计，可以制备具有预定的维度和种模式的DNA砖块晶体。相应地，晶体设计命名为“[生长方向]-[重复单位的大小]-[其形状的基本特点]”。例如XY-4H×4H×64B-长方体晶体是二维晶体(XY晶体)，其基于4H×4H×64B-长方体的重复单位进行设计。如同不连续的DNA砖块结构，根据本文提供的教导，DNA砖块晶体的序列可以随机生成。

通过在缓冲液(例如TE/MgCl₂)中以大约相等的比(例如每条链100nm)组合DNA砖块(纯化或未纯化的)，且随后执行单步热退火72、84、96、108、120、132、144、156、168小时或更久，可以装配晶体。

在其他实施方案中，与所有结构的同时混合和退火相比较，本发明考虑结构的交错或按顺序添加(和退火)。按顺序添加在更复杂结构的合成中可以是特别有用的。在一些情况下，这些及其他退火方法可以在静态环境下或在流动下进行。流动环境允许在添加后续组分前去除未退火的寡核苷酸或核酸结构。

本发明还提供了多种核酸结构。如本文使用的，术语多种意指超过一种，并且可以与术语群体互换使用。此类多种可以包含10、50、100、500、1000种或更多种结构。此类多种可以具有不同程度的同质性，意指多种中的核酸结构百分比就大小、形状、复杂性和/或修饰而言彼此相同。多种结构因此在具有某一特征的结构中可以是至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％同质的。例如，多种长方体形状的结构可以是至少50％同质的，意指在该多种中的至少50％结构是长方体形状的。

此类多种可以是单分散的，意指其成员在一种或多种特征包括大小、形状、复杂性和/或修饰方面可以是相同的。多种对于所有这些特征可以是单分散的。

多种中的同质性(和相反异质性)程度可以使用多种技术进行测定，所述技术包括但不限于原子力显微镜检查(AFM)或透射电子显微镜检查(TEM)和凝胶电泳。这些技术已用于测定制备的结构群体中的同质性程度，如实施例中讨论的。重要的是，已发现本文提供的退火方法重现性获得具有占优势的核酸结构种类的群体。此外，该占优势种类看起来与使用本发明的设计和作图方法预期的种类相同。

如许多图中举例说明的，在一些情况下，一旦形成核酸结构，仍可以存在其为单链的结构域。这些可以例如在边界处出现。此类边界由图中提供的结构的左和右边界表示。已发现依照本发明，此类结构域的性质可以影响退火过程的效率和得率。更具体而言，如果这些单链区域具有混合的核苷酸序列，则结构更可能凝聚且得率降低。此类凝聚可以通过操纵这些单链区域的核苷酸序列得到降低。具体地，其在序列中为聚T的单链区域更不太可能引起凝聚，导致结构的更佳得率。还可以使用聚A和聚C序列。因此，在一些实施方案中，某些单链结构域可以存在于结构中，并且此类结构域可以在序列中彼此相同。

在某些实施方案中，边界区域可以由聚T结构域和混合序列的其他结构域的混合物组成，条件是结构基本上不凝聚。在这些情况下，混合序列结构域可以用于使两种或更多种结构彼此退火。此类结构域的数目可以为6、8、10或更多。

本发明的结构可以在合成期间或合成后进行修饰。它们可以通过使用其为修饰的寡核苷酸在合成期间进行修饰。例如，用于生成结构的一种或多种寡核苷酸可以缀合至目的部分。经修饰的寡核苷酸可以用于生成本发明的结构，条件是此类修饰不干扰寡核苷酸与根据需要的其他寡核苷酸结合的能力，以便形成所需结构。另外或备选地，结构可以是合成后修饰的。

考虑了任何修饰，条件是它不干扰寡核苷酸彼此退火，并且它不致使结构更不稳定，除非这是另外通过修饰预期的。修饰在性质中可以是但不限于化学或酶促的。修饰可以涉及核酸缀合的部分的使用。部分在性质中可以是但不限于金属、有机和无机的。部分可以缀合至能够识别且结合结构中的寡核苷酸的核酸。此类核酸可以是例如三链体形成寡核苷酸。在其他情况下，一种或多种非核酸部分可以永久或瞬时、共价或非共价附着至结构。本发明考虑独特和/或非独特寡核苷酸可以进行修饰。结构中的寡核苷酸可以自身缀合至一个或多个结构域，其不促成结构，而是用于使部分与结构结合。应当理解因为结构中的每种寡核苷酸和每个结构域的位置可以是预定的，所以对最终所得到的结构的每种修饰的位置也可以是预定的。换言之，结构中每种寡核苷酸的位置的了解促进结构的可寻址能力。

另外，说明书进一步将于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309提交的附录全文并入，所述美国临时申请提供用于产生本发明的一些纳米结构的寡核苷酸序列。用于产生本发明的6H×6H×64B-S核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.1-78、157-225和295-336，并且相应的5'末端坐标分别显示于表3A中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表1。)

表3A

用于产生本发明的6H×6H×64B核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.79-156和226-294，并且相应的5'末端坐标分别显示于表3B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表1。)

表3B

用于产生本发明的6H×10H×64B-M核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.337-590，并且相应的5'末端坐标分别显示于表4中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表2。)

表4

用于产生本发明的6H×6H×64B核酸结构的随机寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.591-737，并且相应的5'末端坐标分别显示于表5A中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表3。)

表5A

用于产生本发明的6H×6H×64B核酸结构的设计寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.738-884，并且相应的5'末端坐标分别显示于表5B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表3。)

表5B

用于产生本发明的4H×12H×120B核酸结构的一组寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.885-1220，并且相应的5'末端坐标分别显示于表6A中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表4。)

表6A

用于产生本发明的4H×12H×120B核酸结构的另一组寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.1221-1556，并且相应的5'末端坐标分别显示于表6B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表4。)

表6B

用于产生本发明的4H×12H×120B核酸结构的另外一组寡核苷酸序列指定为SEQID NOs.1557-1892，并且相应的5'末端坐标分别显示于表6C中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表4。)

表6C

用于产生本发明的6H×10H×128B核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.1893-2351，并且相应的5'末端坐标分别显示于表7中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表5。)

表7

用于产生本发明的6H×10H×128B-M核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.2352-2810，并且相应的5'末端坐标分别显示于表8中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表6。)

表8

用于产生本发明的3H×3H×32B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.2811-2822，并且相应的体素坐标分别显示于表9A中。用于产生本发明的3H×3H×32B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.3195-3203，并且相应的体素坐标分别显示于表9B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表7。)

表9A

表9B

用于产生本发明的3H×3H×64B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.2811-2834，并且相应的体素坐标分别显示于表10A中。用于产生本发明的3H×3H×64B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.3203-3212，并且相应的体素坐标分别显示于表10B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表7。)

表10A

表10B

用于产生本发明的3H×3H×128B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.2811-2858，并且相应的体素坐标分别显示于表11A中。用于产生本发明的3H×3H×128B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.3213-3221，并且相应的体素坐标分别显示于表11B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表7。)

表11A

表11B

用于产生本发明的3H×3H×256B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.2811-2906，并且相应的体素坐标分别显示于表12A中。用于产生本发明的3H×3H×256B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.3222-3230，并且相应的体素坐标分别显示于表12B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表7。)

表12A

表12B

用于产生本发明的3H×3H×512B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.2811-3002，并且相应的体素坐标分别显示于表13A中。用于产生本发明的3H×3H×512B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.3231-3239，并且相应的体素坐标分别显示于表13B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表7。)

表13A

表13B

用于产生本发明的3H×3H×1024B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.2811-3194，并且相应的体素坐标分别显示于表14A中。用于产生本发明的3H×3H×1024B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.3240-3248，并且相应的体素坐标分别显示于表14B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表7。)

表14A

表14B

用于产生本发明的4H×4H×32B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.3249-3272，并且相应的体素坐标分别显示于表15A中。用于产生本发明的4H×4H×32B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.3633-3646，并且相应的体素坐标分别显示于表15B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表8。)

表15A

表15B

用于产生本发明的4H×4H×64B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.3249-3296，并且相应的体素坐标分别显示于表16A中。用于产生本发明的4H×4H×64B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.3647-3660，并且相应的体素坐标分别显示于表16B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表8。)

表16A

表16B

用于产生本发明的4H×4H×128B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.3249-3344，并且相应的体素坐标分别显示于表17A中。用于产生本发明的4H×4H×128B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.3661-3674，并且相应的体素坐标分别显示于表17B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表8。)

表17A

表17B

用于产生本发明的4H×4H×256B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.3249-3440，并且相应的体素坐标分别显示于表18A中。用于产生本发明的4H×4H×256B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.3675-3688，并且相应的体素坐标分别显示于表18B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表8。)

表18A

表18B

用于产生本发明的4H×4H×512B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.3249-3632，并且相应的体素坐标分别显示于表19A中。用于产生本发明的4H×4H×512B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.3689-3702，并且相应的体素坐标分别显示于表19B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表8。)

表19A

表19B

用于产生本发明的6H×6H×32B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.3703-3762，并且相应的体素坐标分别显示于表20A中。用于产生本发明的6H×6H×32B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.4183-4209，并且相应的体素坐标分别显示于表20B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表9。)

表20A

表20B

用于产生本发明的6H×6H×64B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.3703-3822，并且相应的体素坐标分别显示于表21A中。用于产生本发明的6H×6H×64B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.4210-4236，并且相应的体素坐标分别显示于表21B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表9。)

表21A

表21B

用于产生本发明的6H×6H×128B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.3703-3942，并且相应的体素坐标分别显示于表22A中。用于产生本发明的6H×6H×128B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.4237-4263，并且相应的体素坐标分别显示于表22B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表9。)

表22A

表22B

用于产生本发明的6H×6H×256B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.3703-4182，并且相应的体素坐标分别显示于表23A中。用于产生本发明的6H×6H×256B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.4264-4290，并且相应的体素坐标分别显示于表23B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表9。)

表23A

表23B

用于产生本发明的6H×10H×32B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.4291-4394，并且相应的体素坐标分别显示于表24A中。用于产生本发明的6H×10H×32B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.4707-4749，并且相应的体素坐标分别显示于表24B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表10。)

表24A

表24B

用于产生本发明的6H×10H×64B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.4291-4498，并且相应的体素坐标分别显示于表25A中。用于产生本发明的6H×10H×64B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.4750-4792，并且相应的体素坐标分别显示于表25B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表10。)

表25A

表25B

用于产生本发明的6H×10H×128B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.4291-4706，并且相应的体素坐标分别显示于表26A中。用于产生本发明的6H×10H×128B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.4793-4835，并且相应的体素坐标分别显示于表26B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表10。)

表26A

表26B

用于产生本发明的8H×12H×32B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.4836-5007，并且相应的体素坐标分别显示于表27A中。用于产生本发明的8H×12H×32B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.5482-5545，并且相应的体素坐标分别显示于表27B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表11。)

表27A

表27B

用于产生本发明的8H×12H×64B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.4836-5179，并且相应的体素坐标分别显示于表28A中。用于产生本发明的8H×12H×64B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.5546-5609，并且相应的体素坐标分别显示于表28B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表11。)

表28A

表28B

用于产生本发明的8H×12H×128B核酸结构的核心寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.4836-5481，并且相应的体素坐标分别显示于表29A中。用于产生本发明的8H×12H×128B核酸结构的末端寡核苷酸序列指定为SEQ ID NO.5610-5671，并且相应的体素坐标分别显示于表29B中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表11。)

表29A

表29B

用于产生本发明的4H×24H×120B核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.5672-6355，并且相应的5'末端坐标分别显示于表30中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表12。)

表30

用于产生本发明的12H×12H×48B核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.6356-6841，并且相应的5'坐标分别显示于表31中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表13。)

表31

用于由10×10×10体素3D画布产生图3E的形状的寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.6842-11296(分别为链0-4454)，并且相应的体素坐标分别显示于表32中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表14。)

表32

用于产生本发明的30H×1H×126B核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.11297-11502，并且相应的5'末端坐标分别显示于表33中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表16。)

表33

用于产生本发明的6H×6H×84B-HC核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.11503-11667，并且相应的5'末端坐标分别显示于表34中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表17。)

表34

用于产生本发明的6H×7H×108B-HL核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.11668-11935，并且相应的5'末端坐标分别显示于表35中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表18。)

表35

用于产生本发明的6H×6H×64B(形式1)核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.11936-12041，并且相应的5'末端坐标分别显示于表36中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表19。)

表36

用于产生本发明的6H×6H×64B(形式2)核酸结构的寡核苷酸序列指定为SEQ IDNO.12042-12203，并且相应的5'末端坐标分别显示于表37中。(还参见附录，通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表20。)

表37

单链寡核苷酸

使用以序列特异性方式彼此退火的多种单链多核苷酸，设计且制备本发明的核酸结构。寡核苷酸可以通过其长度、其序列及其结构域组成进行表征。它们的结构域的数目和序列支配每种寡核苷酸的结合活性和位置。它们的结构域数目通常支配每种寡核苷酸在结构中与之结合的寡核苷酸数目。

在一些情况下，用于制备结构的寡核苷酸包含偶数数目的结构域。每种寡核苷酸通常包含至少两个结构域。在一些实施方案中，用于制备结构的寡核苷酸可以是2和4结构域寡核苷酸。还能够使用其他寡核苷酸组合而形成结构，包括但不限于2和6结构域寡核苷酸、3和6结构域寡核苷酸、2和8结构域寡核苷酸、4和8结构域寡核苷酸等等。

如本文使用的，结构域指核苷酸序列(即，具有以序列特异性方式与其互补体结合的能力的许多邻接核苷酸或核苷酸类似物)。多种寡核苷酸或核酸结构中的结构域这样进行设计，从而使得它们对另一种寡核苷酸中的结构域退火。寡核苷酸的所有结构域的共同互补性有利于此类寡核苷酸的自装配以形成核酸结构。

结构域长度可以不同。在其中来自相同寡核苷酸的两个邻接结构域促成相同螺旋的情况下，两个结构域的长度可以是相关的。例如，一个结构域具有长度x，并且其他结构域具有长度y，条件是x+y为约16，条件是x和y各自为1或更大。

在一些实施方案中，来自促成相同螺旋的相同寡核苷酸的两个邻接结构域可以具有长度约16+/-2个核苷酸的组合长度。因此，单个结构域可以具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个核苷酸的长度。两个邻接结构域可以具有例如14、15、16、17或18个核苷酸的总组合长度。2结构域寡核苷酸可以具有例如16+/-2个核苷酸的长度。4结构域寡核苷酸可以具有例如32+/-4个核苷酸的长度。

在一些重要的实施方案中，结构域具有8个核苷酸的长度，两个邻接结构域具有16个核苷酸的长度，并且4结构域寡核苷酸具有32个核苷酸的长度。应当理解本发明考虑具有两个邻接结构域(两者均促成单一螺旋)的寡核苷酸，其具有16个核苷酸的倍数的长度。

通常，在给定合成方法或所得的结构中，具有相同数目的结构域的寡核苷酸还将具有相同长度。例如，在一个实施方案中，所有4结构域寡核苷酸将具有相同长度，并且所有2结构域寡核苷酸将具有相同长度(但该长度将不同于4结构域寡核苷酸的长度)。更具体而言，一些实施方案将使用其为某一长度(例如n个核苷酸)的4结构域寡核苷酸和其为该长度一半(例如n/2个核苷酸)的2结构域寡核苷酸。

本发明考虑包含任何数目的单链寡核苷酸的核酸结构。例如，核酸结构可以包含少至4种和多达1000种(或更多种)寡核苷酸，没有限制。类似地，用于生成核酸结构的多种寡核苷酸可以包含少至4种不同类型的寡核苷酸(如通过核苷酸序列限定的)和多达1000种(或更多种)不同寡核苷酸种类(如通过核苷酸序列限定的)，没有限制。因此，取决于实施方案，核酸结构可以包含4、5、6、7、8、9、10、15、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500种或更多种寡核苷酸。类似地，取决于实施方案，用于生成核酸结构的多种寡核苷酸可以包含4、5、6、7、8、9、10、15、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500种或更多种不同寡核苷酸。

多种寡核苷酸序列在所附和并入的附录中随同提供。附录举例说明形成具有多种形状和大小的3D画布所需的寡核苷酸，如本文描述的。

在本发明的上下文中，寡核苷酸包括DNA例如D形式DNA和L形式DNA和RNA，以及其多种修饰。修饰包括碱基修饰、糖修饰和主链修饰。这些的非限制性例子在下文提供。

可以用于本发明中的DNA变体的非限制性例子是L-DNA(DNA的主链对映体，文献中已知)、肽核酸(PNA)bisPNA夹、假互补PNA、锁核酸(LNA)、或上述的共核酸例如DNA-LNA共核酸。应当理解在本发明的产物和方法中使用的寡核苷酸在性质中可以是同质的或异质的。例如，它们在性质中可以是完全DNA的或它们可以由DNA和非DNA(例如LNA)单体或序列组成。因此，可以使用核酸元件的任何组合。寡核苷酸修饰可以致使寡核苷酸对在某些条件下的降解更稳定和/或更不敏感。例如，在一些情况下，寡核苷酸是核酸酶抗性的。

寡核苷酸可以具有同质主链(例如完全是磷酸二酯或完全是硫代磷酸酯)或异质(或嵌合)主链。硫代磷酸酯主链修饰致使寡核苷酸对核酸酶更不敏感，并且因此在某些条件下更稳定(与天然磷酸二酯主链核酸相比较)。可以对寡核苷酸提供更多稳定性的其他键包括但不限于二硫代硫酸酯键、甲基膦酸酯键、甲基硫代磷酸酯键、硼代膦酸酯键、肽键、烷基键、脱磷酸型键等等。因此，在一些情况下，寡核苷酸具有非天然存在的主链。

寡核苷酸可以在体外合成。用于合成核酸包括自动化核酸合成的方法也是本领域已知的。具有经修饰的主链例如包含硫代硫酸酯键的主链的寡核苷酸，且包括包含嵌合经修饰的主链的那些，可以使用自动化技术采用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化学进行合成。(F.E.Eckstein，"Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach"IRL Press， Oxford，UK，1991，以及M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，Tetrahedron Lett.21，719(1980))芳基和烷基膦酸酯键可以例如如美国专利号4,469,863中所述进行制备；并且例如如美国专利号5,023,243和欧洲专利号092,574中所述的烷基磷酸三酯键(其中荷电氧部分是烷基化的)可以通过自动化固相合成使用商购可得的试剂进行制备。用于制备其他DNA主链修饰和置换的方法已得到描述。Uhlmann E等人(1990)Chem Rev 90:544；Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1:165；Crooke ST等人(1996)Annu Rev PharmacolToxicol36:107-129；和Hunziker J等人(1995)Mod Synth Methods 7:331-417。

寡核苷酸可以另外或可替代地包含在其糖中的修饰。例如，β-核糖单位或β-D-2'-脱氧核糖单位可以替换为经修饰的糖单位，其中经修饰的糖单位例如选自β-D-核糖、α-D-2'-脱氧核糖、L-2'-脱氧核糖、2'-F-2'-脱氧核糖、阿拉伯糖、2'-F-阿拉伯糖、2'-O-(C₁-C₆)烷基-核糖，优选地2'-O-(C₁-C₆)烷基-核糖是2'-O-甲基核糖、2'-O-(C₂-C₆)烯基-核糖、2'-[O-(C₁-C₆)烷基-O-(C₁-C₆)烷基]-核糖、2'-NH₂-2'-脱氧核糖、β-D-呋喃木糖、α-阿拉伯呋喃糖、2,4-双脱氧-β-D-赤式-己-吡喃糖和碳环(例如在Froehler J(1992)Am Chem Soc 114:8320中描述)和/或开链糖类似物(例如在Vandendriessche等人(1993)Tetrahedron49:7223中描述)和/或双环糖类似物(例如在Tarkov M等人(1993)Helv Chim Acta 76:481中描述)。

寡核苷酸可以包含在其碱基中的修饰。经修饰的碱基包括经修饰的胞嘧啶(例如5-取代胞密度(例如5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-二氟甲基胞嘧啶和未取代或取代的5-炔基-胞嘧啶)、6-取代的胞嘧啶、N4-取代的胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮杂-胞嘧啶、2-巯基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、具有稠环系统的胞嘧啶类似物(例如N,N'-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)，和尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)，经修饰的鸟嘌呤如7-脱氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂-7-取代的鸟嘌呤(例如7-脱氮杂-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤)、7-脱氮杂-8-取代的鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-取代的鸟嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(例如N6-甲基腺嘌呤、8-氧代腺嘌呤)、8-取代的鸟嘌呤(例如8-羟基鸟嘌呤和8-溴鸟嘌呤)、和6-硫鸟嘌呤。核酸可以包含通用碱基(例如3-硝基吡咯、P-碱基、4-甲基吲哚、5-硝基吲哚、和K-碱基)和/或芳环系统(例如氟苯、二氟苯、苯并咪唑或二氯-苯并咪唑、1-甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-羧酸酰胺)。可以掺入本发明的寡核苷酸内的特定碱基对是由Yang等人NAR，2006，34(21):6095-6101报告的dZ和dP非标准核碱基对。dZ，嘧啶类似物，是6-氨基-5-硝基-3-(1’-β-D-2'-脱氧呋喃核糖)-2(1H)-吡啶酮，及其沃森-克里克互补物dP，嘌呤类似物，是2-氨基-8-(1’-β-D-1’-脱氧呋喃核糖)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8H)-酮。

合成方法

本发明考虑了通过退火过程合成核酸结构。在一种方法中，一旦单链寡核苷酸已得到鉴定且合成(例如使用商业供应商例如Bioneer)，就将它们在单一容器例如但不限于管、孔、小瓶等等中组合。使用的寡核苷酸的摩尔量将取决于所需结构中的每种寡核苷酸的频率和所需结构量。在一些实施方案中，寡核苷酸可以以等摩尔浓度存在。在一些实施方案中，每种寡核苷酸可以以约200nM的浓度存在。将寡核苷酸置于溶液中。优选地，溶液是缓冲的，尽管退火反应还可以在不存在缓冲液的情况下发生。溶液可以进一步包含二价阳离子例如但不限于Mg²⁺。阳离子或盐浓度可以改变。示例性浓度为约490mM。溶液还可以包含EDTA或其他核酸酶抑制剂，以便防止寡核苷酸的降解。

退火反应通过对溶液加热且随后允许溶液缓慢冷却来进行。反应的温度应足够高，以使任何不希望有的二级结构例如发夹结构解链，且确保寡核苷酸种类不会不正确地与其他非互补寡核苷酸结合。在一些实施方案中，温度因此可以初始升至约100℃、约95℃、约90℃、约85℃、80℃、75℃、70℃、65℃或60℃。可以通过将容器置于热水浴或加热砖块或能够温度控制的装置例如PCR机器中来升高温度。容器可以在该环境中维持数秒或数分钟。通常，约1-10分钟的温育是足够的。

一旦完成在高温下的温育，温度就可以以多种方式下降。温度可以使用计算机算法以自动化方式下降，所述计算机算法使温度下降一定量，且将该温度维持某一时间段，之后使温度再次下降。此类自动化方法可以涉及使温度在每步中下降一度或在每步时下降多度。容器因此可以在相同装置中加热且冷却。

提供了示例性过程。为了实现温度从约80℃至约24℃的下降，温度以3分钟/度的速率(即80℃3分钟，79℃3分钟等等)以一度增量从80℃变成61℃。温度随后以一度增量和约120分钟/度的速率(即60℃120分钟，59℃210分钟等)从60℃变成24℃。该过程的总退火时间为约17小时。依照本发明，在这些条件下，寡核苷酸自装配成预定的和所需的形状和大小的核酸结构。

具体退火过程的例子使用在5mM Tris-1mM EDTA(TE)、40mM MgCl₂溶液中的100-200nM寡核苷酸，并且将溶液加热至约90℃且随后经过约73小时的时期将溶液冷却至约24℃，如上文所述使用在80℃-61℃之间的3分钟/度下降和60℃-24℃之间120分钟/度下降。

复合结构

本发明进一步考虑了本文描述的核酸结构自身可以基本上用作单体或构建砖块，以便形成更高级别或复合结构。本发明的复合结构由使用间隔物-接头彼此连接的核酸结构组成。接头通常不整合至核酸结构，尽管它们可以经由合适的官能团附着至结构。将两种或更多种核酸结构附着在一起的能力允许制备更大大小和复杂性的结构。

这些复合结构的尺寸范围可以为500nm-100微米、或1-1000微米，没有限制。

应用

本发明的核酸结构可以用于多种应用中，包括将从在纳米或微米规模上精确定位且重要排列一种或多种部分获益的那些应用。

例如，结构可以用作模板用于排列或模式化无机材料，例如用于电子、等离子体和量子计算应用中的那些。可以附着至核酸结构的部分包括金属颗粒例如金纳米颗粒、量子点、碳纳米管等等。以这种方式，由本发明提供的核酸结构充当其他部分可以在其上排列的支架和/或其他结构可以以纳米精确度和受控来合成。例如，碳纳米管可以组构成功能分子电子系统；金纳米颗粒的可调谐几何学排列可以用于制备功能分子电子电路和新型等离子体电路；磁性颗粒的组构的、预定的排列可以用于制备纳米感应器或存储装置；并且量子点的组构的和预定的排列可以用于制备新型量子计算机。

在一些实施方案中，部分(例如金纳米颗粒)可以通过与部分和核酸结构连接的互补单链寡核苷酸的核苷酸碱基配对而附着至本发明的核酸结构，如例如实施例5中所述。因此，在一些实施方案中，部分例如金纳米颗粒可以如下排列成不连续模式。在特定位置处(例如在孔和/或通道内)含有单链聚N寡核苷酸(例如单链聚A寡核苷酸、或包含邻接腺嘌呤核苷酸的单链寡核苷酸)的本发明的核酸结构与连接至(例如共价或非共价地附着至)单链聚N寡核苷酸的部分接触，该单链聚N寡核苷酸与核酸结构的单链聚N寡核苷酸互补(例如单链聚T寡核苷酸、或包含邻接胸苷核苷酸的单链寡核苷酸)。在一些实施方案中，单链聚N寡核苷酸为约2至约15个核苷酸。在一些实施方案中，单链聚N寡核苷酸为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在一些实施方案中，单链聚N寡核苷酸是约10个核苷酸的单链聚A、单链聚T寡核苷酸、单链聚G寡核苷酸、或单链聚C寡核苷酸。

在其他方面，本发明考虑了本发明的核酸结构可以是金属化的，以制备用于电子学的部件。DNA管已金属化成纳米线。除其他事物外，本发明的核酸结构的受控金属化还可以用于制备具有受控的直径和因此受控的电子特性的纳米线。进一步地，新型分子电子部件和电路可以通过基于由本发明提供的核酸结构的支柱(strut)的受控的金属化进行制备。

核酸结构还可以用作用于生物或有机分子的模板。此类模板分子和系统可以例如用于诊断和研究应用中。生物或有机分子包括但不限于蛋白质和肽例如抗体和抗体片段、酶和酶结构域、受体和受体结构域、生物配体例如激素及其他信号传导部分、多糖、细胞、细胞聚集体等等。不同策略已对于在DNA晶格上的模板蛋白质得到证实。蛋白质以可编程的纳米精确度组构成预定的几何学模式可以例如用于研究生物动力蛋白的合作行为。某些核酸结构还可以用于细胞或组织培养中。在这些实施方案中，例如，结构可以用生物部分例如生长因子和细胞外基质组分进行官能化。以这种方式，官能化的结构可以在培养中排列，以模拟二维或三维体内环境。作为进一步例子，考虑可以制备更高级别的官能化结构，其显示出对于任何特定生物部分的浓度梯度。这些系统随后可以用于研究关于任何数目的细胞类型的细胞发育、分化和/或运动。在另外其他情况下，本发明的更高级别结构可以用作用于体外或体内细胞生长和分化的支架。

在多种这些应用中，本发明进一步考虑了一旦由本发明的结构组成的核酸支架停止作为模板，它就可以被保留或可以被去除(例如通过消化或降解)。例如，如果目标是制备金颗粒的预定的排列并且此类颗粒根据需要独立于核酸支架而彼此连接，则支架可以被去除，仅留下金纳米颗粒网络。

算法、程序和计算机系统

本发明考虑了用于生成具有特定形状和大小的3D核酸结构的算法。这些算法涉及具有足够大小的3D画布的起点，其中促成画布中的任何位置的寡核苷酸和结构域是已知的。最终用户随后在画布内限定所需结构，并且算法鉴定在此类结构的生成中何种寡核苷酸待包括，何种待排除，并且何种待替换。示例性算法步骤显示于图17的程序1、2和3中。本发明考虑了此类算法可以人工或通过计算机方法执行。

可以与本发明的一些实施方案结合使用的计算机系统的举例说明性实现可以包括一个或多个处理器和一个或多个计算机可读非临时性存储介质(例如存储器和一个或多个非易失性存储介质)。处理器可以控制以任何合适方式对存储器和非易失性存储介质写入数据以及从存储器非易失性存储介质读取数据，因为本文描述的本发明方面并不限于这点。为了执行本文描述的功能性中的任一种，处理器可以执行在一个或多个计算机可读存储介质(例如存储器)中存储的一个或多个指令，所述计算机可读存储介质可以充当存储用于由处理器执行的指令的非临时性计算机可读存储介质。

本发明的某些上述实施方案可以以多种方法中的任一种实现。例如，实施方案可以使用硬件、软件或其组合实现。当在软件中实现时，软件代码可以在任何合适的处理器或处理器集合上执行，无论所述处理器或处理器集合是在单个计算机中提供还是在多个计算机中分布。应当理解执行上述功能的任何部件或部件集合可以在属类上视为控制上述功能的一个或多个控制器。一个或多个控制器可以以众多方式实现，例如使用专用硬件或通用硬件(例如一个或多个处理器)，其使用微代码或软件编程以执行上述功能。

在这点上，应当理解本发明的实施方案的一种实现包括由计算机程序(例如多个指令)编码的至少一个非临时性计算机可读存储介质(例如计算机存储器、软盘、光盘、磁带等)，其当在处理器上执行时，执行本发明的实施方案的上述功能。计算机可读存储介质可以是可携带的，从而使得存储于其上的程序可以装载到任何计算机资源上，以实现本文讨论的本发明的方面。另外，应当理解提及当执行时执行上述功能的计算机程序并不限于在主机上运行的应用程序。相反，术语计算机程序在本文中以一般含义使用，以指可以用于编程处理器以实现本发明的上述方面的任何类型的计算机代码(例如软件或微代码)。

包括下述实施例用于举例说明的目的，并且不预期限制本发明的范围。

实施例

实施例1.3D DNA砖块纳米结构跨越规模的自装配

为了更好地理解我们的方法且证实其能力，设计且测试多种大小和长宽比的3DDNA砖块纳米结构(图2)。

随机序列设计。寡核苷酸(也称为“DNA砖块”)的序列通过碱基对(A-T，G-C)对3D纳米结构的随机指定进行设计。我们首先测试具有随机序列或专门设计的序列的两种形式的6H×6H×64B，并且观察到可比较的自装配结果(图8)。我们还测试了在4H×12H×120B上的三组随机序列，并且也观察到类似的自装配得率(数据未显示)。基于这些结果，我们使用随机序列设计了另外的纳米结构。通过定制程序和UNAfold的组合生成序列，所述UNAfold是在mfold，rna，Albany网站上可获得的程序。通过考虑下述三个标准，首先生成第一组寡核苷酸(X砖块)的序列：(1)链的平滑结合能(每条链具有相似的GC含量)；(2)使每条链的二级结构降到最低；和(3)减少序列对称。随后根据其与第一组的互补性，生成第二组寡核苷酸(Y砖块)。关于使用随机序列和专门设计的序列装配的结构的产物得率是相似的。虽然随机序列设计策略在本文中用于合成大多数纳米结构，但还可以使用序列设计策略并且用于进行中的研究中。

保护者(Protector)DNA砖块。已证明在DNA双链体的末端处包括不成对的单链有效减轻平端叠加(P.W.K.Rothemund(2006))。不成对的单链8nt结构域从3D纳米结构中的所有DNA双链体的每一个5'或3'末端突出(图1C和1D)。这些8nt结构域的序列可以替换为八个邻接胸腺嘧啶，以防止不需要的相互作用。具有经修饰的头或尾结构域的DNA砖块分别指定为“头保护者”或“尾保护者”。

边界DNA砖块。16nt半砖块可以与沿其螺旋方向而在先的32nt全砖块合并，形成长48nt的边界链(图9和10)。我们观察到当实现长边界设计时，关于6H×6H×64B的自装配的显著改善，可能是由于靶纳米结构形成的加速成核作用。因此，该合并策略应用于所有3D纳米结构。

6H×10H×128B的表征。我们首先构建6H×10H×128B长方体，其由459条链(7680bp，在大小中类似于基于M13的DNA折纸，关于设计细节参见图S11，S12)组成。未纯化的DNA链以额定相等比混合在一起，而无需化学计量学的小心调整。为了测定最佳退火条件，我们测试了用于6H×10H×128B自装配的两种退火坡度(24小时退火和72小时退火)，两种链浓度(100nM和200nM/链)和八种MgCl₂浓度(10、20、30、40、50、60、70、80mM)。随后对等量的每种样品(2pmol/链)实施溴化乙啶(EtBr)染色的2％琼脂糖凝胶电泳(图2B，2C)。3D纳米结构的得率使用琼脂糖凝胶电泳进行估计。图11证实此类测定法的一个例子。对退火样品实施琼脂糖凝胶电泳，以使产物与游离链和不需要的聚集体分开。产物得率通过比较产物条带(在黑色框中标记)的荧光强度与3k bp梯状条带(在灰色框中标记)的荧光强度进行估计。两种荧光强度首先扣除本底噪声，且随后用于计算。强度使用ImageJ软件进行测量：

产物质量＝产物条带的荧光强度/3kb梯状条带的荧光强度×60ng

得率百分比随后计算为：

得率百分比＝产物质量/所有链的质量

EtBr染色的效率可以在双链3kbp梯状条带和我们的3D结构之间不同。因此，得率的绝对数可以不同。然而，这种测定法尤其用于比较纳米结构之间的自装配结果且用于筛选3D结构的最佳退火条件。最大得率(370ng，或约4％)在下述条件时达到：200nM/链，72小时退火，40mM MgCl₂。该得率与先前报告的相似大小和长宽比的3D DNA折纸(10H×6H、8H×8H、6H×10H和4H×16H)的4％-14％得率可比较(S.Douglas，等人，Nucleic AcidsResearch 37，5001(2009))。值得注意的是折纸

折纸得率估计为得率＝掺入产物内的支架链/总支架链。不考虑过度订书针链(通常超过支架链5-10倍)的损失。本文使用的最佳40mM MgCl₂高于用于3D折纸折叠的最佳30mM(或更低的)MgCl₂浓度(S.M.Douglas，等人，Nature 459，414(2009))。柱纯化的产物(～50％回收效率(图2D))通过琼脂糖凝胶电泳作为单一条带迁移，并且在透射电子显微镜检查(TEM)下出现，具有预期形态和测量的0.34nm(±0.01nm SD)/碱基对高度和2.5nm(±0.2nm SD)/螺旋宽度的尺寸。在6H×10H128B的琼脂糖凝胶纯化后，得率还通过计数TEM图像中的结构进行计算。该“TEM得率”与纯化结构的稳定性有关。取决于存在的缺陷量和程度，TEM图像中的颗粒分类为“良好”、“较小缺陷”或“较大缺陷”。最终得率通过计数总颗粒中的良好颗粒百分比进行测定。大多数微小缺陷在接近于结构的螺旋末端的位置处出现，可能指示链在这些位置处易于解离。另外，这些得率一般指示颗粒的稳定性。值得注意的是成像偏差可能影响测量的准确度。估计的55％TEM得率通过计数TEM图像中的完整颗粒百分比来获得(图12)。该TEM得率与先前报告的3D正方形晶格DNA折纸的得率可比较(关于6H×12H×80B的27％得率，关于8H×8H×96B的59％得率)(Y.Ke，等人，J.Am.Chem.Soc 131，15903(2009))。

位于DNA双链体的任一末端处的链仅具有一个或两个8nt随机序列区段，其用于与其他链碱基配对(图13B)。因此，合理假定是与位于结构更深处的链相比较，这些“头”或“尾”链更不太可能在退火期间掺入且在退火后更易于与3D结构解离。可以想象增加这些“头”或“尾”链的掺入效率的设计策略有利于3D结构的总体自装配质量。我们用经修饰的设计(图13C)测试该假设，以改善“头”链的掺入效率。类似修饰可以同样应用于“尾”链。设计方法包括两步。(1)交叉的缺失：如由箭头指示的(图13B)，去除第一列和第二列交叉。(2)链的连接：如图13C中所示，在相同双链体中的每对链合并在一起以形成更长的单链。这些新链是具有三个随机序列结构域的32nt长，或具有五个随机序列结构域的48nt长(边界链)。通过重新设计6H×10H×128B的“头保护者”以使其与其附近链合并(图13)，经修饰形式的6H×10H×128B-M显示超过6H×10H×128B的190％的得率改善和17％的TEM得率改善(图14)。尽管“头”链的修饰预期改善SSD 3D结构的自装配，但缺失导致更低的交叉密度，尤其是对于具有更短螺旋的结构，所述更低的交叉密度可以产生局部变形。因此，我们仅尝试该经修饰的形式作为3D结构可以通过实现专门设计规则得到稳定的概念证明。本文使用的其他3D结构使用最初策略进行设计。其他方法例如交联(A.Rajendran，等人J.Am.Chem.Soc.133，14488(2011))，可以证明是用于稳定3D DNA纳米结构而无需牺牲设计弹性的更一般方法。

不同大小的纳米结构。设计含有9个螺旋、16个螺旋、36个螺旋、60个螺旋、96个螺旋和144个螺旋的六组纳米结构，随后使用先前对于6H×10H×128B自装配鉴定的最佳条件退火(数据未显示)。我们观察到对于所有设计的正确产物条带(图2G和15)，除了长度为32bp(并且因此含有在每对附近螺旋之间的一个交叉)的那些之外。得率从低于1％到约80％不等(图15)。更小的设计显示出在每组内的更高得率百分比，除了长度为32bp的那些之外。对于最小物体3H×3H×64B(1,296nt或约0.43MDa)观察到所有设计的最高得率(80％)。对于8H×12H×120B、4H×24H×120B和12H×12H×48B观察到最低得率，其得率太低(低于1％)而无法准确测量。关于每种纳米结构的完整颗粒的测量尺寸与我们的设计一致，提示不同大小的3D自装配是成功的(表1)。装配的最大DNA结构为8H×12H×120B(由728条链形成)和4H×24H×120B(由710条链形成)，其在分子量中是相同的(24,576nt，或约8MDa，比基于M13的DNA折纸多60％质量)。

实施例2.由3D 10×10×10体素画布制备的错综复杂的形状

应当理解基于本文提供的教导，可以使用本文描述的方法生成多种画布(和随后的结构)。相应地，一种特定画布的该例证是非限制性的。

我们的方法的模块性经由通过10H×10H×80B长方体(10×10×10体素)3D画布制备的102种形状的成功构建和表征得到证实。(图3A和图16)。每个体素对应于通过一对X和Y砖块的相互作用形成的8bp(2.5nm×2.5nm×2.7nm)。

表1.3H×3H、4H×4H、6H×6H、6H×10H、8H×12H、4H×24H、12H×12H的统计学

DNA砖块和衍生物。在定制形状设计中，3D画布中的任何DNA砖块均可变成边界砖块(即在层的边缘处暴露)或保护者砖块(即在第一层或最后一层中)，甚至同时为两者。因此，生成经修饰形式的每个砖块，具有结构域缺失(例如对分成半砖块)、聚胸苷序列置换(例如变成保护者砖块)和边界砖块合并(例如变成48nt边界砖块)的所有组合，以适应所有可能性(图16)。总之，通过计算机程序生成4455条链(总共138,240nt)，以保证任何形状均可用头/尾保护者和砖块长边界砖块进行装配。示例性序列在随同提交且视为本公开内容的一部分的所附附录中提供。

设计过程。我们首先构建10×10×10体素3D画布，其中每个XYZ体素(其中Z在螺旋方向中)对应于8bp双链体(2.5nm×2.5nm×2.7nm)。形状设计通过选择且去除特定组的体素进行介导。通过使用3D可视化软件绘制3D画布，能够在图形界面上编辑体素，以设计且显现以单一体素分辨率的形状(图3B和图17)。随后多重形状的体素信息通过定制程序解释，以生成涉及每种形状形成的链列表。该列表随后进行处理，以指导自动化液体处理自动机从源板中选择DNA链且将它们吸取到产物板的孔，以高流通量方式混合多种形状的链。完全设计工作流显示于图17和18中。

3D形状的设计。图16证实用于制备任意3D形状的4结构域链及其衍生物。不连续的DNA结构的自装配通常被不需要的聚集妥协，当结构含有(1)不成对的单链结构域，或(2)DNA双链体的未保护的平端时，不需要的聚集发生。通过将任何不成对的单链结构域的DNA序列变成八个邻接T，C至E中所示的不同类型的链设计为避免这两种情况。该策略导致总共十四个类型的链衍生物的存在，以覆盖当一个、两个或三个体素对于任意形状设计不存在时的所有可能性。如果包括所有十五个类型的链(A至E)，则可以用8bp(1体素)分辨率设计任何任意形状。

在十四种链衍生物中，其中仅八种实际上在我们的设计和实验中实现。排除其他六类链衍生物(在图16D和16E中用*标记)。图16D中去除的两种衍生物对于我们的任意形状设计视为以低频率方式出现。图16E中去除的四种衍生物由仅一个8nt随机序列结构域组成，因此它们对DNA结构的掺入视为较不稳定的。通过对于每种形状掺入超过一百个“一体素”衍生物，我们已重新设计两种形状(形状45和形状55，关于折纸形状参见图3E)。两种修饰的形状均未能产生任何靶结构，如通过在琼脂糖凝胶上产物条带的缺乏证明的(数据未显示)。然而，该简单实验未提供关于个别“一体素”衍生物的掺入效率的任何明确指示。值得注意的是链的这些衍生物仅在形状的边界处出现。上述六类衍生物的排除实际上看起来对形状的总体外观具有很小的作用。

我们还包括了两类48nt“边界链”(图10)，以改善形状的自装配。如最后部分中所述，每个48nt“边界”链用于取代32nt链和16nt链。总的来说，对于每条链，对于我们的设计总共产生了(9+2)＝11种原始和衍生物。注意到位于3D画布的表面处的链具有更少衍生物。

每条链通过它覆盖的体素位置命名(图16G)。每对数目表示一个体素。第一个数目指示螺旋，并且第二个数目指示螺旋上的体素位置。数目(0，0)意指具有八个邻接T的结构域或空结构域。链的体素信息用于鉴定可以构成形状的链(图17)。

下文为用于设计3D形状的方法例子。

生成所有DNA链：(1)使用定制程序构建3D画布(图6)。我们在本文中使用10×10×10体素画布作为例子。(2)定制程序生成用于任意形状的自装配的链及其衍生物(部分S6.1.1)，所述任意形状可以由10×10×10体素3D画布制备。所有序列及其相应的体素信息随后贮存于单个文本文件ALL-strand.txt中。总共生成4455条链(138,240nt)用于制备任意形状。

构建3D模型和编辑形状：(3)使用商业3D建模软件(我们使用在Strata网站上的StrataTM 3D)，构建含有所有10×10×10体素的3D模型。每个体素由一个小球体表示(图18A)。商业建模软件提供去除/添加体素且从不同角度显现形状的方便工具。(4)通过从10×10×10体素3D画布中去除体素来设计形状，如图18B中所示。在这个步骤时，用单个体素(8bp)分辨率设计形状。每种形状均与其体素信息一起存储于单个文件中。

基于它的体素信息鉴定用于每种形状的链：(5)我们的定制程序读取体素文件。基于形状的体素信息，程序搜索序列文件ALL-strand.txt，且生成用于所设计形状的自装配的链列表。程序首先仅搜索32nt和16nt链以生成形状。随后程序测定32nt和16nt链的任何对是否可以合并在一起，以形成48nt“边界”链(图16F)。如果如此，则程序将用48nt“边界”链取代32nt链和16nt链。(6)由于上文描述的我们的链设计，一些体素可能不由我们在ALL-strand.txt中的链覆盖。在该搜索过程期间，程序将自动去除不能被覆盖的体素且再运行链寻找过程。注意到仅少量体素(在形状的边界处)将从形状中去除，因此缺失不改变形状的总体外观。注：计算机程序可以处理多重形状。因此用户可以首先设计所有形状，且同时使用计算机程序生成用于所有形状的链列表。(7)程序结束搜索链，生成所有形状的链列表。还报告从每种形状中缺失的体素。用户可以检查是否存在错误或是否去除太多体素。例如，下述输出显示从形状23中去除的21个体素(关于形状，参见图3E)：[[0，1]、[0，10]、[1，10]、[2，1]、[3，10]、[4，1]、[5，10]、[6，1]、[7，10]、[8，1]、[9，10]、[18，10]、[22，10]、[36，10]、[44，10]、[54，10]、[66，10]、[72，10]、[88，10]、[90，9]、[90，10]]。

实现该操作，成功装配102种不同的3D形状(图3E)。形状在相同退火条件下(在0.5x TE、40mM MgCl₂缓冲液中的72小时退火)退火，并且通过琼脂糖凝胶电泳和TEM成像(对未纯化的样品)进行表征。

形状1至形状17。使用一组形状研究基本设计限制，所述组的形状各自含有通过中间两层“连接砖块”连接的两个4H×10H×80B砖块(形状2-17)。连接砖块系统设计为沿Y轴(形状2-9)或Z轴(形状10-17)具有递减数目的体素。由于形状对称，沿X轴消除体素应具有与沿Y轴消除体素相同的影响。琼脂糖凝胶电泳结果揭示当连接砖块对于两种系统变得更小时，形状变得更不稳定(数据未显示)，但降低Z轴连接数目看起来对稳定性具有比降低Y轴连接数目更大的作用。沿Y轴仅具有2体素连接的形状9导致少于50％破坏的纳米结构。相比之下，大多数形状17(沿Z轴2体素)颗粒破坏，尽管琼脂糖凝胶和TEM结果的确显示形成小部分的良好颗粒。总之，这些观察提示对于更稳定的特点，至少两个连续X轴或Y轴体素(2个螺旋)和三个连续Z轴体素(24bp)的安全设计标准。然而，如下述实验中证实的，更小的特点(例如两个连续的Z轴体素，形状33-37)可以稳定存在于其中这些特点推测通过紧密接近的体素强化的某些形状中)。

固体形状18-31。设计许多固体形状包括简单几何形状和更错综复杂的物体的Z方向挤出。这些物体的形成得率和图像提供关于我们的方法的结构完整性的更多了解。特别地，偶然发现形状26和27，两者均含有仅在一个边缘上锚定的3螺旋厚的附件，而无这些突出或含有缺陷。因此，尽管落入我们的设计标准内，但此类薄特点比更多支持或更厚特点更不稳定。

闭合空腔形状32-42。先前，证实具有闭合空腔的3D DNA折纸的少数例子，包括盒(E.S.Andersen(2009))、四面体(Y.Ke(2009))以及球体和椭圆体(D.Han(2011))。此处，制备一系列具有不同大小的长方体空腔的“空盒”(形状32-37)。本文结果还证实更复杂的空腔设计(例如正方形环、十字形和三角形)是可实现的(形状38-42)。

开放空腔形状43-62。构建具有不同宽度、深度和几何学(形状43-53)的单个空腔和多重平行空腔(形状54-56)的形状。还构建具有非交叉垂直隧道(形状57)、转弯隧道(形状58)和交叉隧道(形状59-60)的形状。此外，结果显示长方体的外表面可以进行修饰，以产生来自不同角度的不同外部视图，如通过形状60-62证实的。这些形状显示通过本文呈现的模块自装配可实现的复杂性。

特点在于固体基底的形状63-100。设计在10×10×6体素的固体基底上的4体素厚度的细微特点或不连续特点。这些包括数字(形状(形状65-74)和拉丁字母(形状75-100)的完全集合。同心环结构(形状63和64)显示可以制备小至一体素的特点。此类观察进一步显示通过24bp的2个螺旋束的设计标准松散地依赖于结构的周围环境。由于固体基底的2D特点和厚度之间小数目的体素差异，TEM图像显示在两个表面之间的低对比。然而，这种方法突出显示使用这些3D特点制备否则通过2D表面无法达到的多部分挤出特点的潜力。

对于本文描述的大多数形状，得率在几个百分比和30百分比之间(五个3D DNA折纸纳米结构的得率报告为7％-44％(15))。仅五种形状具有高于30％的得率，并且三种形状具有低于1百分比的得率。尽管成功制备多种复杂形状，但一些形状显示出不需要的特性。例如，复杂形状例如形状60-62显示在TEM图像中低百分比的完整颗粒(小于1％)。如果形状从琼脂糖凝胶条带中提取，则形状的一些细微特点(例如形状27的两个翼)可以受损害或甚至全部去除。四种失败设计不产生在琼脂糖凝胶上的明确产物条带(图S55)。在固体基底上具有细微特点的两种其他设计显示在琼脂糖凝胶上的强条带。然而，特点在TEM图像中不能证实。可能自装配对于最后两种形状是成功的，但特点太小而无法成像。

实施例3.3D DNA模块自装配的一般性

为了进一步探究模块DNA自装配的多样性，进行下述实验：(1)设计具有不同晶格几何学的形状，其已通过DNA折纸得到证实(P.W.K.Rothemund(2006)；S.M.Douglas(2009)；Y.Ke，等人J.Am.Chem.Soc(2012))，和(2)使用其他类型的模块DNA基序测试3D自装配。

单层(2D)纳米结构。概念上，单层(2D)DNA纳米结构可以通过从3D DNA砖块纳米结构中“提取”层进行构建(图4A)。测试30H×1H×126B(数据未显示)。将其有意修饰为10.5bp/转角代替10.67bp/转角(对于3D设计)，以便获得相对平坦的纳米结构。基于琼脂糖凝胶电泳的结果，得率估计为18％(数据未显示)。在AFM图像的基础上，30H×1H×126B的尺寸测量为0.31nm(±0.01nm SD)/bp，2.6nm(±0.3nm SD)/螺旋。

3D蜂窝晶格纳米结构。我们随后制备10.8bp/转角(33.3°扭曲/bp)3D蜂窝晶格和六角形晶格DNA纳米结构。四类4结构域DNA链设计用于3D蜂窝晶格DNA纳米结构(图4D，4E)。成功构建且表征6H×6H×84B-HC纳米结构(图4D，并且数据未显示)。TEM图像中的颗粒测量为13nm(±0.9nm SD)×22nm(±1.0nm SD)×29nm(±1.2nm SD)。得率估计为30％(数据未显示)。

3D六角形晶格DNA纳米结构。两类链应用于构建3D六角形晶格DNA纳米结构：具有多9nt结构域的线性链和具有通过交叉连接的两个9nt结构域的18nt链(图4G，4H)。构建且表征6H×7H×108B-HL纳米结构(图4I，并且数据未显示)。TEM图像中的颗粒测量为13nm(±0.8nm SD)×18nm(±1.1nm SD)×35nm(±2.2nm SD)。得率估计为26％(图S64)。

其他基序设计。与“单向”设计形成对比，链还可以设计为指向3D纳米结构中的相反方向。此处我们证实其中奇数数目层中的链指向Z方向并且偶数数目层中的链指向Z+方向的设计策略(图19B)。我们设计且测试6H×6H×64B-A(交替设计)和两种6H×6H×64B纳米结构(其应用两种其他DNA基序设计)的自装配(数据未显示)。6H×6H×64B-A的成功自装配通过琼脂糖凝胶电泳和TEM成像加以证实。我们的结果还证实链设计具有比其他两种基序设计高得多的得率。与纳米结构的大小无关，交叉在此类交替设计中对称排列。这些设计的成功描绘模块DNA自装配的通用方法。

实施例4.DNA砖块晶体

DNA砖块晶体的设计。所有晶体均使用10.67碱基对(bp)/转角扭曲密度进行设计，所述10.67碱基对(bp)/转角扭曲密度略微偏离天然B形DNA的10.5bp/转角扭曲密度。在装配结构中，DNA砖块是32核苷酸(nt)链，其可以在含有四个8-nt结合结构域的简单样砖块模型(图20A，上)中描绘。各自具有不同序列的许多砖块在一步退火反应中装配成预定的三维结构(图20A，下)。

使用在不连续的三维DNA砖块结构之间的“连接”砖块获得DNA砖块晶体。设计策略在小型6H(螺旋)×6H(螺旋)×24B(碱基对)长方体结构上得到证实。对在不连续的DNA砖块设计的表面上的DNA砖块进行修饰，以连接个别结构且沿X轴、Y轴和Z轴个别延伸晶体的生长，以生成一维生长晶体，或组合延伸晶体的生长，以生成二维生长晶体(图20D和图24A-24C)。为了实现沿Z轴的多聚化，对第一层结构域的序列进行修饰，以与最后一层结构域中的那些互补。沿X轴或Y轴的多聚化通过沿X轴或Y轴用新的32-nt砖块取代边界上的砖块来实现。这些新的32-nt砖块各自含有与长方体一侧互补的两个结构域和与长方体相对侧互补的另外两个结构域。因此，这些32-nt砖块可以连接长方体单体，以实现连续生长。

尽管DNA砖块晶体由重复单位设计，但连接砖块在大小和功能中与其他砖块相同。因此，与DNA折纸晶体的分层生长不同，本发明的DNA砖块晶体的生长可以是非分层的(图20C，上)。砖块在晶体生长期间个别掺入晶体内，而无需首先形成重复功能单位。信息分层-重复单位中的砖块的序列独特性-在最终晶体结构中得到保存。相比之下，DNA折纸结晶化是分层过程，其中折纸结构必须完全形成且随后掺入晶体内(图20C，下)。

使用该设计策略，我们构建且测试三组晶体：(1)沿Z轴延伸的一维“DNA束”晶体(称为Z晶体)；(2)沿Z轴和X轴延伸的二维“DNA多层”晶体(称为ZX晶体)；和(3)沿X轴和Y轴延伸的二维“DNA森林”晶体(称为XY晶体)(图20D和20E)。使用重复单位的不同设计，可以制备具有预定的维度和模式的DNA砖块晶体(图20F)。相应地，晶体设计命名为“[生长方向]-[重复单位的大小]-[其形状的基本特点]”。如同不连续的DNA砖块结构，如本文描述的，随机生成所有DNA砖块晶体的序列。

通过在1×TE/MgCl₂(5mM Tris、pH 7.9、1mM EDTA、40mM MgCl₂)缓冲液以等摩尔比(100nM每条链)将所有未纯化的DNA砖块混合在一起来装配晶体，而无需小心调整化学计量学。随后对混合物实施单步72小时或168小时热退火，随后为TEM成像而无需任何纯化。每个DNA螺旋的有效直径在所有3D晶体中均测量为2.5nm。

一维生长DNA-束晶体(Z晶体)。我们首先制备两组Z晶体：(1)具有不同横截面形状的固体Z晶体，包括Z-6H×6H×32B、Z-8H×8H×32B、和Z-10H×10H×32B、Z-8H×8H×128B-螺旋、Z-43H×32B-三角形、和Z-44H×32B-六角形(图21A)；和(2)管形Z晶体、Z-56H×32B-隧道、Z-60H×64B-隧道、和Z-108H×32B-隧道(图21B)。

所有Z晶体均显示出在TEM图像中的总体右手扭曲。总体扭曲应理解为对由10.67bp/转角缠绕不足设计生成的压力的应答。扭曲量级受Z晶体的横截面形状影响。Z晶体容易地形成。大多数Z晶体可以使用24小时退火方案生长至长度几微米。然而，更长的退火方案通常获得更长的Z晶体。因此，我们使用72小时退火方案用于所有Z晶体。

这些固体Z晶体使用32bp重复单位进行设计。Z晶体的正方形横截面分别含有6H×6H、8H×8H和10H×10H长方体。我们随后产生具有更复杂的横截面形状的晶体。成功构建展示沿Z轴的螺旋通道的Z-8H×8H×128B-螺旋晶体。通道在TEM图像中明确可见。我们随后构建两种更简单的设计：Z-43H×32B-三角形和Z-44H×32B-六角形。两者均显示与三种正方形横截面Z晶体可比较的高装配质量。

随后测试三种管形Z晶体。Z-56H×32B-隧道的横截面是具有从中心去除的2H×4H矩形的8H×8H正方形。Z-108H×32B-隧道的横截面是具有从中心去除的6H×6H正方形的12H×12H正方形。Z-60H×64B-隧道是在该组内最复杂的设计。它含有沿Z轴集中的2H×2H正方形隧道。另外，8H×2H×24B孔沿Z轴在每一个64bp中与2H×2H正方形隧道交叉。TEM图像显示看起来仅含有一半所设计的DNA螺旋的许多结构。这可能是由于周期性8H×2H×24B孔减弱沿Y轴在顶部一半和底部一半之间的连接。

Z晶体的另外TEM图像显示于图25A-25H中。

二维生长DNA多层晶体(ZX晶体)。随后构建两组ZX晶体：(1)固体ZX晶体–ZX-4H×4H×32B-长方体、ZX-4H×6H×32B-长方体、ZX-4H×10H×32B-长方体和ZX-4H×20H×32B-长方体，其分别含有4、6、10和20层DNA螺旋(图22A-22C)；和(2)具有隧道或孔的ZX晶体–ZX-32H×64B-通道、ZX-32H×64B-交叉通道、ZX-6H×6H×64B-孔和ZX-96H×64B-交叉通道(图22D和22E)。

我们观察到所有ZX晶体均沿Z轴比X轴更快速生长。在一些情况下(例如X-6H×6H×64B-孔晶体)，沿Z轴的生长快得多，导致在TEM图像上出现的带状ZX晶体。该现象提示沿Z轴(螺旋轴)的晶体生长比沿X轴或Y轴的晶体生长更容易实现。这可能是由于(1)Z轴生长导致更多π-π碱基堆积；和/或(2)X轴或Y轴生长需要克服将带负电的DNA主链彼此紧密堆积的额外能量惩罚。大多数ZX晶体使用72小时退火方案产生，除了最复杂的ZX晶体设计(在成像前退火168小时的ZX-96H×64B-交叉隧道)之外。所有ZX晶体均显示少量右手扭曲，其起于10.67bp/转角缠绕不足设计。因此，我们观察到在TEM图像中晶体有时在自身之上弯曲且着陆。然而，关于ZX晶体的扭曲量级看起来比Z晶体少得多，因为弯曲位置通常在ZX晶体上相隔几微米观察到。

由4H×4H×32B单位设计四种固体ZX晶体，所述4H×4H×32B单位含有4层、6层、10层或20层螺旋。ZX晶体的厚度直接在其中晶体在TEM图像中折叠的位置处进行测量(图22C)。4层、6层、10层或20层ZX晶体的厚度分别测量为约10nm、15nm、25nm和50nm，显示晶体完全形成，并且每个DNA螺旋直径为约2.5nm。我们首先由6H×6H×32B长方体单位设计三种ZX晶体。从长方体中去除四个螺旋，以生成ZX-32H×64B通道设计。第二种ZX-32H×64B-交叉通道设计通过从ZX-32H×64B-通道中去除2H×32B通道而生成。第三种ZX-6H×6H×64B孔设计含有在每个长方体单位中沿Y轴的2H×4H×32B垂直孔。该设计获得窄而长的晶体，可能是由于沿X轴的较少连接。最复杂的ZX晶体为ZX-96H×64B-交叉隧道晶体。它的重复单位可以视为10H×10H×64B(6400bp)长方体，其具有沿Z轴的2H×2H×64B孔和沿X轴的10H×2H×24B孔。实现彼此垂直运行的两组无接触隧道。两组隧道通过DNA螺旋的两个固体层分开。此类合理设计的3D多孔特点使用常规折纸方法更难以达到。

ZX晶体的另外TEM图像显示于图26A-26H中。

二维生长DNA-森林晶体(XY晶体)。最后，我们制备两组XY晶体：(1)固体XY晶体–XY-4H×4H×64B-长方体、XY-4H×4H×128B-长方体、XY-4H×4H×192B-长方体和XY-4H×4H×256B-长方体(图23A和23B)；和(2)复杂XY晶体–XY-32H×64B-孔、XY-32H×128B-孔、XY-4H×8H×96B-通道和XY-4H×4H×32B-管(图23C和23D)。

XY晶体是消除沿DNA螺旋轴的生长的二维生长晶体。相比之下，所有先前的二维DNA晶体均实现DNA螺旋轴生长。因为沿X轴或Y轴的晶体生长比沿Z轴的生长更困难，所以72小时退火方案通常不产生XY晶体，或者产生沿X轴或Y轴小于几百纳米的XY晶体。因此，我们使用168小时退火方案用于图23中的所有XY晶体。XY晶体的生长是等向性的并且不显示明显的方向优先，因为两个生长方向(X轴和Y轴)均垂直于DNA螺旋轴。

XY晶体在我们的图像中未显示任何总体右手扭曲。为了简化分析，我们假定XY晶体形成含有n个螺旋的完美圆柱体。圆柱体弧度中的总体扭曲θ＝TL/JG，其中T是起因于缠绕不足设计的应用的转矩，L是螺旋长度，G是螺旋的模量刚性，并且J是扭转常数。前三个参数可以视为常数。根据横截面半径(XY平面)的圆形的扭转常数J可以用下式约计：J＝πr⁴/2，其中r是圆形横截面半径。因此，θ与r⁴或n²成反比。当XY晶体生长且n接近1时，总体扭曲快速减轻并且可以不再观察到。

XY晶体表面的平坦是对于一些应用的期望特性，因为客体分子的位置和方向即使在溶液中也可以得到精确控制。相比之下，扭曲结构(例如ZX晶体)或弹性结构(例如单层DNA折纸晶体)在溶液中的构象难以准确预测。另外，XY晶体提供用于排列物质的容易平台，因为晶体在表面上暴露非常大量的DNA螺旋。官能化的材料可以方便地连接至DNA螺旋的末端，所述DNA螺旋在每个维度中以2.5nm分辨率紧密堆积。

可变厚度的固体XY晶体由4H×4H长方体单位设计。使用4H×4H长方体单位的不同长度，生成厚度为64bp、128bp、192bp和256bp的四种XY晶体。这些固体XY晶体的厚度无法直接由TEM成像测量，因为它们是完全平坦的。如果每个碱基对对应于B形DNA的标准0.33nm长度，则四种晶体的厚度应分别为约21nm、42nm、63nm和84nm。

构建XY-32H×64B-孔和XY-32H×128B-孔晶体。两种设计均含有周期性2H×2H(5nm×5nm)孔，其在每种维度中通过四个螺旋(10nm)分开。两种晶体结构类似21nm和42nm厚的多孔膜结构。为了证实可以构建具有表面特点的非多孔结构，我们制备XY-4H×8H×96B-通道晶体。它含有固体64bp(42nm)尾碱基和平行通道。通道为宽度4个螺旋(10nm)、高度32bp(21nm)且通过4层螺旋分开。

XY晶体的另外TEM图像显示于图27A-27I中。

特别有利的XY晶体为XY-4H×4H×32B-管晶体。它使用与其他XY晶体相同的设计策略进行设计。这种薄的XY晶体(32bp或10.6nm)形成管结构代替平坦的2D晶体。不受理论束缚，我们假设管形成是由于螺旋间连接的不均匀分布(图28A-28C)。因为XY-4H×4H×32B-管中的螺旋相对短，所以这是每对附近螺旋之间的唯一一个连接。连接沿Y轴均匀分布。沿X轴，一半连接位于结构的中间，并且另一半位于结构的一侧上。因此，不受理论束缚，我们假设晶体在相对侧处扩展且形成管。这些管很窄且可以生长至长度几微米(图29)。管的直径为约14-20nm，伴随小变化。在更高MgCl₂浓度的存在下，使XY-4H×4H×32B-管退火可以产生具有更大直径的管，因为Mg²⁺可以降低在带负电的DNA螺旋之间的排斥。在60mMMgCl₂时，我们观察到直径在140nm-300nm之间的许多管(图30)。为了进一步测试我们的假设，我们设计XY-4H×4H×32B-长方体晶体，其中DNA砖块在层之间以交替方式排列。在该设计中的螺旋间的连接沿X轴和Y轴对称分布。TEM图像证实平坦的晶体结构(图31)。更厚的64bp、128bp、192bp和256bp XY晶体设计具有在每对附近螺旋之间的2、4、6和8个连接。对于这些设计，在TEM图像未观察到可见曲率。

其他DNA砖块晶体。我们进一步证实其他类型的DNA砖块晶体可以由DNA砖块装配，包括(1)沿X轴延伸的两种二维生长晶体和(2)实现“偏移”连接方案的二维生长晶体。

1D X晶体。沿X轴或Y轴生长重复单位生成另一类一维生长晶体。我们设计且测试两种X晶体(注意到由于DNA砖块结构的对称，X晶体和Y晶体应是非常相似的)：X-6H×6H×64B-长方体晶体(图32A)和X-32H×64B-孔晶体(图32B)。X-6H×6H×64B-长方体晶体基于固体6H×6H×64B长方体单位进行设计。X-32H×64B-孔晶体使用6H×6H×64B长方体单位，其中从中心去除四个螺旋。两种晶体均生长至长度几百纳米，并且在TEM图像看起来结构良好。由于大量短DNA螺旋的紧密堆积，两种X晶体的平均长度比Z晶体短得多。

偏移2D ZX晶体。所有前述晶体均使用图20B中的连接方案进行设计：通过以“完美匹配”形式沿轴连接重复单位而达到结构的延伸。例如，为了制备6H×6H×32B-长方体Z轴晶体，重复单位中的每一个双链体设计为连接至下一个重复单位中的相同双链体。然而，沿每根轴的连接可以转移用于生成“偏移”晶体。此类策略允许来自相同基本重复单位的更多晶体设计。我们构建二维生长晶体，其使用偏移方案沿Z轴和X轴延伸6H×6H×64B-长方体重复单位(图33A-33C)。在这种设计中，晶体的Z轴延伸沿X轴转移4个双链体；晶体的X轴延伸沿Z轴转移32bp。由于DNA砖块结构的周期性，偏移连接遵循下述规则：沿X轴或Y轴的转移以2双链体间隔发生；并且沿Z轴的转移以32-bp间隔发生。

实施例5.使金纳米颗粒模式化

使用DNA结构作为模板，金纳米颗粒已排列成不连续模式(Kuzyk，A.等人Nature483，311–314(2012)；Acuna，G P等人Science 338，506–510(2012)；Aldaye，F A&Sleiman，HF.Angew.Chem.Int.Ed.45，2204–2209(2006))和单层周期性模式(Sharma，J.等人Science323，112–116(2009))。然而，形成金纳米颗粒的紧密堆积的周期性模式，尤其是多层模式仍是挑战。为了证实使用DNA砖块晶体用于排列材料，我们设计且构建紧密堆积的金纳米颗粒结构：(1)平行金颗粒线在ZX-4H×6H×96-通道晶体上的2D排列(图34A和34B)和(2)平行金纳米颗粒单层在XY-4H×4H×64-长方体晶体的两个表面上的简单3D排列(图34C至34E)。

ZX-4H×6H×96-通道晶体的设计和TEM图像显示于图35A-35C中。通道为深度二螺旋(5纳米)和宽度32-bp(10.6纳米)。附近的平行通道通过沿Z轴的64-bp(21.2nm)距离分开。由聚A(十个邻接腺嘌呤碱基)DNA链官能化的金纳米颗粒排列在DNA晶体上。在通道内，每一个螺旋末端展示聚T单链DNA用于捕获金纳米颗粒。金纳米颗粒成功排列成与我们的设计一致的平行线。在每条线内，观察到紧密堆积的金纳米颗粒的单链。在金纳米颗粒与线之间的平均距离为约2纳米，除了具有明确缺陷的一些位置之外(图34B)。如图23C中所示，两个平行的金纳米颗粒单层在XY-4H×4H×64-长方体晶体上装配。晶体展示在两个表面上的每个螺旋末端处的聚T序列，用于捕获由聚A链官能化的10纳米金纳米颗粒。颗粒间的平均距离看起来为约1至2纳米(图34D)。结构有时在边缘上弯曲(图34E)。两个金纳米颗粒单层之间的边缘间距离测量为约25nm，与设计的晶体厚度一致。

在不同等离子体应用中需要金纳米颗粒对齐成微米规模级别的低维度阵列(Melosh，N.A.等人Science 300，112–115(2003)；Qi，M.H.等人Nature 429，538–542(2004))。特别地，预期具有小于2nm面对面间距的纳米颗粒阵列显示出强等离子体偶联(Qi，M.H.等人，2004)。使用DNA纳米结构作为模板，金纳米颗粒已排列成手性(Qi，M.H.等人，2004)、线性(Liu，N.，等人Science 332，1407–1410(2011)；Tang，C.B.，等人Science322，429–432(2008)；Tavakkoli K.G.，A.等人Science 336，1294–1298(2012))、和分支模式(Seeman，N.C.J.Theor.Biol.99，237-247(1982)；Chen，J.&Seeman，N.C.Nature 350，631–633(1991))。然而，大多数这些结构为不连续的亚100nm结构，其缺乏在微米规模上的长范围排序。另外，使颗粒间间距下降至2nm也是挑战。产生本发明的DNA晶体的方法提供了解决这些挑战的独特方法。通过改变聚T结合位点的表面分布，在微米规模上用不同2D模式编程金纳米颗粒，从紧密堆积的模式到具有20-nm链间间距的金纳米颗粒链的阵列。聚T结合位点的周期性在DNA晶体上为2.5nm，这使颗粒间间距降低为约2nm。

我们的工作呈现由短的合成DNA构建3D正方形晶格、蜂窝晶格和六角形晶格DNA纳米结构的一般化方法。此外，我们还证实具有不同形状和错综复杂的特点例如通道和孔的102种错综复杂的3D形状。我们的模块方法伴随我们的简化样模型和计算机辅助设计过程，提供了用于设计错综复杂的3D纳米结构的简单方法。由于长支架链的不存在，3D画布中的任何体素均可独立添加或去除，允许我们设计具有8bp分辨率的形状。利用DNA砖块的紧密性和模块性，我们能够装配具有错综复杂特点(例如薄空腔和通路)的纳米结构，这是使用DNA折纸可能难以达到，其中每种订书针链组分通常更不紧密，并且支架完全不是模块的。1000体素3D DNA画布提供最高达2¹⁰⁰⁰～10³⁰⁰种潜在可能性。然而，每个体素必须物理上连接至其附近体素中的至少一个，以便自装配完全形状。因此可以构建的实际形状更少。

我们注意到某些大的或错综复杂的设计可以显示出脆性。一个例子是3H×3H×1024B，其在琼脂糖凝胶纯化后的TEM成像期间大部分破坏成区段。解决该问题的一种方法是通过将更长的合成DNA链掺入纳米结构的一些位置，尤其是“弱点”。这些长链可以加强形状，如同支架链一样。

构建错综复杂的3D形状的能力将延伸DNA纳米技术可以解决的挑战和应用范围，例如制备尖端DNA装置以模拟生物合成机器，或在3D空间中排列客体分子以生成多种功能纳米材料。另外，由合成DNA制备的3D纳米结构允许研究者设计针对其应用修改的定制序列。进一步地，使用其他合成信息聚合物包括L-DNA、具有化学修饰的主链的DNA、具有人工碱基的DNA和RNA的模块自装配可以证明对于多种应用例如药物递送和治疗应用是关键的。

我们还已提供用于构建具有定制设计的尺寸和纳米规模特点的复杂3D DNA晶体的一般方法。这是首个自下而上自装配策略，其能够制备真正的微米规模3D周期性结构，其可以使用重复单位达到大小兆道尔顿，所述重复单位可以以几纳米分辨率合理设计。使用多种周期性单位设计-从几百个碱基对到几千个碱基对-我们构建(1)含有最高达108个平行螺旋的1D生长DNA-束晶体；(2)厚度最高达20层(50nm)的2D生长DNA多层晶体；和(3)高度最高达256bp(84nm)的2D生长DNA森林晶体。此外，我们证实复杂的纳米规模表面特点、通道和多孔模式可以在本文提供的3D晶体中实现。

该装配策略基于对DNA折纸和DNA瓦片(tile)结晶化的理解。本文DNA折纸晶体的装配可以使用一步退火反应或两步退火反应进行。在一步退火反应中，支架、5至10倍订书针和连接链一起退火。不受理论束缚，认为DNA折纸单体必须在退火的早期(在更高温度下)正确形成，且随后在退火的晚期(在更低温度下)彼此连接，以形成晶体。两步退火反应以折纸单体的初始退火开始，排除连接链，随后为纯化步骤以获得折纸单体。纯化的单体随后与连接链混合，并且对混合物实施在低于第一个退火步骤的起始温度下的第二次退火。在两种情况下，DNA折纸晶体的装配均为具有两个分开阶段的分层过程：单体形成和单体结晶化。

此类分层结晶化可以提出几个潜在挑战。首先，单体的形成和结晶化可能必须在两个良好分开的退火阶段时发生。如果结晶化在单体完全形成前开始，则可能缺陷单体将损害一些良好有序晶体的生长。其次，由于单体的庞大规模和单体的大量负电荷，将DNA折纸单体掺入晶体的动力学可能很慢。这些因素可以阻止晶体在合理退火时间内达到大尺寸。第三，成功结晶化可能需要一些错误校正，其涉及单体掺入和解离的再发生，其最终可以导致系统达到最低的能态。对于大折纸单体，解离速率可能很低，这可以导致一些晶体中的缺陷或可以阻碍晶体生长。

本文提供的DNA砖块晶体构架揭示用于在三维空间中制备复杂的DNA晶体的新视角：在结晶化期间的快速动力学可以无需损害重复单位的信息复杂性来达到。使用利用标准化组分(如DNA砖块)的模块策略，重复单位可以含有数以千计的碱基对，允许3D空间中的复杂设计。晶体通过在DNA砖块结晶化期间掺入个别砖块而生长，而无需首先形成多链单位。因此，关于结晶化的信息复杂性和快速动力学两者均在本发明的模块DNA砖块晶体中实现。

本发明的合理设计、自装配的DNA晶体可以用于使功能部分模板化，所述功能部分例如但不限于蛋白质、核酸、金属颗粒、量子点等。此类自下而上方法可以用于制造具有纳米规模特点的微米规模的周期性材料。该技术有利于使用自上而下模式化排列DNA晶体，因此达到纳米技术的重要目标之一——组合有效的纳米规模DNA自装配与强大的自上而下方法用于例如纳米光子学和纳米电子学应用。

材料与方法

样品制备。DNA链由Integrated DNA Technology，Inc.或Bioneer Corporation合成。为了装配结构，在补充有10-80mM MgCl₂的0.5×TE缓冲液(5mM Tris，pH 7.9，1mMEDTA)中，将未纯化的DNA链混合至100nM或200nM/链的最终浓度(对于含有超过500条链的纳米结构，执行蒸发步骤以达到所需200nM浓度)。

退火坡度。链混合物随后在PCR热循环仪中退火，通过经过1小时从80℃到60℃的快速线性冷却步骤，随后为从60℃到24℃的24小时或72小时线性冷却坡度。退火坡度根据第二个冷却步骤的长度命名为24小时退火或72小时退火。

琼脂糖凝胶电泳和样品纯化。随后对退火的样品实施在冰水浴中的2百分比非变性琼脂糖凝胶电泳2小时(凝胶在补充有11mM MgCl₂和0.005％(v/v)EtBr的0.5×TBE缓冲液中制备)。随后，切除靶凝胶条带且置于Freeze’N Squeeze柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.)内。通过柱中的微管研棒将凝胶小片碾成细微小片，并且随后将柱以7000g离心5分钟。收集通过柱提取的样品用于TEM或AFM成像。

用于样品制备的自动机自动操作。Python(http://www.python.org/)程序设计为通过使用液体处理自动机(Bravo，Agilent)，帮助复杂形状的设计和自动化的链混合。对于每种形状，吸取在水溶液中的4μL的10μM每条链且混合成小于2mL的最终体积(确切体积由用于靶形状的组成成分链数目决定)。随后将混合物vacufuge干燥(Savant Speedvacsc110)，且重悬浮于具有40mM MgCl₂的200μL 0.5×TE缓冲液中。每轮自动机吸取适应48种形状且花费三至四天完成。

TEM成像。对于成像，3.5μL琼脂糖凝胶纯化的或未纯化的样品4分钟吸附到辉光放电的碳涂布的TEM格栅上，并且使用含有25mM NaOH的2％甲酸双氧铀水溶液染色1分钟。成像使用在80kV下操作的JEOL JEM-1400执行。

AFM成像。AFM图像使用具有Digital Instruments Nanoscope V控制器的SPMMultimode(Veeco)获得。将伴随纯化随后为40μL0.5×TE(10mM MgCl₂)的5μL纯化、退火的样品应用到新鲜切割的云母表面上，且静置大约2分钟，以允许吸收。有时执行样品的稀释，以达到所需云母表面覆盖。使用的AFM尖端是SNL-10氮化硅悬臂芯片(Veeco Probes)中短而薄的悬臂。

用于晶体生长实验的方法与材料。

样品制备。DNA链由Integrated DNA Technology，Inc.或Bioneer Corporation合成。为了装配结构，在补充有40mM MgCl₂或60mM MgCl₂的0.5×TE缓冲液(5mM Tris，pH 7.9，1mM EDTA)中，将未纯化的DNA链以等摩尔化学计量比混合至来自100μM原液的最高可能浓度。

退火坡度。链混合物随后在PCR热循环仪中退火，通过经过1小时从80℃到60℃的快速线性冷却步骤，随后为从60℃到24℃的72小时或168小时线性冷却坡度。退火坡度根据第二个冷却步骤的长度命名为72小时退火或168小时退火。

TEM成像。对于成像，2.5μL退火的样品2分钟吸附到辉光放电、碳涂布的TEM格栅上。随后使用含有25mM NaOH的2％甲酸双氧铀水溶液将格栅染色10秒。成像使用在80kV下操作的JEOL JEM-1400TEM执行。

在10-nm金纳米颗粒上的DNA装饰。如先前描述的，达到硫醇化的DNA缀合到10-nm金纳米颗粒上(Sharma，J.等人J.Am.Chem.Soc.130，7820–7821,(2008))。在典型实验中，在0.25×TBE缓冲液中，将20μL的2.5μM膦涂布的10-nm金纳米颗粒与0.5μL的2M NaNO3和0.65μL的100μM硫醇化的DNA混合。反应溶液在室温下在黑暗中温育36小时。这之后，将反应溶液装载到含有0.5×TBE缓冲液的1％琼脂糖凝胶内。电泳在95V下在凝胶盒中在冰水浴上运行1小时。通过研棒碾压回收紫色条带，随后为使用“Freeze’N Squeeze”DNA Gel Extraction自旋柱(Bio-Rad)，以10,000rpm在室温下的3分钟离心。回收的DNA模子贮存于4℃下在黑暗中用于未来使用。硫醇化的DNA的序列为：5′-AAAAAAAAAA-/3ThioMC3-D/。

金纳米颗粒装饰：向15μL的400mM NaCl溶液中，加入0.8μL(ZX-4H×6H×96B-通道晶体)或0.6μL(XY-4H×4H×64B-长方体晶体)DNA样品。随后引入0.2uL的95nM的10nm金纳米颗粒。在吸取50次后，将反应混合物在室温下在黑暗中静置三小时。

表2.用于产生图3E的核酸结构的链列表。个别链0-4454分别指定为SEQ IDNO.6842-11296。还参见通过引用并入本文的于2012年7月24日提交的美国临时申请号61/675,309的表15。

等价方案

虽然本文已描述且举例说明了几个本发明实施方案，但本领域普通技术人员将容易设想用于执行本文描述的功能和/或获得结果和/或优点中的一种或多种的多种其他方式和/或结构，并且此类变化和/或修饰各自视为在本文描述的本发明实施方案的范围内。更一般而言，本领域技术人员将容易理解本文描述的所有参数、尺寸、材料和构型均意欲为示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构型取决于本发明教导用于其的一种或多种具体应用。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过例行实验确定本文描述的具体本发明实施方案的许多等价方案。因此，应当理解前述实施方案仅呈现作为例子，并且在所附权利要求及其等价物的范围内，本发明实施方案可以以如具体描述且请求保护外的其他方式进行实践。本公开内容的本发明实施方案涉及本文描述的每种个别特点、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果此类特点、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不是相互矛盾的，则两种或更多种此类特点、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合均包括在本公开内容的本发明范围内。

如本文定义且使用的所有定义应理解为控制字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或限定术语的普通含义。

本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均就对于其各自引用的主题而言通过引用并入，在一些情况下，所述引用可以包含文件的整体。

如本文在说明书和权利要求中使用的，除非明确指出相反，否则不定冠词“一个”和“一种”应理解为“至少一个/种”。

如本文在说明书和权利要求中使用的，短语“和/或”应理解为意指如此结合的元素的“任一或两者”，即在一些情况下结合存在和在其他情况下分离存在的元素。伴随“和/或”列出的多重元素应以相同方式加以解释，即如此结合的元素中的“一个或多个”。除由“和/或”字句具体鉴定的元素外，还可以任选存在其他元素，无论与具体鉴定的这些元素相关还是无关。因此，作为非限制性例子，当与开放式语言例如“包含”结合使用时，提及“A和/或B”在一个实施方案中可以仅指A(任选包括除B外的元素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选包括除A外的元素)；在另外一个实施方案中，指A和B两者(任选包括其他元素)；等。

如本文在说明书和权利要求中使用的，“或”应理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当在列表中分开项目时，“或”或“和/或”应解释为包括在内的，即包括许多元素或元素列表中的至少一个，但还包括许多元素或元素列表中的超过一个，以及任选的另外未列出的项目。仅明确指出相反的术语例如“仅一个”或“确切一个”或当在权利要求中使用时“由……组成”，指包括许多元素或元素列表中的确切一个元素。一般而言，当前面为排他性术语例如“任一”、“之一”、“唯一一个”或“确切一个”时，如本文使用的术语“或”应仅解释为指示唯一的备选方案(即，“一个或另一个，但不是两者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应具有其如在专利法领域中使用的普通含义。

如本文在说明书和权利要求中使用的，提及一个或多个元素列表中的短语“至少一个”，应理解为意指选自元素列表中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括在元素列表内具体列出的每个和每一个元素中的至少一个，且不排除元素列表中的任何元素组合。该定义还允许除术语“至少一个”所指元素列表内具体鉴定的元素外，还可以任选存在元素，无论与具体鉴定的这些元素相关还是无关。因此，作为非限制性例子，“A和B中的至少一个”(或等价地，“A或B中的至少一个”、或等价地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以指至少一个，任选包括超过一个A，不存在B(且任选包括除B外的元素)；在另一个实施方案中，指至少一个，任选包括超过一个B，不存在A(且任选包括除A外的元素)；在另外一个实施方案中，指至少一个，任选包括超过一个A，和至少一个，任选包括超过一个B(且任选包括其他元素)；等。

还应当理解，除非明确指出相反，否则在包括超过一个步骤或动作的本文请求保护的任何方法中，方法的步骤或动作的次序不一定限制于方法的步骤或动作在其中叙述的次序。

在权利要求以及上文说明书中，所有过渡短语例如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”、“组成”等等应理解为开放式的，即意指包括但不限于。仅过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别为封闭式或半封闭式过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册(United States Patent Office Manual of Patent ExaminingProcedures)，部分2111.03中所述。

Claims

1.一种核酸结构，其包含

两种单链寡核苷酸，其中每种寡核苷酸包含四个结构域，所述结构域排列为形成通过单个磷酸键彼此连接的两个临近的反向平行螺旋，并且其中所述两种单链寡核苷酸排列为通过两个互补结构域的杂交形成大约90°二面角，所述两个互补结构域是在所述寡核苷酸各自中一个。

2.权利要求1的核酸结构，其中所述结构包含五种单链寡核苷酸，其中各寡核苷酸包含四个结构域，所述结构域排列为形成通过单个磷酸键彼此连接的两个临近的反向平行螺旋，其中所述单链寡核苷酸中的四种与第五种单链寡核苷酸的分开结构域杂交，从而形成在每对杂交寡核苷酸之间的大约90°二面角。

3.权利要求1的核酸结构，其中所述至少四个结构域具有相等核苷酸长度。

4.权利要求1或2的核酸结构，其中每种寡核苷酸包含两个或更多个独特结构域。

5.权利要求1或2的核酸结构，其中至少一个结构域包含聚胸腺嘧啶(T)寡核苷酸。

6.权利要求1或2的核酸结构，其中至少两个结构域包含聚胸腺嘧啶(T)寡核苷酸。

7.权利要求1或2的核酸结构，其中每个结构域长度为8个核苷酸。

8.权利要求1或2的核酸结构，其中所述结构进一步包含单链2结构域寡核苷酸。

9.权利要求1或2的核酸结构，其中所述寡核苷酸是DNA寡核苷酸。

10.权利要求1或2的核酸结构，其中所述DNA寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。

11.权利要求1或2的核酸结构，其中所述寡核苷酸是交联的。

12.权利要求1或2的核酸结构，其中所述结构包含100、500或1000种单链寡核苷酸。

13.权利要求1或2的核酸结构，其中所有所述单链寡核苷酸在序列中都是独特的。

14.多种权利要求1-13中任一项的核酸结构。

15.权利要求14的多种核酸结构，其中所述核酸结构杂交以形成3D结构。

16.权利要求14的多种核酸结构，其中所述多种结构中的每种单链寡核苷酸均为独特的。

17.权利要求15的多种核酸结构，其中所述3D结构是长方体结构、圆柱体结构、片层、蜂窝结构或六角形晶格结构。

18.权利要求15的多种核酸结构，其中所述3D结构是Z晶体、ZX晶体、Y晶体、X晶体、XY晶体或ZXY晶体。

19.一种组合物，其包含权利要求14-18中任一项的多种核酸结构。

20.一种方法，其包括

在容器中使多种独特的单链寡核苷酸退火，其中各寡核苷酸包含四个结构域，所述结构域排列为形成通过单个磷酸键彼此连接的两个临近的反向平行螺旋，并且其中至少两个寡核苷酸排列为通过两个互补结构域的杂交形成大约90°二面角，所述两个互补结构域各自在物理上分开的寡核苷酸中。

21.权利要求20的方法，其中所述单链寡核苷酸以等摩尔的浓度存在。

22.权利要求20或21的方法，其中所述退火通过经过一段时间的温度转变而发生。

23.权利要求22的方法，其中所述温度转变是温度中从高温到室温的变化。

24.权利要求23的方法，其中所述温度转变是温度中从90℃到室温的变化。

25.权利要求22方法，其中所述退火经过12-24小时的时期发生。

26.权利要求20或21的方法，其中所述寡核苷酸长度为至少32个核苷酸。

27.权利要求26的方法，其中每个结构域长度为8个核苷酸。

28.权利要求20或21的方法，其中所述单链寡核苷酸是DNA寡核苷酸。

29.权利要求20或21的方法，其中所述单链DNA寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。

30.一种方法，其包括：

提供作为N_x×N_y×N_z体素排列的单链寡核苷酸的三维(3D)计算机生成的画布，其中

N为包含来自分开的单链寡核苷酸的两个互补杂交结构域的单个8bp区域，所述两个互补杂交结构域在所述杂交后形成大约90°二面角，

X是沿所述3D画布的x轴的任何数目，

Y是沿所述3D画布的y轴的任何数目，和

Z是沿所述3D画布的z轴的任何数目；

从所述3D计算机生成的画布中去除一个或多个体素，以产生所需形状和/或大小的3D核酸结构；和

鉴定所述3D核酸结构装配所需的单链寡核苷酸亚组。

31.一种脱氧核苷酸(DNA)结构，其包含

两种单链DNA寡核苷酸，其中每种DNA寡核苷酸长度为32个核苷酸并且包含四个结构域，所述结构域排列为形成通过单个磷酸键彼此连接的两个临近的反向平行螺旋，其中每个结构域长度为8个核苷酸，并且其中所述两种单链DNA寡核苷酸排列为通过两个互补结构域的杂交形成大约90°二面角，所述两个互补结构域是在所述DNA寡核苷酸各自中一个。