CN108463560B - 具有降低的背景的基于光学的纳米孔分析 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含不透明层的纳米孔阵列，所述不透明层降低在应用此类阵列用于分析分子中收集的光学信号中的背景荧光。在一些实施方案中，此类阵列用于在包括以下步骤的方法中确定聚合物诸如多核苷酸的特征：使聚合物易位穿过所述阵列的纳米孔，其中聚合物具有一个或更多个光学标记物，激发从所述不透明层向激发光束的方向延伸的每个纳米孔的信号生成区中的聚合物的光学标记物，检测来自每个纳米孔的信号生成区的光学信号以确定穿过其易位的聚合物的特征。

Description

具有降低的背景的基于光学的纳米孔分析
本申请要求2016年1月15日递交的美国临时专利申请第62/279,503号和2016年3月14日递交的美国临时专利申请第62/308,145号的优先权权益，其各自通过引用整体并入本文。
背景
过去十年发展的DNA测序技术已经改变了生物科学，例如van Dijk等,Trends inGenetics,30(9):418-426(2014)。然而，要实现技术的全部潜力，仍必须克服一系列挑战，包括降低每次运行测序成本、简化样品制备、缩短运行时间、增加序列读段长度、改进数据分析等。单分子测序技术，诸如基于纳米孔(nanopore)的测序，可以解决这些挑战中的一些；然而，这些方法具有其自身的一组技术难题，诸如可靠的纳米结构制造、DNA易位速率的控制、明确的核苷酸鉴别、来自纳米级传感器的大阵列的信号的检测和处理等，例如Branton等,Nature Biotechnology,26(10):1146-1153(2008)。
已经提出核苷酸的光学检测作为纳米孔测序领域中的一些技术难题(例如难以从纳米孔的大阵列收集独立信号)的潜在解决方案。然而，对于基于荧光的信号，克服单分子光学检测中的背景噪声仍然是重大挑战。这导致经常使用显微镜系统，诸如全内反射荧光(TIRF)系统，其使背景激发最小化但增加了检测系统的复杂性和费用。
鉴于以上，如果可以获得使用更简单和更便宜的显微镜系统解决单分子分析的背景问题的方法和装置，则对纳米孔传感器技术整体及其具体应用(诸如基于光学的纳米孔测序)是有利的。
发明概述
本发明涉及使用光学标记物和纳米孔进行单分子分析的方法和装置。在一个方面，本发明的方法和装置涉及降低在标记的聚合物分析物易位穿过纳米孔时生成的光学信号中的噪声。
在一些实施方案中，本发明涉及确定聚合物诸如多核苷酸的特征的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含固相膜和与其共同延伸的不透明层的纳米孔阵列，所述纳米孔阵列包括多个孔眼(apertures)并且分隔第一室和第二室，其中每个孔眼提供所述第一室和所述第二室之间的流体连通并具有信号生成区，且其中所述不透明层基本上防止光穿过所述纳米孔阵列；(b)使聚合物从所述第一室穿过所述孔眼易位到所述第二室，每个聚合物具有附接到其上的一个或更多个光学标记物，所述光学标记物能够生成具有指示所述聚合物的特征的至少第一波长的光学信号；(c)当所述聚合物易位穿过所述孔眼的所述信号生成区时，用具有第二波长的激发光束激发所述聚合物的光学标记物，其中检测区中的所述光学标记物生成其第一波长不同于所述第二波长的光学信号；和(d)检测来自所述信号生成区的所述光学标记物的光学信号，以确定所述聚合物的特征。
在一些实施方案中，本发明涉及确定聚合物的特征的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含固相膜的纳米孔阵列，所述固相膜具有第一侧、第二侧和穿过其的多个孔眼，其中所述固相膜分隔第一室和第二室，使得每个孔眼提供所述第一室和所述第二室之间的流体连通，且其中所述固相膜的所述第一侧具有在其上的不透明涂层，且每个孔眼具有从所述第一侧的所述不透明涂层朝向所述第二侧延伸的检测区；(b)使聚合物从所述第一室穿过所述孔眼易位到所述第二室，每个聚合物具有附接到其上的一个或更多个光学标记物，所述光学标记物能够生成具有指示所述聚合物的特征的至少第一波长的信号；(c)从所述固相膜的所述第二侧用具有第二波长的激发光束照射所述孔眼的检测区中的所述光学标记物，使得检测区中的所述光学标记物生成其第一波长不同于所述第二波长的信号；(d)检测来自所述检测区中的所述光学标记物的信号以确定所述聚合物的特征。
在其他实施方案中，本发明涉及确定聚合物的特征的方法，所述方法包括步骤：(a)提供包含固相膜的纳米孔阵列，所述固相膜具有第一侧、第二侧和穿过其的多个孔眼，其中所述固相膜分隔第一室和第二室，使得每个孔眼提供所述第一室和所述第二室之间的流体连通，且其中所述固相膜的所述第二侧具有在其上的不透明涂层，且每个孔眼具有从所述第二侧的所述不透明涂层延伸到所述第二室的检测区；(b)使聚合物从所述第一室穿过所述孔眼易位到所述第二室，每个聚合物具有与其附接的一个或更多个光学标记物，所述光学标记物能够生成具有指示所述聚合物的特征的至少第一波长的信号；(c)从所述固相膜的所述第二侧用具有第二波长的激发光束照射所述孔眼的检测区中的所述光学标记物，使得所述检测区中的所述光学标记物生成其第一波长不同于第二波长的信号；和(d)检测来自所述检测区中的所述光学标记物的信号以确定所述聚合物的特征。
在仍其他实施方案中，本发明涉及用于确定多核苷酸的序列的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含固相膜和与其共同延伸的不透明层的纳米孔阵列，所述纳米孔阵列包括多个孔眼并且分隔第一室和第二室，其中每个孔眼提供所述第一室和所述第二室之间的流体连通并具有信号生成区，且其中所述不透明层基本上防止光穿过所述纳米孔阵列；(b)使多核苷酸从所述第二室易位穿过所述孔眼至所述第二室，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸用生成可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记，且其中所述孔眼的每一个限制多核苷酸的核苷酸单列移动穿过所述信号生成区；(c)当所述多核苷酸易位穿过所述孔眼的信号生成区时，用激发光束激发所述多核苷酸的荧光标记物；(d)检测来自所述信号生成区中的荧光标记物的荧光信号，以确定所述聚合物的特征；和(e)从在每个孔眼的信号生成区处检测的荧光信号确定核苷酸的序列。
本发明有利地克服了由基于光学的纳米孔分析中直接照射系统引起的光学噪声问题。本发明的这些和其他优点在许多实施方案和应用中示例，其中的一些被总结如下并且贯穿本说明书。
附图简述
图1A-1H阐释了具体实施方案中本发明的要素。
图2A-2B阐释了利用多孔层(porous layer)作为不透明层的实施方案。
图3阐释了共聚焦落射照明系统的基本组件。
图4A-4C阐释了具有不透明层的纳米孔阵列在使用猝灭的基于光学的纳米孔测序方法中的应用。
发明详述
虽然本发明服从于多种修改形式和替换形式，其细节已经通过举例显示于附图中并且将被详细描述。然而应该理解的是，意图并非是为了将本发明限制于所描述的特定的实施方案。相反，意图覆盖落在本发明的精神和范围内的所有修改形式、等价物和替代物。例如，为了阐明的目的显示了本发明的具体的纳米孔类型和数目、具体的标记物、FRET对、检测方案、制造方法。然而应当理解的是，本公开内容并非意图被限制在这一方面，因为可以利用其他类型的纳米孔、纳米孔阵列和其他的制造技术来实施本文所讨论的系统的各个方面。本发明的方面的指导见于本领域普通技术人员周知的许多可获得的参考文献和论文，包括，例如Cao,Nanostructures&Nanomaterials(Imperial College Press,2004)；Levinson,Principles of Lithography,第二版(SPIE Press,2005)；Doering和Nishi,编辑,Handbook of Semiconductor Manufacturing Technology,第二版(CRC Press,2007)；Sawyer等，Electrochemistry for Chemists,第二版(Wiley Interscience,1995)；Bard和Faulkner,Electrochemical Methods:Fundamentals and Applications,第二版(Wiley,2000)；Lakowicz,Principles of Fluorescence Spectroscopy,第三版(Springer,2006)；Hermanson,Bioconjugate Techniques,第二版(Academic Press,2008)等，其相关部分通过引用并入本文。
本发明涉及用于分子(诸如核酸)的基于光学的纳米孔分析的方法和装置，其包括具有一个或更多个光阻挡层(即一个或更多个不透明层)的纳米孔阵列。典型地，纳米孔阵列被制造成材料诸如硅、氮化硅、氧化硅、氧化铝等的薄片，其容易透光，特别是在所使用的厚度，例如小于50nm-100nm。对于分析物的电学检测，这不是问题。然而，在易位穿过纳米孔的标记的分子的基于光学的检测中，透过阵列的光总是激发预定反应位点或信号生成区之外的材料，由此生成光学噪声，例如来自非特异性背景荧光、来自尚未进入纳米孔的分子的标记物的荧光等的光学噪声。在一个方面，本发明通过提供具有一个或更多个光阻挡层的纳米孔阵列来解决该问题，该光阻挡层反射和/或吸收来自激发光束的光，从而降低了与阵列的纳米孔相关的在预期反应位点处生成的光学信号的背景噪声。在一些实施方案中，这允许通过直接照射来激发预期反应位点(诸如下文更全面描述的检测区或信号生成区)中的光学标记物。在一些实施方案中，不透明层可以是金属层。此类金属层可以包含Sn、Al、V、Ti、Ni、Mo、Ta、W、Au、Ag或Cu。在一些实施方案中，此类金属层可以包含Al、Au、Ag或Cu。在仍其他实施方案中，此类金属层可以包含铝或金，或者可以仅包含铝。不透明层的厚度可能变化很大，并取决于构成该层的材料的物理和化学性质。在一些实施方案中，不透明层的厚度可以是至少5nm、或至少10nm、或至少40nm。在其他实施方案中，不透明层的厚度可以在从5nm-100nm的范围内；在其他实施方案中，不透明层的厚度可以在从10nm-80nm的范围内。不透明层不需要阻挡(即反射或吸收)来自激发光束的100％的光。在一些实施方案中，不透明层可以阻挡来自激发光束的入射光的至少10％；在其他实施方案中，不透明层可以阻挡来自激发光束的入射光的至少50％。
图1A阐释了本发明的以上方面的具体实施方案。固态膜(100)在第一侧(104)上具有不透明涂层(102)以形成层状膜(101)，层状膜(101)具有面向第一室(112)的表面(105)和具有面向第二室(114)的第二侧(106)。层状膜(101)分隔第一室(112)和第二室(114)，并且包括各自提供第一室(112)和第二室(114)之间的流体连通的孔眼(110)的阵列。孔眼(110)可以是固态或合成的纳米孔，其可以直接使用，或者它们可以用于固定穿过其发生易位的蛋白纳米孔。通常，孔眼具有小于激发光束的波长的直径或横截面尺寸，使得来自该光束的光不穿透孔眼。在一些实施方中，孔眼具有100nm或更小的直径。在一些实施方案中，圆形孔眼的直径是激发光束的波长的0.586或更小。
在前述段落的一些实施方案中，本发明的方法可以用以下步骤实施：(a)提供包含固相膜的纳米孔阵列，所述固相膜具有第一侧、第二侧和穿过其的多个孔眼，其中所述固相膜分隔第一室和第二室，使得每个孔眼提供所述第一室和所述第二室之间的流体连通，且其中所述固相膜的所述第一侧具有在其上的不透明涂层，且每个孔眼具有从所述第一侧的所述不透明涂层朝向所述第二侧延伸的检测区；(b)使聚合物从所述第一室穿过所述孔眼易位到所述第二室，每个聚合物具有附接到其上的一个或更多个光学标记物，所述光学标记物能够生成具有指示所述聚合物的特征的至少第一波长的信号；(c)从所述固相膜的所述第二侧用具有第二波长的激发光束照射所述孔眼的检测区中的所述光学标记物，使得所述检测区中的所述光学标记物生成其第一波长不同于第二波长的信号；和(d)检测来自所述检测区中的所述光学标记物的信号以确定所述聚合物的特征。
在其他实施方案中，如在图1C中示例的，本发明的方法可以包括以下步骤：(a)提供包含固相膜的纳米孔阵列，所述固相膜具有第一侧、第二侧和穿过其的多个孔眼，其中所述固相膜分隔第一室和第二室，使得每个孔眼提供所述第一室和所述第二室之间的流体连通，且其中所述固相膜的所述第二侧具有在其上的不透明涂层，且每个孔眼具有从所述第二侧的所述不透明涂层朝向所述第二室延伸的检测区；(b)使聚合物从所述第一室穿过所述孔眼易位到所述第二室，每个聚合物具有附接到其上的一个或更多个光学标记物，所述光学标记物能够生成具有指示所述聚合物的特征的至少第一波长的信号；(c)从所述固相膜的所述第二侧用具有第二波长的激发光束照射所述孔眼的检测区中的所述光学标记物，使得所述检测区中的所述光学标记物生成其第一波长不同于第二波长的信号；和(d)检测来自所述检测区中的所述光学标记物的信号以确定所述聚合物的特征。
在一些实施方案中，每当不透明涂层或层是金属时，选择最近邻纳米孔距离和激发光束波长以使穿过纳米孔阵列的等离子体介导的超常透射(extraordinarytransmission)最小化。这种选择的指导在通过引用并入的以下参考文献中公开：Ebbesen等,Nature,391:667-669(1998)；Ebbesen等,美国专利5973316；6040936；6236033；6856715；7057151；7248756；8174696；Gur等,Optics Comm.,284:3509-3517(2011)；Ghaemi等,Physical Review B,58:6779-6782(1998)；Pacifici等,Optics Express,16(12):9222-9238(2008)等。在一些实施方案中，选择大约等于例如用于激发光学标记物的激发波长的最近邻纳米孔距离(或例如随机(例如泊松分布的)纳米孔阵列中预期的最近邻纳米孔距离)。
在一些实施方案中，信号生成区(116)(或等同地，预期的反应位点)各自包括纳米孔的内部和紧邻其第二侧(106)上的出口的区域，其中这种区域不与其他纳米孔的等效区域重叠。在一些实施方案中，标记的分子(诸如标记的核酸分子)被装载或沉积在第一室(112)中并且直接地或通过插入的蛋白纳米孔穿过层状膜(101)的孔眼从第一室(112)易位到第二室(114)。当标记的分子穿过孔眼(110)和/或离开孔眼(110)时，它们可以被激发光束(118)直接照射。可以选择或配置激发光束(118)以直接激发标记的分子或通过FRET相互作用间接地激发标记的分子。在一些实施方案中(图1B)，信号生成区(120)(或等同地，预期的反应位点)各自包括从第一侧(104)至第二侧(106)的纳米孔的内部和紧邻其第二侧(106)上的出口的区域，其中这种区域不与其他孔眼(或纳米孔)的等效区域重叠。在仍其他实施方案中，信号生成区(或预期的反应位点)各自包括从其由第一室的入口至其在第二室处的出口的纳米孔的内部和紧邻其入口及其出口的区域，其中这样的区域不与其他孔眼的等效区域重叠。
如上所述，本发明的层状膜中的孔眼可以直接用作纳米孔，或者它们可以用于保持或固定一个或更多个蛋白纳米孔。在后一种类型的一些实施方案中，一个或更多个蛋白纳米孔可以嵌入在设置在所述不透明层的表面(例如图1A、1B或1E中的105)或者所述层状膜的第二侧的表面上(例如图1D中的106)的脂质双层中。在图1D和1E中，示出了具有不透明层或涂层(102)、固态膜(100)、孔眼(110)以及脂质双层(126)(其在图1D的表面(106)上和图1E的表面(105)上示出)的层状膜的截面。在所示出的具体实施方案中，示出了具有附接的标记物(124)(例如供体标记物诸如量子点、金属纳米颗粒或用于生成FRET信号的其他荧光纳米颗粒)的蛋白纳米孔(122)插入到脂质双层(126)中，但是如其他地方所指出的，本发明包括处于此类构造、不具有FRET信号生成的标记物的蛋白纳米孔。具有与标记物(124)相邻的信号生成区(即，在标记物(124)的FRET距离内)的图1D的一些实施方案对应于图1B中描述的构造，其中信号生成区从第一侧(104)延伸至邻近第二侧(106)处的孔眼或纳米孔出口的空间。类似地，也具有与标记物(124)相邻的信号生成区(例如，在标记物(124)的FRET距离内)的图1E的一些实施方案对应于图1A中描述的构造，其中信号生成区从表面(105)延伸至邻近第二侧(106)处的孔眼或纳米孔出口的空间。
在一些实施方案中，诸如在图1A至1E中描述的那些，层状膜还可以包括钝化涂层，诸如氧化物涂层，诸如氧化硅涂层，以稳定金属层。例如，氮化硅膜可以使用物理或化学沉积技术用不透明材料诸如金属涂覆，以形成层状膜，然后可以蚀刻或使用聚焦电子束或离子束钻出孔眼，以形成层状膜中的孔眼阵列。随后，此类阵列可以再次使用化学或气相沉积技术用保护层诸如氧化硅进一步涂覆。
在一些实施方案中，本发明可以包括通过以下步骤表征聚合物(诸如生物聚合物，包括核酸和蛋白)的方法：(a)提供包含固相膜的纳米孔阵列，所述固相膜具有第一侧、第二侧和穿过其的多个孔眼，其中所述固相膜分隔第一室和第二室，使得每个孔眼提供所述第一室和所述第二室之间的流体连通，且其中所述固相膜的所述第一侧具有在其上的不透明涂层，且每个孔眼具有从所述第一侧的所述不透明涂层朝向所述第二侧延伸的检测区；(b)使聚合物从所述第一室穿过所述孔眼易位到所述第二室，每个聚合物具有附接到其上的一个或更多个光学标记物，所述光学标记物能够生成具有指示所述聚合物的特征的至少第一波长的信号；(c)从所述固相膜的所述第二侧用包含至少第二波长的激发光束照射所述孔眼的检测区中的所述光学标记物，使得所述检测区中的所述光学标记物生成其第一波长不同于第二波长的信号；(d)检测来自所述检测区中的所述光学标记物的信号以确定所述聚合物的特征。在一些实施方案中，聚合物可以是多核苷酸或蛋白。在仍其他实施方案中，聚合物可以是多核苷酸。在另外的实施方案中，多核苷酸可以是单链核酸。在一些实施方案中，所分析或确定的聚合物的特征是聚合物的单体序列，诸如核苷酸序列。在一些实施方案中，聚合物上的光学标记物是FRET标记物，诸如在美国专利以及专利和国际公布中描述的：8,771,491；US2013/0203050；或WO2014/190322，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，孔眼包括蛋白纳米孔。简而言之，在一些实施方案中，FRET标记物在每个信号生成区包含至少一个FRET供体标记物和至少一个FRET受体标记物，其中激发光束激发FRET供体标记物，所述FRET供体标记物进而将能量转移到该供体标记物的FRET距离内的FRET受体标记物，所述FRET受体标记物进而发射光学信号。通常，激发光束包括第二波长，并且光学信号包括与第二波长不同的第一波长，例如以允许使用落射照明系统。在一些实施方案中，检测区可以从第一侧的不透明涂层朝向第二侧延伸，并且包括紧邻孔眼和/或纳米孔的出口的膜外空间。在一些实施方案中，这种膜外空间从纳米孔或孔眼的出口延伸不超过50nm；在其他实施方案中，这种膜外空间从纳米孔或孔眼的出口延伸不超过10nm。
简而言之，如美国专利8,771,491中更充分描述的，在一些实施方案中，孔眼和/或纳米孔可以用一种或更多种FRET供体标记，并且聚合物可以各自用FRET受体标记，使得至少选择的供体和受体形成FRET对；也就是说，供体的发射光谱与至少一个受体的吸收光谱重叠，从而如果满足其他条件(例如供体激发、供体和受体在FRET距离内、供体和受体具有适当的相对取向等)则可以发生FRET相互作用。在FRET相互作用中，供体的激发能量被非辐射地转移到受体，然后受体发射具有比供体的激发能量更低能量的光学信号。供体通常通过用诸如由激光产生的光束照射它们而被激发。
在一些实施方案中，蛋白纳米孔可以被插入到不具有或仅具有少量脂质双层的固态膜中以形成阵列，如Huber等,美国专利公布2013/0203050中所描述的，其通过引用并入本文。这种蛋白纳米孔/孔眼构造在图1F中阐释。在该具体实施方案中，包含固态膜(100)和不透明层(102)的层状膜(101)包括具有固定在其中的蛋白纳米孔(122)的孔眼(107)，所述蛋白纳米孔(122)用供体(128)标记，所述供体(128)可以是光学活性颗粒诸如量子点。当受体标记的聚合物(130)通过并离开蛋白纳米孔(122)的孔洞(bore)时，受体标记物在供体(128)的FRET距离内通过。孔眼(107)的尺寸被制造成能够固定单个蛋白纳米孔。在激发光束(133)直接照射孔眼(107)时，供体(128)被激发并且能够进入与正在易位穿过蛋白纳米孔(122)的标记的聚合物(130)的受体的FRET相互作用。另一方面，不透明层(102)减少来自光束(133)的辐射，所述光束(133)来自与光束(133)位于不透明层(102)的相对侧的标记的聚合物(131)上的照射受体。不透明层(102)通过吸收(135)和/或反射(137)辐射阻挡来自光束(133)的辐射。
图1G阐释了另外的实施方案，其中不透明层(102)(诸如金属层)的表面形成第二室(114)的边界。在一些实施方案中，固态孔眼(146)的阵列可以使用传统的微机械加工技术来制造。例如，对于硅基质(140)，非导电固态膜(100)诸如氮化硅层通过例如化学气相沉积或类似技术添加。在一些实施方案中，层(100)在30nm-100nm的范围内。在层(100)的顶部，不透明层(102)诸如金属层通过例如化学气相沉积或类似技术添加，以形成三层片材。可以向不透明层(102)添加光刻胶层，其在孔眼位置处去除显影的光刻胶材料后，通过蚀刻穿过不透明层(102)和固态膜(100)形成孔，以形成孔眼(146)的一部分。第二次蚀刻穿过硅层(140)进行以形成阵列中的其余孔眼(146)。根据本发明的一个实施方案，纳米孔感测装置可以通过将脂质双层(126)沉积在不透明层(102)的表面(141)上来构建，所述脂质双层(126)中插入具有FRET供体标记物(124)的至少一个蛋白纳米孔(122)。当在第一室(112)中沉积时，例如包含针对两种不同类型的单体的受体标记物(151)和(152)的带电和标记的聚合物(150)可以易位穿过蛋白纳米孔(122)，蛋白纳米孔(122)限制每个受体标记物(151或152)进入供体标记物(124)的FRET距离(142)内。供体标记物(124)被光束(133)激发并将激发能量传递给FRET距离(142)内的受体标记物，受体标记物进而发射指示与其附接的单体的FRET信号(144)。
在仍其他实施方案中，如图1H阐释的，脂质双层(126)可以设置在层(100)的表面(104)上，使得蛋白纳米孔(122)插入到层状膜(101)的与激发光束(133)所导向的一侧相对的一侧上。
在一些实施方案中，不透明层可以包括不透明的多孔层，其在一些实施方案中可以是不透明的纳米多孔层(opaque nanoporous layer)，如图2A和2B中所阐释的。在此类实施方案中，层状膜(101)包括固态膜(200)和纳米多孔层(202)，其包括具有纳米尺寸孔的不透明材料，所述纳米尺寸孔提供穿过所述层到孔眼(204)的间接和/或蛇形通道。图2B阐释了具有插入到设置在固态膜(200)的第二侧(216)上的脂质双层(206)中的标记的蛋白纳米孔(210)的实施方案。如图1A-1H的实施方案一样，纳米多孔层(202)阻挡或减少被引导至固态膜(200)的第二侧(216)的辐射到达纳米多孔层(202)的另一侧上的标记的聚合物或其他材料，由此减少来自蛋白纳米孔(210)出口处的检测事件的光学信号中不期望的噪声。
如上所述，在一些实施方案中，其中激发光束递送和光学信号收集通过单个物镜发生的落射照明系统可以用于直接照射聚合物分析物上的标记物或纳米孔上的供体。用于本发明使用的共聚焦落射照明系统的基本组件在图3中阐释。激发光束(302)穿过分光镜(dichroic)(304)并到达将激发光束(302)聚焦(310)到层状膜(300)的物镜(306)上，其中标记物被直接激发以发射诸如荧光信号的光学信号，或者标记物经由FRET相互作用被间接地激发以发射光学信号。这种光学信号被物镜(306)收集并被引导到分光镜(304)，该分光镜(304)被选择为传递激发光束(302)的光但反射光学信号(311)的光。反射的光学信号(311)通过透镜(314)，透镜(314)将反射的光学信号(311)聚焦通过针孔(316)并且到达检测器(318)。
在一些实施方案中，用于实施针对包含单链核酸的聚合物的上述方法的装置通常包括用于建立跨层状膜和纳米孔的电场的一组电极。通过将单链核酸置于第一室中的电解质中，将单链核酸暴露于纳米孔，所述第一室通过在室中放置负极而构造为层状膜的“顺式”侧。在施加电场时，带负电的单链核酸被纳米孔捕获并易位到层状膜的另一侧上的第二室，所述第二室通过在室中放置正极而构造为膜的“反式”侧。易位的速度部分取决于第一室和第二室中电解质的离子强度以及跨越纳米孔施加的电压。在基于光学的检测中，易位速度可以通过初步校准测量来选择，例如，使用预定的标记的单链核酸的标准品，其针对不同的电压针对每个纳米孔以不同的预期速率生成信号。因此，对于DNA测序应用，易位速度可以基于来自这种校准测量的信号速率选择。因此，根据这种测量，可以选择允许或最大化可靠的核苷酸鉴定的例如在纳米孔阵列上的电压。在一些实施方案中，这样的校准可以使用来自待分析的模板的样品的核酸(代替预定标准序列或除预定标准序列以外)进行。在一些实施方案中，这样的校准可以在测序运行期间实时执行，并且所施加的电压可以基于这样的测量实时修改，例如以最大化核苷酸特异性信号的采集。
纳米孔和纳米孔阵列
如上文讨论的，用于本发明的纳米孔可以是在固态膜或类似的框架中构造的固态纳米孔、蛋白纳米孔、或包括蛋白纳米孔或有机纳米管诸如碳或石墨烯纳米管的杂合纳米孔。纳米孔的重要特征包括约束聚合物分析物诸如多核苷酸，使得它们的单体依次通过检测区(或信号生成区)(即，使得核苷酸一次一个或者单列地通过检测区)。在一些实施方案中，纳米孔的另外的特征包括传递单链核酸而不传递双链核酸或等同体积的分子。
在一些实施方案中，与本发明的方法和装置组合使用的纳米孔以阵列的形式提供，诸如可规则地布置在平坦表面上的纳米孔簇阵列。在一些实施方案中，簇各自处于单独的分辨率有限区域中以使来自不同簇的纳米孔的光学信号可被所采用的光学检测系统区分，但是来自同一簇内的纳米孔的光学信号不一定由所采用的光学系统分配给这样的簇内的特定纳米孔。
固态纳米孔可以由多种材料制造，包括但不限于氮化硅(Si3N4)、二氧化硅(SiO2)等。用于分析应用(诸如DNA测序)的纳米孔的制造和操作公开于通过引用并入的以下示例性参考文献中：Ling,美国专利7,678,562；Hu等,美国专利7,397,232；Golovchenko等,美国专利6,464,842；Chu等,美国专利5,798,042；Sauer等,美国专利7,001,792；Su等,美国专利7,744,816；Church等,美国专利5,795,782；Bayley等,美国专利6,426,231；Akeson等,美国专利7,189,503；Bayley等,美国专利6,916,665；Akeson等,美国专利6,267,872；Meller等,美国专利公布2009/0029477；Howorka等,国际专利公布WO2009/007743；Brown等,国际专利公布WO2011/067559；Meller等,国际专利公布WO2009/020682；Polonsky等,国际专利公布WO2008/092760；Van der Zaag等,国际专利公布WO2010/007537；Yan等,Nano Letters,5(6):1129-1134(2005)；Iqbal等,Nature Nanotechnology,2:243-248(2007)；Wanunu等,Nano Letters,7(6):1580-1585(2007)；Dekker,Nature Nanotechnology,2:209-215(2007)；Storm等,Nature Materials,2:537-540(2003)；Wu等,Electrophoresis,29(13):2754-2759(2008)；Nakane等,Electrophoresis,23:2592-2601(2002)；Zhe等,J.Micromech.Microeng.,17:304-313(2007)；Henriquez等,The Analyst,129:478-482(2004)；Jagtiani等,J.Micromech.Microeng.,16:1530-1539(2006)；Nakane等,J.Phys.Condens.Matter,15R1365-R1393(2003)；DeBlois等,Rev.Sci.Instruments,41(7):909-916(1970)；Clarke等,Nature Nanotechnology,4(4):265-270(2009)；Bayley等,美国专利公布2003/0215881等。
在一些实施方案中，本发明包括具有一个或更多个光阻挡层(即一个或更多个不透明层)的纳米孔阵列。通常，纳米孔阵列被制造成材料诸如硅、氮化硅、氧化硅、氧化铝等的薄片，其容易透光，特别是在所使用的厚度，例如小于50nm-100nm。对于分析物的电学检测，这不是问题。然而，在易位纳米孔的标记的分子的基于光学的检测中，透过阵列的光总是激发预定反应位点之外的材料，从而生成光学噪声，例如来自非特异性背景荧光、来自尚未进入纳米孔的分子的标记物的荧光等的光学噪声。在一个方面，本发明通过提供具有一个或更多个光阻挡层的纳米孔阵列来解决该问题，该光阻挡层反射和/或吸收来自激发光束的光，从而降低了在与阵列的纳米孔缔合的预期反应位点处生成的光学信号的背景噪声。在一些实施方案中，这允许预定反应位点中的光学标记物通过直接照射被激发。在一些实施方案中，不透明层可以是金属层。此类金属层可以包含Sn、Al、V、Ti、Ni、Mo、Ta、W、Au、Ag或Cu。在一些实施方案中，此类金属层可以包含Al、Au、Ag或Cu。在仍其他实施方案中，此类金属层可以包含铝或金，或者可以仅包含铝。不透明层的厚度可能变化很大，并取决于构成该层的材料的物理和化学性质。在一些实施方案中，不透明层的厚度可以是至少5nm、或至少10nm、或至少40nm。在其他实施方案中，不透明层的厚度可以在从5nm-100nm的范围内；在其他实施方案中，不透明层的厚度可以在从10nm-80nm的范围内。不透明层不需要阻挡(即反射或吸收)来自激发光束的100％的光。在一些实施方案中，不透明层可以阻挡来自激发光束的入射光的至少10％；在其他实施方案中，不透明层可以阻挡来自激发光束的入射光的至少50％。
不透明层或涂层可以通过本领域已知的各种技术在固态膜上制造。可以使用包括以下的材料沉积技术：化学气相沉积、电沉积、外延、热氧化、物理气相沉积，包括蒸发和溅射(sputtering)、铸造等。在一些实施例中，可以使用原子层沉积，例如美国专利6,464,842；Wei等,Small,6(13):1406-1414(2010)，其通过引用并入。
在一些实施方案中，可以形成穿过固体基质的1nm-100nm的通道或孔眼，所述基质通常是平面基质例如膜，分析物诸如单链DNA被引导易位穿过所述通道或孔眼。在其他实施方案中，2nm-50nm通道或孔眼通过基质形成；并且在仍其他实施方案中，2nm-30nm、或2nm-20nm、或3nm-30nm、或3nm-20nm、或3nm-10nm通道或孔眼通过基质形成。生成纳米孔的固态方法提供了稳健性和耐久性以及调整纳米孔的大小和形状的能力、在晶片规模上制造高密度的纳米孔阵列的能力、与基于液体的系统相比优越的机械、化学和热特性以及与电子或光学读出技术集成的可能性。在另一方面，生物纳米孔提供了可再现的狭窄的孔洞或腔，尤其是在1-10纳米范围内的孔或腔，以及提供了用于定制纳米孔的物理和/或化学性质并且用于通过常规的蛋白质工程化方法直接或间接附接基团或元件例如荧光标记物(其可以是FRET供体或受体)的技术。蛋白纳米孔通常依赖于精巧的脂质双层用于机械支撑，并且以精确的尺寸制造固态纳米孔仍然具有挑战性。在一些实施方案中，固态纳米孔可与生物纳米孔组合以形成克服其中一些缺点的所谓“杂合”纳米孔，由此提供生物孔蛋白的精确度与固态纳米孔的稳定性。对于光学读出技术，杂合纳米孔提供了纳米孔的精确位置，其极大地简化了数据的获取。
在一些实施方案中，也可通过将蛋白纳米孔布置于由含有孔眼阵列的固相膜支撑的脂质双层中来形成簇。例如，这样的阵列可以包括在固相支持物中制造(例如钻孔、蚀刻等)的孔眼。这种孔眼的几何形状可根据所采用的制造技术而变化。在一些实施方案中，每个这样的孔眼与独立的分辨率有限区域相关联或由其包围；然而，在其他实施方案中，多个孔眼可以在同一分辨率有限区域内。孔眼的横截面积可以变化很大，并且可以或可以不在不同簇之间相同，尽管这些区域通常与常规制造方法的结果基本上相同。在一些实施方案中，孔眼具有在10至200nm范围内的最小线性尺寸(例如在圆形孔眼的情况下的直径)，或具有在约100至3×104nm2范围内的面积。跨孔眼可以设置脂质双层。每个孔眼的蛋白纳米孔的分布可以变化，例如通过在插入步骤期间控制蛋白纳米孔的浓度。在这样的实施方案中，纳米孔的簇可以包含随机数目的纳米孔。在其中蛋白纳米孔随机插入孔眼中的一些实施方案中，含有平均一个或更多个孔眼的簇具有大于零的数目的蛋白纳米孔；在其他实施方案中，这样的簇具有大于0.25的数目的蛋白纳米孔；在其他实施方案中，这样的簇具有大于0.5的数目的蛋白纳米孔；在其他实施方案中，这样的簇具有大于0.75的数目的蛋白纳米孔；在其他实施方案中，这样的簇具有大于1.0的数目的蛋白纳米孔。
在一些实施方案中，本发明的方法和装置包括固相膜，诸如SiN膜，其具有穿过其的孔眼阵列，孔眼提供第一室和第二室(有时也称为“顺式室”和“反式室”)之间的连通，并支持在面向第二室或反式室的表面上的脂质双层。在一些实施方案中，这种固相膜中的孔眼的直径可在10至200nm的范围内，或在20至100nm的范围内。在一些实施方案中，这种固相膜还包括在其中脂质双层跨越面向反式室的表面上的孔眼的区域中插入这种双层中的蛋白纳米孔。在一些实施方案中，使用本文所述的技术从固相膜的顺式侧插入这种蛋白纳米孔。在一些实施方案中，这种蛋白纳米孔具有与α-溶血素相同或相似的结构，因为其包括沿着轴的桶、或孔洞，并且在一端具有“帽”结构，且在另一端具有“茎”结构(使用的术语来自Song等，Science,274:1859-1866(1996))。在使用这种蛋白纳米孔的一些实施方案中，插入到脂质双层中导致蛋白纳米孔被定向成使得其帽结构暴露于顺式室并且其茎结构暴露于反式室。
在一些实施方案中，本发明可采用簇中的杂合纳米孔，尤其是用于多核苷酸的基于光学的纳米孔测序。这样的纳米孔包括固态孔口或孔眼，其中稳定地插入了蛋白生物传感器例如蛋白纳米孔。带电荷的聚合物可以通过传统的蛋白工程化技术附接至蛋白纳米孔(例如α-溶血素)，然后可以使用施加的电场来引导蛋白纳米孔进入固态膜中的孔眼中。在一些实施方案中，在固态基质中的孔眼被选择略微小于蛋白，从而防止蛋白易位穿过孔眼。相反，蛋白将被嵌入固态孔口中。
在一些实施方案中，供体荧光团附接至蛋白纳米孔。随后，通过施加跨固态纳米孔道(nanohole)或孔眼的电场将该复合物插入固态孔眼或纳米孔道(例如直径3nm-10nm)直到蛋白纳米孔被转运进入固态纳米孔道中形成杂合纳米孔。杂合纳米孔的形成可通过以下来验证：(a)基于固态纳米孔道的部分阻断，插入的蛋白纳米孔导致电流的下降和(b)供体荧光团的光学检测。
固态或合成的纳米孔可以用多种方式制备，如在以上引用的参考文献中例证的。在一些实施方案中，可使用氦离子显微镜在多种材料中钻出合成的纳米孔，例如，如由Yang等,Nanotechnolgy,22:285310(2011)公开的，其通过引用被并入本文。支撑已经被加工成自支撑膜的薄膜材料例如氮化硅的一个或更多个区域的芯片被引入氦离子显微镜(HIM)室。当显微镜被设置为低放大倍数时使用HIM电机控制以将自支撑膜引入离子束的路径。包括聚焦和消像散(stigmation)的光束参数在毗邻自支撑膜但在固体基质上的区域被调节。适当地固定参数后，芯片位置被移动使得自支撑膜区域集中在离子束扫描区域并且光束被消隐。HIM的视场被设置为足以包含整个预期的纳米孔模式且足以在未来的光学读出中有用(即取决于光学放大倍数、相机分辨率等)的维度(以μm计)。随后，跨越整个视场在导致足以移除所有或大部分的膜自体荧光的总离子剂量的像素停留时间(pixel dwell time)下使离子束光栅化一次。随后，将视场设置为合适的值(小于以上所用的值)以执行单个纳米孔或纳米孔阵列的刻蚀界定的铣削(lithographically-defined milling)。模式的像素停留时间被设置为产生一个或更多个预定直径的纳米孔，该预定直径通过在样品处理前使用校准样品来确定。针对单一芯片上的每一个期望的区域和/或针对引入HIM室中的每一个芯片，重复整个过程。
在一些实施方案中，纳米孔可以具有一个或更多个附接的标记物，用于在基于光学的纳米孔测序方法中使用。标记物可以是福斯特共振能量转移(Forster ResonanceEnergy Transfer,FRET)对的成员。此类标记物可包括有机荧光团、化学发光标记物、量子点、金属纳米颗粒和/或荧光蛋白。靶核酸可具有每种核苷酸一种独特的标记物。附接到核苷酸的标记物可以选自由有机荧光团组成的组。孔蛋白中的标记物附接位点可通过常规蛋白工程化方法生成，例如，可构建将允许标记物的特异性结合的突变体蛋白。作为实例，可将半胱氨酸残基插入蛋白的期望的位置，其插入可以被用于附接标记物的巯基(SH)基团。半胱氨酸可代替天然存在的氨基酸或可被掺入作为添加的氨基酸。马来酰亚胺活化的标记物随后共价地附接至蛋白纳米孔的巯基残基。在优选的实施方案中，标记物与蛋白纳米孔的附接或标记物在核酸上的附接是可逆的。通过实施可切割的交联剂，引入容易断裂的化学键(例如，S-S键或pH不稳定的键)并且当满足相应的条件时可将标记物去除。
使用FRET信号的基于光学的纳米孔测序
在一些实施方案中，可用一种或更多种量子点标记纳米孔。特别地，在一些实施方案中，一种或更多种量子点可附接至纳米孔，或附接至与纳米孔毗邻(并且在纳米孔的入口或出口的FRET距离之内)的固相支撑物上，并且被用作与分析物上的受体的FRET反应中的供体。量子点的此类用途是周知的并且被广泛描述于科学文献和专利文献中，例如，描述于美国专利6,252,303；6,855,551；7,235,361等中，其通过引用被并入本文。
可被用作孔标记物的量子点的一个实例是可在水性溶液中合成的CdTe量子点。CdTe量子点可以用亲核基团例如伯胺、巯基或例如羧酸的官能团官能化。CdTe量子点可包括巯基丙酸加帽的配体，其具有可用于将量子点共价地连接至蛋白孔外部的伯胺的羧酸官能团。可使用生物缀合领域内普通技术人员已知的标准的交联试剂(同双功能的和异双功能的)完成交联反应。必须小心以确保修饰不会损害或基本上不会损害核酸易位穿过纳米孔。这可通过改变用于将供体标记物附接至纳米孔的采用的交联剂分子的长度来实现。
例如，可使用天然α-溶血素蛋白的赖氨酸残基131的伯胺(Song,L.等，Science274，(1996):1859-1866)通过1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐/N-羟基磺基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)偶联化学反应共价结合羧基修饰的CdTe量子点。可选地，氨基酸129(苏氨酸)可被交换为半胱氨酸。因为在天然α溶血素蛋白中不存在其他半胱氨酸残基，新插入的半胱氨酸的巯基侧基可被用于共价附接其他化学部分。
生物聚合物，例如核酸分子或聚合物，可用一种或更多种受体标记物标记。对于核酸分子，核酸分子的四种核苷酸或构件(building block)的每一种可用一种受体标记物标记，从而创建每一种天然存在的核苷酸的标记的(荧光)对应物。受体标记物可以呈接受能量的分子的形式，所述接受能量的分子可被附接至转换的核酸的部分或整条链上的一个或更多个核苷酸。
多种方法可被用来标记核酸分子或聚合物的单体或核苷酸。标记的核苷酸可在使用原始样品作为模板合成新的核酸期间被掺入核酸(“通过合成标记”)。例如，核酸的标记可通过PCR、全基因组扩增、滚环扩增、引物延伸等或通过本领域普通技术人员已知的以上方法的多种组合和扩展形式来实现。
标记物可包括反应性基团，例如亲核体(胺、巯基等等)。随后不存在于天然核酸中的此类亲核试剂可被用于通过胺或巯基反应化学诸如NHS酯、马来酰亚胺、环氧环、异氰酸酯等附接荧光标记物。此类亲核试剂反应性荧光染料(即，NHS-染料)从不同来源是容易市售可得的。当使用“通过合成标记”方法时，用小的亲核体标记核酸的优点在于高效掺入此类标记的核苷酸。由于聚合过程期间标记物的空间位阻，大量荧光标记的核酸构件可能被聚合酶较差地掺入新合成的DNA。
每当使用两种或更多种互相猝灭的染料时，这些染料可使用正交附接化学附接至DNA上。例如，NHS酯可用于非常特异地与伯胺反应或马来酰亚胺将与巯基基团反应。伯胺(NH2)或巯基(SH)修饰的核苷酸均可商购。这些相对小的修饰容易地被掺入聚合酶介导的DNA合成中，并且可用于使用NHS或马来酰亚胺修饰的染料的随后的标记反应。选择和使用这种正交接头化学反应的指导可在Hermanson(上文引用)中找到。
用于典型连接位置的另外的正交附接化学反应包括用于铜催化反应和未催化反应的Huisgen型环加成；烯烃加腈氧化物环加成，例如公开在Gutsmiedl等，Org.Lett.,11:2405-2408(2009)中；Diels-Alder环加成，例如公开在Seelig等Tetrahedron Lett.,38:7729-7732(1997)；羰基连接，例如公开在Casi等，J.Am.Soc.,134:5887-5892(2012)；Shao等，J.Am.Soc.,117:3893-3899(1995)；Rideout,Science,233:561-563(1986)中；迈克尔加成，例如公开在Brinkley，Bioconjugate Chemistry,3:2-13(1992)；天然化学连接，例如公开在Schuler等，Bioconjugate Chemistry,13:1039-1043(2002)；Dawson等，Science,266:776-779(1994)中；或通过活性酯形成酰胺，例如公开在Hermanson(上文引用)中。
核酸链中1、2、3或4种核苷酸的组合可与它们的标记的对应物互换。标记的核苷酸的多种组合可被平行地测序，例如，除了四种单一标记的样品外，用两种标记的核苷酸的组合标记源核酸或DNA，其将产生总共10种不同标记的样品核酸分子或DNA(G、A、T、C、GA、GT、GC、AT、AC、TC)。得到的序列模式由于在冗余序列读出中重叠的核苷酸位置，可允许更准确的序列比对。在一些实施方案中，聚合物诸如多核苷酸或多肽，可被附接至单个种类单体的单个荧光标记物标记，例如，多核苷酸的每个T(或基本上每个T)被荧光标记物例如花青染料标记。在这样的实施方案中，来自聚合物的荧光信号的集合或序列可形成特定聚合物的特征或指纹。在一些这样的实施方案中，这样的指纹可以或可以不为待确定的单体序列提供足够的信息。
在一些实施方案中，本发明的特征是用为互相猝灭集的成员的荧光染料或标记物标记聚合物分析物的基本上所有单体。关于标记聚合物分析物的术语“基本上所有”的使用是认识到化学和酶标记技术通常低于100％有效。在一些实施方案中，“基本上所有”意味所有单体的至少80％附接了荧光标记物。在其他实施方案中，“基本上所有”意味所有单体的至少90％附接了荧光标记物。在其他实施方案中，“基本上所有”意味所有单体的至少95％附接了荧光标记物。
用于测序聚合物诸如核酸分子的方法包括提供插入膜或膜样结构或其他基质中的纳米孔或孔蛋白(或合成的孔)。孔的底部或其他部分可被一种或更多种孔标记物修饰。所述底部可指孔的反式侧。任选地，孔的顺式侧和/或反式侧可用一种或更多种孔标记物修饰。待分析或待测序的核酸聚合物可用作模板，用于产生标记版本的核酸聚合物，其中在所得聚合物中四种核苷酸的一种或多达所有四种核苷酸被核苷酸的标记的类似物代替。对纳米孔施加电场，迫使标记的核酸聚合物穿过纳米孔，同时外部的单色或其他光源可被用于照射纳米孔，从而激发孔标记物。在核酸的标记的核苷酸通过、离开或进入纳米孔时、之后或之前，能量从孔标记物转移至核苷酸标记物，其导致较低能量辐射的发射。然后通过本领域普通技术人员已知的能够进行单分子检测的共焦显微镜装置或其他光学检测系统或光学显微镜系统检测核苷酸标记物辐射。这种检测系统的实例包括但不限于共焦显微术、落射照明荧光显微术等。在一些实施方案中，采用落射照明荧光显微术。
当聚合物的受体标记的单体(例如，核苷酸)的受体标记物在标记的单体离开、进入或通过纳米孔时、之后或之前与供体标记物反应时，能量可从孔或纳米孔供体标记物(例如，量子点)转移至聚合物(例如，核酸)上的受体标记物。例如，供体标记物可被放置于或连接到纳米孔的顺式侧或反式侧或表面上，使得供体标记物和受体标记物之间的相互作用或能量转移不发生，直到标记的单体离开纳米孔并进入纳米孔通道或开口之外的供体标记物的附近或邻近。结果，标记物之间的相互作用、从供体标记物到受体标记物的能量转移、来自受体标记物的能量发射和/或来自受体标记物的能量发射的测量或检测，可在穿过纳米孔的通路、通道或开口之外发生，例如，在纳米孔的顺式或反式侧上的顺式或反式室中。从单体的受体标记物发射的能量的测量或检测可被用来鉴定单体。
纳米孔标记物可放置于纳米孔的通路、通道或开口的外部使得标记物可以是可见的或可被暴露来促进标记物的激发或照射。供体标记物和受体标记物之间的相互作用和能量转移以及由于能量转移而从受体标记物的能量发射，可在纳米孔的通路、通道或开口的外部发生。这可促进通过例如光学检测或测量装置检测或测量来自受体标记物的能量或光发射的简便性和准确度。
供体标记物可以以多种方式和/或在纳米孔上的多个位点处附接。例如，供体标记物可直接或间接附接或连接至纳米孔的部分或单元上。可选地，供体标记物可与纳米孔毗邻放置。
聚合物(例如，核酸)的每个受体标记的单体(例如，核苷酸)可以与供体标记物顺序地相互作用，所述供体标记物放置于聚合物易位穿过的纳米孔或通道的出口上或紧邻该出口或直接或间接附接至该出口。供体和受体标记物之间的相互作用可在纳米孔通道或开口之外进行，例如，在受体标记的单体离开纳米孔后或在单体进入纳米孔之前。相互作用可发生在或部分发生在纳米孔通道或开口之内，例如当受体标记的单体经过、进入或离开纳米孔时发生。
当核酸的四种核苷酸的一种被标记时，单个核苷酸标记物发射引起的时间依赖性信号被转换为对应于标记的核苷酸在核酸序列中的位置的序列。随后，对不同样品中的四种核苷酸的每一种重复该过程，并且四个部分的序列随后被比对以组装完整的核酸序列。
当分析多色标记的核酸(DNA)序列时，从一种或更多种供体标记物到可存在于核酸分子上的四种不同的受体标记物的每一种的能量转移可产生四种不同的波长或颜色的光发射(每一种与四种核苷酸中的一种相关)，这允许直接的序列读出。
供体标记物(有时在本文也被称为“孔标记物”)可被置于离纳米孔的孔眼尽可能近的位置(例如在出口处)，而不引起损害核酸易位穿过纳米孔的阻塞。孔标记物可具有多种合适的性质和/或特征。例如，孔标记物可具有满足特定需求的能量吸收性质。孔标记物可具有从例如约0至约1000nm或从约200nm至约500nm范围的大的辐射能量吸收截面。孔标记物可吸收高于核酸标记物(例如受体标记物)的能量吸收的特定能量范围内的辐射。孔标记物的吸收能量可根据核酸标记物的吸收能量调整，以控制能量转移藉以可在两种标记物之间发生的距离。孔标记物可持续至少106至109个激发和能量转移循环是稳定的且有功能的。
在一些实施方案中，用于分析各自具有附接至单体序列的光学标记物的聚合物的装置可包括以下元件：(a)分隔第一室和第二室的固相膜中的纳米孔阵列，其中所述纳米孔阵列的纳米孔各自提供第一室和第二室之间的流体连通并且被布置成簇使得纳米孔的每个不同簇被布置在不同的分辨率有限区域内，并且使得每个簇包括大于1或为平均值大于零的随机变量的数目的纳米孔；(b)用于使第一室中的聚合物穿过纳米孔阵列的纳米孔移动到第二室的聚合物易位系统；以及(c)用于在每当光学标记物在分辨率有限区域内离开纳米孔时，收集由附接至聚合物的光学标记物生成的光学信号的检测系统。
使用自猝灭染料和/或猝灭剂的基于光学的纳米孔测序
在一个方面，本发明包括使用具有不透明层的纳米孔阵列和直接照射荧光标记的多核苷酸以进行序列确定。在一些实施方案中，此类应用包括使用荧光猝灭和荧光信号传导以依序鉴定荧光标记的多核苷酸分析物的核苷酸。多核苷酸分析物的这种分析可同时对多个多核苷酸平行进行，例如通过使用包含不透明层的纳米孔的阵列。在一些实施方案中，当被附接至多核苷酸时，核苷酸被能够具有至少三种状态的荧光标记物标记：(i)基本上猝灭状态，其中附接的荧光标记物的荧光被紧邻的单体上的荧光标记物猝灭或通过与猝灭剂的相互作用被猝灭；例如，当被标记的多核苷酸在用于研究和操作多核苷酸的常规水性溶液或缓冲液中游离时，附接至根据本发明的多核苷酸的荧光标记物被基本上猝灭。(ii)空间束缚状态，当被标记的多核苷酸易位穿过纳米孔以使附接的荧光标记物的游离溶液运动或排列被破坏或限制时，使得从荧光标记物生成很少或没有可检测信号。(iii)跃迁状态，其中随着荧光标记物的核苷酸离开纳米孔(在“跃迁间隔”或“间隔”期间)，附接至多核苷酸的荧光标记物从空间束缚状态跃迁为猝灭状态。在跃迁间隔期间，(在原本基本上完全标记的和自猝灭的或猝灭的多核苷酸上的)荧光标记物能够生成可检测的荧光信号，并且对测量信号有贡献的离开的标记物的数量可以(至少部分地)通过控制标记的多核苷酸的易位速度来控制。如果易位速度(例如每毫秒离开纳米孔的核苷酸)高于跃迁速率(从能够产生信号到被猝灭，即猝灭速率)，则测量的荧光信号或信号样本可能包含来自多于一个标记物的贡献。
不意图受到以上方法的任何潜在理论的限制，据信，在跃迁间隔期间生成的荧光信号是由于出现于纳米孔的荧光标记物中的一个或更多个可自由旋转的偶极子的存在，其使荧光标记物能够生成荧光信号，例如在直接激发后或经由FRET激发后。在一些实施方案中，多核苷酸是单链多核苷酸，诸如DNA或RNA，但特别是单链DNA。在一些实施方案中，本发明包括用于通过记录当随着多核苷酸易位穿过纳米孔荧光标记物一次一个地离开纳米孔时生成的信号，确定多核苷酸的核苷酸序列的方法。可以选择易位速度以使测量的荧光信号包括基本上仅来自单个标记物的荧光的可能性最大化，其中这种选择可以通过在操作期间实时调整可控制的参数(例如跨越纳米孔的电压、温度等)或通过预定的仪器设置(例如反应缓冲液黏度、离子浓度等)。在离开时，每个附接的荧光标记物在跃迁间隔期间由纳米孔内的束缚状态跃迁成游离溶液中的多核苷酸上的猝灭状态。在跃迁间隔期间，标记物能够生成可以测量的荧光信号。换言之，在一些实施方案中，方法的一个步骤可以包括在每个荧光标记物由纳米孔内的束缚状态跃迁成游离溶液中聚合物上的猝灭状态时激发它们。如以上提到的，在这个跃迁间隔或时间段期间荧光标记物能够发射指示其所附接的核苷酸的可检测荧光信号。
在一些实施方案中，如以上使用的“基本上猝灭”意味着荧光标记物生成的荧光信号比在相同条件下但无毗邻的相互猝灭标记物时生成的信号，减少至少百分之三十。在一些实施方案中，如以上使用的“基本上猝灭”意味着荧光标记物生成的荧光信号比在相同条件下但无毗邻的相互猝灭标记物时生成的信号，减少至少百分之五十。
以上概念在图4A-4B中阐释，其示意性示出了易位穿过纳米孔(4002)的标记的多核苷酸(4000)。标记的多核苷酸(4000)包含两个标记物“a”和“b”(例如，其可以对应于用“a”标记的dC和用“b”标记的dA、dG和dT等)。游离于纳米孔(4002)的核苷酸的标记物通过与其他标记物(4011)的相互作用或通过猝灭剂(未示出)的作用猝灭。纳米孔(4002)内的核苷酸的标记物受到约束和/或定向(4014)，使得它们在穿过纳米孔的全部或部分期间不产生可检测的信号。当标记的多核苷酸(4000)的核苷酸从纳米孔(4002)的出口(4015)出现时，它们变得能够被激发光束(4010)激发并在猝灭之前的间隔生成可检测的信号。如果易位速度V1高，则猝灭之前核苷酸行进的距离(4008)可能超过多核苷酸(4000)的核苷酸间距离，使得多于一个标记物(图4A中示出)为由检测器(4018)收集的荧光信号，即测量的荧光信号，贡献荧光。如果易位速度V2低，则猝灭之前核苷酸行进的距离(4008)大约等于或小于多核苷酸(4000)的核苷酸间距离，使得不多于一个标记物(图4B中示出)为由检测器(4018)收集的荧光信号，即测量的荧光信号，贡献荧光。由于相邻标记物之间的距离低于激发光(4010)的衍射极限，所以没有获得关于标记物的顺序的信息，尽管存在一些使用专用算法来推断这种信息的方法，例如，Anderson等,美国临时专利申请62/322343；Timp等,Biophys.J.,102:L37-L39(2012)；Carson等,Nanotechnology,26:074004(2015)。在使用具有不同发射带的荧光标记物进行光学检测的情况下，所测量的荧光信号可以分到两个或更多个通道中，例如使用带通滤波器(bandpass filters)，以评估来自多个标记物的荧光的相对贡献。但是，随着有助于荧光的荧光标记物的数量增加，例如，3个、4个或更多个，确定核苷酸的正确顺序的难度增加。两个通道的信号强度，例如对应于两个荧光标记物的发射最大值在图4A(4031和4032)和图4B(4041和4042)中示出，在图4A中两个荧光标记物对测量的信号有贡献，在图4B中的单个荧光标记物对测量的信号有贡献。用实线表示的强度值例如4033来自标记物“a”，并且用虚线表示的强度值例如4036来自标记物“b”。图4A的两个通道中的实线和虚线的存在反映了荧光标记物的重叠发射带，其在一起收集时使分析变得复杂，因为测量强度的量来自两个标记物。在图4B中，只有单个荧光标记物对测量的信号有贡献，强度值不包含由于其他标记物的重叠发射带的贡献，由此使标记物(以及因此核苷酸)确定更容易。
在纳米孔技术领域中已经认识到多核苷酸穿过纳米孔的易位速度的作用以及其控制的需要，其中电流的变化用于鉴定易位的分析物。已经使用各种各样的方法来控制易位速度，其既包括可以实时调整而没有显著困难(例如跨越纳米孔的电压电位、温度等)的方法也包括有困难的仅在操作期间可以调整的方法(反应缓冲液粘度、在蛋白纳米孔的孔洞中存在或不存在带电侧链、反应缓冲液的离子组成和浓度、与多核苷酸分析物附接或杂交的速度延迟基团、分子马达等)，例如Bates等,Biophysical J.,84:2366-2372(2003)；Carson等,Nanotechnology,26(7):074004(2015)；Yeh等,Electrophoresis,33(23):58-65(2012)；Meller,J.Phys.Cond.Matter,15:R581-R607(2003)；Luan等,Nanoscale,4(4):1068-1077(2012)；Keyser,J.R.Soc.Interface,8:1369-1378(2011)等，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以包括一个或更多个步骤来在本发明的方法正在被实施的同时主动控制易位速度，，例如电压电势、温度等；在其他实施方案中，包括一个或多个步骤，其确定在实施本发明的方法时易位速度不被有效控制或改变，例如反应缓冲液粘度、离子浓度等。关于后者，在一些实施方案中，通过提供浓度在1％-60％的范围内的甘油或等效试剂的反应缓冲液来选择易位速度。
关于前面的实施方案(具有实时易位速度调节)，一个或多于一个标记物是否为测量信号贡献荧光的测量可以基于荧光强度在荧光收集所在的多个通道上的分布。通常，多个通道包括对应于所使用的荧光标记物的发射带的2个、3个或4个通道。在来自相邻于纳米孔出口的区域发出的荧光的测量样本中，如果仅有单个标记物对测量的信号有贡献，则不同通道(例如4个通道)中信号强度的相对分布可理想地表示为(1,0,0,0)；(0,1,0,0)；(0,0,1,0)或(0,0,0,1)。另一方面，如果多于一个标记物对测量的荧光信号有贡献，则相对分布将包括多于一个通道中的非零值，更糟糕的情况是四个不同的标记物贡献相等，这在以上表示中将显示为(.25,.25,.25,.25)。在对应于相对强度分布(1,0,0,0)；(0,1,0,0)；(0,0,1,0)或(0,0,0,1)的最大值和对应于(.25,.25,.25,.25)的相对强度分布的最小值之间单调变化的度量可以用于实时控制易位速度。例如，初始易位速度可以基于接近其最小值的这种度量的值来降低。例如，可以通过将跨纳米孔的潜在电压降低预定量来实现这种降低，之后可以重新计算该量度。这些步骤可以重复直到过程被优化。
如上所述，易位速度部分取决于跨越纳米孔的电压差(或电场强度)以及多核苷酸在其中暴露于纳米孔(例如置于构成第一室的一个壁的固相膜中)的第一室的反应混合物或缓冲液中的条件。纳米孔的多核苷酸捕获速率取决于此类多核苷酸的浓度。在一些实施方案中，用于纳米孔测序的常规反应混合物条件可以用于本发明(用于通过改变跨纳米孔的电压电位来控制易位速度)，例如1M KCl(或等同的盐诸如NaCl、LiCl等)和pH缓冲系统(其例如确保所使用的蛋白例如蛋白纳米孔、核酸酶等不变性)。在一些实施方案中，可以使用pH缓冲系统使pH基本恒定在6.8至8.8的范围内的值。在一些实施方案中，跨纳米孔的电压差可以在70mV至200mV的范围内。在其他实施方案中，跨纳米孔的电压差可以在80mV至150mV的范围内。可以使用常规测量技术来选择适当的操作电压。跨纳米孔的电流(或电压)可以使用商购可得的仪器容易地测量。可以选择电压差使得易位速度在期望的范围内。在一些实施方案中，易位速度的范围包括小于每秒1000个核苷酸的那些速度。在其他实施方案中，易位速度的范围为10至800个核苷酸/秒；在其他实施方案中，易位速度的范围为10至600个核苷酸/秒；在其他实施方案中，易位速度的范围为200至800个核苷酸/秒；在其他实施方案中，易位速度的范围为200至500个核苷酸/秒。同样，可以选择影响易位速度的其它因素例如温度、黏度、离子浓度、蛋白纳米孔的孔洞中的带电侧链等以获得上述范围内的易位速度。
在一些实施方案中，用于实施针对单链核酸的上述方法的装置通常包括提供用于建立跨纳米孔(其可能包含阵列)的电场的一组电极。通过将单链核酸置于第一室中的电解质(即反应缓冲液)中，将单链核酸暴露于纳米孔，所述第一室通过在室中放置负极而构造为层状膜的“顺式”侧。在施加电场时，带负电的单链核酸被纳米孔捕获并易位到层状膜的另一侧上的第二室，所述第二室层通过在室中放置正极而构造为膜的“反式”侧。如上文所述，易位的速度部分取决于第一室和第二室中电解质的离子强度以及跨越纳米孔施加的电压。在基于光学的检测中，易位速度可以通过初步校准测量来选择，例如，使用预定的标记的单链核酸的标准品，其针对不同的电压以针对每个纳米孔不同的预期速率生成信号。因此，对于DNA测序应用，可以基于来自这些校准测量的信号速率以及基于上述讨论的相对信号强度分布的测量来选择初始易位速度。因此，根据这种测量，可以选择允许或最大化可靠的核苷酸鉴定的例如在纳米孔阵列上的电压。在一些实施方案中，这样的校准可以使用来自待分析的模板的样品的核酸(代替预定标准序列或除预定标准序列以外)进行。在一些实施方案中，这样的校准可以在测序运行期间实时执行，并且所施加的电压可以基于这样的测量实时修改，例如以最大化核苷酸特异性信号的采集。
使用相互猝灭和自猝灭标记物的实施方案
如上所述，在一些实施方案中，除了猝灭剂以外，可以使用自猝灭和相互猝灭的荧光标记物以降低来自离开纳米孔的核苷酸上的标记物的荧光发射之外的那些。这种荧光标记物的使用在美国专利公布2016/0122812中公开，其通过引用并入。在一些实施方案中，当被附接至靶多核苷酸时，单体被能够具有至少三种状态的荧光标记物标记：(i)基本上猝灭状态，其中附接的荧光标记物的荧光被紧邻的单体上的荧光标记物猝灭；例如，当被标记的多核苷酸在用于研究和操作多核苷酸的常规水性溶液中游离时，附接至根据本发明的多核苷酸的荧光标记物被基本上猝灭。(ii)空间束缚状态，当被标记的多核苷酸易位穿过纳米孔以使附接的荧光标记物的游离溶液运动或排列被破坏或限制，使得从荧光标记物生成很少或没有可检测信号。(iii)跃迁状态，其中在多核苷酸易位穿过纳米孔时，随着荧光标记物离开纳米孔(在“跃迁间隔”期间)，附接至多核苷酸的荧光标记物从空间束缚状态跃迁为猝灭状态。
部分地，本实例是在跃迁间隔期间(否则基本上完全被标记和自猝灭的多核苷酸上的)荧光标记物能够产生可检测荧光信号的发现的应用。不意图受到本发现的任何潜在理论的限制，据信，在跃迁间隔期间生成的荧光信号是由于出现于纳米孔的荧光标记物中的可自由旋转的偶极子的存在，其使荧光标记物短暂地能够生成荧光信号，例如在直接激发后或经由FRET激发后。在空间束缚状态和猝灭状态二者中，偶极子旋转的自由度被限制，从而减少或限制发射的光子的数目。在一些实施方案中，多核苷酸是通常为单链多核苷酸的多核苷酸，例如DNA或RNA，但特别是单链DNA。在一些实施方案中，本发明包括用于通过记录当多核苷酸易位穿过纳米孔时附接的荧光标记物一次一个地离开纳米孔时生成的信号，确定多核苷酸的核苷酸序列的方法。在离开时，每个附接的荧光标记物在跃迁间隔期间由纳米孔内的束缚状态跃迁成游离溶液中的多核苷酸上的猝灭状态。换言之，在一些实施方案中，本发明的方法的一个步骤包括在每个荧光标记物由纳米孔内的束缚状态跃迁成游离溶液中多核苷酸上的猝灭状态时激发它们。如以上提到的，在这个跃迁间隔或时间段期间荧光标记物能够发射指示其所附接的核苷酸的可检测荧光信号。
在一些实施方案中，本发明包括以下发现的应用：荧光标记物和纳米孔可被选择，以使在多核苷酸易位穿过纳米孔期间，附接至单体的荧光标记物被迫使进入束缚状态，在该状态它们不能够(或基本上不能够)产生可检测荧光信号。在一些实施方案中，纳米孔被选择以具有直径在1nm至4nm的范围内的孔洞或腔；在其他实施方案中，纳米孔被选择以具有直径在2nm至3nm的范围内的孔洞或腔。在一些实施方案中，这种孔洞的直径由蛋白纳米孔提供。在一些实施方案中，这种纳米孔被用于迫使荧光标记物进入根据本发明的束缚状态，以使每当荧光标记物离开纳米孔时，其由基本上不能够生成荧光信号跃迁为可被其被诱导发射的荧光信号所检测和鉴定。因此，附接至多核苷酸的单体序列的每个的荧光标记物可在紧邻纳米孔出口的区域(“跃迁区”或“跃迁体积”或“检测区”)当其突然生成荧光信号时被顺序地检测。在一些实施方案中，有机荧光染料被用作具有上述直径的纳米孔的荧光标记物。在一些实施方案中，至少一种这样的有机荧光染料选自由呫吨染料、罗丹明染料和花青染料组成的组。用于确定多核苷酸的单体序列的一些实施方案可用以下步骤进行：(a)使多核苷酸易位穿过纳米孔，其中多核苷酸的单体被荧光标记物标记，其中纳米孔将其孔洞内的荧光标记物束缚为束缚状态以使基本上没有可检测荧光信号在其中生成；(b)在每个单体离开纳米孔时激发每个单体的荧光标记物；(c)在检测区测量由离开的荧光标记物生成的荧光信号以鉴定荧光标记物附接的单体；(d)猝灭来自检测区以外的激发的荧光标记物的荧光信号；以及(d)由荧光信号的序列确定多核苷酸的单体序列。在进一步的实施方案中，荧光标记物是FRET对的受体并且FRET对的一个或更多个供体在出口的FRET距离内被附接至纳米孔上。
在一些实施方案中，如以上使用的“基本上猝灭”意味着荧光标记物生成的荧光信号比在相同条件下但无毗邻的相互猝灭标记物时生成的信号减少至少百分之三十。在一些实施方案中，如以上使用的“基本上猝灭”意味着荧光标记物生成的荧光信号比在相同条件下但无毗邻的相互猝灭标记物时生成的信号减少至少百分之五十。
在一些实施方案中，靶多核苷酸的核苷酸序列通过进行四个单独的反应来确定，这四个单独的反应中，靶多核苷酸的拷贝的四种不同种类的核苷酸(A、C、G和T)中的每种被单一荧光标记物标记。在这样的实施方案的变化形式中，靶多核苷酸的核苷酸序列通过进行四个单独的反应来确定，这四个单独的反应中，靶多核苷酸的拷贝的四种不同种类的核苷酸(A、C、G和T)中的每种被一种荧光标记物标记，而与此同时，在同一靶多核苷酸上的其他核苷酸被第二荧光标记物标记。例如，如果在第一反应中第一荧光标记物附接至靶多核苷酸的A，那么在第一反应中第二荧光标记物附接至靶多核苷酸的C、G和T(即，至“非A的核苷酸”)。同样地，在实例的延续中，在第二反应中，第一标记物附接至靶多核苷酸的C并且第二荧光标记物附接至靶多核苷酸的A、G和T(即，至“非C的核苷酸”)。且对于核苷酸G和T，以此类推。
相同的标记方案可按照核苷酸类型的子集的常规术语的方式表述；因此，在上述实例中，在第一反应中，第一荧光标记物附接至A上以及第二荧光标记物附接至B上；在第二反应中，第一荧光标记物附接至C上以及第二荧光标记物附接至D上；在第三反应中，第一荧光标记物附接至G上以及第二荧光标记物附接至H上；且在第四反应中，第一荧光标记物附接至T上以及第二荧光标记物附接至V上。
在一些实施方案中，聚合物，例如多核苷酸或肽，可被附接至单个种类单体的单个荧光标记物标记，例如，多核苷酸的每个T(或基本上每个T)被荧光标记物如花青染料标记。在这样的实施方案中，来自多核苷酸的荧光信号的集合或序列可形成特定多核苷酸的特征或指纹。在一些这样的实施方案中，这样的指纹可以或可以不为待确定的单体序列提供足够的信息。
在一些实施方案中，本发明的特征是用为互相猝灭组的成员的荧光染料或标记物标记多核苷酸分析物的基本上所有单体。关于标记多核苷酸分析物的术语“基本上所有”的使用是承认，化学和酶标记技术通常低于百分之百的有效。在一些实施方案中，“基本上所有”意味所有单体的至少百分之八十附接了荧光标记物。在其他实施方案中，“基本上所有”意味所有单体的至少百分之九十附接了荧光标记物。在其他实施方案中，“基本上所有”意味所有单体的至少百分之九十五附接了荧光标记物。荧光染料的互相猝灭组具有以下性质：(i)各成员猝灭每一成员的荧光(例如，通过FRET或通过静态或接触机制)，和(ii)当被激发时且当处于未猝灭状态时，每个成员生成不同的荧光信号。即，如果互相猝灭组由两种染料D1和D2组成，则(i)D1是自猝灭的(例如通过与另一个D1分子接触猝灭)，并且其被D2猝灭(例如通过接触猝灭)并且(ii)D2是自猝灭的(例如通过与另一个D2分子接触猝灭)并且其被D1猝灭(例如通过接触猝灭)。选择用于互相猝灭组的荧光染料或标记物的指导可在以下参考文献中找到，其通过引用并入本文：Johansson,Methods in Molecular Biology,335:17-29(2006)；Marras等，Nucleic Acids Research,30:el22(2002)等等。在一些实施方案中，互相猝灭组的成员包括有机荧光染料，其组分或部分能够进行堆叠相互作用，例如芳族环结构。荧光染料或标记物的示例性的互相猝灭组可选自罗丹明染料、荧光素染料和花青染料。在一个实施方案中，互相猝灭组可包含罗丹明染料TAMRA和荧光素染料FAM。在另一个实施方案中，荧光染料的互相猝灭组可通过从由以下组成的组中选择两种或更多种染料来形成：俄勒冈绿488、荧光素-EX、异硫氰酸荧光素、罗丹明红-X、丽丝胺罗丹明B、钙黄绿素、荧光素、罗丹明、一种或更多种BODIPY染料、德克萨斯红、俄勒冈绿514和一种或更多种Alexa Fluors。代表性的BODIPY染料包括BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650和BODIPY 650/665。代表性的Alexa Fluors包括Alexa Fluor 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790。
如上所述，在一些实施方案中，靶多核苷酸的单体序列通过进行单独的反应(每种单体一个)来确定，其中靶多核苷酸的拷贝的各不同种类的单体被互相猝灭或自猝灭的荧光标记物标记。在其他实施方案中，靶多核苷酸的单体序列通过进行单独的反应(每种单体一个)来确定，其中靶多核苷酸的拷贝的各不同种类的单体被选自同一互相猝灭组的不同的互相猝灭的荧光标记物标记。在其中互相猝灭组仅含有两种染料的实施方案中，则用第一互相猝灭染料标记选择的单体(例如单体X)，并且用来自同一组的第二互相猝灭染料标记每一其他种类单体(即，不是单体X)。因此，该实施方案的步骤生成了两个不同荧光信号的序列，一个指示单体X，另一个指示不是单体X。
在一些实施方案中，单一的荧光标记物(例如，附接至包含多种类型单体的多核苷酸的单种单体上)可被使用，当其被附接至多核苷酸上的毗邻单体(同种类型)，例如多核苷酸的毗邻核苷酸时，是自猝灭的。示例性自猝灭荧光标记物包括但不限于俄勒冈绿488、荧光素-EX、FITC、罗丹明红-X、丽丝胺罗丹明B、钙黄绿素、荧光素、罗丹明、BODIPYS和德克萨斯红，例如其公开在Molecular Probes Handbook，第11版(2010)中。
使用猝灭剂的实施方案
如下面更充分地解释的，大量的非荧光猝灭剂可用于本发明，所述非荧光猝灭剂包括许多周知的有机染料的衍生物，如不对称花青染料，以及此类化合物的缀合物和寡核苷酸和/或其类似物。猝灭剂可以放置在顺式室、反式室或两者中。图4C阐释了包括以下要素的实施方案：设置在脂质双层(402)中的蛋白纳米孔(400)；对荧光标记物进行落射照射，固相膜(406)中的不透明层(408)防止或减少背景荧光；和设置在反式室(426)中的猝灭剂(410)。如上所述，具有荧光标记的核苷酸的多核苷酸(420)(如(422)所示的，标记物由“f”表示)从顺式室(424)易位穿过纳米孔(400)至反式室(426)。寡核苷酸猝灭剂(410)在允许寡核苷酸猝灭剂(428)与从纳米孔(400)出现的多核苷酸(420)的部分杂交的条件下(例如浓度、温度、盐浓度等)置于反式室(426)。如在Huber等的美国专利公布US 2016/0076091中所述，纳米孔(400)可以被选择为使得来自荧光标记物的信号在纳米孔的传送期间被抑制，其通过引用并入本文。因此，当标记的核苷酸从区域(428)中的纳米孔(400)出现时，它们变得不受抑制并且能够生成信号。对于大多数即使不是所有形式的直接照射(例如非FRET)，当这种出现的标记物进一步行进到反式室(426)中时，它们将继续发出荧光，从而对收集的信号贡献极大。利用反式室(426)中与出现的多核苷酸结合的猝灭剂，这种发射可以显著降低并且可以限定检测区(428)，从中收集的信号可以被分析以提供关于多核苷酸(420)的核苷酸序列信息。在一些实施方案中，随着标记的多核苷酸移动通过检测区(428)，在检测期期间从检测区(428)检测来自单个荧光标记物的荧光信号。在其他实施方案中，在预定时间段期间从检测区(428)中的多个荧光标记物收集多个荧光信号。在一些实施方案中，这种检测时间段小于1毫秒、或小于0.1毫秒、或小于0.01毫秒。在一些实施方案中，这样的检测期是至少0.01毫秒、或至少0.1毫秒、或至少0.5毫秒。
本发明的猝灭剂包括在纳米孔测序条件下为(i)基本上不发荧光，(ii)结合单链核酸，特别是单链DNA，和(iii)以非辐射方式从其他分子吸收激发能量，并非辐射地释放能量的任何化合物(或一组化合物)。在一些实施方案中，猝灭剂进一步非共价结合至单链DNA。各种猝灭化合物可用于本发明，包括但不限于普通合成染料如花青和呫吨染料的非荧光衍生物，如下文更充分描述的。选择猝灭化合物的指导可参见美国专利6,323,337；6,750,024以及相似的参考文献，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，猝灭剂可以是单链DNA结合染料，其已经用已知猝灭荧光的重原子(诸如溴或碘)共价修饰，或用已知猝灭荧光的其他基团(诸如硝基或偶氮基)共价修饰。已知结合单链DNA的染料的实例是Sybr Green(Zipper等,(2004),Nucleic AcidsResearch.32(12))。将硝基、溴、碘和/或偶氮基团掺入到花青Sybr Green结构中提供了将猝灭可能存在于DNA上的荧光标记物的单链DNA结合基团部分。
在一些实施方案中，猝灭剂包含结合部分和一个或更多个猝灭部分。结合部分可以包括无实质序列特异性地结合单链核酸的任何化合物。结合部分可以包含具有修饰的连接和/或单体的肽或寡核苷酸或类似物。寡核苷酸及其类似物可以经由双链体形成或通过非碱基配对的适体结合提供与多核苷酸的结合。在一些实施方案中，结合部分包含长度在从6至60个核苷酸的范围内的寡核苷酸或其类似物。此类寡核苷酸或类似物可以缀合至一个猝灭部分或多个猝灭部分。在一些实施方案中，缀合至每个寡核苷酸或类似物的多个猝灭部分是2个或3个。与结合部分缀合的猝灭部分可以相同或不同。在一些实施方案中，每当结合部分是寡核苷酸或类似物时，两个猝灭部分与其缀合，一个在寡核苷酸的5'端且一个在寡核苷酸的3'端。具有从2至3个猝灭部分的寡核苷酸或类似物可以使用常规连接和合成化学来合成，例如，如本文引用的参考文献中所公开的。
寡核苷酸或类似物可作为单一物类提供，或者它们可作为具有不同序列的多种寡核苷酸或类似物的混合物提供，并因此具有不同的结合特异性。在一些实施方案中，寡核苷酸或类似物是随机序列聚合物；也就是说，它们作为给定长度的每种可能的序列的混合物被提供。例如，此类寡核苷酸或类似物可以由下式表示：对于6聚体，“NNNNNN”，或对于8聚体，“NNNNNNNN”，其中N可以是A、C、G或T或其类似物。
关于寡核苷酸的“类似物”是指含有一个或更多个核苷酸类似物的寡核苷酸。如定义部分所述，“核苷酸类似物”是可以具有修饰的连接部分、糖部分或碱基部分的核苷酸。可以用于本发明的示例性寡核苷酸类似物包括但不限于肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)(2'-O-甲基RNA)、硫代磷酸酯寡核苷酸、桥接核酸(BNA)等。
在一些实施方案中，寡核苷酸结合部分包含通用碱基；也就是说，它们含有一个或更多个核苷酸类似物，所述核苷酸类似物可以替换四种天然核苷酸中的任何一种，而不会使碱基对相互作用不稳定。具有通用碱基性质的核苷酸类似物在Loakes,Nucleic AcidsResearch,29(12):2437-2447(2001)中描述，该文献通过引用并入本文。在一些实施方案中，寡核苷酸结合部分包含2'-脱氧肌苷、7-脱氮-2'-脱氧肌苷、2-氮杂-2'-脱氧肌苷、3-硝基吡咯核苷酸、5-硝基吲哚核苷酸等。
在一些实施方案中，猝灭剂可包含两种或更多种化合物的组合，所述化合物一起起作用以猝灭单链标记的多核苷酸的不希望的荧光信号。例如，猝灭剂可以包含可以与标记的多核苷酸形成双链体的寡核苷酸(例如聚脱氧肌苷)以及单独地包含为猝灭剂的双链嵌入剂。因此，每当聚脱氧肌苷与标记的多核苷酸结合时，猝灭嵌入剂结合所得双链体并猝灭来自多核苷酸的荧光信号。
为了本发明的目的，可检测地猝灭标记的多核苷酸的荧光标记物的荧光信号的任何合成染料是可接受的猝灭部分。具体而言，如本发明使用的，猝灭部分具有显示与标记的多核苷酸上的荧光标记物的发射带的至少一些光谱重叠的吸收带。这种重叠可以在荧光标记物(供体)的发射在比猝灭部分(受体)的最大吸收波长更低或甚至更高的波长发射最大值处发生时发生，条件是存在足够的光谱重叠。能量转移也可以通过将供体的发射转移给受体的更高电子状态而发生。本领域普通技术人员通过检查该染料的激发带相对于所用荧光标记物的发射光谱来确定给定猝灭部分的效用。
典型地，本发明中的荧光猝灭通过本发明的荧光标记物和猝灭部分之间的荧光共振能量转移(FRET或通过形成电荷转移复合物)而发生。供体和受体化合物的光谱和电子性质对观察到的能量转移的程度具有强烈的影响，标记的多核苷酸上的荧光标记物与猝灭部分之间的分离距离也一样。随着分离距离增加，荧光猝灭的程度降低。
猝灭部分可以任选地是荧光的，条件是当与标记的多核苷酸结合时，染料的最大发射波长与荧光标记物的最大发射波长充分分离。然而，优选地，当与寡核苷酸或类似物共价缀合时，猝灭部分仅具有微弱的荧光，或者基本上无荧光。如本文使用的，基本上无荧光表示如对于本文的任何方法所描述的，测定溶液中猝灭部分的荧光效率小于或等于5％，优选地小于或等于1％。在其他实施方案中，共价结合的猝灭部分表现出小于约0.1，更优选地小于约0.01的量子产率。在一些实施方案中，相对于在不存在共价结合的猝灭部分的情况下与相同荧光标记物缔合的相同寡核苷酸，本发明的与猝灭寡核苷酸缔合的荧光标记物的荧光被猝灭超过50％。在另一个实施方案中，相对于未标记的寡核苷酸，荧光标记物被猝灭超过90％。在又另一个实施方案中，相对于未标记的寡核苷酸，核酸染色剂被猝灭超过95％。
在一些实施方案中，猝灭部分可以是芘、蒽、萘、吖啶、茋、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯-2-氧杂1,3-二唑(NBD)、花青、羰花青(carbocyanine)、carbostyryl、卟啉、水杨酸盐、邻氨基苯甲酸盐、甘菊环烃、苝(perylene)、吡啶、喹啉、香豆素(包括羟基香豆素和氨基香豆素及其氟化和磺化衍生物(如Gee等(1998)的美国专利第5,830,912号和Wang等(1997)的美国专利第5,696,157号(通过引用并入)中所述的)、polyazaindacene(例如Haugland等(1988)的美国专利第4,774,339号；Kang等(1993)的美国专利第5,187,288号；Haugland等(1993)的美国专利第5,248,782号；Kang等(1993)的美国专利第5,274,113号；Kang等(1995)的美国专利第5,433,896号；Wu等(1999)的美国专利第6,005,113号，全部通过引用并入)、呫吨、噁嗪或苯并噁嗪，卡比嗪(Corey(1989)的美国专利第4,810,636号，通过引用并入)或phenalenone或benzphenalenone(Babb等(1989)的美国专利第4,812,409号，通过引用并入)。
在其他实施方案中，为基本上非荧光的染料的猝灭部分特别包括偶氮染料(诸如DABCYL或DABSYL染料及其结构类似物)、三芳基甲烷染料诸如孔雀绿或酚红、4',5z-二醚取代的荧光素(美国专利第4,318,846号(1982))或不对称花青染料猝灭剂(PCT国际申请WO99 37,717(1999))。
在猝灭部分是呫吨的实施方案中，合成染料任选地为荧光素、对甲氨基酚(Haugland等(1993)的美国专利第5,227,487号，通过引用并入)或罗丹明。如本文使用的，荧光素包括苯并荧光素或二苯并荧光素、半萘荧光素(seminaphthofluorescein)或萘并荧光素(naphthofluorescein)。类似地，如本文使用的，对甲氨基酚包括seminaphthorhodafluor(Haugland等(1990)的美国专利第4,945,171号，通过引用并入)。呫吨类包括呫吨染料的氟化衍生物(国际公布号WO 97/39064，Molecular Probes,Inc.(1997)，通过引用并入)和呫吨染料的磺化衍生物(国际公布号WO 99/15517，MolecularProbes,Inc.(1999)，通过引用并入)。如本文使用的，噁嗪包括试卤灵、氨基噁嗪酮、二氨基噁嗪和它们的苯并取代的类似物。
在另外的实施方案中，猝灭部分是在一个或更多个氨基氮原子处被芳族或杂芳族环系统取代的3-和/或6-氨基呫吨的基本上无荧光的衍生物，例如，如美国专利6,399,392中所述的，其通过引用并入本文。这些猝灭染料通常具有530nm以上的吸收最大值，具有很少或没有可观察到的荧光，并有效地猝灭广谱的荧光发射，诸如由化学发光体、荧光体或荧光团发出的荧光发射。在一个实施方案中，猝灭染料是取代的罗丹明。在另一个实施方案中，猝灭化合物是取代的对甲氨基酚。
在仍其他实施方案中，猝灭部分可以包含一种或更多种在以下专利中描述的被称为Black Hole QuenchersTM化合物(BHQ)的非荧光猝灭剂：7,019,129；7,109,312；7,582,432；8,410,025；8,440,399；8,633,307；8,946,404；9,018,369；或9,139,610，其通过引用并入本文。
另外的猝灭部分在以下公开，其通过引用并入本文：美国专利6,699,975；6,790,945；和8,114,979。
实施例
基于光学的纳米孔测序方法中靶多核苷酸的易位
在此实施例中，本发明与示例性基于光学的纳米孔测序方法结合使用。在此示例性基于光学的纳米孔测序方法中，靶多核苷酸的核苷酸用能够具有至少3种状态的荧光标记物标记：(i)猝灭状态，其中附接的荧光标记物的荧光被紧邻的多核苷酸上的荧光标记物猝灭；例如，当被标记的多核苷酸在水性溶液中游离时，附接至多核苷酸的荧光标记物被猝灭。(ii)空间束缚状态，其中被标记的多核苷酸易位穿过纳米孔以使附接的荧光标记物的游离溶液运动或排列被破坏或限制，使得从荧光标记物生成很少或没有可检测信号。(iii)跃迁状态，其中在多核苷酸易位穿过纳米孔时，随着荧光标记物离开纳米孔(在“跃迁间隔”期间)，附接至多核苷酸的荧光标记物从空间束缚状态跃迁为猝灭状态。多核苷酸的核苷酸序列通过记录当多核苷酸易位纳米孔时附接的荧光标记物一次一个地离开纳米孔时生成的信号来确定。在离开时，每个附接的荧光标记物在跃迁间隔期间由纳米孔内的束缚状态跃迁成游离溶液中多核苷酸上的猝灭状态。在这个跃迁间隔期间，荧光标记物能够发射指示其所附接的核苷酸的可检测荧光信号。
在一些实施方案中，本发明可以使用以下步骤以这种纳米孔测序方法使用：(a)延伸在反应混合物中的模板上的具有5’非互补性尾部的引物以产生包含延伸的链和作为单链突出端的5’非互补性尾部的双链产物；(b)提供分隔第一室和第二室并提供第一室和第二室之间的流体连通的纳米孔(或纳米孔阵列)，其中纳米孔能够传递单链核酸而非双链核酸；(c)将双链产物放置于第一室中；(d)通过施加跨纳米孔的电场通过纳米孔捕获分离的双链产物的5’非互补性尾部；(e)使聚合物分析物易位穿过具有孔洞和出口的纳米孔，该聚合物分析物包含单体的序列，其中基本上每个单体被荧光标记物标记，使得相邻单体的荧光标记物通过在纳米孔之外彼此自猝灭而处于猝灭状态且荧光标记物在纳米孔内部处于空间束缚状态且不能生成可检测的荧光信号；(f)当纳米孔的出口处的荧光标记物从空间束缚状态过度为猝灭状态时激发每个荧光标记物，从而产生指示其附接的单体的荧光信号；(g)检测荧光信号以鉴定单体。如本文所用，关于标记单体，特别是核苷酸，“基本上每个”、“基本上所有”或类似术语承认化学标记程序可能不会导致每个单体的完全标记；在可行的程度内，这些术语包括，与本发明相关的标记反应继续至完成；在一些实施方案中，此类完成的标记反应包括标记至少百分之五十的单体；在其他实施方案中，此类标记反应包括标记至少百分之八十的单体；在其他实施方案中，此类标记反应包括标记至少百分之九十五的单体；在其他实施方案中，此类标记反应包括标记至少百分之九十九的单体。
在以上方法的一些实施方案中，荧光标记物是FRET对的成员。FRET对通常是一个或更多个FRET供体和一个或更多个FRET受体，其中每一个供体能够与每一个受体发生FRET反应。在一方面，这意味着，FRET对的供体具有与受体的吸收光谱基本上重叠的发射光谱。在另一方面，供体和受体的跃迁偶极子(transition dipole)必须以允许有效能量转移的方式对齐(aligned)。在一些方面，本发明部分地基于对荧光的发现和鉴别，特别地，纳米孔的FRET抑制性质和应用该性质以使能够检测易位穿过纳米孔的标记的聚合物。相信，尽管本发明并不意图因此被限制，可选择具有定制尺寸的孔洞的纳米孔以使FRET对的标记物在易位穿过纳米孔时不能够定向参与FRET相互作用。基于纳米孔的限制的直径，纳米孔的孔洞中的多核苷酸的标记物的偶极子在其转动自由度方面被约束。偶极子对齐与附接至纳米孔的相应的FRET对的对齐的该减少极大地限制了FRET的效率。标记的多核苷酸可在离开纳米孔之后参与FRET相互作用，届时聚合物(例如多核苷酸)上的FRET受体或供体恢复转动自由度，这允许FRET事件。
定义
“FRET”或“
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或荧光共振能量转移”意指从激发的供体荧光团至基态的受体荧光团的非辐射偶极子-偶极子能量转移机制。FRET相互作用中能量转移的速率取决于供体的发射光谱与受体的吸收光谱的光谱重叠程度、供体的量子产率、供体和受体跃迁偶极子的相对取向以及供体和受体分子之间的距离，Lakowitz，Principles of FluorescenceSpectroscopy，第三版(Springer，2006)。特别感兴趣的FRET相互作用是导致以下的那些：能量的一部分被转移到受体，继而，被受体作为光子发射，其频率低于激发其供体的光的频率(即，“FRET信号”)。“FRET距离”意指FRET供体和FRET受体之间可发生FRET相互作用并且FRET受体生成可检测FRET信号的距离。
“试剂盒”是指用于递送用于实施本发明的方法的材料或试剂的任何递送系统。在反应测定的上下文中，这种递送系统包括允许反应试剂(例如，在适当的容器内的荧光标记物，例如互相猝灭的荧光标记物、荧光标记物连接剂、酶等)和/或支撑材料(例如，缓冲液、用于进行测定的书面说明等)的储存、从一个位置到另一个位置的转运或递送的系统。例如，试剂盒包括一个或更多个包含相关反应试剂和/或支持材料的外壳(例如盒)。这样的内容物可一起或分开地传送到目标接收者。例如，第一容器可含有用于测定的酶，而第二个或更多个容器含有互相猝灭的荧光标记物。
“纳米孔”意指位于基质中的任何开口，其允许分析物以预定的或可辨别的顺序穿过基质，或在聚合物分析物的情况中，允许聚合物的单体单元以预定的或可辨别的顺序穿过基质。在后一种情况下，预定的或可辨别的顺序可以是聚合物中单体单元的一级序列。纳米孔的实例包括蛋白性质的或基于蛋白的纳米孔、合成的或固态的纳米孔、和包括其中嵌入蛋白纳米孔的固态纳米孔的杂合纳米孔。纳米孔可具有1-10nm或1-5nm或1-3nm的内径。蛋白纳米孔的实例包括但不限于α-溶血素、电压依赖性线粒体孔蛋白(VDAC)、OmpF、OmpC、MspA和LamB(麦芽糖孔蛋白)，例如公开在Rhee,M.等，Trends in Biotechnology,25(4)(2007):174-181；Bayley等(以上引用)；Gundlach等，美国专利公布2012/0055792等等，其通过引用并入本文。可采用允许单个核酸分子的易位的任何蛋白孔。纳米孔蛋白可在孔的外部的特定的位点被标记，或在组成孔形成蛋白的一个或更多个单体单元的外部的特定位点被标记。孔蛋白选自诸如但不局限于以下的蛋白的组：α-溶血素、MspA、电压依赖性线粒体孔蛋白(VDAC)、炭疽孔蛋白、OmpF、OmpC和LamB(麦芽糖孔蛋白)。将孔蛋白整合至固态孔道是通过将带电荷的聚合物附接至孔蛋白来完成的。在施加电场后，带电荷的复合物被以电泳方式牵拉入固态孔道。合成的纳米孔或固态纳米孔，可被创建在各种形式的固态基质中，固态基质的实例包括但不局限于硅酮(例如Si3N4、SiO2)、金属、金属氧化物(例如Al2O3)、塑料、玻璃、半导体材料和其组合。合成的纳米孔可以比置于脂双层膜中的生物蛋白孔更稳定。合成的纳米孔还可通过使用嵌入在合适的基质中的碳纳米管来创建，所述合适的基质例如但不局限于聚合的环氧树脂。碳纳米管可具有均一的并且定义明确的化学性质和结构性质。可获得各种大小的碳纳米管，范围从一至几百纳米。碳纳米管的表面电荷已知约是零，并且作为结果，核酸穿过纳米孔的电泳运输变得简单和可预测(Ito,T.,Chem.Commun.12(2003):1482-83)。合成的纳米孔的基质表面可被化学修饰以允许蛋白孔的共价附接或以致使表面性质合适于光学纳米孔测序。此类表面修饰可以是共价的或非共价的。大多数共价修饰包括有机硅烷沉积，其最常用的方案被描述为：1)从乙醇水溶液中沉积。这是制备甲烷硅基化表面的最简易的方法。将95％乙醇-5％水的溶液用乙酸调整至pH4.5-5.5。伴随搅拌添加硅烷至产生2％的终浓度。在水解作用和硅醇基团形成之后添加基质持续2-5分钟。之后，通过短暂地浸渍在乙醇中将过量材料冲洗干净。在110摄氏度持续5-10分钟使硅烷层硬化。2)气相沉积。硅烷可在干燥的疏质子条件下通过化学气相沉积方法被施加至基质。这些方法有利于单层沉积。在封闭的室设计中，基质被加热至足够温度以达到5mm蒸气压。可选地，可施加真空直到观察到硅烷蒸发。3)旋涂沉积。旋涂施加可在有利于最大官能化和多层沉积的水解条件下进行，或在有利于单层沉积的干燥条件下进行。在一些实施方案中，单个纳米孔被用于本发明的方法。在其他实施方案中，多个纳米孔被采用。在后一种的一些实施方案中，多个纳米孔以纳米孔阵列被采用，纳米阵列通常设置在平面基质，例如固相膜中。纳米孔阵列的纳米孔可规则地间隔开，例如以直线模式，或者可随机间隔开。在优选的实施方案中，纳米孔在平面固相基质中以直线模式规则地间隔开。
“纳米结构”(与“纳米级结构”和“纳米级特征”可互换使用)意指具有在几纳米至几百纳米范围内的至少一个尺寸的结构，例如1至1000纳米。在一些应用中，此范围为2至500纳米；在其他应用中，该范围为3至500纳米。纳米结构的形状和几何形状可以广泛变化并且包含但不限于纳米孔、纳米井(nanowells)、纳米颗粒以及特别适用于实施系列反应的任何其他方便的形状。在一些实施方案中，纳米结构可以是与固相膜可操作地关联的蛋白纳米孔。一些纳米结构，例如纳米孔和纳米井，可在较大的普通基质例如固相膜或其他固体中形成，以形成纳米孔或纳米井阵列。特别感兴趣的纳米结构是那些能够支持或含有化学、物理(例如FRET)、酶促和/或结合反应或一系列这种反应的纳米结构。在一些实施方案中，纳米结构例如纳米井，包围小于1纳升(10×-9升)、小于1皮升或小于1飞升的体积。在其他实施方案中，每个单独的纳米井提供小于1000仄升、100仄升、80仄升、或小于50仄升、或小于1仄升、或甚至小于100yactoliters的体积。在一些实施方案中，纳米井包括零模波导。
关于肽的“肽”、“肽片段”、“多肽”、“寡肽”或“片段”在本文中同义使用，并且是指由肽键连接的氨基酸残基的单个未分支的链组成的化合物。肽或多肽中的氨基酸可用各种部分衍生化，所述部分包括但不限于聚乙二醇、染料、生物素、半抗原或类似部分。蛋白或多肽或肽中的氨基酸残基的数目可变化很大；然而，在一些实施方案中，本文提及的蛋白或多肽或肽可具有2至70个氨基酸残基；并且在其他实施方案中，它们可具有2至50个氨基酸残基。在其他实施方案中，本文提及的蛋白或多肽或肽可具有从几十个氨基酸残基，例如20，至多达一千或更多个氨基酸残基，例如1200个。在又其他实施方案中，蛋白、多肽、肽或其片段可具有10至1000个氨基酸残基；或者它们可具有20-500个氨基酸残基；或者它们可具有20至200个氨基酸残基。
“聚合物”是指多个单体连接成直链。通常，聚合物包含多于一种类型的单体，例如，如包含A、C、G和T的多核苷酸，或包含多于一种氨基酸的多肽。单体可包括但不限于核苷及其衍生物或类似物，以及氨基酸及其衍生物和类似物。在一些实施方案中，聚合物是多核苷酸，其中核苷单体通过磷酸二酯键或其类似物连接。
“多核苷酸”或“寡核苷酸”被可互换地使用并且各自意指核苷酸单体的线性聚合物。组成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够经由单体与单体相互作用的规则模式,例如Watson-Crick类型的碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反式Hoogsteen类型的碱基配对等，特异性地结合天然多核苷酸。此类单体以及其核苷间连键可以是天然存在的或可以是其类似物，例如天然存在或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可包含PNA、硫代磷酸核苷间连键、含有允许标记物(例如荧光团或半抗原等)附接的连接基团的碱基。当寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶加工时，例如通过聚合酶的延伸、通过连接酶的连接等等，普通技术人员应该理解在那些情况下寡核苷酸或多核苷酸将在任何或一些位置不包含以下的某些类似物：核苷间连键、糖部分或碱基。多核苷酸大小的范围通常从少数单体单元，例如5-40个，此时它们通常称为“寡核苷酸”，到几千个单体单元。除非另有说明或从上下文明显的，每当多核苷酸或寡核苷酸以字母(大写或小写)序列表示时，例如“ATGCCTG”，应该理解的是该核苷酸从左到右是5’→3’的顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，并且“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。除非另有指出，术语和原子编号惯例将遵循公开在Strachan和Read,Human Molecular Genetics 2(Wiley-Liss，New York,1999)中的那些。通常多核苷酸包含由磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如，对于DNA的脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或对于RNA的它们的核糖对应物)；然而，它们还可包含非天然的核苷酸类似物，例如包含修饰的碱基、糖或核苷间连键。对本领域的技术人员明显的是，当酶活性具有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物的需求时，例如，单链DNA、RNA/DNA双链体(duplex)或其类似物，则选择寡核苷酸或多核苷酸底物的合适的组成在普通技术人员的知识内，尤其是在专著的指导下，例如Sambrook等,Molecular Cloning,第二版(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)和类似的参考文献。同样，寡核苷酸和多核苷酸可以指单链形式或双链形式(即寡核苷酸或多核苷酸与其各自的互补物的双链体)。对普通技术人员来说，意图哪种形式或者是否意图两种形式将是从术语使用的上下文明显的。
“引物”意指天然的或合成的寡核苷酸，当与多核苷酸模板形成双链体时其能够用作核酸合成的起始点并从其3’端沿着模板延伸，使得形成延伸的双链体。引物的延伸通常用核酸聚合酶诸如DNA或RNA聚合酶进行。在延伸反应中添加的核苷酸由模板多核苷酸的序列决定。通常引物由DNA聚合酶延伸。引物通常具有范围从14至40个核苷酸、或范围从18至36个核苷酸的长度。在各种核酸扩增反应中使用引物，例如，使用单个引物的线性扩增反应，或使用两个或更多个引物的聚合酶链式反应。选择用于具体应用的引物的长度和序列的指导是本领域普通技术人员周知的，如通过引用并入的以下参考文献中证明的：Dieffenbach,编辑,PCRPrimer:A Laboratory Manual,第二版(Cold Spring HarborPress,New York,2003)。
关于多核苷酸的“序列确定”、“测序”或“确定核苷酸序列”或类似的术语包括确定多核苷酸的部分的以及全部的序列信息。即，该术语包括四种天然核苷酸A、C、G和T全组的亚组的序列，诸如，例如靶多核苷酸的仅仅A和C的序列。即，该术语包括确定靶多核苷酸中四种类型核苷酸中的一种、两种、三种或所有的身份、顺序和位置。在一些实施方案中，该术语包括确定靶多核苷酸中四种类型核苷酸中的两种、三种或所有的身份、顺序和位置。在一些实施方案中，序列确定可通过鉴定靶多核苷酸“catcgc...”内的单一类型的核苷酸例如胞嘧啶的顺序和位置来实现，以使其序列表示为二进制代码，例如“100101...”，其代表“c-(非c)(非c)c-(非c)-c...”等等。在一些实施方案中，该术语还可包括充当靶多核苷酸的指纹的靶多核苷酸的子序列；即，在多核苷酸的组中独特地标识靶多核苷酸或一类靶多核苷酸的子序列，例如由细胞表达的所有不同的RNA序列。
本公开内容并不意图限制于所列具体形式的范围，而是意图覆盖本文描述的变化形式的替代、修饰和等价物。进一步地，本公开内容的范围充分涵盖了基于本公开内容对本领域的技术人员可变得明显的其他的变化形式。本发明的范围仅受所附的权利要求限制。

Claims (8)

1.一种确定多核苷酸的序列的方法，所述方法包括：
提供纳米孔阵列，所述纳米孔阵列包含(a)第一侧和第二侧、(b)固相膜和与其共同延伸的不透明层，以及(c)多个孔眼，所述固相膜分隔所述纳米孔阵列的第一侧上的第一室和所述纳米孔阵列的第二侧上的第二室，其中每个孔眼提供所述第一室和所述第二室之间的流体连通并具有信号生成区，且其中所述不透明层基本上防止光穿过所述纳米孔阵列；
使多核苷酸从所述第一室易位穿过所述孔眼至所述第二室，其中
(i)每个多核苷酸包含多核苷酸链，其中所述多核苷酸链的不同种类的核苷酸被生成可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记，
(ii)所述孔眼中的每一个限制每条所述多核苷酸链的核苷酸以单列移动穿过每个孔眼的所述信号生成区；并且
(iii)每条多核苷酸链的荧光标记物互相自猝灭，使得当所述标记物在所述信号生成区以外时，来自激发的互相自猝灭的标记物的荧光信号被猝灭；
当所述多核苷酸链易位穿过所述孔眼的所述信号生成区时，用激发光束激发所述多核苷酸链的荧光标记物，其中所述激发光束被引导穿过所述第二室至所述纳米孔阵列，使得所述不透明层基本上防止激发所述第一室中的光学标记物；
检测来自所述信号生成区中的所述荧光标记物的荧光信号，以确定所述多核苷酸链的特征；和
从在每个孔眼的信号生成区处检测的荧光信号确定所述多核苷酸链的核苷酸的序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述不透明层是金属层。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述金属层是铝层或金层。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述孔眼中的每一个的所述信号生成区从最接近所述第二室的所述金属层的表面延伸至所述第二室。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述激发和检测的步骤用落射照明系统实施。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述纳米孔阵列的所述孔眼中的每一个包含固定在其中的蛋白纳米孔。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述蛋白纳米孔中的每一个固定在跨所述孔眼设置的脂双层中。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述荧光标记物是受体标记物，且其中所述激发光束激发所述孔眼的每一个处的供体标记物，所述供体标记物在受体标记物易位穿过所述信号生成区时激发所述受体标记物。
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