JP2023523236A - 蛍光性ポリヌクレオチドの配列決定方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、シス側およびトランス側を含むソリッドステート基材を提供することを含む。蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、（ｉ）担体粒子に結合した近位端と、（ｉｉ）エキソヌクレアーゼによって切断可能な遠位端と、（ｉｉｉ）蛍光標識を含む少なくとも１つの蛍光標識ヌクレオチドと、を含む。基材のトランス側を励起光で照射し、蛍光励起ゾーンを作製する。基材が照射されている間、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖はエキソヌクレアーゼと反応し、その結果、モノヌクレオチドが鎖の遠位端から連続的に放出され、蛍光励起ゾーンを通って拡散し、その結果、励起ゾーン内の蛍光標識モノヌクレオチドが蛍光シグナルを放出する。蛍光シグナルは時間の関数として検出され、ポリヌクレオチド配列の推定を可能にする。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年４月２４日に出願された共同所有の米国仮特許出願第６３／０１５，２５０号に基づく優先権の利益を主張しており、その内容は参考としてその全体が本明細書に援用される。

本開示の分野
本発明は、核酸配列決定に関する。

序論
核酸、特にＲＮＡおよびＤＮＡのヌクレオチド配列の決定は、生物学的および医学的研究を進歩させるために重要であった。核酸配列決定を容易にするために、過去数十年にわたって多くの方法が提案されてきた。ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（塩基選択的化学分解手順を使用）およびＳａｎｇｅｒ（「３’－ターミネーター」と呼ばれる３’－ブロックヌクレオチド三リン酸を使用）によって開発された２つの初期の方法は、１９８０年および１９９０年に研究所で広く使用された。しかし、これらの方法は、隣接するレーン（配列あたり４レーン、標準的な４つの核酸塩基型（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）のそれぞれに１つずつ）で放射性標識された核酸断片を分解するための繊細なポリアクリルアミドスラブゲルへの依存、および配列を組み立てることができる配列決定断片の画像（配列決定ラダーとも呼ばれる）を生成するための長い膜露光時間の必要性のために不便であった。

１９９０年に、研究者らは、蛍光標識プライマー（蛍光プライマー法）または蛍光標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸（蛍光ターミネーター法）のいずれかを使用して生成された蛍光標識を含有する配列決定断片を使用して、Ｓａｎｇｅｒ法を非放射性検出アプローチに適合させた。配列決定断片を分離するためのマルチプレックスキャピラリー電気泳動を使用する蛍光ターミネーター法は、２００１年にＣｅｌｅｒａおよび学術研究機関の共同体によって公開された最初のヒトゲノム配列を決定するために使用された主要な方法であった。

２００１年以来、いくつかのいわゆる「次世代」配列決定方法が開発されている。過去１０年間で最も優勢な配列決定法は、Ｓｏｌｅｘａによって開発され、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって商品化された合成による配列決定法であった。Ｓｏｌｅｘａ法では、相補的な試料鋳型鎖に沿ったプライマー伸長によって相補鎖を合成しながら配列決定データを収集する。この方法では、固定化された鋳型鎖にプライマーをハイブリダイズさせ、プライマー－鋳型複合体を形成させる。ハイブリダイズしたプライマーを、４つの異なる蛍光標識された可逆的に３’ブロックされたヌクレオチドターミネーター（ｄＮＴＰ）の存在下でＤＮＡポリメラーゼによって伸長する。ポリメラーゼは、鋳型中のヌクレオチド塩基に相補的なヌクレオチドターミネーターの、成長中のプライマーの３’末端への付加を触媒し、それにより、３’－ブロックプライマーを作製する。残存するブロックｄＮＴＰが除去された後、プライマー－鋳型複合体を画像化して、どのタイプのｄＮＴＰがプライマーに添加されたかを決定する。画像収集後、添加されたｄＮＴＰの蛍光標識を除去し、添加されたｄＮＴＰの３’－炭素を非ブロック化して、伸長可能な３’－ヒドロキシル基を有する非ブロック化プライマーを生成する。次いで、非ブロック化プライマーは、プライマーに付加された相補的ｄＮＴＰの配列から鋳型鎖の配列を決定するために、付加、画像化、および非ブロック／脱標識化のさらなるサイクルの準備が整う。この方法は、良好な精度で高いスループットを提供したが、多数の短い配列のアラインメントを必要とし、著しい配列ギャップおよび配列あいまいさを残す。さらに、それは高価であり、長時間を要する試料調製を必要とする。

Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発された異なる合成による配列決定方法は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能プライマーの３’末端に付加されるガンマ標識蛍光ｄＮＴＰを使用する。各ｄＮＴＰが付加されると、ガンマ標識がＮＴＰから同時に切断され、検出される。この方法は、ポリメラーゼが高強度エバネッセント場によって照らされた反応チャンバの底部に近接して保持されることを必要とするので、ポリメラーゼ、鋳型および近くの標識されたＮＴＰは、光誘起架橋によってポリメラーゼを不活性化することができ、光退色によってガンマ標識を破壊することができる光損傷を被る。別の制限は、ポリメラーゼが各反応チャンバの底部に固定化される前に各ＤＮＡポリメラーゼ分子にＤＮＡ鋳型を事前にロードする必要があるため、各反応チャンバは単一の配列読み取りに１回しか使用できないことである。

Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは、一本鎖試料核酸がタンパク質ナノポアを通過する間に膜貫通電流を測定することを含む配列決定技術を商品化した。核酸の配列は、特定の時間にナノポアを通過する特定のヌクレオチド配列に依存する測定電流の変化から推定される。しかしながら、この方法は、多くの要因のために広く採用されていない。この方法は、典型的には、不安定で製造が困難な脂質二重層などの疎水性環境を必要とするタンパク質ナノポアを使用する。速すぎるまたは一貫していない転流速度は、ヌクレオチドを誤って同定するかまたは完全に見逃す可能性がある。転流を遅くするためにいわゆる分子モータが含まれる場合、これらの問題は完全には解決されない。また、この方法による配列決定は、通常、タンパク質ナノポア内の複数の（例えば、５またはそれを超える）連続するヌクレオチドからの同時寄与を有する測定電流に対する個々のヌクレオチドの寄与の絡まりを解くために複雑なアルゴリズムを必要とする。

Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの上記の方法は、限られた精度しかもたらさず、同じ配列セグメントにわたって複数のリードからのデータを組み合わせた後にいくらかの改善がみられた。

使用が簡便であり、コストが低く、高精度を提供する新しい配列決定方法が強く必要とされている。

選択された実施形態の簡単な要旨
いくつかの実施形態では、本開示は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法を提供する。この方法は、シス側およびトランス側を含むソリッドステート基材を提供することを含み、基材は、反応容積を画定し、かつ（ｉ）基材のシス側とトランス側との間に延在する近位貫通孔と、（ｉｉ）１またはそれを超える側壁と、および（ｉｉｉ）遠位開口部と、を含む反応ウェルを含む。ソリッドステート基材は、励起光が反応容積に浸透すること、および基材のシス側に浸透することを実質的にブロックする不透明金属層をさらに含む。担体粒子に結合した蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含む担体粒子も提供される。蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、（ｉ）担体粒子に結合した近位端と、（ｉｉ）エキソヌクレアーゼによって切断可能な遠位端と、（ｉｉｉ）蛍光標識を含む少なくとも１つの蛍光標識ヌクレオチドと、を含む。担体粒子は、基材のシス側に位置するが、貫通孔を通過せず、その結果、結合した蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が貫通孔を通って突出し、その結果、蛍光標識された鎖の遠位端が反応容積内にある。基材のトランス側を励起光で照射して、反応ウェルの遠位開口部に隣接する蛍光励起ゾーンを作製する。基材が照射されている間、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖はエキソヌクレアーゼと反応し、その結果、モノヌクレオチドが鎖の遠位端から連続的に放出され、蛍光励起ゾーンを通って拡散し、その結果、励起ゾーン内の蛍光標識モノヌクレオチドが蛍光シグナルを放出する。蛍光シグナルは時間の関数として検出され、それにより、放出された蛍光標識モノヌクレオチドから検出された蛍光シグナルの時間順序からヌクレオチド配列が決定される。

いくつかの実施形態では、反応ウェルの遠位開口部は、少なくとも３０ｎｍの最小直径を有する。いくつかの実施形態では、反応ウェルの遠位開口部は、５０ｎｍ～１５０ｎｍの最小直径を有する。

いくつかの実施形態では、反応ウェルの１またはそれを超える壁は、テーパーではない。いくつかの実施形態では、反応ウェルの１またはそれを超える壁は、実質的に円筒形である。

いくつかの実施形態では、不透明金属層は、金またはアルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、不透明金属層は、１００ｎｍ～６００ｎｍの厚さを有する。いくつかの実施形態では、ソリッドステート基材は、複数の不透明金属層を含む。

いくつかの実施形態では、反応ウェルは、少なくとも２００ｎｍのウェル深さを有する。いくつかの実施形態では、反応ウェルは、２００ｎｍ～１０００ｎｍのウェル深さを有する。

いくつかの実施形態では、反応容積中の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、少なくとも１００個の連続ヌクレオチドを含有する蛍光標識されたポリヌクレオチドセグメントを含む。

いくつかの実施形態では、貫通孔は、少なくとも２ｎｍの最小直径を有する。いくつかの実施形態では、貫通孔は、２ｎｍ～５０ｎｍの最小直径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、近位貫通孔を含み、２０ｎｍ～５０ｎｍの厚さを有する薄膜層を含む。いくつかの実施形態では、薄膜層は、窒化ケイ素を含む。

いくつかの実施形態では、励起光は、３８０ｎｍまたはそれを超える波長を有する。

いくつかの実施形態では、ソリッドステート基材は、反応容積を画定する表面部分を含み、表面部分は、少なくとも１つの表面不動態化コーティングを含む。

いくつかの実施形態では、反応ウェルの１またはそれを超える側壁は、酸化ケイ素コーティングおよび酸化アルミニウムコーティングの一方または両方を含む。

いくつかの実施形態では、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、少なくとも２種類の異なる種類のヌクレオチドを含み、それぞれの種類は、識別蛍光標識で標識される。

いくつかの実施形態では、担体粒子は、磁気を帯びていない。いくつかの実施形態では、担体粒子は、磁気を帯びている。

いくつかの実施形態では、前記反応中、担体粒子は、電圧バイアスによって近位貫通孔の隣に維持される。

いくつかの実施形態では、担体粒子は、互いに異なるポリヌクレオチド配列を有する複数の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含む。

いくつかの実施形態では、前記反応の後、電圧バイアスを停止して担体粒子を近位貫通孔から離れるようにし、その結果、残りの蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が反応容積から除去され、次いで、電圧バイアスを印加して、同じまたは異なる担体粒子を近位貫通孔に向かって移動させ、その結果、新しい蛍光標識ポリヌクレオチド鎖がエキソヌクレアーゼと反応するために反応ウェルに送達される。

いくつかの実施形態では、反応容積中の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸を含む。いくつかの実施形態では、反応容積中の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は一本鎖核酸を含む。いくつかの実施形態では、担体粒子は、いくつかの実施形態では一本鎖または二本鎖核酸である複数の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ソリッドステート基材は、複数の反応ウェルを含む。いくつかの実施形態では、複数の反応ウェルは、一次元または二次元アレイとして構成される。いくつかの実施形態では、複数の反応ウェルのうちの２つまたはそれを超えるものはそれぞれ、配列決定されるべき蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含有する。

上記の方法は、複数のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するのにも有用である。

本発明はまた、本発明の方法で使用するためのキットを提供する。

図１Ａ～図１Ｄは、本発明のソリッドステート基材の例示的な反応ウェルの特徴および動作を示す。 同上。

図２は、本発明の例示的な配列決定装置を示す。

図３は、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖のエキソヌクレアーゼ切断から得られた例示的な配列決定プロファイルを示す。

例示的な実施形態の詳細な説明
発明は様々な改変および代替形態に適しているが、その詳細は図面に例として示され、本明細書でさらに詳細に説明される。しかしながら、その意図は、発明を本明細書に記載の特定の実施形態に限定するものではないことを理解されたい。別の見方をすれば、その意図は、発明の精神および範囲内に入るすべての改変、均等物、および代替物を網羅することである。

例えば、例示の目的で、特定の反応ウェル構造、特定の標識、および製造例が示されている。しかしながら、本明細書に具体的に詳述されていない他の構造、反応ウェルのアレイ、および他の製造技術を利用して本発明の様々な態様を実施することができるので、本開示はこの点に関して限定することを意図していないことを理解されたい。本発明の態様の指針は、例えば、Ｃａｏ、Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ＆Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｒｅｓｓ、２００４）；Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＳＰＩＥ Ｐｒｅｓｓ、２００５）；Ｄｏｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｎｉｓｈｉ，Ｅｄｉｔｏｒｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、２００７）；Ｓａｗｙｅｒら、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５）；Ｂａｒｄ ａｎｄ Ｆａｕｌｋｎｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ、２０００）；Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００６）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００８）などを含む、当業者に知られている多くの参考文献および学術論文に見られる。これらに関連する部分が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの態様では、本発明は、エキソヌクレアーゼ活性による蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の逐次消化を使用するポリヌクレオチドの蛍光ベースの分析に関する。

「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用され、ヌクレオチドモノマーまたはその類似体の直鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドモノマーは、ワトソン・クリック型の塩基対合、塩基スタッキング、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型の塩基対合など、モノマー対モノマー相互作用の規則的なパターンによって天然ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。そのようなモノマーおよびそれらのヌクレオシド間結合は、天然に生じてもよく、またはその類似体、例えば天然に生じるかまたは天然に生じない類似体であってもよい。天然に生じない類似体としては、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、フルオロフォアまたはハプテンなどの標識の付着を可能にする結合基を含む塩基などが挙げられ得る。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が、ポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーションなどの酵素的プロセシングを必要とするときはいつでも、当業者は、それらの例におけるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、任意の位置またはいくつかの位置にヌクレオシド間結合、糖部分または塩基の特定の類似体を含有しないことを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、典型的には、それらが通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる場合、数個のモノマー単位、例えば５～４０個から数千個のモノマー単位のサイズの範囲である。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字の配列（上または下の場合）によって表されるときはいつでも、別段の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、ヌクレオチドは左から右に向かって５’→３’の順序であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、「Ｔ」はチミジンを表し、「Ｉ」はデオキシイノシンを表し、「Ｕ」はウリジンを表すことが理解されよう。特に明記しない限り、用語および原子番号付けの慣習は、Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、ニューヨーク、１９９９）に開示されているものに従う。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された４つの天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡのためのデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはＲＮＡのためのそれらのリボース対応物）を含む。しかしながら、それらは、例えば修飾塩基、糖またはヌクレオシド間結合を含む非天然ヌクレオチド類似体も含み得る。酵素が、例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖などの活性のための特定のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質要件を有する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質のための適切な組成物の選択が、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１９８９）および同様の参考文献などの学術論文からの指針を伴って、当業者の知識の範囲内であることは当業者には明らかである。同様に、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、一本鎖形態または二本鎖形態（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびそのそれぞれの相補体の二重鎖）のいずれかを指し得る。どの形態または両方の形態が使用の文脈から意図されているかは、当業者には明らかであろう。

「プライマー」は、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドであって、ポリヌクレオチド鋳型と二重鎖を形成すると、核酸合成の開始点として作用し、鋳型に沿ってその３’末端から伸長されて伸長二重鎖が形成され得るオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は、通常、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼを用いて行われる。伸長過程で付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは、通常、１４～４０ヌクレオチドの範囲、または１８～３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。しかしながら、はるかに長いプライマーも使用され得る。プライマーは、様々な核酸増幅反応、例えば、単一のプライマーを使用する線形増幅反応、または２またはそれを超えるプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応に使用される。例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、２００３）によって証明されるように、特定の用途のためにプライマーの長さおよび配列を選択するための指針は当業者に公知である。

「核酸」は、以下に定義されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを包含し、天然または人工、任意の長さ、一本鎖、二本鎖、三本鎖、直鎖、環状または分岐であってよく、２’－デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）（例えば、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドおよびＤＮＡ－ＲＮＡキメラによって例示される。核酸は、通常、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルなどの１またはそれを超える標準的なヌクレオチド塩基、ならびにその類似体を含み、その結果、塩基は、通常、相補鎖中の相補的な塩基と二本鎖形態で反対の塩基中の塩基と塩基対合することができる。

「配列決定判定」、「配列決定」、「ヌクレオチド配列の決定」、「ポリヌクレオチド配列の決定」および同様の用語は、ポリヌクレオチドに言及するとき、１またはそれを超えるポリヌクレオチドの部分的または完全なヌクレオチド配列情報の決定を含む。これらの用語はまた、例えば標的ポリヌクレオチドのＡおよびＣのみの配列など、ＤＮＡ（またはＲＮＡの場合はＡ、Ｃ、ＧまたはＵ）についての４つの天然ヌクレオチドの完全なセットＡ、Ｃ、ＧおよびＴのサブセットの配列を決定することを含む。これらの用語はまた、標的ポリヌクレオチド内の４つのタイプのヌクレオチドのうちの１つ、２つ、３つまたはすべての同一性、順序および位置の決定を含む。いくつかの実施形態では、用語は、標的ポリヌクレオチド内の４つのタイプのヌクレオチドのうちの２つ、３つまたはすべての同一性、順序および位置の決定を含む。いくつかの実施形態では、配列決定は、標的ポリヌクレオチド「ｃａｔｃｇｃ．．．」内の単一タイプのヌクレオチド、例えばシトシンの順序および位置を同定することによって達成されてよく、その結果、その配列はバイナリコードとして表され、例えば「１００１０１．．．」は「ｃ－（ｃではない）（ｃではない）ｃ－（ｃではない）－ｃ．．．」などを表す。いくつかの実施形態では、これらの用語はまた、標的ポリヌクレオチドに対するフィンガープリントとして働く標的ポリヌクレオチドの部分配列を含み得る。すなわち、ポリヌクレオチドのセット内の標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドのクラスをユニークに同定する部分配列、例えば、細胞によって発現されるすべての異なるＲＮＡ配列である。

「標的ポリヌクレオチド」は、配列が決定されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセグメントを意味する。標的ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、標的ポリヌクレオチドの一方の鎖の配列の決定は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋの塩基対合則に基づいて、対応する相補鎖の配列を明らかにする。標的ポリヌクレオチドが一本鎖である場合（または二本鎖核酸中の一本鎖を指すことを意図している場合）、標的ポリヌクレオチドに相補的な鎖の配列を決定すると、標的ポリヌクレオチドの配列（例えば、標的ＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写によって調製されるｃＤＮＡの配列）が明らかになる。したがって、「標的」がどのように使用されるかの文脈に応じて、標的ポリヌクレオチドは、その配列がエキソヌクレアーゼ媒介消化によって連続的に放出されるモノヌクレオチドの配列から直接決定される蛍光標識ポリヌクレオチド鎖であると考えられてもよく、または標的ポリヌクレオチドは、その配列が蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の配列に相補的であるポリヌクレオチド鎖であると考えられてもよい。

「標的配列」は、標的ポリヌクレオチドの配列を意味する。

ポリヌクレオチドは、本発明を使用して配列決定するための任意の適切な試料源から得ることができる。ウイルス、細菌、マイコバクテリア、真菌、植物、動物、哺乳動物、ヒトなどの多種多様な生物源が好適であり得る。ヒトなどの複雑な生物の場合、全血、血漿、血清、細胞（例えば、赤血球、白血球、破骨細胞、骨芽細胞、肝細胞）、尿、鼻粘液、糞便、痰、唾液、脳脊髄液、ミトコンドリア、エキソソーム、ホルマリン固定組織試料、および組織スワブなどの様々な異なる試料タイプが関心対象となり得る。

核酸は、任意の適切な方法を使用して調製および／または精製され得る。異なる試料タイプについて多くの方法が知られている。例えば、Ｑｉａｇｅｎ、Ｒｏｃｈｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘなどの様々な試料タイプからＤＮＡおよびＲＮＡを単離するための多くの試薬およびキットが市販されている。核酸は、それらの天然の状態で単離され得るか、または配列決定の前に他の方法で断片化または修飾され得る。例えば、核酸は、機械的方法によって（例えば、超音波処理または噴霧化によって）または酵素消化によって断片化され得る。

その後の使用のために試料核酸を保存および／または調製するためのプラスミドライブラリーまたは他の種類のライブラリーを調製することが一般的である。試料核酸は、断片化されていても断片化されていなくてもよく、操作を容易にするために両端のアダプターによってキャップされていてもよい。アダプターは、プライマー伸長によって相補鎖を作製するために、またはそのようなアダプターの下流もしくは間にある配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅を促進するためにプライマーをハイブリダイズさせるのに有用な配列を含み得る。

例えば、機械的に剪断されたＤＮＡ断片は、通常、断片化中に生成された一本鎖オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼを使用して充填して二本鎖平滑末端断片を作製する末端修復を必要とする。フィルイン反応に使用され得るいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、平滑末端ではなく非鋳型３’－Ａオーバーハングを有するフィルドイン断片を生成し、これによりアダプターライゲーションの効率を高めることができる。アダプターライゲーションの前に、ＤＮＡ断片は、ＳＰＲＩビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはゲル精製などの市販のキットを使用してサイズ選択される。次いで、二本鎖合成ＤＮＡアダプターを、サイズ選択されたＤＮＡ断片の両端に酵素的に連結する。ＤＮＡアダプターは、一方の側に平滑末端（または対応する３’－Ａオーバーハング断片については５’－Ｔオーバーハング）を含み、それを介して断片化されたＤＮＡに連結される。反対側の末端において、Ｙ字形の非相補的一本鎖部分は、アダプターの配向性ライゲーションを確実にし、プライマー伸長のための、例えばポリメラーゼ媒介プライマー伸長による蛍光標識ヌクレオチドの取り込みのためのプライミング部位を提供する。Ｓｈｅｎｄｕｒｅ＆Ｊｉ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６（１０）：１１３５－１１４５（２００８）も参照のこと。

好ましくは、核酸は、非標的ポリヌクレオチドおよび細胞残屑、タンパク質などの他の材料を実質的に除去するために精製される。種々の試料タイプから核酸を精製する方法は周知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｐｒｅｓｓ（２０２０）などの刊行物に記載されている。

本発明による配列決定のための蛍光標識ポリヌクレオチド鎖（「蛍光標識された鎖」とも呼ばれる）は、任意の適切な方法によって調製され得る。各蛍光標識された鎖は、近位端および遠位端を有し得る。近位端は、以下にさらに記載されるように、担体粒子に直接的または間接的に結合される。蛍光標識された鎖の遠位端は、蛍光標識された鎖が担体粒子に結合されると、担体粒子から突出する。蛍光標識された各鎖は、エキソヌクレアーゼによって切断されることが可能であり、その結果、その一部または全部が蛍光標識を含むモノヌクレオチドが、その後の検出（以下でさらに論じる）のために鎖の遠位端から連続的に（１つずつ）放出される。

いくつかの実施形態では、蛍光標識された鎖は、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによる蛍光標識された鎖の遠位端の連続的な切断のために、一本鎖形態で提供され得る。他の実施形態では、蛍光標識された鎖は、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼによる蛍光標識された鎖の遠位端の連続的な切断のために、蛍光標識された鎖を含む二本鎖形態で提供され得る。

いくつかの実施形態では、５’－エキソヌクレアーゼが使用される。５’－エキソヌクレアーゼは、一本鎖特異的または二本鎖特異的であり得る。一本鎖特異的５’－エキソヌクレアーゼの場合、蛍光標識された鎖は、３’末端が担体粒子に結合した近位端であり、５’末端が５’－エキソヌクレアーゼによって切断される遠位端であるように一本鎖形態で提供され得る。二本鎖特異的５’－エキソヌクレアーゼの場合、蛍光標識された鎖が、蛍光標識された鎖にハイブリダイズした相補鎖を含む二本鎖形態で提供されることを除いて、直前の文の特徴のすべてが適用される。

いくつかの実施形態では、３’－エキソヌクレアーゼが使用される。３’－エキソヌクレアーゼは、一本鎖特異的または二本鎖特異的であり得る。一本鎖特異的３’－エキソヌクレアーゼの場合、蛍光標識された鎖は、５’末端が担体粒子に結合した近位端であり、３’末端が３’－エキソヌクレアーゼによって切断される遠位端であるように一本鎖形態で提供され得る。二本鎖特異的３’－エキソヌクレアーゼの場合、蛍光標識された鎖が、蛍光標識された鎖にハイブリダイズした相補鎖を含む二本鎖形態で提供されることを除いて、直前の文の特徴のすべてが適用される。

蛍光標識された鎖はまた、二本鎖領域および一本鎖領域を含む形態で提供され得る。例えば、蛍光標識された鎖が二本鎖形態で提供され、蛍光標識された鎖が二本鎖領域から伸長する一本鎖３’－オーバーハングを含むように相補鎖にハイブリダイズする場合、３’－オーバーハングは、エキソヌクレアーゼが二本鎖領域に達するまで一本鎖特異的３’－エキソヌクレアーゼによって切断され得る。この例では、３’オーバーハングの３’末端が蛍光標識された鎖の遠位端であり、３’オーバーハングの５’末端が蛍光標識された鎖の近位端である。別の例では、蛍光標識された鎖が二本鎖形態で提供され、二本鎖領域から伸長する一本鎖３’オーバーハングを含む相補鎖にハイブリダイズする場合、二本鎖特異的５’エキソヌクレアーゼは、二本鎖領域の蛍光標識された鎖の凹んだ５’末端を切断することができる。この代替例では、蛍光標識された鎖の５’末端が遠位端であり、蛍光標識された鎖の３’末端が近位端である。

蛍光標識された鎖が二本鎖形態で提供され、蛍光標識された鎖が二本鎖領域から伸長する一本鎖５’－オーバーハングを含むように相補鎖にハイブリダイズする場合、５’－オーバーハングは、エキソヌクレアーゼが二本鎖領域に達するまで一本鎖特異的５’－エキソヌクレアーゼによって切断され得る。この例では、５’オーバーハングの５’末端が蛍光標識された鎖の遠位端であり、５’オーバーハングの３’末端が蛍光標識された鎖の近位端である。別の例では、蛍光標識された鎖が二本鎖形態で提供され、二本鎖領域から伸長する一本鎖５’オーバーハングを含む相補鎖にハイブリダイズする場合、二本鎖特異的３’エキソヌクレアーゼは、二本鎖領域の蛍光標識された鎖の凹んだ３’末端を切断することができる。この代替例では、蛍光標識された鎖の３’末端が遠位端であり、蛍光標識された鎖の５’末端が近位端である。

いくつかの実施形態では、蛍光標識された鎖は、試料ポリヌクレオチド配列に相補的なプライマーのＤＮＡポリメラーゼ媒介伸長（蛍光標識されたＤＮＡ鎖を作製するため）またはＲＮＡポリメラーゼ媒介伸長（蛍光標識されたＲＮＡ鎖を作製するため）によって調製され得る。複数の試料配列を配列決定するために、複数のプライマーを使用することができる。プライマーはすべて同じであってもよく（すなわち、選択されたプライマー配列を有する単一のプライマー）、またはプライマーは複数の異なるプライマー配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、すべてのプライマーは、予め選択されたプライマー配列を有する。いくつかの実施形態では、プライマーは、ランダムに生成されたプライマー配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマーは、すべての可能なｎ－ｍｅｒ配列、例えばすべての可能な６－ｍｅｒ、７－ｍｅｒ、８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、または１０－ｍｅｒ配列を含んでよく、これは試料中のすべての可能な配列のプライミングを促進し得る。いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるプライマーはそれぞれ、以下にさらに論じるように、担体粒子への伸長プライマーの結合を促進するための親和性部分を含み得る。

いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的ポリヌクレオチドのコピー（またはその相補的配列）が単一の蛍光標識で標識されたその４つの異なる種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）のそれぞれを有する４つの別々の反応を、各々が別々の反応ウェルにおいて行うことによって決定される。

いくつかの実施形態では、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、蛍光標識で標識された１種類のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は２つの異なる種類のヌクレオチドを含み、それぞれの種類は識別蛍光標識で標識される。いくつかの実施形態では、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、少なくとも２つの異なる種類のヌクレオチドを含み、それぞれの種類は、識別蛍光標識で標識される。いくつかの実施形態では、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は３つの異なる種類のヌクレオチドを含み、それぞれの種類は識別蛍光標識で標識される。いくつかの実施形態では、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、少なくとも３つの異なる種類のヌクレオチドを含み、それぞれの種類は、識別蛍光標識で標識される。いくつかの実施形態では、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は４つの異なる種類のヌクレオチドを含み、それぞれの種類は識別蛍光標識で標識される。

いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド配列は、標的ポリヌクレオチド鎖のコピーが、その４つの異なる種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）の各々を１つの蛍光標識で標識し、同時に同じ標的ポリヌクレオチド鎖上の他のヌクレオチドを第２の蛍光標識で標識する、４つの別々の反応を行うことによって決定される。例えば、第１の反応において第１の蛍光標識が標的ポリヌクレオチド鎖のＡに結合している場合、第１の反応において第２の蛍光標識が標的ポリヌクレオチド鎖のＣ、ＧおよびＴに（すなわち、「Ａではない」ヌクレオチドに）結合する。同様に、この例を続けると、第２の反応では、第１の標識が標的ポリヌクレオチド鎖のＣに結合し、第２の蛍光標識が標的ポリヌクレオチド鎖のＡ、ＧおよびＴに（すなわち、「Ｃではない」ヌクレオチドに）結合する。ヌクレオチドＧおよびＴについても同様である。

同じ標識スキームは、ヌクレオチドタイプのサブセットのための従来の用語に関して表現され得る。したがって、上記の例では、第１の反応において、第１の蛍光標識がＡに結合し、第２の蛍光標識がＢに結合する。第２の反応において、第１の蛍光標識がＣに結合し、第２の蛍光標識がＤに結合する。第３の反応において、第１の蛍光標識がＧに結合し、第２の蛍光標識がＨに結合する。第４の反応では、第１の蛍光標識がＴに結合し、第２の蛍光標識がＶｓに結合する。

いくつかの実施形態では、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、１種類のモノマーに結合した１つの蛍光標識を含み、例えば、ポリヌクレオチド鎖のすべてのＴ（または実質的にすべてのＴ）が蛍光標識、例えばシアニン色素で標識される。そのような実施形態では、ポリヌクレオチド鎖からの蛍光シグナルの収集物または配列は、特定のポリヌクレオチドに対するシグネチャまたはフィンガープリントを形成し得る。いくつかのそのような実施形態では、そのようなフィンガープリントは、決定されるモノマーの配列に対して十分な情報を提供してもしなくてもよい。

いくつかの実施形態では、蛍光標識は相互に消光している。いくつかの実施形態では、蛍光標識は相互に消光していない。

相互に消光する蛍光標識は、以下の特性を有する。（ｉ）各メンバーはすべてのメンバーの蛍光を消光し（例えば、ＦＲＥＴによって、または静的もしくは接触機構によって）、かつ（ｉｉ）各メンバーは、励起されたときおよび非消光状態にあるときに異なる蛍光シグナルを生成する。すなわち、相互消光セットが２つの色素、Ｄ１およびＤ２からなる場合、（ｉ）Ｄ１は自己消光され（例えば、別のＤ１分子との接触消光によって）、Ｄ２によって消光され（例えば、接触消光によって）、（ｉｉ）Ｄ２は自己消光され（例えば、別のＤ２分子との接触消光によって）、Ｄ１によって消光される（例えば、接触消光によって）。接触消光は、隣接するモノヌクレオチド上の蛍光標識間で強く起こることが多いが、接触消光は、互いに隣接していないモノヌクレオチド上の蛍光標識間でも起こり得る。相互消光する蛍光標識を使用する利点としては、例えば、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖からの非特異的蛍光バックグラウンドを最小限に抑えること、および反応ウェルの照射されていない（または無視できるほど照射された）領域にさえ存在し得る偶発的なラジカルおよび三重項状態種から蛍光標識を保存することが挙げられる。

蛍光標識は、本発明の方法において結合したモノヌクレオチドを同定するためにユーザによって選択された任意の蛍光色素を含む。ＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ類似体およびｄＮＴＰ類似体を標識するための例示的な蛍光標識としては、キサンテン、フルオレセイン、ローダミン、スルホローダミン、ローダル、シアニン、クマリンおよびピレンが挙げられるが、これらに限定されない。異なる種類のヌクレオチドを同定および区別するために異なる蛍光標識が使用される場合、蛍光標識は、同じ構造クラスの蛍光標識（例えば、すべてフルオレセインである）または異なるクラスの蛍光標識からのものであり得る。

相互消光セットのための蛍光標識を選択するための例示的な指針は、以下の参考文献に見出すことができ、これらは参照により本明細書に組み込まれるＪｏｈａｎｓｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３３５：１７－２９（２００６）；Ｍａｒｒａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０：ｅｌ２２（２００２）；などである。いくつかの実施形態では、相互消光セットのメンバーは、芳香環構造などの相互作用を積層することができる成分または部分を含む有機蛍光色素を含む。いくつかの実施形態では、例示的な相互に消光する蛍光標識のセットは、ローダミン色素、フルオレセイン色素およびシアニン色素から選択され得る。いくつかの実施形態では、相互消光セットは、ローダミン色素ＴＡＭＲＡおよびフルオレセイン色素ＦＡＭを含み得る。いくつかの実施形態では、蛍光色素の相互消光セットは、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、フルオレセイン－ＥＸ、フルオレセインイソチオシアネート、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ－Ｘ、リサミンＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ、カルセイン、フルオレセイン、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、１またはそれを超えるＢＯＤＩＰＹ色素、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、および１またはそれを超えるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓから選択される２またはそれを超える色素を含み得る。例示的なＢＯＤＩＰＹ染料としては、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０およびＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５が挙げられる。例示的なＡｌｅｘａ蛍光標識としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０が挙げられる。

さらなる実施形態では、ＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ類似体およびｄＮＴＰ類似体を標識するための例示的な蛍光標識としては、Ａｌｅｘａ ４８８、ＡＭＣＡ、Ａｔｔｏ ６５５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、フルオレセイン、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ １、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ ２、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ ３、Ｄｙ６３０、Ｄｙ６３５、ＭＲ１２１、ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、ＴＡＭＲＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。ｄＵＴＰ類似体に対する例示的な蛍光標識には、Ａｌｅｘａ ４８８、ＡＭＣＡ、Ａｔｔｏ ６５５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｄｙ６３０、Ｄｙ６６５、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｅｖｏｂｌｕｅ ９０、フルオレセイン、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ １、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ ２、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ ３、ＭＲ１２１、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、ＴＡＭＲＡなどが含まれるが、これらに限定されない。ｄＣＴＰ類似体の例示的な蛍光標識には、Ａｔｔｏ ６５５、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ ３、ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、ＴＡＭＲＡなどが含まれるが、これらに限定されない。ｄＡＴＰ類似体の例示的な蛍光標識には、Ａｔｔｏ ６５５、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ ３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎなどが含まれるが、これらに限定されない。ｄＧＴＰ類似体の例示的な蛍光標識には、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ ３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎなどが含まれるが、これらに限定されない。ｄＵＴＰ類似体およびｄＣＴＰ類似体に対する例示的な蛍光標識の対には、ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ａｔｔｏ ６５５、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ａｔｔｏ ６５５、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ ３、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ １、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ ２、Ａｔｔｏ ６５５、Ｇｎｏｔｈｉｓ ｂｌｕｅ ３、Ｃｙ５などが含まれるが、これらに限定されない。

さらなる実施形態では、ＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ類似体およびｄＮＴＰ類似体を標識するための例示的な蛍光標識としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ－Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１０）（本開示の日付のオンライン改訂）に開示されている、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、フルオレセイン－ＥＸ、ＦＩＴＣ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ－Ｘ、リサミンローダミンＢ、カルセイン、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが挙げられるが、これらに限定されない。

標識するヌクレオチドの種類、標識の種類、結合のためのリンカー、ならびにＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ類似体および／またはｄＮＴＰ類似体の存在下で蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を合成するための核酸ポリメラーゼを選択するためのさらなる指針は、以下の参考文献に見出すことができ、これらは参照により組み込まれる。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら、米国特許第５，９４５，３１２号；Ｊｅｔｔら、米国特許第５，４０５，７４７号；Ｍｕｅｈｌｅｇｇｅｒ他、米国特許出願公開第２００４／０２１４２２１号；Ｇｉｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１（１０）：２６３０－２６３５（２００３）；Ｔａｓａｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１０）：２６３６－２６４６（２００３）；Ａｕｇｕｓｔｉｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８６：２８９－３０１（２００１）；Ｂｒａｋｍａｎｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５（１）：１１９－１２６（２００４）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３８：２５７－２６４（２００５）。

ＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ類似体および／またはｄＮＴＰ類似体の存在下で蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を合成するための例示的な核酸ポリメラーゼには、Ｖｅｎｔ（エキソマイナス）ポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、大腸菌Ｐｏｌ Ｉ、Ｔｇｏ（エキソマイナス）ポリメラーゼ、クレノウ断片（エキソマイナス）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅおよび他の供給者）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（エキソマイナス）ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼ、Ｐｆｕ（エキソマイナス）ポリメラーゼ、Ｐｆｕアルファルファモザイクウイルス逆転写酵素、マウス白血病ウイルス逆転写酵素、Ｔ４ポリメラーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、例示的な核酸ポリメラーゼとしては、Ｖｅｎｔ（エキソマイナス）ポリメラーゼおよびクレノウ断片（エキソマイナス）が挙げられるが、これらに限定されない。エキソマイナスポリメラーゼは、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の合成をより効率的に達成することができるように、３’－エキソヌクレアーゼ活性を保持する対応するポリメラーゼと比較してより大きな処理能力を有することに留意されたい。

他の実施形態では、鎖の選択された種類のヌクレオチドは、伸長反応において選択された種類のヌクレオチドの類似体ｄＮＴＰを組み込むことによって標識され、類似体ｄＮＴＰは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＪｅｔｔらの米国特許第５，４０５，７４７号に記載されているように、後続の反応において異なる種類のヌクレオチドへの異なる標識の結合を可能にする直交反応性官能基で誘導体化される。

担体粒子は、担体粒子が反応ウェルの貫通孔を通って反応ウェルに移動するのを防ぐのに十分に大きい寸法を有する。各担体粒子は、電磁力によって反応ウェルの貫通孔の近くまで移動して、担体粒子に結合した第１の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の遠位端を貫通孔を通して反応ウェル内に送達することができる。いくつかの実施形態では、担体粒子は磁性担体粒子である。いくつかの実施形態では、担体粒子は磁性担体粒子ではない。いくつかの実施形態では、電磁力は電圧バイアスである。いくつかの実施形態では、電磁力は磁力である。

いくつかの実施形態では、担体粒子は、少なくとも１５ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍ、または少なくとも２５ｎｍ、または少なくとも３０ｎｍ、または１５ｎｍ～１００ｎｍ、または１５ｎｍ～７５ｎｍ、または１５ｎｍ～５０ｎｍ、または２０ｎｍ～５０ｎｍである直径または最大直径を有する。しかしながら、より大きいまたはより小さい直径を有する担体粒子も使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明の担体粒子は、１つまたは複数のナノ粒子であるか、またはそれを含む。本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」は、２００ｎｍ未満、または１５０ｎｍ未満、または１００ｎｍ未満の直径または最大直径を有する担体粒子を指す。

担体粒子は、帯電していても、帯電していなくてもよい。担体粒子は、周囲の水性媒体（通常は水性緩衝液を含む）のｐＨ条件下で粒子上の正に帯電した基と負に帯電した基の正味のバランスに基づいて、正味の中性電荷、正味の正電荷、または正味の負電荷を有することができる。好ましくは、電界（電圧バイアス）による移動の制御のために、担体粒子は、それらが１またはそれを超える結合した蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含む場合、正味の負電荷を有する。

いくつかの実施形態では、各担体粒子は、切断された蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を貫通孔から除去するために、電磁力によって反応ウェルの貫通孔から離れるように移動することができる。本発明の方法の好ましい実施形態では、ウェル内の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖のエキソヌクレアーゼ切断後、切断された鎖がウェルから引き抜かれるように担体粒子がウェルから離れ、次いで、同じまたは異なる担体粒子がウェルの貫通孔の近くを移動して、第２の（「新しい」と呼ばれることもある）蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の遠位端を貫通孔を通して反応ウェル内に送達する。電圧バイアスまたは磁場によって蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の遠位端の反応ウェルへの出入りを容易にするために、担体粒子は貫通孔に共有結合していない。

いくつかの実施形態では、担体粒子は球状粒子を含む。いくつかの実施形態では、担体粒子は、例えば楕円形または不規則な形状を有する非球状粒子を含む。いくつかの実施形態では、担体粒子は、球状粒子および非球状粒子の両方を含む。いくつかの実施形態では、担体粒子は、サイズ範囲内（例えば、プラスまたはマイナスの標準偏差または変動係数の範囲内）の実質的に同一の担体粒子の均一な集団として提供されるが、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を効果的に担持して反応ウェルに送達する限り、担体粒子は必ずしも同一ではない。

担体粒子は、本発明の目的に適した任意の材料から作製され得る。いくつかの実施形態では、担体粒子は、金属ナノ粒子などの金属粒子である。いくつかの実施形態では、担体粒子は、金ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、担体粒子は、銀ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、１またはそれを超える担体粒子は、粒子を磁場によって移動させることを可能にする鉄または酸化鉄などの１またはそれを超える磁性材料を含む。いくつかの実施形態では、担体粒子は、酸化鉄粒子である。いくつかの実施形態では、担体粒子は、シリカ粒子または制御細孔ガラス粒子である。

いくつかの実施形態では、担体粒子は、配列決定される蛍光標識ポリヌクレオチド鎖に結合または会合しているビオチン部分または抗原部分を結合させるための、ストレプトアビジンまたは抗原特異的抗体などの固定化タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、担体粒子は、１またはそれを超えるビオチン化オリゴヌクレオチドまたは抗原－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを結合させるためのタンパク質、例えばストレプトアビジンまたは抗体である。

蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、任意の適切な手段によって担体粒子に結合され得る。通常、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、捕捉部分によって担体粒子に結合される。捕捉部分は、通常、互いに相互親和性を有する一対の部分のメンバー（「結合対」とも呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態では、捕捉部分は、抗体または抗原などのポリペプチドである。いくつかの実施形態では、捕捉部分は、配列決定されるべき蛍光標識ポリヌクレオチド鎖中の配列または蛍光標識ポリヌクレオチド鎖と会合した配列に相補的なオリゴヌクレオチドである。

捕捉部分は、一価（１つの結合パートナーを捕捉するため）または多価（複数の結合パートナーを捕捉するため）であり得る。アビジンは一価捕捉部分の一例であり、４つのビオチン結合部位を有するストレプトアビジンは多価捕捉部分の一例である。いくつかの実施形態では、捕捉部分は、（１つまたは２つの抗原に特異的に結合するための）抗体を含む。より一般的には、捕捉メンバーは、対の他のメンバーが蛍光標識ポリヌクレオチド鎖と会合して、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の担体粒子への結合を促進する結合対の任意のメンバーであり得る。

通常、担体粒子自体が捕捉部分ではない場合（例えば、担体粒子がストレプトアビジン、抗体、または別の一価もしくは多価の実体でない場合）、担体粒子は、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を担体粒子に直接または間接的に結合させることができる少なくとも１つの、好ましくは複数の捕捉部分を含む。

捕捉部分は、通常、リンカーによって担体粒子に結合される。任意の適切なリンカーを使用してもよい。エキソヌクレアーゼ切断および本発明の他の要素は通常水溶液中で行われるので、リンカーは通常親水性である。例示的なリンカーとしては、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリ（ポリエチレングリコールホスフェート）、ポリアルキルホスフェート、ポリアミンなどのポリマーが挙げられる。そのようなリンカーは、任意の適切な長さを有し得る。いくつかの例示的なリンカーおよびコンジュゲーション方法を以下の実施例１に記載する。

捕捉部分を担体粒子に結合させるための例示的な官能基対およびそれらの得られた結合を以下の表１に示す。

蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、任意の適切な手段によって担体粒子上に固定化（に結合）される。いくつかの実施形態では、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖はそれぞれ、試料鋳型鎖を使った核酸ポリメラーゼ媒介鋳型依存性プライマー伸長によって合成される。いくつかの実施形態では、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を担体粒子に結合させる前に、溶液中の試料鋳型核酸鎖から合成される。いくつかの実施形態では、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、試料鋳型核酸鎖が担体粒子に結合した相補的プライマー（「捕捉部分」として作用する）にハイブリダイズした後、ポリメラーゼ媒介プライマー伸長によって担体粒子上に合成される。

いくつかの実施形態では、担体粒子は、試料核酸鎖の配列に相補的な１またはそれを超えるオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、担体粒子は、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の配列に相補的な１またはそれを超えるオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるオリゴヌクレオチドは、その５’末端によって担体粒子に結合される。いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるオリゴヌクレオチドは、その３’末端によって担体粒子に結合される。

いくつかの実施形態では、例えば、オリゴヌクレオチドがその５’末端によって担体粒子に結合される場合、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの３’末端（３’－ヒドロキシル）のポリメラーゼ媒介鋳型依存性伸長によって担体粒子上に合成され得る。試料核酸は、配列決定される試料核酸鎖の領域の上流の配列領域にオリゴヌクレオチドの３’末端がハイブリダイズするように、固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＴＴＰまたはＵＴＰのうちの１またはそれを超えるものに対応する蛍光標識ヌクレオチド三リン酸を含む１またはそれを超える異なるヌクレオチド三リン酸の存在下で、ポリメラーゼは、固定化されたオリゴヌクレオチドの３’末端をプライマーとして伸長して、蛍光標識された鎖になる成長プライマー伸長産物に相補標識されたヌクレオチドを組み込むことによって、ハイブリダイズされた試料核酸鎖に相補的な蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を合成する。

いくつかの実施形態では、上記のように、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、非固定化プライマーを使用して溶液中で形成され得る。プライマーは、配列決定される試料核酸鎖の領域の上流にある相補的試料核酸配列にハイブリダイズする。１またはそれを超える異なる蛍光標識されたヌクレオチド三リン酸の存在下でのポリメラーゼ媒介プライマー伸長の後、得られたハイブリダイゼーション複合体（新たに合成された蛍光標識ポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズした試料核酸鎖を含む）を、担体粒子上に既に固定化されている捕捉オリゴヌクレオチドと接触させることができ、その結果、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、捕捉オリゴヌクレオチドに対する試料鎖／蛍光標識ポリヌクレオチド鎖複合体のハイブリダイゼーションによって担体粒子上に固定化される。

いくつかの実施形態では、非固定化プライマーを使用して蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が溶液中で形成された後、得られた試料鎖／蛍光標識ポリヌクレオチド鎖ハイブリダイゼーション複合体は、試料核酸鎖中の配列への捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって担体粒子上に固定化される。

いくつかの実施形態では、非固定化プライマーを使用して蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が溶液中で形成された後、得られた試料鎖／蛍光標識ポリヌクレオチド鎖ハイブリダイゼーション複合体は、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖中の配列への捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって担体粒子上に固定化される。例えば、試料鎖／蛍光標識ポリヌクレオチド鎖ハイブリダイゼーション複合体は、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を合成するために使用されたプライマー中の配列への捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、担体粒子上に固定化することができる。

いくつかの実施形態では、プライマーは、ビオチンまたは抗原部分などの非ポリヌクレオチド親和性部分を含み、担体粒子はストレプトアビジン部分または抗体部分を含み、その結果、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が非固定化プライマーを使用して溶液中で形成された後、得られた試料鎖／蛍光標識ポリヌクレオチド鎖ハイブリダイゼーション複合体は、固定化ストレプトアビジン部分とビオチン部分との間（または固定化抗体と抗原部分との間）の結合によって担体粒子に固定化される。

上記のように、本発明の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、１またはそれを超えるエキソヌクレアーゼを使用して切断される。エキソヌクレアーゼが蛍光標識された鎖の遠位端から単一の連続するモノヌクレオチドのみを切断することを確実にするために、エキソヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性を実質的に有しないように選択される。エキソヌクレアーゼは、３’特異的エキソヌクレアーゼまたは５’特異的エキソヌクレアーゼであってよく、エキソヌクレアーゼは、一本鎖または二本鎖形態で提供される蛍光標識された鎖を切断し得る。

任意の適切なエキソヌクレアーゼを使用することができる。エキソヌクレアーゼは、天然（すなわち、自然界に見られる化学構造を有する）であってもよく、またはそれらの天然構造と比較して改変されていてもよく、それらの天然源または組換え宿主に由来していてもよい。例えば、エキソヌクレアーゼは、単離または精製後に化学的に修飾されてもよく、例えば所望の特性を有するエキソヌクレアーゼのスクリーニングを含むコンビナトリアルおよび組換え技術によって生成されてもよい。例示的な３’特異的エキソヌクレアーゼとしては、例えば、大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＸ、酵母ＴａｔＤエキソヌクレアーゼＸＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片の３’エキソヌクレアーゼ活性、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性、Ｑ５Ｕ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性、およびｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性が挙げられる。例示的な５’特異的エキソヌクレアーゼとしては、例えば、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性、Ｅｐｉｍａｒｋ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性、およびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性が挙げられる。

場合によっては、エキソヌクレアーゼは、一本鎖として存在するか、または二本鎖構造で存在する鎖を切断し得る。例えば、酵母ＴａｔＤエキソヌクレアーゼＸＩは、一本鎖形態または二本鎖形態で３’から５’方向に核酸鎖を切断することができる。

３’－エキソヌクレアーゼ活性および５’－エキソヌクレアーゼ活性の両方を有するヌクレアーゼには、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＯｎｅＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼおよびＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。そのようなエキソヌクレアーゼは、反応混合物中のいずれのポリヌクレオチド鎖も他の（例えば、５’から３’）エキソヌクレアーゼ活性によって切断可能でない場合、それらのエキソヌクレアーゼ活性の１つ（例えば、３’から５’）を利用して蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を切断するために修飾なしで使用され得る。あるいは、所望のエキソヌクレアーゼ活性を保持し、望ましくないエキソヌクレアーゼ活性を不活性化するために、例えば組換えまたは化学修飾によってそのようなエキソヌクレアーゼを修飾することが望ましい場合がある。

一本鎖核酸に対するエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼとしては、例えば、大腸菌ＲＮＡｓｅ Ｔ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌熱不安定性エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌エキソヌクレアーゼＶＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、毒液エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、およびＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼが挙げられる。

前述の酵素（例えば、ポリメラーゼ）のいずれかがエキソヌクレアーゼ活性に加えて他の酵素活性を有する限りにおいて、反応条件は、本発明によるポリヌクレオチド配列決定を妨害しないようにそれらの活性を抑制するように選択される。例えば、いくつかの実施形態では、重合活性は、重合のための基質である標準ヌクレオチド５－三リン酸のいずれも含まないエキソヌクレアーゼ切断反応条件下では無視できるかまたは存在しない。

本明細書に開示される発明のいくつかの態様では、ソリッドステート基材はシス側およびトランス側を含む。基材は、反応容積を画定する反応ウェルを含む。反応ウェルは、（ｉ）基材のシス側とトランス側との間に延在する近位貫通孔と、（ｉｉ）１またはそれを超える側壁と、（ｉｉｉ）遠位開口部と、を含む。ソリッドステート基材は、基材のトランス側に入射する励起光が反応ウェルの反応容積に浸透すること、および基材のシス側に浸透することを実質的にブロックする不透明金属層をさらに含む。

配列決定される蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含有するための反応ウェルは、様々な形状およびサイズのいずれかを有し得る。例えば、円形断面および平行な側壁を有する円筒形ウェルが適しているが、反応ウェルはまた、平行または非平行な側壁を有する楕円形、三角形、正方形、長方形、五角形、六角形、八角形または他の規則的または不規則な断面形状を有してもよい。例えば、前述の形状のいずれかを有する反応ウェルの側壁は、平行、テーパー、円錐台形、または砂時計形であってもよい。例えば、円筒形ウェルは、それ自体と本質的に平行な単一の側壁を有すると見なされ得る。

反応ウェルは、ユーザによって選択され得る様々な寸法のいずれかを有し得る。特定の寸法の選択は、配列決定される蛍光標識された鎖の選択された長さおよび最小直径、蛍光標識された鎖が一本鎖形態であるか二本鎖形態であるか、および任意の他の関連する考慮事項を考慮に入れることができる。

反応ウェルの深さおよび最小直径は、通常、各反応ウェルが（１）配列決定される蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の遠位端、および（２）末端モノヌクレオチドのヌクレアーゼ的切断中に鎖の遠位端に結合するエキソヌクレアーゼ分子を含有することができるように選択される。

本明細書で使用される場合、「最小直径」は、適用可能な場合、反応ウェルまたは貫通孔の最短直径を意味する。例えば、円柱は、最小直径である単一の直径を有する。反応ウェルの深さ軸に垂直な正方形のオーバーヘッド断面を有する反応ウェルの場合、最小直径は、反応ウェルの２つの対向する壁の間の（および垂直な）距離（正方形断面の辺の長さ）であり、最大直径は、正方形断面を横切る対角線の長さである。テーパーまたは他の非平行な壁を有する反応ウェルの場合、反応ウェルの最小直径は、ウェルの断面における最短寸法である。より一般的には、遠位開口部、および遠位開口部から延在する反応ウェルの少なくとも一部は、上記要件（１）および（２）を満たす最小直径を有する。したがって、反応ウェルの遠位開口部が特定の最小直径を有する場合、遠位開口部からウェルの貫通孔に向かって延在する反応ウェルの少なくとも一部または全部の最小直径は、反応ウェルの遠位開口部の最小直径またはそれを超える。いくつかの実施形態では、近位貫通孔は、遠位開口部および側壁によって画定される反応容積の直径と実質的に同じ直径を有することができる。

いくつかの実施形態では、反応ウェルまたは反応ウェルの遠位開口部は、少なくとも３０ｎｍ、または少なくとも４０ｎｍ、または少なくとも５０ｎｍ、または少なくとも６０ｎｍ、または少なくとも７０ｎｍ、または少なくとも８０ｎｍ、または少なくとも９０ｎｍ、または少なくとも１００ｎｍの最小直径を有する。いくつかの実施形態では、反応ウェルは、１５０ｎｍ未満、または１２０ｎｍ未満、または１００ｎｍ未満、または９０ｎｍ未満、または８０ｎｍ未満である最小直径を有する。いくつかの実施形態では、反応ウェルは、３０ｎｍ～２５０ｎｍ、または３０ｎｍ～１５０ｎｍ、または３０ｎｍ～１２０、または３０ｎｍ～１００、または３０ｎｍ～９０ｎｍ、または５０ｎｍ～１５０ｎｍ、または５０ｎｍ～１２０ｎｍ、または５０ｎｍ～１００ｎｍ、または５０ｎｍ～９０ｎｍ、または８０ｎｍ～１２０ｎｍの最小直径を有する。

反応ウェルの深さは、通常、配列情報を生成するためにエキソヌクレアーゼによって切断される蛍光標識ポリヌクレオチド鎖のセグメントの長さよりも長くなるように選択される。二本鎖ＤＮＡは比較的硬い棒状であり、単位長さは３．６オングストローム（０．３６ｎｍ）あたり約一塩基対である。したがって、１０００個の連続した塩基対を含むｄｓＤＮＡセグメントは、約３６０ｎｍの長さを有する。したがって、４００ｎｍの反応ウェル深さは、ｄｓＤＮＡの遠位端を望ましくない励起光に曝露することなく固定化された１０００ｂｐのｄｓＤＮＡを封入するのに適切であってよく、５００ｎｍのウェル深さは、望ましくない励起光からのさらに良好な保護を提供し得る。あるいは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の場合、一本鎖核酸は剛性が低く、二本鎖核酸よりも直径が小さいので、４００ｎｍの反応ウェル深さは、ｄｓＤＮＡの遠位端を望ましくない励起光に曝露することなく、１０００個を超える連続塩基を有する固定化された蛍光標識された鎖を封入し得る。

いくつかの実施形態では、反応ウェルは、少なくとも１５０ｎｍ、または少なくとも２００ｎｍ、または少なくとも３００ｎｍ、または少なくとも４００ｎｍ、または少なくとも５００ｎｍのウェル深さを有する。いくつかの実施形態では、反応ウェルは、１０００ｎｍ未満、または８００ｎｍ未満、または７００ｎｍ未満、または６００ｎｍ未満、または５００ｎｍ未満であるウェル深さを有する。いくつかの実施形態では、反応ウェルは、１５０ｎｍ～１０００ｎｍ、または１５０ｎｍ～８００ｎｍ、または１５０ｎｍ～７００ｎｍ、または１５０ｎｍ～６００ｎｍ、または１５０ｎｍ～５００ｎｍのウェル深さを有する。いくつかの実施形態では、反応ウェルは、２００ｎｍ～１０００ｎｍ、または２００ｎｍ～８００ｎｍ、または２００ｎｍ～７００ｎｍ、または２００ｎｍ～６００ｎｍ、または２００ｎｍ～５００ｎｍのウェル深さを有する。いくつかの実施形態では、反応ウェルは、３００ｎｍ～１０００ｎｍ、または３００ｎｍ～８００ｎｍ、または３００ｎｍ～７００ｎｍ、または３００ｎｍ～６００ｎｍ、または３００ｎｍ～５００ｎｍのウェル深さを有する。いくつかの実施形態では、反応ウェルは、４００ｎｍ～１０００ｎｍ、または４００ｎｍ～８００ｎｍ、または４００ｎｍ～７００ｎｍ、または４００ｎｍ～６００ｎｍ、または４００ｎｍ～５００ｎｍのウェル深さを有する。

上記のように、反応ウェルはまた、基材のシス側とトランス側との間に延在する近位貫通孔を含む。ここで、「近位」貫通孔は、貫通孔が関連する反応ウェルの遠位開口部よりも基材のシス側に近いことを意味する。各近位貫通孔は、（１）蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の遠位端が電界によって貫通孔の中におよび貫通孔を通って引き込まれることを可能にするのに十分に大きく、（２）蛍光標識された鎖が結合した担体粒子が貫通孔を通って基材のトランス側に通過するのを防ぐのに十分に小さい最小直径を有する。好ましくは、近位貫通孔の最小直径は、任意のエキソヌクレアーゼ分子が基材のトランス側からシス側へ近位貫通孔を通過するのを防ぐのに十分に小さい。いくつかの実施形態では、各近位貫通孔は、エキソヌクレアーゼの最小寸法よりも小さい最小直径を有する。

いくつかの実施形態では、近位貫通孔は、少なくとも２ｎｍの最小直径を有する。いくつかの実施形態では、近位貫通孔は、２ｎｍ～５０ｎｍ、または３ｎｍ～５０ｎｍ、または５ｎｍ～５０ｎｍ、または１０ｎｍ～５０ｎｍ、または２０ｎｍ～５０ｎｍ、または２ｎｍ～４０ｎｍ、または３ｎｍ～４０ｎｍ、または５ｎｍ～４０ｎｍ、または１０ｎｍ～４０ｎｍ、または２０ｎｍ～４０ｎｍ、または３ｎｍ～３０ｎｍ、または５ｎｍ～３０ｎｍ、または１０ｎｍ～３０ｎｍ、または２ｎｍ～２０ｎｍ、または３ｎｍ～２０ｎｍ、または５ｎｍ～２０ｎｍ、または１０ｎｍ～２０ｎｍ、または２ｎｍ～１０ｎｍ、または３ｎｍ～１０ｎｍ、または５ｎｍ～１０ｎｍの最小直径を有する。

いくつかの実施形態では、近位貫通孔は、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも１５ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍ、または１０～６０ｎｍ、または１０～５０ｎｍ、または１０～４０ｎｍ、または２０～６０ｎｍ、または２０～５０ｎｍ、または２０～４０ｎｍ、または３０～６０ｎｍ、または３０～５０ｎｍの長手方向厚さを有する。

いくつかの実施形態では、基材は、近位貫通孔を含む薄膜層を含む。いくつかの実施形態では、薄膜層は、窒化ケイ素（ＳｉＮ）を含む。

本発明で使用するための反応ウェルを含む基材は、シリコーン（例えば、Ｓｉ_３Ｎ_４、ＳｉＯ_２）、金属、金属酸化物（例えば、Ａｌ_２Ｏ_３）プラスチック、ガラス、半導体材料、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない様々な形態の固体材料で、任意の適切な方法によって製造することができる。ソリッドステート基材を作製するための製造技術は、参照により組み込まれる以下の例示的な参考文献に見出すことができる。Ｇｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏら、米国特許第６，４６４，８４２号；Ｓａｕｅｒら、米国特許第７，００１，７９２号；Ｓｕら、米国特許第７，７４４，８１６号；Ｍｅｌｌｅｒら、国際特許公開ＷＯ２００９／０２０６８２号；Ｙａｎら、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５（６）：１１２９－１１３４（２００５）；Ｗａｎｕｎｕら、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ、７（６）：１５８０－１５８５（２００７）；Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２：２０９－２１５（２００７）；Ｓｔｏｒｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２：５３７－５４０（２００３）；Ｚｈｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．、１７：３０４－３１３（２００７）；などである。

ソリッドステート基材は、本明細書で不透明金属層と呼ばれる１またはそれを超える遮光層を含む。各不透明金属層は、励起ビームからの入射光を反射および／または吸収し、それによって（１）反応ウェル内および基材のシス側の蛍光標識された鎖を光退色および入射光によって引き起こされる他の損傷から保護し、（２）エキソヌクレアーゼによって標識された鎖から切断される前に蛍光標識された鎖内の標識が蛍光を発し、切断された蛍光標識モノヌクレオチドからの正しい蛍光シグナルを潜在的に妨害することを防止する。

不透明金属層は、例えば、Ｓｎ、Ａｌ、Ｖ、Ｔｉ、Ｎｉ、Ｍｏ、Ｔａ、Ｗ、Ａｕ、ＡｇもしくはＣｕ、および／または合金もしくはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、不透明金属層は、Ａｌ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含む。いくつかの実施形態では、不透明金属層は、アルミニウム（Ａｌ）または金（Ａｕ）を含む。不透明金属層の組成は、入射光の金属の反射率の波長依存性に基づいて選択することができる。本発明における蛍光検出のために、入射光は、典型的には、約３８０ｎｍ～約７４０ｎｍの範囲の可視スペクトルである。アルミニウムは、可視スペクトル全体にわたって約９０％の反射率を示し、不透明層として使用するための良好な候補となる。金は、約２６０ｎｍ～約４８０ｎｍの波長で約３５％の反射率を示し、次いで、約４８０ｎｍ～７００の波長で急激に上昇し、約５５０ｎｍを超える波長では約９０％を超える。したがって、金は、特に約４８０ｎｍを超える波長、特に赤色および赤外領域において、可視スペクトルにわたって良好な遮光特性を有する。銀は、約３５０ｎｍを超える波長に対して約８０％を超える反射率を有する。

いくつかの実施形態では、基材は、２またはそれを超える不透明金属層を含む。例えば、基材は、金層およびアルミニウム層を含むことができ、これらの両方は、基材のトランス側に衝突する入射光を反射および／または吸収する。いくつかの実施形態では、基材は、アルミニウム層が金層よりも基材のシス側に近くなるように、アルミニウム層の上に金層を含む。金の最上層（外側金層または遠位金層と呼ばれることもあり、反応ウェルの遠位開口部を取り囲む）を有することの１つの利点は、金が反応ウェルの遠位開口部の周りの光励起の強度を高めることができ、それにより、励起ゾーンを通って拡散する各放出された蛍光標識モノヌクレオチドからの蛍光シグナルの収率を高めることができることである。いくつかの実施形態では、基材は、金層がアルミニウム層よりも基材のシス側に近くなるように、金層の上に遠位アルミニウム層を含む。

不透明金属層の厚さは変化してよく、不透明層を構成する材料の物理的および化学的特性に依存する。いくつかの実施形態では、不透明層の厚さは、少なくとも４０ｎｍ、または少なくとも８０ｎｍ、または少なくとも１２０ｎｍ、または少なくとも２００ｎｍ、または少なくとも３００ｎｍであってもよい。他の実施形態では、不透明層の厚さは、５０～７００ｎｍの範囲であってもよい。他の実施形態では、不透明層の厚さは、１００～６００ｎｍの範囲であってもよい。基材が２つ以上の不透明金属層を含む場合、「厚さ」は、各個々の層の厚さを指す。

不透明金属層は、励起ビームからの光の１００％をブロック（すなわち、反射または吸収する）する必要はない。いくつかの実施形態では、不透明金属層、または２つ以上の層が存在する場合には複数の不透明金属層は、反応ウェルの近位貫通孔から５０ｎｍの深さで反応ウェルの遠位開口部に入射する励起光の少なくとも３０％、少なくとも５０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％をブロックする。

不透明層は、様々な技術によって製造することができる。例えば、化学蒸着、電着、エピタキシ、熱酸化、物理蒸着（蒸着およびスパッタリングを含む）、鋳造を含む材料堆積技術を使用することができる。いくつかの実施形態では、原子層堆積を使用することができる。例えば、米国特許第６，４６４，８４２号；Ｗｅｉら、Ｓｍａｌｌ，６（１３）：１４０６－１４１４（２０１０）があり、参照により組み込まれる。

ソリッドステート基材は、他の層を含んでもよい。例えば、ソリッドステート基材は、基材内の反応ウェルの深さを増加させるために、１またはそれを超える不透明でない層を含んでもよい。そのような誘電体層は、例えば、ＳｉＯ_２、ＴｉＯ_２を含むことができる。

いくつかの実施形態では、ソリッドステート基材は、層の安定性を高め、層間剥離または他の種類の損傷を抑止するために、２つの他の層の間に薄い接着層を含んでもよい。例えば、Ａｏｕａｎｉら、ＡＣＳ Ｎａｎｏ ３（７）：２０４３－２０４８（２００９）によって教示されているように、金層とアルミニウム層との間に薄い接着層を含めることにより、ソリッドステート基材内の金層の接着性を高めることができる。そのような薄い接着層は、例えば、クロム、チタン、二酸化チタン、酸化クロム、またはニッケルを含む任意の適切な材料を含むことができる。薄い接着層は、任意の適切な厚さを有し得る。例えば、薄い接着層は、１ｎｍ～４０ｎｍ、または５ｎｍ～２０ｎｍの厚さを有することができる。いくつかの実施形態では、薄い接着層が反応ウェルの遠位開口部から数十または数百ナノメートルである場合、薄い接着層は、励起ゾーンを通って拡散する蛍光標識モノヌクレオチドの蛍光収率に無視できるかまたは影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、薄い接着層が反応ウェルの遠位開口部の縁部に近い（例えば、以下の１０または２０または３０ｎｍ以内）場合、薄い接着層の厚さおよび組成は、励起ゾーンにおける蛍光励起の最適な増強を提供するように選択され得る。いくつかの実施形態では、ソリッドステート基材は、複数の薄い接着層を含む。例えば、ソリッドステート基材は、第１の不透明金属層と第２の不透明金属層との間の第１の薄い接着層と、第２の不透明金属層とＳｉＯ_２またはＳｉＮなどの誘電体層との間の第２の薄い接着層とを含むことができる。

いくつかの実施形態では、ソリッドステート基材は、様々な目的のために複数の層を有する多層構造を含む。例示的な多層構造は、左から右に列挙されたシス側からトランス側までの以下の層を有する基材を含む。
（１）ＳｉＮ（３０ｎｍ）、Ｃｒ（５ｎｍ）、Ａｕ（３００ｎｍ）
（２）ＳｉＮ（３０ｎｍ）、Ａｌ（２００ｎｍ）、Ｃｒ（５ｎｍ）、Ａｕ（３００ｎｍ）
（３）ＳｉＮ（３０ｎｍ）、ＳｉＯ_２（２００ｎｍ）、Ｃｒ（５ｎｍ）、Ａｕ（３００ｎｍ）
（４）ＳｉＮ（３０ｎｍ）、ＳｉＯ_２（２００ｎｍ）、Ａｌ（２００ｎｍ）、Ｃｒ（５ｎｍ）、Ａｕ（３００ｎｍ）
（５）ＳｉＮ（３０ｎｍ）、Ａｌ（４００ｎｍ）

貫通孔は、窒化ケイ素、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）などを含むがこれらに限定されない様々な材料の固体膜において製造することができる。窒化ケイ素は、しばしばＳｉ_３Ｎ_４（３：４のＳｉ：Ｎ化学量論を示す）として表されるが、ケイ素および窒化物の他の化学量論比を有するケイ素／窒素混合物を使用してもよい。例えば、３：４に近いが３：４～４：４のＳｉ：Ｎ化学量論は、Ｓｉ_３Ｎ_４よりも低い構造応力を有し得る。

一般に、本発明の方法および基材は、タンパク質ナノポアまたは脂質二重層を含まないか、または必要とせず、それによってそれらの複雑さおよび不安定性の問題を回避する。

固体貫通孔は、上記の参考文献に例示されているように、様々な方法で作製することができる。いくつかの実施形態では、例えばＹａｎｇら、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２：２８５３１０（２０１１）によって開示されているように、ヘリウムイオン顕微鏡を使用して、様々な材料に合成貫通孔を穿孔することができる。自立膜になるように処理された薄膜材料、例えば窒化ケイ素の１またはそれを超える領域を支持するチップが、ヘリウムイオン顕微鏡（ＨＩＭ）チャンバに導入される。ＨＩＭモータ制御を使用して、顕微鏡を低倍率に設定しながら自立膜をイオンビームの経路に導入する。集束および非点補正を含むビームパラメータは、自立膜に隣接するがソリッドステート基材上の領域で調整される。パラメータが適切に固定されると、自立膜領域がイオンビームスキャン領域の中心に置かれ、ビームが打ち消されるように、チップ位置が移動される。ＨＩＭ視野は、予想される反応ウェルパターン全体を含むのに十分であり、光学的読み出しに有用であるのに十分な寸法（ミクロン）に設定される（すなわち、光学倍率、カメラ解像度などに依存する）。必要に応じて、イオンビームはその後、もしあれば膜自己蛍光の全部または大部分を除去するのに十分な総イオン線量をもたらす画素滞留時間で視野全体を通して１回ラスターされる（例えば、国際公開第２０１４／０６６９０５号を参照されたい）。次いで、視野は、対応する反応ウェルと整列した単一の貫通孔または貫通孔のアレイのいずれかのリソグラフィ的に画定されたミリングを実行するために適切な値（上記で使用されたものよりも小さい）に設定される。例えば、貫通孔は、対応する反応ウェルと同軸であるか、または同軸でないようにすることができる。パターンの画素滞留時間は、１またはそれを超える所定の直径の貫通孔をもたらすように設定され、貫通孔は、試料処理の前に較正試料の使用によって必要に応じて決定される。このプロセス全体は、単一チップ上の各所望の領域および／またはＨＩＭチャンバに導入された各チップについて繰り返される。本発明による貫通孔を含む反応ウェルを含む基材を調製するためのさらなる指針は、以下の実施例１に提供される。

反応ウェルの深さおよび直径は、基材の１またはそれを超える不透明金属層の種類および厚さと共に、遠位開口部から近位貫通孔に向かってウェル内の励起光の許容され得るレベルを達成するように、または励起光を最小化するように選択されてもよい。一般に、ウェルの遠位開口部に入射する光の強度は、貫通孔に向かってウェル内により深く進むにつれて指数関数的に弱くなり、その結果、反応容積の大部分は、特に近位貫通孔の近くで実質的に暗くなる。これは、不透明金属層が反応ウェルの遠位開口部を取り囲む場合に特にそうである。この現象の利点は、反応ウェル内の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖のかなりの部分またはすべてが、入射光による望ましくない励起から保護されることである。これにより、バックグラウンド蛍光および蛍光標識された鎖の望ましくない修飾または分解が減少する。したがって、より深いウェルは、入射光からのより大きな保護を提供し、その結果、反応ウェルのより大きな割合は、同じ直径であるがより小さい深さを有する反応ウェルよりも実質的に光を含まない。より深いウェルはまた、より長い蛍光標識された鎖が配列決定されるためのより多くの空間を提供する。同様に、より小さい遠位開口部を有するウェルは、より大きい遠位開口部が設けられたウェルよりも、遠位開口部から離れたウェルにおいてより増した暗さを提供する。これらの一般的な傾向は、例えば、以下の表２に示されており、これは、カナダ、バンクーバーのＬｕｍｅｒｉｃａｌ Ｉｎｃ．から入手可能なＬｕｍｅｒｉｃａｌ（２０２０年３月）ソフトウェアを使用したシミュレーションで測定された光強度を示している。より具体的には、強度は、ウェルの貫通孔からウェル深さ５０ｎｍ（アルミニウム側壁を有する）について、遠位開口部における入射光強度（６４０ｎｍ）の割合として計算された。

いくつかの実施形態では、各反応ウェルは、下記の表３における組み合わせによって例示される深さおよび最小直径の組み合わせを有する。

基材、特に反応成分と接触する基材の表面はまた、１またはそれを超えるコーティングでコーティングされて、緩衝液または反応成分、例えばエキソヌクレアーゼ、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖、放出されたモノヌクレオチド、および／または他の反応成分または緩衝成分に対する不活性、非反応性、または非親和性などの望ましい特性を付与することができる。

いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用されるかまたは生成される１またはそれを超える緩衝成分および／または反応成分と接触し得る１またはそれを超えるコーティングを基材の表面（本明細書では基材の「内面」とも呼ばれる）に適用することができる。例えば、そのようなコーティングは、反応ウェルの表面を不動態化して、エキソヌクレアーゼおよび／またはモノヌクレオチドに対するそれらの親和性を低下させるのに役立ち得る。そのようなコーティングはまた、酸化または他の分解プロセスから金属成分を保護するために、またはウェルの壁に沿って水性流を生成することができるような表面に沿った緩衝イオンの電気浸透流（ＥＯＦ）を減少させるために使用され得る。

いくつかの実施形態では、反応ウェルの内面、貫通孔の内面、または反応ウェルと貫通孔の両方の内面は、少なくとも１つのコーティングを含む。いくつかの実施形態では、単一のコーティングが適用される。いくつかの実施形態では、複数のコーティングが適用される。いくつかの実施形態では、複数のコーティングが適用される場合、コーティングは同じである。いくつかの実施形態では、複数のコーティングが適用される場合、コーティングは同じではない。そのようなコーティングは、ユーザによって選択された任意の適切な厚さを有することができる。例えば、コーティングは、１ｎｍ～２０ｎｍ、または１ｎｍ～１０ｎｍ、または２ｎｍ～１０ｎｍ、または５ｎｍ～１０ｎｍの厚さを有することができる。好ましくは、コーティング厚さは、原子層堆積（ＡＬＤ）などの様々な方法によって提供され得るように、実質的に均一である。

いくつかの実施形態では、コーティングは無機コーティングを含む。いくつかの実施形態では、無機コーティングは、ＨｆＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、ＳｉＯ_２、ＴｉＯ_２、ＳｉＮ、またはＰｔを含む膜を含む。そのようなコーティングは、任意の適切な方法によって作製され得る。例えば、このようなコーティングは、ＡＬＤによって加えられてもよい。そのようなコーティングは、アルミニウム、銅、および金などの様々な金属表面をコーティングするために、ならびにケイ素および窒化ケイ素などの様々な他の種類の材料表面をコーティングするためにも特に適している。基材が金層を含むいくつかの実施形態では、金表面は有機チオレート化合物でコーティングされてもよい。例えば、Ｌｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２４（１１）：１７９０－１７９７（２０１３）を参照のこと。基材が非金金属または金属酸化物層を含むいくつかの実施形態では、金属または金属酸化物表面は、Ｍｕｔｉｎら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １６：５６７０－５６７５（２００４）、Ｇａｏら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １２：６４２９－６４３５（１９９６）、およびＺｏｕｌａｌｉａｎら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ １１０：２５６０３－２５６０５（２００６）によって教示されるようなホスホン酸含有化合物でコーティングされてもよい。

いくつかの実施形態では、基材は、本発明の配列決定方法が実施される緩衝液中に存在し得るポリビニルピロリドンを含む動的コーティングを含む。そのようなコーティングは、例えば、ＳｉＮ、ＳｉＯ_２、および金属酸化物をコーティングするのに特に適し得る。いくつかの実施形態では、そのようなコーティングは、エキソヌクレアーゼ、モノヌクレオチド、または他の緩衝液もしくは反応成分の非特異的結合を減少させ得る。

いくつかの実施形態では、ソリッドステート基材は、本開示に記載の複数の反応ウェルを含み、その各々は配列決定のための蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含み得る。複数の反応ウェルは、ランダムまたは非ランダムな構成など、どのような構成で配置されていてもよく、通常、平面内に配置される。いくつかの実施形態では、反応ウェルは、複数の配列決定反応の並行した実行を容易にするためのアレイとして構成される。いくつかの実施形態では、アレイは、線形アレイに配置された複数の反応ウェルを含む。いくつかの実施形態では、アレイは、行および列の二次元アレイに配置された複数の反応ウェルを含む。いくつかの実施形態では、反応ウェルは、規則的に、例えば、平行な行が平行な列に対して垂直である（すなわち、９０度離れたｘ軸およびｙ軸に類似する）直線パターンで間隔を空けて配置される。いくつかの実施形態では、行は列に対して垂直ではない。例えば、行は互いに平行であってもよいが、列は、行に対して４５度または６０度などの９０度でない角度で延在してもよい。いくつかの実施形態では、反応ウェルは、ウェルの列が行の方向に対して６０度の角度で行から延びる六角形のアレイとして構成され得る。いくつかの実施形態では、各行の隣接するウェルは、互いに同じ距離だけ離れている。いくつかの実施形態では、各列の隣接するウェルは、互いに同じ距離だけ離れている。いくつかの実施形態では、各行および各列の隣接するウェル間の間隔は、互いに同じ距離だけ離れている。いくつかの実施形態では、隣接する行の間隔は、隣接する列の間隔とは異なる。

ソリッドステート基材が複数の反応ウェルを含む場合、各ウェルは、好ましくは、他のウェルからの蛍光シグナルからの実質的な干渉なしに、各ウェルから蛍光シグナルを明確に検出することを可能にする距離だけ他のすべてのウェルから分離される。通常、隣接するウェル間の最小距離は、（１）検出される蛍光の最長波長、および（２）シグナル検出器の画素分解能に依存する。

２つの隣接する光源からの光シグナルの光学的分解能は、光源の寸法がλ／２より小さくても（例えば、反応ウェルが１５０ｎｍ、１００ｎｍまたは８０ｎｍの直径を有する場合）、光源が検出された光の波長の少なくとも半分（λ／２）の距離だけ離れている場合に達成されると考えられることが多い。しかしながら、隣接するウェルからの光シグナルからのクロストーク干渉を最小限に抑えるために、より良好な分解能のためには、より大きな間隔が好ましい場合がある。したがって、隣接するウェルから発する７００ｎｍの波長を有する蛍光シグナルについて、３５０ｎｍ（λ／２）の最小ウェル間距離は、２つのシグナルの適切な分解能を提供するのに十分であり得る。しかしながら、より大きいウェル間距離は、シグナル分解能および検出精度を改善する可能性が高い。

シグナル検出器は、ユーザによって適切であると考えられる任意の適切な画素解像度を有することができる。例えば、シグナル検出器の各画素が１００ｎｍ×１００ｎｍの面積を有し、各反応ウェルが１００ｎｍの直径を有する場合、各ウェルから放出する光シグナルは、通常、各ウェルから放出した光子の大部分またはすべてを捕捉するために、各ウェルに対して複数の検出画素（例えば、ウェルあたり３×３画素領域、または４×４画素領域、または５×５画素領域）を使用して収集される。一般に、ウェルからのシグナル検出のためにより多くの画素を使用すると、画素領域が次の隣接するウェルに近すぎない限り、各ウェルから収集された蛍光シグナルの光子収率（すなわち、より高いシグナル強度）がより高くなる。

いくつかの実施形態では、反応ウェルは、少なくとも１マイクロメートル、または少なくとも１．３マイクロメートル、または少なくとも１．５マイクロメートル、または少なくとも１．７マイクロメートル、または少なくとも２マイクロメートル離れている。しかしながら、これらのウェル間分離距離よりも大きいまたは小さい反応ウェル分離距離を有する基材も使用され得る。

いくつかの実施形態では、複数のウェルは、少なくとも１０×１０反応ウェル、または少なくとも３０×３０反応ウェル、または少なくとも１００×１００反応ウェル、または少なくとも５００×５００反応ウェル、または少なくとも１０００×１０００反応ウェルのアレイを含む。

例示的なソリッドステート基材を調製するための例示的な手順は、以下の実施例２にも見られる。

上記のように、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を反応ウェル内でエキソヌクレアーゼと反応させると、蛍光標識モノヌクレオチドであるか、または蛍光標識モノヌクレオチドを含むモノヌクレオチドが鎖の遠位端から放出される。蛍光標識された鎖とのエキソヌクレアーゼ反応の間、基材のトランス側が励起光で照射されて、反応ウェルの遠位開口部に隣接する蛍光励起ゾーンを形成し、その結果、励起ゾーンを通って拡散する蛍光標識モノヌクレオチドは、時間の関数として検出される蛍光シグナルを放出する。別の言い方をすれば、基材のトランス側を励起光で照射して、反応ウェルの遠位開口部に隣接する蛍光励起ゾーンを形成する。基材が照射されている間、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖はエキソヌクレアーゼと反応し、その結果、モノヌクレオチドが鎖の遠位端から連続的に放出され、蛍光励起ゾーンを通って拡散し、その結果、励起ゾーン内の蛍光標識モノヌクレオチドが蛍光シグナルを放出する。

蛍光シグナルは時間の関数として検出され、それにより、放出された蛍光標識モノヌクレオチドから検出された蛍光シグナルの時間順序からヌクレオチド配列が決定される。

蛍光シグナルの生成および検出は、任意の適切な検出器を使用して達成され得る。検出器は、同時にまたは異なる時間に１またはそれを超える配列決定反応ウェルを照明するために光を放射する励起源を含む。

典型的には、励起光は単色の光を含み、すなわち、光は狭い波長範囲を含む。励起源が単色でない光を放射する場合、望ましくない波長が反応ウェルに衝突するのをブロックするために、光は１またはそれを超えるフィルタを通過することができる。例示的な光源は、レーザ（例えば、アルゴンレーザ）、放射光ダイオード、レーザダイオード、ならびにキセノンおよび水銀ランプなどのランプを含む。いくつかの実施形態では、検出器は、１またはそれを超える自由空間レーザを含む。いくつかの実施形態では、検出器は、１またはそれを超えるファイバ結合レーザを含む。

いくつかの実施形態では、検出器は、各々が、各反応ウェルの励起ゾーンを通って拡散する蛍光標識モノヌクレオチドの選択された蛍光標識を励起するための励起光を生成するのに適した選択された発光波長または発光波長範囲を有する、２またはそれを超えるレーザまたは発光ダイオードなどの複数の光源を含む。

いくつかの実施形態では、励起光は、円偏光である。いくつかの実施形態では、励起光は、直線偏光である。いくつかの実施形態では、励起光は、無偏光である。いくつかの実施形態では、励起光は、４８８ｎｍの波長を有する光を含む。いくつかの実施形態では、励起光は、５３２ｎｍの波長を有する光を含む。いくつかの実施形態では、励起光は、６４０ｎｍの波長を有する光を含む。いくつかの実施形態では、励起光は、７３０ｎｍの波長を有する光を含む。

いくつかの実施形態では、励起光は、アレイとして構成され得る複数の反応ウェルなどの１またはそれを超える反応ウェルを照らすために平行にされる。いくつかの実施形態では、励起光は、例えば単一の反応ウェルからの蛍光シグナルの検出に使用され得る共焦点顕微鏡構成などで集束される。

複数の蛍光標識を使用する実施形態の場合、すなわち、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が異なる識別蛍光標識を含む異なるヌクレオチドを含む場合、励起波長は、異なる蛍光標識からの放射光の相対強度のバランスをとるように調整され得る。異なる蛍光標識からの放射光の相対強度をバランスさせる別の方法は、１つまたは複数の光源によって生成された励起波長に基づいて異なる蛍光標識を選択することである。例えば、蛍光標識によって放出される蛍光シグナルの強度は、標識の蛍光発光波長に対応する標識の最大吸収波長（λｍａｘ，ａｂｓ）よりも短い波長で標識を励起することによって低減され得る。異なる蛍光標識および光源はまた、異なる蛍光標識の発光シグナルの分解能のバランスをとり、最適化するように選択され得る。これは、異なる標識からのシグナルを区別するために必要と考えられるほど互いに離れている発光波長を有する標識を選択することによって達成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、標識は、蛍光標識ヌクレオチド中の他の標識の最も近い発光波長最大値よりも少なくとも２０ｎｍ、または少なくとも２５ｎｍ、または少なくとも３０ｎｍ大きいかまたは小さい発光波長最大値で選択される。標識の選択はまた、１またはそれを超える光源によって提供される励起波長に依存し得る。

蛍光検出は、様々な検出モードのいずれかを使用して達成され得る。適切な光検出器としては、例えば、アバランシェフォトダイオード検出器；光電子増倍管；増感ＣＣＤ（ｉＣＣＤ）および電子増倍ＣＣＤ（ｅｍＣＣＤ）などの電荷結合素子（ＣＣＤ）；相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）検出器；共焦点顕微鏡；およびダイオードアレイ検出器が挙げられる。典型的には、ＣＣＤおよびダイオードアレイなどの検出器は、反応ウェルから蛍光シグナルを収集するための画素の二次元アレイを含む。上述のように、反応ウェルからの蛍光シグナルは、通常、検出器内の複数の画素によって収集され、そのウェルからの光子の収集を最大化して、各蛍光標識を正確に識別することができる。画素は通常、蛍光標識された鎖のエキソヌクレアーゼ切断によって放出されるすべての蛍光標識の波長を包含する波長のスペクトルにわたって光子を検出するように設計される。

蛍光シグナルは、通常、検出された蛍光シグナルの最大収率について連続的にモニターされる。蛍光シグナルは、励起ゾーンを通過する各放出されたモノヌクレオチドによって放出される蛍光シグナルの持続時間よりも速いフレームレートを使用して検出および／または記録される。フレームレートは、蛍光標識モノヌクレオチドによって放出される個々の光子または光子バーストの蛍光シグナル強度および持続時間を考慮することによって選択され得る。蛍光シグナルは、通常、蛍光モノヌクレオチドの非存在下で測定されるバックグラウンド／ベースライン蛍光の減算後に測定される。

本発明の反応ウェルを含む例示的なソリッドステート基材を図１Ａ～図１Ｄの断面図に示す。基材１００は、シス側１０２ａおよびトランス側１０２ｂを含む。基材１００は、反応容積部１０６を画定する反応ウェル１０４をさらに含む。反応ウェル１０４は、（ｉ）基材のシス側とトランス側との間に延在する近位貫通孔１０８と、（ｉｉ）１またはそれを超える側壁１１０ａおよび１１０ｂと、ならびに（ｉｉｉ）遠位開口部１１２と、を含む。円筒形または非円筒形であり得る近位貫通孔１０８は、薄膜層１１４を通過する開口部として設けられてもよい。

ソリッドステート基材１００は、励起光が反応容積に浸透すること、および基材のトランス側からシス側に浸透することを実質的にブロックする不透明金属層１１６をさらに含む。図１Ａ～図１Ｄは、単一の不透明金属層を含むソリッドステート基材を示しているが、ソリッドステート基材は、本明細書の他の箇所で説明するように、追加の層および材料を含んでもよい。

図１Ａを参照すると、反応ウェル１０４は円筒形であるが、反応ウェルは他の非円筒形の形状を有してもよい。反応容積部１０６は、層１１６の側壁１１０ａ、薄膜層１１４の側壁１１０ｂ、および反応ウェルの直径によって画定され囲まれており、遠位開口部１１２にまたがる点線の水平な両矢印によって示されている。反応ウェル１０４の深さは、点線の垂直両矢印１１８によって示されている。

各反応ウェルの最小直径は、少なくとも１つのエキソヌクレアーゼ分子が、基材のトランス側から遠位開口部を通って反応ウェル内に拡散し、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の遠位端に結合して消化するのに十分な大きさでなければならない。したがって、各反応ウェルの最小直径は、使用されるエキソヌクレアーゼの最小寸法または断面と少なくとも同じ大きさであるか、またはそのようにされ得る。例えば、６ｎｍ×６ｎｍ×６ｎｍのｘ－ｙ－ｚ寸法を有するエキソヌクレアーゼの場合、５０ｎｍまたは１００ｎｍまたは１５０ｎｍの最小直径はそれぞれ、エキソヌクレアーゼが反応ウェルに拡散し、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の遠位端からモノヌクレオチドを連続的に消化するのに十分な空間を提供するのに十分に大きい。

蛍光標識ポリヌクレオチド鎖がロードされた担体粒子の移動または位置に影響を及ぼすために基材にわたって電界が印加されると、シス側１０２ａは陽極（負に帯電した）電極に関連し、基材１００のトランス側１０２ｂは陰極（正に帯電した）電極に関連する。

ソリッドステート基材のシス側およびトランス側を１またはそれを超える水性緩衝液と接触させる。いくつかの実施形態では、基材のシス側およびトランス側の緩衝液は、シス側の担体粒子（存在する場合）およびトランス側のエキソヌクレアーゼ分子（存在する場合）の存在を除いて同じであり得る。他の実施形態では、基材のシスおよびトランス側の緩衝液は互いに異なる。

本発明の配列決定方法に適した緩衝液組成物が提供される。典型的には、緩衝液は、例えば、選択されたｐＨを維持するために、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｔｒｉｓおよびリン酸塩などの緩衝分子を含有する（例えば、「良好な緩衝液」に関するＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔａｌｏｇを参照されたい）。５ｍＭ～１００ｍＭの緩衝分子濃度が典型的には有用であるが、より高いまたはより低い濃度も使用することができる。塩および他の添加剤、例えばＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＫＣｌおよびグリセロール（例えば、１０ｍＭ ＫＣｌ～１Ｍ ＫＣｌおよび／または１～６０もしくは１～７０体積パーセントのグリセロール）などもまた、必要に応じて、使用される特定の酵素のための適切な補因子と同様に含められ得る（例えば、いくつかのエキソヌクレアーゼのためのＭｇＣｌ_２またはＭｎＣｌ_２）。いくつかの実施形態では、緩衝液組成物は、ｐＨを６．０～８．８の範囲の値で実質的に一定に維持するように構成されるが、より高いまたはより低いｐＨ値を有する緩衝液を使用してもよい。例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびＴ４エキソヌクレアーゼの場合、緩衝液１または緩衝液２を以下のように使用することができ、ここで、ＤＴＴはジチオスレイトールであり、Ａｃは酢酸塩であり、ＢＳＡはウシ血清アルブミンである。
緩衝液１：１０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ－プロパン－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．５。
緩衝液２：５０ｍＭ ＫＡｃ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ａｃ、１０ｍＭ ＭｇＡｃ_２、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、２５℃でｐＨ７．９。

Ｔ４エキソヌクレアーゼに使用され得る別の緩衝液は緩衝液３である。
緩衝液３：５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ ｐＨ７．９、２５℃。

蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を反応ウェルに送達するために、各々が１またはそれを超える結合した蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含む１またはそれを超える担体粒子を含む水溶液を、基材１００のシス側１０２ａと接触させる。各蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、（ｉ）担体粒子に結合した近位端と、（ｉｉ）エキソヌクレアーゼによって切断可能な遠位端と、（ｉｉｉ）蛍光標識を含む少なくとも１つの蛍光標識ヌクレオチドと、を含む。電圧バイアスは、基材のシス側からトランス側への電界を確立する一組の電極を使用して基材にわたって印加され、典型的には、基材のシス側に１またはそれを超える陽極電極（アノード）およびトランス側に１またはそれを超える陰極電極（カソード）を有する。電界は、担体粒子を反応ウェルの貫通孔に引き付け、その結果、担体粒子上の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の遠位端は、近位貫通孔に引き込まれ、近位貫通孔を通って反応ウェルの反応容積に引き込まれる。

しかしながら、担体粒子は貫通孔を通過しない。担体粒子の最小寸法は貫通孔の最小直径よりも大きいか、または担体粒子はそうでなければ大きすぎて貫通孔を通過することができないため、担体粒子は基材のシス側に残る。さらに、貫通孔が、ただ１つの蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が貫通孔を介して各反応ウェルに入ることを可能にするように寸法決めされる場合、または担体粒子が十分に低いローディング密度の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を有する場合、エキソヌクレアーゼ分子による消化のために、ただ１つの蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が反応ウェル内に存在する。

担体粒子および結合した蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、担体粒子を貫通孔のシス側に隣接させ、または押し付けるように基材を横切る（シス側とトランス側との間の）緩やかな電圧バイアスを維持することによって定位置に保持（維持）され得る。担体粒子は貫通孔に共有結合していない。電圧バイアスは、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を担体粒子から放出させないほど十分に穏やかである。穏やかな電圧バイアスは、結合したポリヌクレオチド鎖を反応ウェルに送達するために担体粒子を貫通孔に引き付けるために使用される電圧バイアスと同じであっても異なっていてもよい。

図１Ｂは、担体粒子１２０が電界によって（電圧バイアスによって）貫通孔１０８のシス側に隣接する位置に移動した例示的な反応ウェルを示す。担体粒子１２０は、三つの蛍光標識ポリヌクレオチド鎖１２２ａ、１２２ｂおよび１２２ｃを含む。各鎖は、近位端１２４ａによって鎖１２２ａについて示されるように近位端によって担体粒子に結合され、そして遠位端は、遠位端１２６ａによって鎖１２２ａについて示されるようにエキソヌクレアーゼによって切断可能である。鎖１２２ａは、連続ヌクレオチド配列５’－ＡＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＴＴＡＣＣＣＴＧＧＡ－３’（配列番号１）を有し、５’末端は担体粒子１２０に結合しており、３’－アデニル酸（Ａ）は遠位端である。図１Ｂ～図１Ｄでは、鎖１２２ａ、１２２ｂ、および１２２ｃのヌクレオチドのすべてが蛍光標識ヌクレオチドであり、それぞれが、各種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）を他の種類のヌクレオチドと区別する異なる蛍光標識を含む。

図１Ｂの鎖１２２ａは、一本鎖形態のみを有するものとして示されているが、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は代わりに二本鎖形態で提供されてもよく、または１またはそれを超える一本鎖および二本鎖領域を含んでもよいことが理解されよう。例えば、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖１２２ａが完全に二本鎖であった場合、それは、以下に示されるように配列５’－ＴＣＣＡＧＧＧＴＡＡＣＴＧＧＡＡＣＣＣＡＧＴ－３’（配列番号２）を含む相補鎖にハイブリダイズし、相補的ヌクレオチド間の塩基対合は縦線によって表される。

上述のように、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の遠位端が二本鎖である場合、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼを使用して、蛍光標識された鎖の遠位端を切断することができる。

引き続き図１Ｂを参照すると、エキソヌクレアーゼ分子を含む第２の水溶液を基材１００のトランス側１０２ｂと接触させることによってエキソヌクレアーゼを導入することができ、その結果、エキソヌクレアーゼ分子、この場合は鎖１２２ａを切断するための３’特異的一本鎖切断エキソヌクレアーゼが、反応ウェル内で蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の遠位端に結合し、モノヌクレオチドを切断し、それらを鎖の遠位端から連続的に放出することができる。エキソヌクレアーゼ分子１３０は、ポリヌクレオチド鎖１２２ａの遠位端１２６ａに結合し、３’末端Ａヌクレオチドとすぐ隣のＧヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合（矢印１３２ａで示す）を切断する。

エキソヌクレアーゼと蛍光標識ポリヌクレオチド鎖との反応中、基材のトランス側が励起光１４０で照射されて、反応ウェルの遠位開口部に隣接する蛍光励起ゾーン１５０が形成される。遠位開口部の直径を横切って広がり、反応ウェルの反応容積の外側と内側の両方に延在する陰影領域として示されている蛍光励起ゾーン１５０は、別個の境界を有しないことに留意されたい。むしろ、励起ゾーン内の入射光の強度は、ほぼ図１Ａに示すように、遠位開口部の近傍に最も集中し、反応ウェルのさらに内側または外側（上）の位置で急速に減少する（例えば、表２および上記の関連する考察を参照されたい）。しかしながら、励起ゾーンの直径は、反応ウェルの遠位開口部の直径と同じまたは実質的に同じである。言い換えれば、励起ゾーンは、遠位開口部の直径を超えてソリッドステート基材の領域まで延在しない。反応ウェルの入射光の三次元強度プロファイルはまた、ウェルの周りのソリッドステート基材材料（例えば、アルミニウム、金、または他の材料）の組成および他の特性に依存する。したがって、本発明に関して使用される場合、「反応ウェルの遠位開口部に隣接して」は、図１Ａの矢印１１２によって真横向きで示されるように、遠位開口部を通過する（および反応容積の遠位端を画定する）平面の直上および直下の両方にある空間、およびその空間を通って拡散する放出された蛍光標識モノヌクレオチドによって検出可能な蛍光シグナルの放出を引き起こす反応ウェル内の任意の他の近くの照射された空間を指すことが意図される。

図１Ｃを参照すると、放出されたモノヌクレオチド１２８ａ（Ａ^＊として示す）は、反応容積から蛍光励起ゾーン１５０を通って拡散する。励起ゾーンにある間、蛍光標識モノヌクレオチド１２８ａは、検出器によってアデニル酸モノヌクレオチドとして検出される複数の（複数の）光子（ｈν）の形態で蛍光シグナルを放出する（以下でさらに説明する図２を参照されたい）。特に、受動拡散は、放出された蛍光標識モノヌクレオチドが蛍光励起および検出のために励起ゾーンに到達することができる十分な機構を提供する。エキソヌクレアーゼ切断および検出中の反応ウェルへのまたは反応ウェルからの水溶液の能動的なバルク流は、必要ではなく、本発明は排除する。

最初の３’末端Ａモノヌクレオチドの鎖１２２ａからのエキソヌクレアーゼ切断および放出は、その遠位端に３’末端Ｇを有するより短い鎖１２２ｂを生成する。図１Ｄに示すように、鎖１２２ｂの遠位端とエキソヌクレアーゼ１３０との反応は、３’末端Ｇヌクレオチドとすぐ隣のＧヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合（矢印１３２ｂで示す）を切断し、より短い鎖１２２ｃおよび放出されたモノヌクレオチド１２８ｂ（Ｇ＊として示す）を生成する。放出された蛍光標識モノヌクレオチド１２８ｂは、反応容積から蛍光励起ゾーン１５０を通って拡散し、グアニル酸モノヌクレオチドとして検出器によって検出される蛍光シグナル（ｈν）を放出する。次いで、エキソヌクレアーゼ１３０は、最初の２つの３’－モノヌクレオチドと同じ方法で、鎖１２２ｃから次の３’末端モノヌクレオチドを切断する準備が整う。

消化が蛍光標識ポリヌクレオチド鎖に沿って継続すると、モノヌクレオチドが１つずつ放出され、その一部（またはそのすべてが、図１Ｂ～図１Ｄのストランド１２２ａｂｃの場合）は蛍光標識モノヌクレオチドである。放出されたモノヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼの切断速度よりもはるかに速い速度で拡散によって反応ウェルを出て、その結果、放出された蛍光標識モノヌクレオチドは、連続的に励起ゾーンに入り、励起ゾーンを通過して反応ウェルのトランス側のバルク溶液に入る。近位貫通孔を通るモノヌクレオチドの非生産的な拡散は、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖に結合した担体粒子による近位貫通孔のブロックのために実質的に回避される。

蛍光標識された鎖が完全に消化される前にエキソヌクレアーゼ分子が蛍光標識された鎖から解離する場合、溶液からの別のエキソヌクレアーゼは、蛍光標識された鎖の遠位端に結合し、消化を継続する。消化は、蛍光標識された鎖が非常に短くなり、エキソヌクレアーゼが蛍光標識された鎖の消化を停止するまで、または切断反応もしくは照射が他の方法で終了するまで続く。

蛍光標識ポリヌクレオチド鎖のエキソヌクレアーゼ媒介消化は、選択された消化時間にわたって、または信頼できる蛍光シグナルの収率が特定の量または選択された最小量閾値もしくは品質閾値未満まで進行させられる。

１またはそれを超える反応ウェル内の１またはそれを超える蛍光標識ポリヌクレオチド鎖のエキソヌクレアーゼ媒介切断（「エキソヌクレアーゼ媒介消化」または「エキソヌクレアーゼ消化」と呼ばれることもある）が終了した後、基材に逆電圧バイアスを印加して担体粒子を貫通孔から移動させることにより、反応ウェルに新しい蛍光標識ポリヌクレオチド鎖をリロードすることができ、その結果、残りの蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は反応容積から除去され、次いで、基材に新しい電圧バイアスを（全体に）印加して、各反応ウェルに異なる蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を、エキソヌクレアーゼと反応するために（すなわち、異なる蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の遠位端が各反応ウェルに送達されるように）各反応ウェルにリロードする。反応ウェルにロードされる新しい蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、以前のエキソヌクレアーゼ切断周囲において蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を提供した担体粒子と比較して同じまたは異なる担体粒子からのものであり得る。所望の量の配列データが収集されるまで、または配列決定サイクルがもはや十分に生産的でなくなるまで、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を反応ウェルにローディングし、エキソヌクレアーゼ媒介切断を用いて鎖を配列決定する複数回（サイクル）が行われ得る。

いくつかの実施形態では、約２５０ｍＶ～５００ｍＶの電圧バイアスを使用して蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を反応ウェルにロードして、結合した担体粒子を反応ウェルの貫通孔に移動させるが、より小さいまたはより大きい電圧バイアスを使用してもよい。いくつかの実施形態では、担体粒子は、約２５０ｍＶ～５００ｍＶの電圧を使用して貫通孔に隣接して保持されるが、より小さいまたはより大きい電圧バイアスも使用することができる。いくつかの実施形態では、約－２５０ｍＶ～－５００ｍＶの電圧バイアスを使用して、担体粒子を反応ウェルから遠ざける（「排出する」）が、より小さいまたはより大きい負電圧バイアスを使用してもよい。

複数の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を１またはそれを超える反応ウェルに送達させるために担体粒子を再使用する１つの利点は、多数の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を単一のソリッドステート基材および単一の核酸試料から配列決定することができることである。別の利点は、全核酸試料集団のより大きな割合から配列データを収集することにより、配列データの完全性を改善し、ギャップを低減し、かつ／または冗長な配列データの収集を増加させて配列を整列させ、最適なコンセンサス配列を定式化することができることである。

本発明のソリッドステート基材を含む例示的な配列決定装置２００を図２に示す。シス側およびトランス側を有する基材２０２が、顕微鏡対物レンズ２２２に隣接して、基材のトランス側がレンズに面するように配置される。励起光が基材２０２内の１またはそれを超える反応ウェルの励起ゾーンに送達され、励起ゾーンから蛍光シグナルが受信される。光路を点線で示す。

装置はまた、エキソヌクレアーゼ活性によって蛍光標識ポリヌクレオチド鎖から放出されるモノヌクレオチドの蛍光標識を励起するように選択される、それぞれ５３２ｎｍおよび６４０ｎｍの波長などの選択された波長を有する励起光を提供するための励起光源２０４ａおよび２０４ｂを含む。ここで、装置は、２つのファイバ結合レーザ光源２０４ａおよび２０４ｂを備える。源２０４ａおよび２０４ｂからの異なる波長を有する励起光ビームは、波長結合器（ＷＣ）２０６（ファイバベースの波長結合器）、光ファイバコネクタ２０８、コリメートレンズ２１０（例えば、無彩色ダブレットレンズ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ＃ＡＣ２５４－０６０－Ａ）、任意選択のシャッタ２１１、次いで１／４波長板２１２（例えば、無彩色４分の１波長板、Ｔｈｏｒｌａｂｓ ＡＱＷＰ０５Ｍ－６００）を通過し、レーザからの直線偏光ビームを円偏光ビームに変換する。次いで、光は、集束レンズ２１４（例えば、Ｔｈｏｒｌａｂｓ ＡＣ２５４－４００－Ａからの無彩色ダブレットレンズ）を通過して、ビームを顕微鏡対物レンズの後焦点面に集束させ、次いで、マルチバンド励起フィルタ２１６を（例えば、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＺＥＴ ５３２／６４０ｘから）通過する。フィルタ２１６を通過した後、光は、マルチバンド二色性ビームスプリッター２１８（例えば、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＺＴ ５３２／６４０ｒｐｃ）からミラー２２０、顕微鏡対物２２２を通って、基材２０１のトランス側に反射される。いくつかの実施形態では、顕微鏡対物２２２は油浸顕微鏡対物（例えば、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＰＯＮ６０ＸＯＴＩＲＦ）である。いくつかの実施形態では、対物２２２は、水浸顕微鏡対物である。いくつかの実施形態では、対物２２２は空気顕微鏡対物である。

基材２００のトランス側、特に基材２００の１またはそれを超える反応ウェルの遠位開口部への励起光の衝突は、反応ウェルの遠位開口部に隣接する蛍光励起ゾーン（図１Ｂ～図１Ｄを参照）を生成する。

蛍光標識モノヌクレオチドが蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の遠位端から連続的に放出され、反応ウェルの遠位開口部を通って反応容積から拡散すると、モノヌクレオチドは励起ゾーンを通って拡散し、励起光に応答して蛍光を放射する。放射された蛍光は、顕微鏡対物２２２によって収集されて集束され、マルチバンド二色性ビームスプリッター２１８を介して、マルチバンド放射フィルタ２２４（例えば、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＺＥＴ ５３２／６４０ｍ）を介して、ミラー２２０によって二色性ビームスプリッター２２６（例えば、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔ６３５ｌｐｘｒ）に反射される。図２の装置では、二色性ビームスプリッター２２６を通過する放射された蛍光は、レンズ２２８ａ（例えば、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＳＷＴＬＵ－Ｃチューブレンズ）によって集束され、次いで検出のために検出器カメラ２３０ａに集束される。二色性ビームスプリッター２２６によって反射された放出蛍光は、レンズ２２８ｂによって集束され、次いで検出のために検出器カメラ２３０ｂに集束される（例えば、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ１３４４０－２０ＣＵ Ｏｒｃａ Ｆｌａｓｈ ４．０）。検出器カメラ２３０ａおよび２３０ｂは、好ましくは、放出された蛍光標識モノヌクレオチドからの蛍光シグナルの時間順序を適切に検出するために同期される。

より多くの色について、二つのカメラを単一のカメラと置き換えてもよく、また、放出された光シグナルが個々の定量化およびヌクレオチド特異的蛍光シグナルの識別のために検出器場の異なる領域上に波長によって角度的に分離される集束レンズ２２８ａの代わりにプリズムが使用されてもよい。あるいは、３つ以上の異なる蛍光シグナルを捕捉するために、付随するレンズおよびビームスプリッターと共に第３および第４のカメラが含まれてもよい。

本発明で使用するための配列決定装置はまた、蛍光シグナルデータを収集および処理するためのコンピュータおよびソフトウェアを含み得る。

反応ウェル貫通孔と励起ゾーンとの間の反応容積内にある蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の部分は実質的に照射されないので、蛍光標識された鎖のその部分内の照射されていない蛍光ヌクレオチドは蛍光シグナルを放出せず、または仮に放出たとしても、そのようなシグナルは無視できる。励起ゾーンにある間に励起された蛍光モノヌクレオチドのみが、検出器によって検出される蛍光シグナルを放出する。また、遠位開口部が金を含む側壁によって画定される場合、入射光の励起強度はアルミニウムよりも大きく、蛍光の増強、言い換えれば、検出のための蛍光光子のより大きな束を提供し得る。

各反応ウェルの遠位開口部に衝突する励起光は、例えば反応ウェルが円筒形の形状である場合、基材表面に直交であるように、言い換えれば、各反応ウェルの中心軸に平行に配向され得る。あるいは、各反応ウェルの遠位開口部に入射する励起光は、基材表面に対して非直交であるように配向されてもよい。

励起光の波長はまた、放出されたモノヌクレオチドの蛍光標識と適合するように選択され、その結果、励起光が各蛍光標識に衝突すると、蛍光標識は励起光を吸収し、次いで、励起光の波長よりも長い波長（より低いエネルギー）を有する光子を放出する。最大吸収波長と蛍光標識に関連する最大発光波長との差は、ストークスシフトとして知られている。

蛍光シグナルは、蛍光標識モノヌクレオチドが励起ゾーンを通って拡散しながら個々の光子または光子バーストを放出する最短時間窓よりも速い検出器フレームレートを使用して検出される。通常、放出された蛍光標識モノヌクレオチドは、１０ミリ秒以内、または２０ミリ秒以内、または５０ミリ秒以内に励起ゾーンに入るが、約１００ミリ秒～約１０秒の時間間隔でエキソヌクレアーゼ媒介切断によって一個ずつ放出される。通常、放出された蛍光標識モノヌクレオチドは、蛍光標識された鎖から切断された後、１０ミリ秒以内に励起ゾーンに入る。フレームレートはまた、メモリのサイズおよび速度、シグナル対ノイズ、および蛍光シグナル強度に部分的に基づいて選択され得る。

放出された蛍光標識モノヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ切断速度および拡散時間（または拡散速度）は、ｐＨ、粘度、温度、およびエキソヌクレアーゼの選択などの反応パラメータを変えることによって調整することができる。例えば、粘度は、グリセロールなどの粘性添加剤を、例えば１％～６０％（ｖ：ｖ）、または１％～７０％（ｖ：ｖ）、または５０％～７０％（ｖ：ｖ）の濃度で、基材のトランス側の水性緩衝液に含めることによって増加させることができる。いくつかの実施形態では、基材のトランス側の水性緩衝液は、約５０％～約６０％のグリセロール（ｖ：ｖ）、または約５０％～７０％（ｖ：ｖ）、または約５０％のグリセロール（ｖ：ｖ）、または約６０％のグリセロール（ｖ：ｖ）、または約７０％のグリセロール（ｖ：ｖ）を含む。検出ゾーン内およびその周囲の増加した粘度の存在は、蛍光検出中のモノヌクレオチド拡散速度を低下させる（およびより長いモノヌクレオチド滞留時間を提供する）のに役立ち、（１）検出ゾーンを通過する各蛍光モノヌクレオチドについてより多くの放出された光子の収集によるより高い蛍光シグナル、（２）より高いシグナル対ノイズ、（３）必要に応じてより低いレーザ出力を使用し、それによってより少ない熱を生成する能力、（４）反応ウェルから隣接する反応ウェルに向かって拡散する蛍光モノヌクレオチドからの（もしあれば）交差汚染が少ないこと、（５）および反応ウェルをアレイ内でより密接に一緒に配置する能力などのいくつかの利点を提供する。

放出された各蛍光標識モノヌクレオチドは、測定された蛍光シグナルの特徴、例えば（１）各異なる種類のヌクレオチドに関連する蛍光標識の蛍光の特定の発光波長またはピーク形状、（２）反応ウェルの励起ゾーンを通過する間に同じモノヌクレオチドからの複数の光子の合計として測定され得るシグナル強度、および（３）任意の他の放出されたモノヌクレオチドからの蛍光シグナルの寄与がないことから同定され得る（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴとして）。例えば、第１の反応ウェルの励起ゾーンから第２の反応ゾーンの励起ゾーンに拡散する蛍光標識モノヌクレオチドは、蛍光標識モノヌクレオチドの第２のウェルに向かう移動の軌跡に基づいて、第２のウェルについて検出された蛍光シグナルから除外することができる。同様に、第１の反応ウェルの励起ゾーンから拡散し、次いで励起ゾーンに戻る蛍光標識モノヌクレオチドは、第１のウェルに向かって戻る蛍光標識モノヌクレオチドの移動の軌跡に基づいて、第１のウェルについて検出された蛍光シグナルから除外することができる。

また、本発明で使用される蛍光標識モノヌクレオチドは、基材の照明条件下で光退色に対して中程度に感受性であるように選択されてもよく、その結果、励起ゾーンから拡散する蛍光標識モノヌクレオチドは、モノヌクレオチド標識が第１の反応ウェルの励起ゾーンで検出された後、同じ励起ゾーンに戻るかまたは別の励起ゾーンに拡散する前に、入射励起光によって実質的に退色し、したがって非蛍光になる。不活性反応ウェルからの蛍光シグナルは、コンピュータソフトウェアによって無視することができる。

配列は、同じまたは重複する配列領域を含む複数のポリヌクレオチド断片から得られた配列データから組み立てることができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列の決定は、例えば標的ポリヌクレオチドのＡおよびＣのみの配列などの、ＤＮＡ（またはＲＮＡの場合はＡ、Ｃ、ＧまたはＵ）についての４つの天然ヌクレオチドの完全なセットＡ、Ｃ、ＧおよびＴのサブセットの配列を決定することを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列の決定は、標的ポリヌクレオチド内の４つのタイプのヌクレオチドのうちの１つ、２つ、３つまたはすべての同一性、順序および位置の決定を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列の決定には、標的ポリヌクレオチド内の４つのタイプのヌクレオチドのうちの１つ、２つ、３つまたはすべての同一性、順序および位置の決定が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列の決定には、標的ポリヌクレオチドのフィンガープリントとして機能する標的ポリヌクレオチドの１またはそれを超える部分配列、例えばポリヌクレオチドのセット内の標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドのクラスをユニークに同定する部分配列、例えば細胞によって発現されるすべての異なるＲＮＡ配列を決定することが含まれる。

本発明はまた、本発明の方法を実施するのに有用であり得るキットを提供する。一般に、キットは、本発明の方法を実施するための材料または試薬を送達するための任意の送達システムであり得る。反応アッセイの文脈において、そのような送達システムは、ある場所から別の場所への反応試薬（例えば、適切な容器内の蛍光標識、例えば相互に消光する蛍光標識、酵素、担体粒子などを含むヌクレオチド５’－三リン酸）および／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを実施するための書面の説明書など）の貯蔵、輸送または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持材料を含む１またはそれを超えるエンクロージャ（例えば、ボックス）を含む。そのような内容物は、一緒にまたは別々に意図された受取人に送達されてもよい。例えば、第１の容器は、アッセイに使用するための酵素を含有してもよく、第２のまたはそれを超える容器は、相互に消光する蛍光標識を含有する。いくつかの実施形態では、キットは、エキソヌクレアーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ、１またはそれを超える蛍光標識ヌクレオチド５’－三リン酸、緩衝液、およびアビジン、ストレプトアビジン、配列決定されるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドなどの親和性標識を含む担体粒子のうちの１またはそれを超えるものを含み得る。

実施例１
核酸の担体粒子へのコンジュゲーション
Ａ．担体粒子への結合のためのＤＮＡの選択および設計 ＤＮＡの金もしくは銀ナノ粒子または金もしくは銀表面への直接コンジュゲーションのために、単一または複数の（２～６）チオール基をオリゴヌクレオチドの３’または５’末端のいずれかに結合させる（５’－ＧＣＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＴＴＡＴ－３’）（配列番号３）。単一チオールは、市販の前駆体、３’－または５’－ジスルフィド（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＨ（ｎ＝３または６）修飾オリゴヌクレオチド（ＩＤＴ、アイオワ）から得られる。市販の３’－または５’－アミノ官能化オリゴヌクレオチド（ＩＤＴ、アイオワまたはＴｒｉＬｉｎｋ）と（±）－α－リポ酸とのコンジュゲーションを介して２つのチオール基を導入する。あるいは、複数のチオールを、オリゴヌクレオチド（ＩＤＴ、アイオワ）の３’末端または５’末端のいずれかに１個、２個または３個の連続するＤＴＰＡホスホラミダイトと共に導入する。ＤＮＡを官能基化ナノ粒子にコンジュゲートさせるために、適切な相補的コンジュゲーション基（アミン、チオール、ＤＢＣＯ、ＢＣＮ）をオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のいずれかに結合させる。オリゴヌクレオチド配列への酵素オリゴヌクレオチドのアクセス（例えば、試料核酸鎖に相補的な蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が、担体粒子に固定化された鋳型を使用してＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって合成される場合、ポリメラーゼへのアクセス）を容易にするために、コンジュゲーション部分とオリゴヌクレオチドとの間に様々な長さのリンカーが導入される。リンカーの例は、チミジン一リン酸×ｎ（ｎ＝１～４０）、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５および（ＰＥＧ６－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ－）×ｎ（ｎ＝１～１２）であり、ＰＥＧはポリエチレングリコールを意味し、Ｎ＝３、４、５および６のＰＥＧＮはＮ個のエチレングリコール単位のポリマーを意味する。

Ｂ．ＤＮＡの金ナノ粒子へのコンジュゲーション。非環式ジスルフィド基（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＨ（ｎ＝３または６）、１、２または３ ＤＴＰＡ（ＩＤＴより、アイオワ）または（±）－α－リポ酸で３’または５’末端で官能化されたオリゴヌクレオチドを、リン酸緩衝液中ｐＨ７．４で５０倍過剰の還元剤（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）と共に４５分間インキュベートする。還元されたチオール官能化オリゴヌクレオチドを、溶離液としてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５およびミリＱ水を充填したゲル濾過カラムでの脱塩によって精製する。

精製オリゴヌクレオチドを様々なモル比（１００：１、３００：１、５００：１、１０００：１、３０００：１、１００００：１、２００００：１など）で金ナノ粒子（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製の直径１０ｎｍ、１５ｎｍ、５０ｎｍおよび１００ｎｍ）と混合し、ｐＨを５０ｍＭクエン酸塩－ＨＣｌ緩衝液で４．３、または１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ７．４もしくはｐＨ８に調整する。Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を０．０２％、０．０５％または０．１％の最終濃度まで添加するか、またはＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０の代わりにＳＤＳを０．０１％、０．０２５％または０．０５％の最終濃度まで添加する。周囲温度で１～２４時間の初期インキュベーション後、４Ｍ ＮａＣｌを少量ずつ合計濃度１Ｍまで添加する。反応混合物をさらに１～２４時間インキュベートする。必要に応じて、金ナノ粒子上の未反応の表面積をブロックするために（「埋め戻し」とも呼ばれる）、水溶性オリゴ（エチレングリコール）－アルキルチオール（オリゴ（エチレングリコール）はＰＥＧ３またはＰＥＧ６であり、アルキルは（ＣＨ_２）_８－（ＣＨ_２）_１２である）を反応混合物に添加し（チオール修飾オリゴヌクレオチドに対する可変比：１：１、４：１、１０：１、２５：１、１００：１）、反応混合物を１５分～２４時間インキュベートする。オリゴヌクレオチド－ナノ粒子コンジュゲートを、遠心分離および適切な緩衝液（例えば、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ８）による複数回の洗浄によって回収する。さらなる使用の前に、ナノ粒子を同じ洗浄緩衝液中で４℃で保存する。

ＤＮＡローディングの定量化のために、ＫＣＮ／Ｋ_３［Ｆｅ（ＣＮ）_６］混合物またはＤＴＴによるエッチングを介してオリゴヌクレオチドをナノ粒子から放出する。放出されたオリゴヌクレオチドを、染色剤としてＳＹＢＲ（商標）ＧｏｌｄまたはＯｌｉＧｒｅｅｎ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して蛍光光度計で定量する。少なくとも１つの蛍光標識（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８など）デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＵＴＰ）の存在下でのプライマー伸長によって得られる内部標識オリゴヌクレオチドの場合、固有の吸光度または蛍光を、ナノ粒子からのヌクレオチド放出後の定量のための読み出しとして使用する。あるいは、適切に標識された相補的オリゴヌクレオチドの可逆的ハイブリダイゼーションが定量のために使用される。

表４は、蛍光ｄＮＴＰを用いたその後のプライマー伸長に使用するための、または別個に調製されたプライマー伸長産物を用いてアニーリングするための、金ナノ粒子にコンジュゲートされた捕捉部分および／またはプライマーとして異なる量のオリゴヌクレオチド５’－ＧＣＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＴＴＡＴ－３’（上記の配列番号３）を含む担体粒子を用いて得られたＤＮＡローディングデータを示す。

＊Ｔ_４０はチミジンの４０－ｍｅｒである。Ａｕ粒子ベンダーは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ＳＡ）、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ（ＴＰ）およびＣｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｃ）であった。コンジュゲーション条件は、（１）リン酸塩ｐＨ７．４、引き続いて１Ｍ ＮａＣｌで一晩（塩熟成）、または（２）５０ｍＭ クエン酸塩－ＨＣｌ ｐＨ４．３であった。

Ｃ．アミノ官能化ＤＮＡ；アミド結合。カルボン酸官能化ナノ粒子（市販の量子ドット、ポリマーコーティングされた金または酸化鉄ナノ粒子－例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製のＰ／Ｎ ９００２２６、７４７２５４、７６５４８１、９００４７５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＰ／Ｎ Ｑ２１３０１ＭＰ、Ｎａｎｏｃｓ製のＰ／Ｎ ＭＰ２５－ＣＡまたはＯｃｅａｎ Ｎａｎｏｔｅｃｈ製のＰ／Ｎ ＳＣ００５０）を、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８～９）に懸濁し、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ；１００～２０００当量）およびＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ、１００～２０００当量）で、周囲温度にて１～２時間処理する。次いで、アミノ官能化ＤＮＡ（１当量）を混合物に添加する。必要に応じて、４Ｍ ＮａＣｌを、（特定のナノ粒子のコロイド安定性に応じて）０．１５Ｍ～０．５Ｍまで少量ずつ添加する。反応混合物を３～２４時間インキュベートする。ＤＮＡ－ナノ粒子コンジュゲートを、遠心分離およびその後の洗浄によって、またはサイズ排除クロマトグラフィーおよびその後の透析によって精製する。

Ｄ．ＤＢＣＯまたはＢＣＮ官能化ＤＮＡ；銅フリークリック反応結合。カルボン酸官能化ナノ粒子（市販の量子ドット、ポリマーコーティングされた金または酸化鉄ナノ粒子－例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製のＰ／Ｎ ９００２２６、７４７２５４、７６５４８１、９００４７５；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＰ／Ｎ Ｑ２１３０１ＭＰ；Ｎａｎｏｃｓ製のＰ／Ｎ ＭＰ２５－ＣＡまたはＯｃｅａｎ Ｎａｎｏｔｅｃｈ製のＰ／Ｎ ＳＣ００５０）を、上記のプロトコルに従って適切なアジドアミンと結合させる。アジド官能化ナノ粒子（上記で調製した）を、適切な反応緩衝液（１０ｍＭ～５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７～ｐＨ８）中で、３’－または５’－ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）－またはＢＣＮ（ビシクロオクチン）－官能化ＤＮＡ（ＩＤＴから市販されているか、または対応するＮＨＳエステル、例えば、Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＴｏｏｌｓからのＰ／Ｎ Ａ１０２もしくはＢｒｏａｄＰｈａｒｍからのＰ／Ｎ ＢＰ－２２８５１との結合を介して３’－もしくは５’－アミノ官能化ＤＮＡから調製される）と混合する。必要に応じて、４Ｍ ＮａＣｌを、（特定のナノ粒子のコロイド安定性に応じて）０．１５Ｍ～０．５Ｍまで少量ずつ添加する。反応混合物を３～２４時間インキュベートする。ＤＮＡ－ナノ粒子コンジュゲートを、遠心分離およびその後の洗浄によって、またはサイズ排除クロマトグラフィーおよびその後の透析によって精製する。

Ｅ．チオール官能化ＤＮＡ；マレイミドへのマイケル付加。アミン官能化ナノ粒子（市販の量子ドット、ポリマーコーティングされた金または酸化鉄ナノ粒子－例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製のＰ／Ｎ ９００２９０、７６５３４１、７４７３２７）を、確立されたプロトコル（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に従ってｐＨ７．０～ｐＨ７．４でスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）と結合させる。マレイミド官能化ナノ粒子（市販品、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製の９００４６１、または上記で調製）を、１０ｍＭ－５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０～ｐＨ７．４中でチオール官能化ＤＮＡ（ＴＣＥＰまたはＤＴＴで脱保護し、上記のように精製する）と混合する。必要に応じて、４Ｍ ＮａＣｌを、（特定のナノ粒子のコロイド安定性に応じて）０．１５Ｍ～０．５Ｍまで少量ずつ添加する。反応混合物を０．５～２４時間インキュベートする。ＤＮＡ－ナノ粒子コンジュゲートを、遠心分離およびその後の洗浄によって、またはサイズ排除クロマトグラフィーおよびその後の透析によって精製する。
実施例２
ソリッドステート基材

基材の調製。ウエハの各側に低圧化学気相成長（ＬＰＣＶＤ）によって堆積された３０ｎｍのＳｉＮ層を有する厚さ３００μｍの１００ｍｍの両面研磨シリコンウエハ（例えば、バージニア州ＦｒｅｄｅｒｉｃｋｓｂｕｒｇのＶｉｒｇｉｎｉａ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ製、またはバージニア州ローグバレーのＲｏｇｕｅ Ｖａｌｌｅｙ製）を準備する。負の電子ビームレジストが各側でスピンされ、次いで、ウエハの一方の側（「前面」側）のレジストが電子ビームリソグラフィ（ＥＢＬ）装置で露光されて、その側のＳｉＮ層上に反応ウェルをパターン化する。その後、レジストを現像し、未露光のレジストを除去する。クロムまたはチタンの５ｎｍの接着層が、ｅビーム蒸着によって、続いて選択された厚さの不透明金属層（例えば、２００ｎｍのＡｕまたはＡｌ）のウエハの前面上へのｅビーム堆積によって、ウエハの前面に堆積される。次いで、ウエハは、残っている露光レジストを前面から除去する溶液中に配置され「リフトオフ」、４０～１２０ｎｍの直径および１００～２５０のウェル深さ、またはユーザの好みに応じた他の寸法を有する反応ウェルを金属膜層内に残す。

次いで、ウエハの裏面（パターン化されていない）側を、ポジ型レジストを用いた従来のフォトリソグラフィによってパターン化して、前面ＥＢＬ特徴と位置合わせされた正方形の窓を露出させる。これらの特徴は、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）を用いてウエハの裏面のＳｉＮ層を貫通してＳｉ層までエッチングされる。次いで、ウエハは、金属コーティング面をＫＯＨ溶液から保護するＯリングを有するホルダに取り付けられ、次いでＫＯＨ溶液に浸漬され、これは反対側のＳｉＮ膜に達するまで（１００）面を優先的にエッチングし、その結果、ＳｉＮ層に開口しているウエハの前面に反応ウェルを有する自立型ＳｉＮ＋金属基材が得られる。

反応ウェルに整列した貫通孔の製造。次いで、上述の基材を集束イオンビーム（ＦＩＢ）装置（例えば、ヘリウムを用いたＧＦＩＳモードのＺｅｉｓｓ Ｏｒｉｏｎ ＮａｎｏＦａｂ）にロードして、各反応ウェルの底部に貫通孔を形成する。貫通孔は、前述のように自立ＳｉＮ膜中でミリングされる（Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｍｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｓｉｌｉｃｏｎ ｎｉｔｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｆｏｃｕｓｅｄ ｈｅｌｉｕｍ ｉｏｎ ｂｅａｍ．Ｓｃａｎｎｉｎｇ ３４：１０１－１０６（２０１２））。簡潔には、イオンビームが整列され、ミリングされる基材がツールに焦点を合わせる。所望の最終サイズおよび形状を目標とするために、所与の滞留時間および基材の厚さに対するビーム電流の間、基材内の点を露出させるか、または基材内の形状をラスタリングすることによって、基材の自立ＳｉＮ層に貫通孔がフライス加工される。小さな貫通孔を製造することができる他のツールには、ＴＥＭおよび他の様々なＦＩＢ（例えば、ガリウムまたはガスフィールドイオンソース（ＧＦＩＳ）ネオン）が含まれる。貫通孔はまた、より大きな反応ウェルを作製した後に（上記の基材準備セクションで説明したように）第２のＥＢＬパターニングステップを重ね合わせることによってリソグラフィ的に形成されてもよい。第１の特徴上に第２の特徴を重ね合わせると、より小さい第１の特徴（貫通孔）と同心円状に位置合わせされた第２の特徴（反応ウェル）からなるパターンが得られる。得られたパターンは直接使用されてもよく、または第２の特徴が所望の最終サイズよりも大きい場合、ＨｆＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、ＳｉＯ_２、ＴｉＯ_２、ＳｉＮ、またはＰｔなどの膜の原子層堆積（ＡＬＤ）によってサブナノメートル精度で減少させることができる。
実施例３
エキソヌクレアーゼ的に放出されたモノヌクレオチドの検出

Ａ．蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の形成 二本鎖蛍光標識ＤＮＡを、５’－ビス－ビオチン化プライマーの鋳型依存性ポリメラーゼ媒介伸長によって調製した。５’－ビス－ビオチン化プライマーは、ストレプトアビジンへの非共有結合性結合を増強するためにその５’末端に結合した２つのビオチン基を含んでいた。

ビス－ビオチン部分の構造は以下の通りであり、３’－ホスフェートはプライマーの５’末端ヌクレオチドの５’－ヒドロキシルに結合している：

。

プライマーのヌクレオチド配列は、

であった。

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）鋳型（「ＨＢＶ－ｐｏｓ＝１９８０」と呼ばれる）の配列は：

であった。

鋳型の最初の１８０個の５’ヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムのヌクレオチド１９８０～２１５９に対応していた。鋳型の最後の２０個の３’末端ヌクレオチド（下線）は、プライマー配列に相補的であった。鋳型の最後の５つの３’末端ヌクレオチドは、鋳型の３’末端のエキソヌクレアーゼ分解を阻害するためのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含有するように合成された。

鋳型依存性プライマー伸長を、以下の条件下でＡＴＰ、ＧＴＰ、Ｃｙ３ｂ－ｄＣＴＰおよびＣｙ５－ｄＵＴＰの存在下で行った：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ－１００、ｐＨ８．８、２５℃、１ｍＭ ＤＴＴ、１％ホルムアミド（ｖ／ｖ）、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．８マイクロモルＤＮＡ鋳型および２つのマイクロモルプライマー。これにより、相補的プライマー伸長産物にハイブリダイズしたＨＢＶ鋳型配列を含む二本鎖核酸が得られ、プライマー伸長産物は、蛍光標識されたシチジン塩基およびウリジン塩基を含む蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含んでいた。

配列番号５（非標識プライマーに由来する最初の５’末端の２０個のヌクレオチドを無視する）の最初の１８０個の５’－ヌクレオチドの相補配列に対応するプライマー伸長産物の蛍光標識部分の予測配列は：

であった。

Ｂ．例示的な担体粒子への蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の結合。５０ｎｍの平均直径を有するストレプトアビジンコーティング酸化鉄ナノ粒子（Ｏｃｅａｎ Ｎａｎｏｔｅｃｈ製の部品番号ＳＶ００５０）を、様々なモル比（１０：１、５：１、２：１、１：１）で反応緩衝液（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１３４ｍＭ 塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ７．４）中でビオチン官能化ＤＮＡと混合した。Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を最終濃度０．０１％（ｖ／ｖ）に添加し、結合（コンジュゲーション）反応混合物を２５０ｒｐｍで振盪しながら２５℃で４～１４時間インキュベートした。コンジュゲーション反応が完了した後、反応混合物を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ナノ粒子を含まないＤＮＡ含有上清を除去した。ＤＮＡ－ナノ粒子コンジュゲートを、（１）遠心分離、（２）０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有する１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４でのその後の遠心洗浄、および（３）同じ洗浄緩衝液中への再懸濁によってさらに精製した。ＤＮＡコンジュゲート化ナノ粒子を４℃で保存した。

Ｃ．反応ウェルへの蛍光標識ポリヌクレオチド鎖のローディング シス側およびトランス側を含むソリッドステート基材を、上記の技術を使用して調製した。ソリッドステート基材は、約４０ｎｍの内径および約３１５ｎｍのウェル深さを有する半径方向に対称な側壁を有する反応ウェルの４×４の正方形アレイを含んでいた。反応ウェルの側壁は、基材内に画定された膜のイオン衝撃によって形成され、膜は、トランス側からシス側に向かって、（１）アルミニウム（２５０ｎｍ）、（２）チタン（１５ｎｍ）、および（３）ＳｉＮ（３０ｎｍ）の平面層を含む。さらに、膜のトランス側およびシス側、ならびに反応ウェルの内側側壁を、原子層堆積によって添加された厚さ１０ｎｍのＳｉＯ_２コーティングでコーティングした。この例では、近位貫通孔の内径、半径方向に対称な側壁によって囲まれた反応容積、および各反応ウェルの遠位開口部はほぼ同じであった。

反応ウェルは、ｘおよびｙ方向に１５００ｎｍのピッチで互いに分離した。ソリッドステート基材を、基材のシス側およびトランス側が流体的にアクセス可能であるように配列決定カートリッジに組み立てた。配列決定カートリッジ内のソリッドステート基材は、ソリッドステート基材のトランス側の反応ウェルの遠位開口部が顕微鏡対物２２２を通過した励起レーザビームの焦点になるように、図２の基材２０２について概略的に示すように配置された。対物に近い流体チャンバは、トランスチャンバと呼ばれ、遠位チャンバは、シスチャンバと呼ばれる。各チャンバを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有する反応緩衝液で満たし、次いで、同じ緩衝液中の２５ ｐｍｏｌｅのＤＮＡコンジュゲート担体粒子をシスチャンバに添加した（約７本のＤＮＡ鎖／ナノ粒子を有する最終濃度１００ｐＭナノ粒子）。

チャンバは、２つの電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ_２電極）を介して電気的に接続されていた。これらの電極を使用して、ＤＮＡコンジュゲート化ナノ粒子をナノポア反応ウェルに電気泳動的に輸送するために基材にわたってシス－トランス３００ｍＶ電圧バイアスを印加し、その結果、担体粒子に結合した負に帯電した蛍光標識ポリヌクレオチド鎖（ｄｓＤＮＡ複合体中の相補的鋳型鎖にハイブリダイズした）を、近位貫通孔を通して、かつ反応ウェルの反応容積内に電気泳動的に引き込んだ。

担体粒子による近位貫通孔の閉塞を、約１０００ｎＡｍｐの開始（開栓）電流から約２００ｎＡｍｐ未満の電流までのシス－トランス電流を、電流の変化速度が定常に達したときに測定することによって監視した。１６個すべてのウェルの閉塞は約３０秒で完了した。担体粒子の直径が反応ウェルの直径よりも大きいため、担体粒子が基材のシス側からトランス側へ反応ウェルを通過することを防止した。さらに、担体粒子には蛍光標識ポリヌクレオチド鎖がまばらにロードされていたので、各反応ウェルには１本以下の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖がロードされた。

反応ウェルの近位貫通孔を塞ぎ、蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を反応ウェルにロードした後、トランスチャンバ緩衝液を、以下のエキソヌクレアーゼ反応緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０％～７０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび２０ｎＭ 大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩで、置き換えた。

エキソヌクレアーゼ反応緩衝液を導入した直後に、基材のトランス側のレーザ照射および反応ウェルの遠位端からの蛍光発光のカメラ記録を開始した。発光シグナル検出のためのカメラフレームレートは、通常、２００～５００フレーム／秒（ｆｐｓ）の間であり、５３５ｎｍおよび６４８ｎｍにおけるレーザ光強度は、通常、５ｍＷａｔｔ～１５ｍＷａｔｔであった。

図３は、本実施例のセクションＡに記載したように調製したｄｓＤＮＡ ＨＢＶ配列複合体の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖（配列番号６）の３’末端のエキソヌクレアーゼ切断から最初の９つのヌクレオチドについて得られた例示的な配列決定プロファイルを示す。相対蛍光単位（ｒｆｕ）の蛍光を時間（秒）の関数としてプロットする。検出時間、蛍光発光ピーク強度、発光色（Ｃｙ３ｂ－ｄＣＴＰ＝５７１ｎｍ＝赤色）、およびＣｙ５－ｄＵＴＰ＝６７０ｎｍ＝緑色）を以下の表５にまとめる（Ｃはシチジンであり、Ｕはウリジンである）。

図から分かるように、蛍光シグナルの時間順序および蛍光発光波長は、その蛍光標識された鎖の最初の３’－モノヌクレオチドから出発して、配列番号６のシチジルおよびウリジルヌクレオチドの順序（３’から５’方向）と一致した。３’－エキソヌクレアーゼによって切断された様々なモノヌクレオチドについて測定された蛍光シグナル強度の変動は、個々のフルオロフォアのランダムな光退色時間に部分的に依存していた。放出された蛍光標識モノヌクレオチド間の可変時間間隔は、ＤＮＡの一分子エキソヌクレアーゼ消化の確率論的性質を反映し、この実験の条件下で１～３秒あたり約１個のモノヌクレオチドが放出される触媒切断速度と一致する。

本開示は、記載された特定の形態の範囲に限定されることを意図するものではなく、本明細書に記載された変形形態の代替形態、修正形態、および均等物を包含することを意図している。さらに、本開示の範囲は、本開示を考慮して当業者に明らかになり得る他の変形を完全に包含する。

Claims (29)

1. ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
   （ａ）シス側およびトランス側を含むソリッドステート基材であって、前記基材が、反応容積を画定し、かつ
   （ｉ）前記基材の前記シス側と前記トランス側との間に延在する近位貫通孔と、
   （ｉｉ）１またはそれを超える側壁と、
   （ｉｉｉ）遠位開口部と、を含む、反応ウェルを含み、
   前記ソリッドステート基材が、励起光が前記反応容積内に浸透すること、および前記基材の前記シス側に浸透することを実質的にブロックする不透明金属層をさらに含む、ソリッドステート基材と、
   （ｂ）担体粒子に結合した蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含む前記担体粒子であって、前記蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が、
   （ｉ）前記担体粒子に結合した近位端と、
   （ｉｉ）エキソヌクレアーゼによって切断可能な遠位端と、
   （ｉｉｉ）蛍光標識を含む少なくとも１つの蛍光標識ヌクレオチドと、を含み、
   前記担体粒子は、前記基材の前記シス側に位置するが、前記貫通孔を通過せず、その結果、前記蛍光標識ポリヌクレオチド鎖は、前記貫通孔を通って突出し、その結果、前記蛍光標識ポリヌクレオチド鎖の前記遠位端は、前記反応容積内にある、担体粒子と、を提供することと、
   前記蛍光標識ポリヌクレオチド鎖をエキソヌクレアーゼと反応させることであって、その結果、モノヌクレオチドが前記鎖の遠位端から連続的に放出され、前記遠位開口部を通って前記反応容積から拡散することと、
   前記反応中に、前記基材の前記トランス側を励起光で照射することであって、前記反応ウェルの前記遠位開口部に隣接する蛍光励起ゾーンを作製し、その結果、前記励起ゾーン内の蛍光標識モノヌクレオチドが蛍光シグナルを放出することと、
   時間の関数として蛍光シグナルを検出することと
   を含み、
   それにより、放出された蛍光標識モノヌクレオチドから検出された蛍光シグナルの時間順序からヌクレオチド配列が決定される、方法。
2. 前記反応ウェルの前記遠位開口部が、少なくとも３０ｎｍの最小直径を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
3. 前記反応ウェルの前記遠位開口部が、５０～１５０ｎｍの最小直径を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
4. 前記反応ウェルの前記１またはそれを超える壁がテーパーになっていない、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記反応ウェルの前記１またはそれを超える壁が、実質的に円筒形である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記不透明金属層が、金またはアルミニウムを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記不透明金属層が、１００ｎｍ～６００ｎｍの厚さを有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記反応ウェルが、少なくとも２００ｎｍのウェル深さを有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記反応ウェルが、２００ｎｍ～１０００ｎｍのウェル深さを有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記反応容積中の前記蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が、少なくとも１００個の連続ヌクレオチドを含有する蛍光標識されたポリヌクレオチドセグメントを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記貫通孔が、少なくとも２ｎｍの最小直径を有する、請求項１に記載の方法。
12. 前記貫通孔が、２ｎｍ～５０ｎｍの最小直径を有する、請求項１に記載の方法。
13. 前記基材が、前記近位貫通孔を含み、２０ｎｍ～５０ｎｍの厚さを有する薄膜層を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記薄膜層が、窒化ケイ素を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記励起光が３８０ｎｍまたはそれを超える波長を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記ソリッドステート基材が、前記反応容積を画定する表面部分（単数または複数）を含み、前記表面部分（単数または複数）が、少なくとも１つの表面不動態化コーティングを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記反応ウェルの１またはそれを超える側壁が、酸化ケイ素コーティングおよび酸化アルミニウムコーティングのうちの少なくとも１つのものを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が、少なくとも２つの異なる種類のヌクレオチドを含み、それぞれの種類が識別蛍光標識で標識されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記反応の間、前記担体粒子は、電圧バイアスによって前記近位貫通孔の隣に維持される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記反応の後、前記電圧バイアスを停止して前記担体粒子を前記近位貫通孔から離れるようにし、その結果、前記残りの蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が前記反応容積から除去され、次いで、電圧バイアスを印加して、同じまたは異なる担体粒子を前記近位貫通孔に向かって移動させ、その結果、新しい蛍光標識ポリヌクレオチド鎖がエキソヌクレアーゼと反応するために前記反応ウェルに送達される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記担体粒子が磁気を帯びてない、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記担体粒子が磁気を帯びている、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記反応容積中の前記蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が二本鎖核酸を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記反応容積中の前記蛍光標識ポリヌクレオチド鎖が一本鎖核酸を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記担体粒子が、複数の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記担体粒子が、互いに異なるポリヌクレオチド配列を有する複数の蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記ソリッドステート基材が複数の反応ウェルを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記複数の反応ウェルが、一次元または二次元アレイとして構成される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記複数の反応ウェルのうちの２またはそれを超えるものがそれぞれ、配列決定されるべき蛍光標識ポリヌクレオチド鎖を含有する、請求項２７または２８に記載の方法。

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