CN109154021A - 数字邻近试验 - Google Patents

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Abstract

提供了确定样品中靶标是否存在的方法。还提供了进行本文所述方法的试剂盒。

Description

数字邻近试验
本申请要求2016年5月25日提交的美国申请62/341,550的权益，该申请通过引用整体并入本文。
背景技术
邻近试验允许对样品中的一种或多种分析物进行灵敏、快速和方便的检测或定量。邻近试验采用一对寡核苷酸标记的抗体来检测特异性靶标。设计寡核苷酸以直接或通过接头杂交，以在2个抗体同时结合靶标时形成新DNA模板。然后使用实时聚合酶链反应(PCR)来检测所得的DNA模板。为了对靶标的量进行定量，使用标准曲线来将Cq值与DNA模板和由此与靶标浓度相关联。
在邻近试验中，背景信号的主要来源是由于不与靶标结合的2个寡核苷酸探针的自发结合。为了最小化背景，在较低的探针浓度下进行邻近试验。因此，生成的DNA模板的最终数量低于靶分子的实际数量。这可能限制试验的灵敏度。
发明内容
本文公开了检测样品中是否存在靶标的方法。
在一个实施方式中，方法包括使样品和与固体支持物连接的第一亲和剂接触，其中所述第一亲和剂特异性结合靶标上的第一表位；洗涤固体支持物；用含有能够特异性结合靶标上的第二表位的第二亲和剂和能够特异性结合靶标上的第三表位的第三亲和剂的溶液孵育固体支持物，其中第二亲和剂附着于第一寡核苷酸并且第三亲和剂附着于第二寡核苷酸，第二寡核苷酸能够在第一和第二寡核苷酸紧密靠近时与第一寡核苷酸直接或间接相互作用；使第一和第二寡核苷酸通过以下相互作用：(a)与第一和第二寡核苷酸各自的至少一部分互补的第三寡核苷酸的杂交，然后连接第一寡核苷酸与第二寡核苷酸，或(b)第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交；洗涤固体支持物；任选形成DNA模板；释放DNA模板并形成包含DNA模板的溶液；从溶液形成多个分区，其中分区的亚组含有DNA模板；扩增分区的亚组中的DNA模板；并通过检测多个分区中是否存在扩增的DNA模板来检测样品中是否存在靶标。在一些实施方式中，该方法还包括通过确定包含靶标的分区的数量和分区的总数来对靶标进行定量。
在一些实施方式中，第一、第二和第三表位至少部分重叠。在一些实施方式中，第二表位位于第一靶标上并且第三表位位于第二靶标上(例如，具有不同亚基的蛋白质)。在一些实施方式中，靶标(例如，二聚体蛋白质或聚集体形成蛋白质)具有重复的相同表位，使得第一和第二亲和剂或第一和第三亲和剂识别相同表位。
在一些实施方式中，多个分区各自是液滴。在一些实施方式中，形成DNA模板的步骤包括延伸第三寡核苷酸的3’末端。在某些实施方式中，形成DNA模板的步骤包括延伸第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸的3’末端。在一些实施方式中，第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交包括形成DNA模板步骤。
在一些实施方式中，第二和第三亲和剂的浓度至少等于第一亲和剂的浓度。在某些实施方式中，释放步骤包括通过限制性内切酶切割DNA模板中的位点。在一些实施方式中，释放步骤包括DNA模板的物理、化学或酶促切割。在一些实施方式中，释放步骤包括通过蛋白酶或通过pH的变化来切割亲和剂-寡核苷酸复合物的至少一部分。
在一些实施方式中，扩增步骤包括PCR。在一些实施方式中，靶标是蛋白质或蛋白质聚集体。在某些实施方式中，第一、第二和第三亲和剂各自是抗体或抗体片段。在一些实施方式中，固体支持物是颗粒或反应容器的表面。
在一些实施方式中，用于检测样品中靶标是否存在的试剂盒包含与固体支持物连接的第一亲和剂，其中所述第一亲和剂特异性结合靶标上的第一表位；和第二亲和剂，其能够特异性结合靶标上的第二表位；以及第三亲和剂，其能够特异性结合靶标上的第三表位，其中第二亲和剂与第一寡核苷酸偶联并且第三亲和剂与第二寡核苷酸偶联，第二寡核苷酸能够在第一和第二寡核苷酸紧密靠近时直接或间接与第一寡核苷酸相互作用。在一些实施方式中，试剂盒还包含由以下组成的至少一种组分：连接酶，限制性内切酶，DNA聚合酶，dNTP，缓冲剂，PCR主混合物，和用于进行检测样品中靶标的方法的说明书。
附图说明
图1是显示根据本发明的一个实施方式确定是否存在靶标的方法的流程图。
图2显示了根据本发明的一个实施方式确定是否存在靶标的方案。
具体实施方式
本文公开了确定样品中是否存在靶标的方法。描述了数字邻近试验方法，可采用该方法确定靶标的浓度而不需要标准曲线。也已经发现数字邻近试验方法具有降低的靶标不相关寡核苷酸探针结合的背景。
定义
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICTIONARY OF CELLAND MOLECULAR BIOLOGY(《细胞和分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(第4版2007)；Green等，MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL(《分子克隆，实验室手册》)(第4版)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约2012)。
术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。
如本文所用，“核酸”意指包含核苷酸单体链的化合物。核酸可以是单链或双链(即，与另一种核酸碱基配对)等。核酸链可以由任何合适数量的单体组成，例如至少约十或一百个。通常，核酸链的长度对应于其来源，合成核酸(例如，核酸试剂，例如引物和探针)通常较短，并且生物学产生的核酸(例如，核酸分析物)通常较长。
核酸可具有天然或人工结构，或其组合。有天然结构的核酸，即脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，具有交替的戊糖基团和磷酸基团的骨架。每个戊糖基团与核碱基(例如嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(T))或嘧啶(例如胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)))连接。具有人工结构的核酸是天然核酸的类似物，并且可以例如通过改变天然骨架的戊糖和/或磷酸基团来产生。示例性人工核酸包括乙二醇核酸(GNA)，肽核酸(PNA)，锁核酸(LNA)，苏糖核酸(TNA)等。类似地，具有人工结构的核酸是天然核酸的类似物，并且可例如由核碱基的变化产生。示例性的人工和非天然存在的核碱基包括，但不限于卤代核碱基(5-FU)，次黄嘌呤，黄嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，肌苷，黄嘌呤核苷，7-甲基鸟嘌呤，5，6-二氢尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，二氢尿苷和5-甲基胞苷。
核酸的序列由核碱基沿骨架排列的顺序定义(一般从5’到3’端读取)。该序列通常决定核酸通过氢键特异性结合伴侣链(或形成分子内双链体)的能力。具体地，腺嘌呤与胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对。通过与另一种核酸形成连续的腺嘌呤-胸腺嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对，可以以反平行方式与另一种核酸结合的核酸被称为“互补的”。
术语“标记物”、“可检测标记物”和“标记试剂”可互换地指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记包括荧光染料(荧光团)、荧光猝灭剂、发光剂、高电子密度试剂、酶(例如ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛、32P和其它同位素、半抗原、蛋白质、核酸或可被检测的其他物质，例如通过将标记整合至与目标分子特异性反应的抗体、肽或寡核苷酸中。该术语包括单一标记试剂的组合，例如，提供独特可检测特征(例如，特定波长或波长组合下)的荧光团的组合。可检测标记物也可包括报告物和猝灭剂的组合。
“连接”至标记物的分子(例如本文所述标记的核酸)是共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子、范德华力、静电或氢键)地结合标记物的分子，从而可通过检测与该分子结合的标记物来检测是否存在该分子。
术语“报告物”是指物质或其部分，其能够显示可检测信号，该信号可被猝灭剂抑制。报告物的可检测信号是，例如，可检测范围内的荧光；因此，报告物也可以是标记物。
术语“猝灭剂”是指能够抑制、降低、阻遏(等)由报告物产生的可检测信号的物质。
本文所用术语“猝灭”是指一种过程，其中当报告物和猝灭剂紧密靠近并且报告物被能源激发时，激发状态的大部分能量非辐射地转移到猝灭剂，其中其非辐射地消散或者在与报告物不同的发射波长下发射(例如，通过荧光共振能量转移或FRET)。
报告物可选自用合适的连接基团修饰的荧光有机染料，该连接基团用于附着寡核苷酸，例如，附着至3′或5′末端。猝灭剂也可选自有机染料，其可以是或不是荧光的，取决于本发明的实施方式。一般而言，无论猝灭剂是荧光的或通过非辐射衰减简单释放来自报告物的转移的能量，猝灭剂的吸收带至少基本与报告物的荧光发射带重叠以优化猝灭。
非荧光猝灭剂或暗猝灭剂一般通过吸收来自激发的报告物的能量来发挥功能，但不辐射释放能量。
可以根据已知技术来选择特定探针的合适报告物-猝灭剂对。荧光和暗猝灭剂及其相关的光学性质(可从中选择示例性报告物-猝灭剂对)列示并描述于，例如，R.W.Sabnis，《荧光染料和探针手册》(HANDBOOK OF FLUORESCENT DYES AND PROBES)，约翰韦利森出版社(John Wiley and Sons)，新泽西州(New Jersey)，2015，其内容通过引用纳入本文。
报告物-猝灭剂对可选自包括荧光素和若丹明染料的氧杂蒽染料。这些化合物的许多合适形式可商购获得，在苯基上具有取代基，其可用作键合位点或用作附着寡核苷酸的键合官能团。用作报告物的另一组荧光化合物是萘胺，具有α或β位的氨基。这些萘氨基化合物包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸盐，1-苯胺基-8-萘磺酸盐和2-对甲苯氨基-6-萘磺酸盐。其他染料包括3-苯基-7-异氰酸酯香豆素；吖啶如9-异硫氰酸酯吖啶；N-(对-(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺；苯并噁二唑；芪；芘等。
猝灭剂的合适示例可选自6-羧基-四甲基-若丹明，4-(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABYL)，四甲基若丹明(TAMRA)，BHQ-OTM，BHQ-1 TM，BHQ-2TM和BHQ-3TM，每个都可以从加利福尼亚州诺瓦托的生物研究技术公司(Biosearch Technologies，Inc.)获得，Qy7TMQSY-9TM，QSY-21 TM和QSY-35TM，每个都可以从分子探针公司(Molecular Probes，Inc)获得。
报告物的合适实例可选自染料，例如SYBR绿，5-羧基荧光素(5-FAMTm，购自加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(Applied Biosystems))，6-羧基荧光素(6-FAM)，四氯-6-羧基荧光素(TET)，2，7-二甲氧基-4，5-二氯-6-羧基荧光素，六氯-6-羧基荧光素(HEX)，6-羧基-2′，4，7，7′-四氯荧光素(6-TETTm，购自应用生物系统公司)，羧基-X-若丹明(ROX)，6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素(6-JOETM，购自应用生物系统公司)，购自分子探针公司(Molecular Probes，Inc.)的VICTM染料产品，购自应用生物系统公司的NEDTM染料产品，购自生物研究公司的Cal Fluor染料产品(例如，Cal Fluor Gold 540，Orange 560，Red 590，Red 610，Red 635)，购自生物研究公司的Quasar染料产品(例如，Quasar 570，670，705)等。
“靶标”或“靶分析物”(在本文中可互换使用)是指要确定其存在和/或量的任何试剂。在一些实施方式中，靶标可以是几种靶标的混合物。在一些实施方式中，要确定不同靶标的存在或浓度分布。
靶标可以是任何生物和/或化学试剂(即分子/大分子/复合物/缀合物)。在一些实施方式中，靶标是有机或无机分子。在一些实施方式中，靶标是生物试剂。
在一个实施方式中，靶标是蛋白质，蛋白质聚集体，多肽或肽。在一些实施方式中，蛋白质聚集体包含超过一种蛋白质(例如，超过一种靶标)。在一些实施方式中，蛋白质具有超过一个相同或不同的亚基，其可以或可以不彼此共价结合。靶标可以是激素，抗体，氨基酸(例如谷氨酸，天冬氨酸)或其任何衍生物和/或组合。在一些实施方式中，靶标是毒素或药物。在一些实施方式中，靶标的量以微克计。在一些实施方式中，靶标的量低于1微克。在一些实施方式中，靶标的量以纳克计。在一些实施方式中，靶标的量在100ng至1ng之间。在一些实施方式中，靶标的量在100pg至1pg之间。在某些实施方式中，靶标的量在1pg至1fg之间。
术语“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含能够非共价、可逆并以特定方式结合相应抗原的免疫球蛋白的片段的多肽。该术语包括但不限于：源自人或其它哺乳动物细胞的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM同种型类的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移接和体外生成的抗体。该术语包括偶联物，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白(如嵌合或双特异性抗体或单链Fv’s(scFv’s))以及片段(如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb和其他组合物)。
示范性免疫球蛋白(抗体)的结构单元包含四聚体。各四聚体包含相同的两对多肽链，每对包含一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端确定约100至110个或更多个氨基酸构成的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别指这些轻链和重链。可变区含有抗体的抗原结合区(或其功能性等价物)并且对于结合的特异性和亲和性是至关重要的。参见Paul，Fundamental Immunology(《基础免疫学》)(2003)。
抗体可以完整的免疫球蛋白形式或任何包含特异性抗原结合活性的多种已充分表征片段的形式存在。这样的片段可以通过用多种肽酶消化来产生。胃蛋白酶在铰链区中的二硫键以下消化抗体，产生Fab的二聚体F(ab)′2，Fab本身是由二硫键接合到VH-CH1的轻链。可在温和条件下还原F(ab)′2以打断铰链区中的二硫键，从而将F(ab)′2二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体实质上是具有铰链区部分的Fab。虽然根据对完整抗体的消化定义了多种抗体片段，但是本领域技术人员会理解，这类片段也可用化学方法或重组DNA方法从头合成。因此，本文中所用术语抗体，也包括通过修饰整个抗体而生成的抗体片段，或用重组DNA方法从头合成所产生(例如，scFv)，或使用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段(参见如McCafferty等，Nature 348：552-554(1990))。制备抗体的方法是本领域已知的；参见例如Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(《单克隆抗体和癌症治疗》)，第77-96页，ARL公司(Alan R.Liss，Inc.)1985。
本文中，术语“Fv”指单价或双价可变区片段，并可仅包括可变区(如VL和/或VH)，以及较长的片段，如Fab、Fab’或F(ab’)2，其还可包含CL和/或CH1。除非另有说明，术语“Fc”指包含CH1和CH2区的重链单体或二聚体。
术语“划分”或“划分的”指将水性溶液样品分隔为多个部分或“分区(partitions)”，该水性溶液含有一种或多种样品和反应物。分区可以是固体或流体。在一些实施方式中，分区是固体分区，例如微通道或微孔。在一些实施方式中，分区是流体分区，例如液滴。在一些实施方式中，流体分区(如液滴)是不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，流体分区(如液滴)是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。
方法
参照图1和图2，现在将描述确定样品中是否存在靶标的方法100。一些步骤可以任意顺序、任意组合实施，并且可与本公开的任意其他合适的方面进行组合或改进。
在示例性步骤110中，使样品与连接至固体支持物的第一亲和剂(例如，抗体或抗体片段)接触，其中第一亲和剂特异性结合靶标上的第一表位。在一些实施方式中，将样品与第一亲和剂一起孵育，以留出第一亲和剂捕获或结合靶标的时间。在一些实施方式中，将样品与第一亲和剂一起孵育一小时或更长时间。在一些实施方式中，在使样品与连接至固体支持物的第一亲和剂接触之前，用封闭剂处理固体支持物以防止材料与支持物的非特异性结合。示例性的封闭剂包括但不限于蛋白质(例如，脱脂乳或牛血清白蛋白)和洗涤剂(例如吐温20或曲通X-100)。
在一些实施方式中，所述样品是生物样品。生物样品可获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、细菌或任何其他有机体。在一些实施方式中，该生物样品来自动物，例如哺乳动物(如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(如鸡)、或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液、血液成分或血液产品(如血清、血浆、血小板、血红细胞等)、痰液或唾液、组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物、外植体，转化的细胞、干细胞、粪便或尿液。其他样品是非生物样品，可包括但不限于水和空气。
在一些实施方式中，可制备样品以改进靶标的有效检测。例如，在一些实施方式中，可对样品进行片段化、分馏、匀化或超声。在一些实施方式中，可从样品(如生物样品)中提取或分离感兴趣的靶标或含有感兴趣的靶标的子组分。在一些实施方式中，富集样品中存在的一种或多种靶标。在一些实施方式中，通过亲和方法在样品中富集靶标，例如免疫亲和富集。在一些实施方式中，使用尺寸选择(如除去非常小的片段或分子或非常长的片段或分子)在样品中富集靶标。
示例性固体支持物包括但不限于颗粒(例如聚合物或磁珠)或反应容器(例如管或孔)的表面。在一些实施方式中，在附着第一亲和剂抗体(例如，基于疏水和其他相互作用，通过非共价吸附将抗体附着于基材)之前未对固体支持物进行化学修饰。在某些实施方式中，在附着第一亲和剂之前对固体支持物进行化学修饰。示例性的化学修饰的固体支持物可以具有附连的羧基或胺基，并且这些基团可以用于共价结合第一亲和剂。在一些实施方式中，第一亲和剂通过碳二亚胺介导的化学作用与固体支持物附连以形成酰胺键。在一些实施方式中，通过化学或光化学反应增强第一亲和剂与固体支持物的附着。在某些实施方式中，第一亲和剂通过化学或光化学反应永久附着于固体支持物。在一些实施方式中，在将第一亲和剂附着于固体支持物后使固体支持物失活以防止其他试剂结合。例如，固体支持物上的活性羧基可以用乙醇胺失活。
在示例性步骤120中，用洗涤溶液(例如，含有洗涤剂如吐温20或曲通X-100的缓冲液)洗涤固体基材以除去未结合的物质。
在示例性步骤130中，将固体支持物与具有能够特异性结合靶标上的第二表位的第二亲和剂和能够特异性结合靶标上的第三表位的第三亲和剂的溶液孵育，其中第二亲和剂附着于第一寡核苷酸，第三亲和剂附着于第二寡核苷酸，该第二寡核苷酸在第一和第二寡核苷酸紧密靠近时能够与第一寡核苷酸直接或间接相互作用。在一些实施方式中，第一、第二和第三表位至少部分重叠。在一些实施方式中，第二表位位于第一靶标上，第三表位位于第二靶标上。在一些实施方式中，靶标(例如，二聚体蛋白质或聚集体形成蛋白质)具有重复的相同表位，使得第一和第二亲和剂或第一和第三亲和剂识别相同表位。
在一些实施方式中，第二和第三亲和剂是抗体或抗体片段。在某些实施方式中，第二和第三亲和剂的浓度至少等于第一亲和剂的浓度。
在示例性步骤140中，允许第一和第二寡核苷酸通过以下相互作用：(a)与第一和第二寡核苷酸中各自的至少一部分互补的第三寡核苷酸的杂交，然后连接第一寡核苷酸与第二寡核苷酸；或(b)第一寡核苷酸与第二寡核苷酸的杂交。
在示例性步骤150中，再次用洗涤溶液(例如，含有洗涤剂如吐温20或曲通X-100的缓冲液)洗涤固体基材以除去未结合的物质。
在示例性步骤160中，形成了DNA模板。在一些实施方式中，通过将第三寡核苷酸与第一和第二寡核苷酸杂交，然后连接第一和第二寡核苷酸来形成DNA模板。在一些实施方式中，通过使第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交来形成DNA模板。
在示例性步骤170中，释放DNA模板并形成包含DNA模板的溶液。在一些实施方式中，通过限制性内切酶切割DNA模板中的位点来释放DNA模板。在某些实施方式中，通过DNA模板的物理，化学或酶促切割释放DNA模板。在一些实施方式中，通过蛋白酶或通过pH的变化来切割亲和剂-寡核苷酸复合物的至少一部分来释放DNA模板。
在示例性步骤180中，从溶液形成多个分区，使得分区的子集包含DNA模板。分区可包括多种类型的分区中的任一种，包括固体分区(如孔或管)和流体分区(如油相内的水相或液滴)。在一些实施方式中，分区是液滴。在一些实施方式中，分区是微通道或微孔。用于划分溶液的方法和组合物描述于，例如，公开的专利申请WO 2012/135259、WO 2014/117088、WO 2010/036352和US 9156010，其全部内容各自通过引用纳入本文。
在一些实施方式中，液滴包含乳液组合物，即不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在一些实施方式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的运载体流体(如水性溶液)包围。在一些实施方式中，本文所述液滴是相对稳定的并在两种或更多种液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中，生成的液滴中少于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他液滴聚结。
在一个实施方式中，使油相流过水相，从而形成液滴。用于油相的油可经合成或天然存在。在一些实施方式中，所述油包括碳和/或硅。在一些实施方式中，所述油包括烃和/或氟碳。示例性的油包括但不限于硅油、矿物油、氟碳油、植物油或其组合。
该油相可包含氟化基础油，其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中，该原油包括以下一种或多种：HFE 7500、FC-40、FC-43、FC-70或其他常见氟化油。在一些实施方式中，该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中，该阴离子含氟表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AS)、Krytox FSH的铵盐或Krytox FSH的吗啉代衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.62％。KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.62％。
在一些实施方式中，该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘度或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H，1H，2H，2H-全氟癸醇。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇添加至约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇添加至约0.18％(w/w)的浓度。
在一些实施方式中，使油相流过包含DNA模板和/或用于检测靶标是否存在的一种或多种组分(例如试剂)的水溶液，从而形成液滴。在一些实施方式中，用于确定水性液滴中是否存在靶标的一种或多种组分可溶于和/或可混溶于水，包括但不限于，一种或多种盐、缓冲剂、试剂(例如，释放剂，如限制性内切酶或蛋白酶，PCR组分)、表面活性剂、和/或可用于在所形成的液滴内发生期望反应所需的任意其他组分。所有这种其他组分可经选择以与所需的反应或待进行的试验相容。
在一些实施方式中，可以将试验组分(例如，连接酶，限制性内切酶，DNA聚合酶，dNTP和/或PCR主混合物)注射到分区中。可以任何顺序或同时将试验组分注入分区。
向分区中注射流体的方法描述于，例如，WO2012/135259和US2012/0132288，其各自通过引用其全文纳入本文。
在一些实施方式中，形成了至少500个分区(如液滴)、至少1000个分区、至少2000个分区、至少3000个分区、至少4000个分区、至少5000个分区、至少6000个分区、至少7000个分区、至少8000个分区、至少10,000个分区、至少15,000个分区、至少20,000个分区、至少30,000个分区、至少40,000个分区、至少50,000个分区、至少60,000个分区、至少70,000个分区、至少80,000个分区、至少90,000个分区、至少100,000个分区、至少200,000个分区、至少300,000个分区、至少400,000个分区、至少500,000个分区、至少600,000个分区、至少700,000个分区、至少800,000个分区、至少900,000个分区、至少1,000,000个分区、至少2,000,000个分区、至少3,000,000个分区、至少4,000,000个分区、至少5,000,000个分区、至少10,000,000个分区、至少20,000,000个分区、至少30,000,000个分区、至少40,000,000个分区、至少50,000,000个分区、至少60,000,000个分区、至少70,000,000个分区、至少80,000,000个分区、至少90,000,000个分区、至少100,000,000个分区、至少150,000,000个分区或至少200,000,000个分区。
在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如，在一些实施方式中，这些液滴在平均直径方面基本均匀。术语“基本上”或“约”是指所列的数字以及所列数字10％范围内的任何值。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米，或小于约25微米。在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。
在一些实施方式中，生成的液滴在体积上基本均匀。例如，在一些实施方式中，生成的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL、或约50nL。
在一些实施方式中，这些分区(如液滴)是稳定的且能够长期储存。在一些实施方式中，这些分区在约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃下长时间储存(例如至少30天、至少60天、至少90天或更长)。
本文描述的分区能够含有一种或多种表面活性剂以减少移动过程中液滴的聚结。本文所用的“表面活性剂”是表面活性物质，能够减少含有该物质的液体的表面张力。表面活性剂，也可以或选择性地描述为洗涤和/或润湿剂，可引入亲水部分和疏水部分，它们可同时赋予表面活性剂双重亲水性-疏水性。表面活性剂在一些情况下可通过其亲水性与疏水性之比来表征。在一些实施方式中，水相纳入至少一种亲水性表面活性剂。水相可包括至少一种非离子表面活性剂和/或离子表面活性剂。在某些实施方式中，水相包括表面活性剂，该表面活性剂是聚环氧丙烷和聚环氧乙烷的嵌段共聚物。在一些实施方式中，表面活性剂是以商品名PLURONIC及TETRONIC(巴斯夫(BASF)公司)销售的聚环氧丙烷和聚环氧乙烷的嵌段共聚物。在一些实施方式中，表面活性剂是以商品名PLURONIC F-68销售的聚环氧丙烷和聚环氧乙烷的非离子嵌段共聚物。在一些实施方式中，水相的表面活性剂是水溶性和/或亲水性氟表面活性剂。水相的示例性氟表面活性剂以商品名ZONYL(杜邦(DuPont)公司)销售，例如ZONYL FSN氟表面活性剂。在一些情况下，表面活性剂可包括聚山梨醇酯20(以商品名TWEEN-20美国ICI公司(ICI Americas，Inc.)销售)。水相中的特定表面活性剂或总表面活性剂的浓度可经选择以在加热前使乳液液滴稳定。在一些实施方式中，水相的表面活性剂的浓度以重量计为0.01-10％，0.05-5％，0.1-1％或0.5％。
在示例性步骤190中，DNA模板在分区子集中被扩增。可以通过例如PCR，LCR(连接酶链反应)，SDA(链置换扩增)，3SR(自持合成反应)，TMA(转录介导的扩增)，滚环扩增(RCA)或超支化RCA(HRCA)来扩增DNA模板。
在示例性步骤200中，通过检测多个分区中是否存在扩增的DNA模板检测样品中是否存在靶标。在一些实施方式中，通过使用标记物偶联的引物或核苷酸将标记物(例如荧光团，放射性同位素或酶)直接掺入扩增的DNA模板中来检测扩增的DNA模板。在一些实施方式中，当插入双链DNA时发荧光的染料用于检测扩增的DNA模板。示例性插入染料包括但不限于溴化乙锭，碘化丙锭和SYBRTM绿。在一些实施方式中，通过使用在一端具有报道物而在另一端具有猝灭剂的DNA探针来检测扩增的DNA模板。在一些实施方式中，探针包含报告物-猝灭剂组合，所述组合在双链探针，TAQMANTM探针，分子信标探针，SCORPIONTM探针，双杂交探针或ECLIPSETM探针中使用。
可使用多种检测装置中的任一种来检测可检测标记物(例如本文所述标记物)。检测方法的示例包括光学吸光度检测(如荧光或化学发光)或放射性检测。作为非限制性示例，可使用配备生成激发光的模块(所述激发光可被荧光团吸收)以及检测由荧光团发射的光的模块的检测装置来检测荧光标记物。
在一些实施方式中，该检测器还包括对经划分的样品(如液滴)的操作能力，通过单独划分的样品进入检测器，进行检测，然后退出检测器。在一些实施方式中，经划分的样品(如液滴)在所述经划分的样品流动时连续检测。在一些实施方式中，经划分的样品(如液滴)排列在表面，而检测器相对所述表面运动，在含信号分区的各位置检测信号。检测器的示例如WO 2010/036352所示，其内容通过引用纳入本文。在一些实施方式中，经划分样品中的可检测标记物连续检测而无需使经划分的样品流动(如使用室玻片)。
获取荧光检测数据后，可使用通用目的计算机系统(本文中称作“主机”)来储存和处理数据。可使用计算机可执行逻辑进行诸如扣减背景信号、对目标和/或参考序列赋值和定性和/或定量数据的功能。主机可用于显示、储存、检索或计算来自分子谱分析的结果；储存、检索或计算来自表达分析的原始数据；或者显示、储存、检索或计算用于本发明的方法中的任何样品或患者信息。
主机可配置许多不同的硬件组件并可以许多尺寸和形式制造(例如台式PC、笔记本、平板PC、手持式计算机、服务器、工作站、大型机)。可包含标准组件，例如监视器、键盘、磁盘驱动器、CD和/或DVD驱动器等。当主机与网络相连时，可通过任何合适的传输介质(如有线、光和/或无线介质)和任何合适的通信协议(如TCP/IP)来提供连接；主机可包括合适的网络硬件(例如调制解调器、以太网卡、WiFi卡)。主机可使用多种操作系统中的任一种，包括UNIX、Linux、Microsoft Windows、MacOS或任何其他操作系统。
可以多种语言编写用于实施本发明的各方面的计算机代码，包括PERL、C、C++、Java、JavaScript、VBScript、AWK或任何其他的可在主机上执行或可经编译在主机上执行的脚本或编程语言。代码也可以低级语言编写或分配，例如汇编语言或机器语言。
主机系统有利地提供界面，用户可通过该界面控制工具的操作。在本文所述的实施例中，软件工具以脚本方式实施(例如使用PERL)，其执行可由用户从操作系统(如Linux或UNIX)的标准控制线界面起始。本领域技术人员应理解，需要时，可使命令适用于操作系统。在其他实施方式中，可提供图形化用户界面，使用户使用点击设备控制操作。因此，本发明不限于任何特定的用户界面。
可在用于储存和/或传输的多种计算机可读取介质上编码整合本文所述的本发明的多种特征的脚本或程序。合适的介质的示例包括：磁盘或磁带、光学储存介质(如光盘(CD)或DVD(数字多功能光盘))、闪速存储器以及经由遵循各种协议的有线、光纤和/或无线网络(包括因特网)的适用于传输的载波信号。
在一些实施方式中，方法100还包括通过确定包含靶标的分区的数量和分区的总数来对靶标进行定量。一旦确定各分区的二进制“是-否”结果，即可使用基于泊松统计的算法分析各分区的数据以定量样品中的靶标的量。用于定量一种或多种靶标的浓度或量的统计方法描述于例如，前述WO 2010036352中。
试剂盒
在另一方面，提供可用于根据本文所述的方法检测样品中靶标是否存在的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包含与固体支持物连接的第一亲和剂，与第一寡核苷酸偶联的第二亲和剂，和与第二寡核苷酸偶联的第三亲和剂，所有这些均在本文中描述。在一些实施方式中，试剂盒还包含试验组分(例如，连接酶，限制性内切酶，DNA聚合酶，dNTP，缓冲剂，PCR主混合物)。在一些实施方式中，试剂盒还包括用来进行本文所述方法的说明。
实施例
仅以说明的形式而非限制的形式提供以下实施例。本领域技术人员不难了解，可改变或调整各种非关键参数而获得基本相同或相似的结果。
实施例1：用数字邻近试验对靶标进行定量
该实施例说明了用根据本发明的数字邻近试验对靶标进行定量的可行性。该实施例包括用于具有已知浓度的蛋白质靶标的试验的方案，随后进行分析，其将测量的浓度与已知的蛋白质浓度相关联，从而证明绝对靶标定量。
重组纯化的人前列腺特异性抗原(PSA)来自R&D系统公司(R&Dsystems)。三种单克隆PSA抗体(针对三种不同的表位)来自子午线生命科学公司(Meridian Life Science)。根据制造商的方案，使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(热科学公司(Thermo Scientific))将两种单克隆抗体生物素化。根据制造商的方案，使用TaqMan蛋白质试验寡探针试剂盒(热科学公司)，用生物素化的抗体制备PLA探针。
用作捕获剂的第三抗体根据制造商的方案与羧酸修饰的磁珠(热科学公司)结合，使得最终抗体包被密度为1.5μg抗体/mg珠。
连续稀释的纯化的PSA蛋白以5倍增量从1nM至1fM在PLA缓冲液(1xPBS pH 7.4，1mM D-生物素(生命技术公司(Life Technologies))，1mg/ml BSA(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)，0.05％吐温-20(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))，100nM山羊IgG(西格玛奥德里奇公司)，0.1mg/ml鲑鱼精子DNA(生命技术公司)，5mM EDTA)中制备。每个结合反应包括45μl连续稀释的PSA和1μl的5mg/ml抗体包被的磁珠(相当于每个反应50fmole抗体)，并在37℃下在旋转器上以20rpm孵育1小时，以使抗原与抗体结合。孵育后，通过将珠磁吸到管壁并小心地移取上清液来除去未结合的PSA。然后用500μl洗涤缓冲液(1xPBS pH 7.4和0.05％(体积/体积)吐温-20)洗涤珠子两次，随后除去洗涤缓冲液。
向每个反应管中加入50μl探针混合物(PLA缓冲液中每种探针1nM或每次反应50fmole探针)，并将反应物在37℃下在旋转器上以20rpm孵育1小时。通过将珠磁吸到管壁并小心地移取上清液来除去未结合的探针。然后用100μl洗涤缓冲液洗涤珠两次，随后除去洗涤缓冲液。
向每个反应管中加入50μl连接溶液(Thermo的TaqMan蛋白质试验试剂盒，根据制造商的方案制备)，并将反应在37℃下孵育10分钟。向每个反应管中加入2μl稀释的蛋白酶(Thermo的TaqMan蛋白质试验试剂盒，根据制造商的方案制备)，并将反应在37℃下孵育10分钟，然后在95℃下孵育5分钟。对于连接的模板回收，将珠磁吸并将上清液转移到新管中。
通过如下使用液滴数字PCR进行检测：将11μl每种连接模板与1μl通用PCR试验20x(Thermo的TaqMan蛋白质测定试剂盒)和12μl用于探针的ddPCR超混合物(伯乐公司(Bio-Rad))混合。根据制造商的方案，使用QX200TM液滴发生器生成液滴，在C1000热循环仪中循环，并使用QX200TM液滴读取器读取，全部来自伯乐公司。
为了分析，假设从每个靶分子产生单个模板分子，从样品中的原始靶标浓度计算液滴内连接模板的理论浓度。然后，绘制图表，将通过ddPCR测量的结果(每微升的模板拷贝)与每个样品的液滴内的理论连接模板浓度相关联。试验的动态范围是在理论和测量的靶标浓度之间观察到一对一比率的浓度范围。
本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。

Claims (20)

1.一种确定样品中靶标是否存在的方法，所述方法包括：
使样品和与固体支持物连接的第一亲和剂接触，其中所述第一亲和剂特异性结合所述靶标上的第一表位；
洗涤所述固体支持物；
将所述固体支持物与具有能够特异性结合靶标上第二表位的第二亲和剂和能够特异性结合靶标上第三表位的第三亲和剂的溶液孵育，其中所述第二亲和剂附着于第一寡核苷酸，并且所述第三亲和剂附着于第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸在第一和第二寡核苷酸紧密靠近时能够与第一寡核苷酸直接或间接相互作用；
使所述第一和第二寡核苷酸通过以下相互作用：
(a)与第一和第二寡核苷酸各自的至少一部分互补的第三寡核苷酸的杂交，然后连接第一寡核苷酸与第二寡核苷酸；或
(b)第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交；
洗涤所述固体支持物；
任选形成DNA模板；
释放DNA模板并形成包含DNA模板的溶液；
从溶液形成多个分区，其中分区的亚组含有DNA模板；
扩增分区的亚组中的DNA模板；并且
通过检测多个分区中是否存在扩增的DNA模板来检测样品中是否存在靶标。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一、第二和第三表位至少部分重叠。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第二表位位于第一靶标上并且所述第三表位位于第二靶标上。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述靶标具有重复的相同表位，使得第一和第二亲和剂或第一和第三亲和剂识别相同表位。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述靶标是二聚体蛋白质或聚集体形成蛋白质。
6.如权利要求1所述的方法，所述方法还通过确定包含靶标的分区的数量和分区的总数来对靶标进行定量。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述多个分区中的每一个是液滴。
8.如权利要求1所述的方法，其中形成DNA模板的步骤包括延伸第三寡核苷酸的3’末端。
9.如权利要求1所述的方法，其中形成DNA模板的步骤包括延伸第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸的3’末端。
10.如权利要求1所述的方法，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交包括形成DNA模板步骤。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中第二和第三亲和剂的浓度至少等于第一亲和剂的浓度。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中释放步骤包括用限制性内切酶切割DNA模板中的位点。
13.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中释放步骤包括DNA模板的物理、化学或酶促切割。
14.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中释放步骤包括通过蛋白酶或通过pH的变化来切割亲和剂-寡核苷酸复合物的至少一部分。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶标是蛋白质或蛋白质聚集体。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一、第二和第三亲和剂各自是抗体或抗体片段。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增步骤包括PCR。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中固体支持物是颗粒或反应容器的表面。
19.一种用于检测样品中是否存在靶标的试剂盒，所述试剂盒包含：
与固体支持物连接的第一亲和剂，其中所述第一亲和剂特异性结合所述靶标上的第一表位；和
能够特异性结合靶标上的第二表位的第二亲和剂和能够特异性结合靶标上的第三表位的第三亲和剂，其中所述第二亲和剂与第一寡核苷酸偶联，并且所述第三亲和剂与第二寡核苷酸偶联，所述第二寡核苷酸在第一和第二寡核苷酸紧密靠近时能够与第一寡核苷酸直接或间接相互作用。
20.如权利要求19所述的试剂盒，还包含由以下组成的至少一种组分：连接酶，限制性内切酶，DNA聚合酶，dNTP，缓冲剂，PCR主混合物，和用于进行检测样品中靶标的方法的说明书。
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