CN105431575B

CN105431575B - 磁性免疫数字pcr试验

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Publication number: CN105431575B
Application number: CN201480026340.XA
Authority: CN
Inventors: S·豪杰斯; N·埃雷迪亚; J·彼得森
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2013-05-09
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2034-05-07
Also published as: EP2994559B1; EP2994559A4; US9896717B2; US20140336068A1; EP2994559A1; CN105431575A; WO2014182835A1

Abstract

本发明提供检测样品中抗原的方法，所述方法包括将样品与亲和试剂接触以形成抗原‑亲和试剂‑标记物复合物，将抗原‑亲和试剂‑标记物复合物从非复合组分中分离，将来自所述分离的样品的标记物划分为多个分区，和检测一个或多个分区中是否存在标记物。还提供检测样品中抗原的组合物和试剂盒。

Description

磁性免疫数字PCR试验

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年5月9日提交的美国临时专利申请61/821,530和2013年6月20日提交的美国临时专利申请61/837,533的优先权，通过引用将其全部内容纳入本文用于所有目的。

背景技术

样品中抗原的定量可为多种临床应用提供有用的信息。一种检测和定量抗原的方法是通过酶联免疫吸附实验(ELISA)。然而，该试验可实现的检测限和定量精确性无法满足多种应用。

因此，仍需要提供改进的定量精确性和低末端灵敏度的检测和定量抗原的方法。

发明内容

在一个方面，提供检测样品中抗原的方法。在一些实施方式中，该方法包括：

将所述样品与第一亲和试剂和第二亲和试剂接触，其中所述第二亲和试剂连接磁珠，并且若存在抗原则所述第一和第二亲和试剂特异性结合所述抗原；

将含所述第一和第二亲和试剂的样品与第三亲和试剂接触，其中所述第三亲和试剂含标记物并且所述第三亲和试剂特异性结合所述第一亲和试剂，从而形成抗原-亲和试剂-标记物复合物；

根据是否存在所述磁珠，从含所述抗原-亲和试剂-标记物复合物的样品中分离所述抗原-亲和试剂-标记物复合物和未复合组分，从而生成含所述抗原-亲和试剂-标记物复合物的分离样品；

至少将来自所述分离样品的标记物划分为多种分区；和

检测至少一个分区中是否存在标记物；从而检测是否存在抗原。

在一些实施方式中，该方法包括：

将所述样品与第一亲和试剂和第二亲和试剂接触，其中所述第一亲和试剂包含标记物，所述第二亲和试剂连接磁珠，并且若存在抗原则所述第一和第二亲和试剂特异性结合所述抗原，从而形成抗原-亲和试剂-标记物复合物；

至少将来自所述分离样品的标记物划分为多种分区；和

在一些实施方式中，经划分的标记物在抗原-亲和试剂-标记物复合物中。在一些实施方式中，在所述划分步骤前将所述标记物从所述抗原-亲和试剂-标记物复合物中切下。

在一些实施方式中，在所述分离步骤之后和所述划分步骤之前，所述方法还包括在溶液中至少重悬来自所述分离样品的标记物。·

在另一方面，提供检测样品中抗体分析物的方法，其中所述抗体分析物特异性结合具体抗原。在一些实施方式中，该方法包括：

将样品与抗原和第一亲和试剂接触，其中所述第一亲和试剂连接磁珠并特异性结合所述抗原，从而形成分析物-抗原-亲和试剂复合物；

将含所述分析物-抗原-亲和试剂复合物的样品与第二亲和试剂接触，其中所述第二亲和试剂包含标记物并特异性结合所述抗体分析物，从而形成分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物；

根据是否存在所述磁珠，从所述样品中分离所述分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物和未复合组分，从而生成含所述分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物的分离样品；

至少将来自所述分离样品的标记物划分为多种分区；和

检测至少一个分区中是否存在标记物；从而检测是否存在抗体分析物。

在一些实施方式种，经划分的标记物在分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物中。在一些实施方式中，在所述划分步骤前将所述标记物从所述分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物中切下。

在一些实施方式中，所述第一、第二和/或第三亲和试剂各选自：抗体、适体、和非抗体蛋白支架。在一些实施方式中，所述第一、第二和/或第三亲和试剂各为抗体。

在一些实施方式中，该标记物是核酸标记物。在一些实施方式中，所述核酸标记物包含可检测标签。在一些实施方式中，所述可检测标签是荧光团。在一些实施方式中，所述可检测标签是插入染料。

在一些实施方式中，在所述检测步骤前扩增所述核酸标记物。在一些实施方式中，所述核酸标记物在存在探针的情况下扩增，所述探针包含荧光团和淬灭剂，所述核酸标记物的扩增生成来自所述探针的荧光信号。在一些实施方式中，所述溶液包含用于核酸扩增的试剂。在一些实施方式中，在所述检测步骤前未扩增所述核酸标记物。

在一些实施方式中，该标记物是酶，并所述检测包括检测该酶生成的产物。在一些实施方式中，所述酶选自：辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、水解二乙酸荧光素的酯酶和聚合酶。在一些实施方式中，所述酶是DNA聚合酶，并且所述检测包括检测所述DNA聚合酶生成的核酸扩增产物。

在一些实施方式中，该标记物是荧光团。在一些实施方式中，所述检测包括检测荧光团标记物生成的信号。

在一些实施方式中，所述标记物至少在形成抗原-亲和试剂-标记物复合物或分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物之前(例如所述第一、第二和/或第三亲和试剂接触所述样品时)共价连接所述第一、第二和/或第三亲和试剂。

在一些实施方式中，使用吸引所述磁珠的磁体从含所述抗原-亲和试剂-标记物复合物的样品中分离所述抗原-亲和试剂-标记物复合物和未复合组分，或从含所述分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物的样品中分离所述分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物和未复合组分，所述磁珠连接所述抗原-亲和试剂-标记物复合物中的亲和试剂(例如，连接抗原-亲和试剂-标记物复合物或分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物中亲和试剂的磁珠)。

在一些实施方式中，来自分离样品的标记物(如抗原-亲和试剂-标记物复合物或分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物中的标记物，或已从抗原-亲和试剂-标记物复合物或分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物中切下的标记物)划分为足量分区，从而平均至少一个分区缺少所述标记物的拷贝。

在一些实施方式中，这些分区是液滴。在一些实施方式中，所述液滴被不互溶的运载体流体包围。

在一些实施方式中，所述第一亲和试剂和第二亲和试剂以大致等同的亲和性特异性结合所述抗原。在一些实施方式中，所述第一亲和试剂和第二亲和试剂以不同亲和性特异性结合所述抗原。

在一些实施方式中，所述抗原是蛋白质、免疫原、多糖、毒素、细胞壁、细胞被囊、病毒被囊、病毒包衣、鞭毛、纤毛或菌毛、微生物、与蛋白质或多糖复合的核酸、或与蛋白质或多糖复合的脂质。

在一些实施方式中，所述方法包括检测标记物，从而定性抗原或抗体分析物是否存在。

在一些实施方式中，所述方法还包括定量含所述标记物的分区数量，从而对抗原或抗体分析物的量进行定量。

在一些实施方式中，所述方法还包括检测样品中两种或更多不同抗原或两种或更多不同抗体分析物。

在另一方面，提供用于检测样品中抗原或抗体分析物的分区库。在一些实施方式中，所述分区库包含本文所述两个或更多分区，其中至少一些分区包含第一亲和试剂和第二亲和试剂；其中所述第一亲和试剂包含标记物；其中所述第二亲和试剂连接磁珠；并且其中若所述抗原存在则所述第一和第二亲和试剂各特异性结合所述抗原。在一些实施方式中，所述分区库包含本文所述的两个或更多分区，其中至少一些分区包含第一亲和试剂、第二亲和试剂和第三亲和试剂；其中若所述抗原存在则所述第一和第二亲和试剂各特异性结合所述抗原；其中所述第二亲和试剂连接磁珠；并且其中所述第三亲和试剂包含标记物并特异性结合所述第一亲和试剂。在一些实施方式中，所述分区库包含两个或更多分区，其中至少一些分区包含所述抗体分析物特异性结合的抗原、第一亲和试剂和第二亲和试剂；其中所述第一亲和试剂连接磁珠并特异性结合所述抗原；其中所述第二亲和试剂包含标记物并且若所述抗体分析物存在则所述第二亲和试剂特异性结合所述抗体分析物。

在一些实施方式中，该标记物是核酸标记物。在一些实施方式中，所述核酸标记物包含可检测标签。在一些实施方式中，所述标记物是酶。在一些实施方式中，所述酶是辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、水解二乙酸荧光素的酯酶或聚合酶。

在一些实施方式中，该分区库包含至少500个分区。在一些实施方式中，至少一些分区包含标记物。在一些实施方式中，所述分区库包含足量分区，从而平均至少一个分区缺少所述标记物的拷贝。

在另一方面，提供用于检测样品中抗原或抗体分析物的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包含本文所述的一种或多种亲和试剂。在一些实施方式中，所述一种或多种亲和试剂选自：抗体、适体、和非抗体蛋白支架。在一些实施方式中，该亲和试剂是抗体。

定义

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICTIONARY OF CELLAND MOLECULAR BIOLOGY(《细胞和分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(第4版2007)；Sambrook等，MOLECULARCLONING,A LABORATORY MANUAL(《分子克隆，实验室手册》)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约1989)。术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。

术语“抗原”指能刺激生产抗体的物质。示例性抗原包括但不限于蛋白质、免疫原、多糖、毒素、细胞壁、细胞被囊、病毒被囊、病毒包衣、鞭毛、纤毛或菌毛、微生物、与蛋白质或多糖复合的核酸、或与蛋白质或多糖复合的脂质。

术语“亲和试剂”指特异性结合抗原的分子。示例性亲和试剂包括但不限于抗体、抗体片段、非抗体蛋白支架、抗体模拟物或适体。在一些实施方式中，该亲和试剂是抗体。

术语“抗体分析物”指特异性结合具体抗原的抗体或抗体片段。

术语“结合”用于结合抗原的抗体分析物或亲和试剂时，通常表示所述亲和试剂(如抗体)或抗体分析物分别结合纯群体中大部分抗原，假设亲和试剂或抗体分析物与抗原具有合适摩尔比。例如，结合给定抗原的亲和试剂通常结合溶液中至少2/3的抗原分子(例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。本领域技术人员应理解，取决于测定结合的方法和/或阈值，可出现一些变化。

术语“特异性结合”用于亲和试剂或抗体分析物时，分别指亲和试剂(如抗体)或抗体分析物与抗原的结合亲和性比非抗原分子高至少2倍，例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍。例如，特异性结合特定抗原的亲和试剂通常以与非抗原分子相比高至少2倍的亲和性结合所述抗原。

术语“标记物”和“可检测标记物”可互换地指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记物包括荧光染料、发光剂、放射性同位素(如³²P、³H)、高电子密度试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原以及可被检测的蛋白质、核酸或其他实体，例如通过将放射性标记物整合至与目标分子特异性反应的抗体、肽或寡核苷酸中。可以采用本领域已知的用于使抗体偶联所述标记物的任何方法，例如，使用如下文献中所述的方法：Hermanson，《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)1996，圣迭戈的学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)。

术语“连接”，例如用于连接磁珠的亲和试剂时，指共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子、范德华力、静电或氢键)地结合。

术语“划分”或“划分的”指将样品分隔为多个部分，或“分区”。分区可以是固体或流体。在一些实施方式中，分区是固体分区，例如微通道。在一些实施方式中，分区是流体分区，例如液滴。在一些实施方式中，流体分区(如液滴)是不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，流体分区(如液滴)是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。

附图的简要说明

图1.检测抗原的“方案1”的概述。根据该方案，抗原特异性结合两种亲和试剂(一抗)A和B。抗体B具有共价接合的磁珠。通过用标签核酸("TNA")标记的二抗C来进行“三明治”检测。通过磁性分离对游离一抗A和二抗C进行洗涤，然后在液滴中捕获抗原-一抗-二抗-TNA复合物。通过液滴数字PCR("ddPCR")扩增TNA标记，并对所述抗原进行检测。

图2.检测抗原的ELISA样变型方案("方案2")的概述。(A)根据该方案，抗原特异性结合两种亲和试剂(一抗)A和B。抗体B具有共价接合的磁珠。抗原-抗体复合物接触偶联DNA聚合酶(如Taq、Fast Start Taq或一些其他聚合酶，如具有该应用所需特性的突变或变体DNA聚合物)的二抗C。(B)通过磁性分离从游离一抗A和二抗C中纯化抗原-一抗-二抗-DNA聚合酶复合物，然后所述复合物在适于形成数字液滴和PCR扩增的主混物(例如包括适于扩增的核酸、dNTP、合适的正向和反向引物和探针)中重悬。在液滴中捕获重悬复合物，然后进行核酸扩增并检测来自探针的荧光信号以检测所述抗原。

图3.标记亲和试剂的标签核酸("TNAs")的概述。所述核酸可针对特定亲和试剂(如特异性二抗)进行特异性条形码化。通过使TNA对特定亲和试剂有特异性，可构建一套TNA，各TNA具有指示特异性亲和试剂的特异性信号序列。存在互补引物和具有荧光团和淬灭剂的探针时，可通过TNA的核酸扩增来检测TNA条形码。

图4.使用荧光团作为标记物的检测方案(“方案3”)的概述。根据该方案，抗原特异性结合两种亲和试剂(一抗)A和B。抗体B具有共价接合的磁珠。抗原-抗体复合物与用荧光标记物(如荧光团)标记的二抗C接触。通过磁性分离洗去游离一抗A和二抗C，然后在液滴中捕获抗原-一抗-二抗-荧光团复合物。通过检测所述荧光标记物生成的荧光信号来检测所述抗原。

图5.检测结合抗原的感兴趣抗体分析物的检测方案(“方案4”)的概述。根据本方案，感兴趣的抗体分析物特异性结合抗原。共价接合磁珠的亲和试剂(一抗B)还特异性结合所述抗原。分析物-抗原-抗体复合物接触标记的二抗C。二抗C上的标记物可为本文所述标记物，如荧光团(图5所示)、TNA或DNA聚合酶或能将底物转变为可检测信号的其他酶。通过磁性分离洗去游离抗原和二抗C，然后在液滴中捕获抗原-抗体-标记物复合物。如本文所述检测抗体分析物，如通过检测所述荧光标记物生成的荧光信号。

图6.检测抗原的双抗体检测方案(“方案5”)的概述。根据该方案，抗原特异性结合两种亲和试剂(一抗)A和B。抗体A经标记(如用带标签的核酸或荧光标记物)，抗体B接合磁珠。通过磁性分离从标记物-一抗-抗原复合物洗去游离一抗A，然后在液滴中捕获抗原-一抗-抗原复合物。通过检测所述标记物是否存在来检测抗原，所述标记物是例如通过检测荧光标记物生成的荧光信号来检测的荧光标记物(如荧光团)，或通过ddPCR扩增的TNA标记物。

发明详述

I.引言

本发明提供了检测样品中一种或多种抗原或抗体分析物的方法、组合物和试剂盒。样品与标记的亲和试剂(例如抗体)接触，所述亲和试剂与可能存在于样品中的抗原特异性结合。然后将样品划分为很多分区并通过例如数字分析来分析(如抗原和亲和试剂的复合物中)是否存在标记物。在一些实施方式中，待测标记物在检测前经扩增，例如可通过例如液滴数字PCR扩增的核酸标记物。本文所述方法可改善检测样品中抗原或抗体分析物的灵敏度和/或进行样品中抗原或抗体分析物的精确定量。

II.检测抗原的方法

在一个方面中，提供使用亲和试剂检测样品中感兴趣抗原的方法，所述亲和试剂特异性结合所述抗原。在一些实施方式中，该方法包括：

将所述样品与第一亲和试剂接触，其中所述第一亲和试剂包含标记物，并且若存在抗原则所述第一亲和试剂特异性结合所述抗原，从而形成抗原-亲和试剂-标记物复合物；

将含所述抗原-亲和试剂-标记物复合物的样品与第二亲和试剂接触，其中所述第二亲和试剂连接磁珠并特异性结合在所述抗原-亲和试剂-标记物复合物中未结合的所述第一亲和试剂；

根据是否存在所述磁珠，从所述样品中分离所述抗原-亲和试剂-标记物复合物和未复合组分，从而生成含所述抗原-亲和试剂-标记物复合物的分离样品；

至少将来自所述分离样品的标记物划分为多种分区；和

在一些实施方式中，该方法包括：

至少将来自所述分离样品的标记物划分为多个分区；和

本文所述的方法可用于检测任何类型样品中的一种或多种抗原。在一些实施方式中，该样品是生物样品。生物样品可获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、细菌或任何其他有机体。在一些实施方式中，该生物样品来自动物，例如哺乳动物(如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(如鸡)或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液，血液成分或血液产品(如血清、血浆、血小板、血红细胞等)，痰液或唾液，组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物，外植体，和转化的细胞，干细胞，粪便，尿液等。

在一些实施方式中，待测的一种或多种抗原是肽、蛋白质(如抗体、酶、生长调节剂、凝血因子或磷蛋白)、免疫原、多糖、毒素、细胞壁、细胞被囊、病毒被囊、病毒包衣、鞭毛、纤毛或菌毛、微生物、与蛋白质或多糖复合的核酸、或与蛋白质或多糖复合的脂质。在一些实施方式中，所述抗原是蛋白质。

在一些实施方式中，两种、三种、四种、五种或更多种不同抗原待检测。在一些实施方式中，其中两种或更多种不同的抗原待检测，所述两种或更多种不同的抗原是相同类型的抗原(例如复合物中存在的两种或更多种蛋白质)。在一些实施方式中，其中两种或更多种不同的抗原待检测，所述两种或更多种不同的抗原是不同类型的抗原。

亲和试剂

适用于本发明方法的亲和试剂是特异性结合感兴趣抗原的任何分子。亲和试剂的非限制性示例包括抗体、抗体片段、非抗体蛋白支架、抗体模拟物或适体。

在一些实施方式中，该亲和试剂是抗体。本文中，“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含能够非共价、可逆并以特定方式结合相应抗原的免疫球蛋白的片段的多肽。术语抗体也包括通过全抗体修饰，或用重组DNA方法从头合成所产生(例如，单链Fv)，或用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见如McCafferty等，Nature 348:552-554(1990))。制备抗体的方法是本领域已知的；参见例如Kohler和Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4:72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy(《单克隆抗体和癌症治疗》)，第77-96页，ARL公司(Alan R.Liss,Inc.)1985。

在一些实施方式中，该亲和试剂是抗体模拟物。本文所用“抗体模拟物”指表现出与抗体相似的抗原结合性但结构上与抗体无关联的分子(如肽、蛋白质、核酸或小分子)。在一些实施方式中，所述抗体模拟物是人工分子。

在一些实施方式中，该亲和试剂是非抗体蛋白支架。本文中，“非抗体蛋白支架”指能够以高特异性结合抗原的非免疫原性多肽。在一些实施方式中，该蛋白支架具有衍生自蛋白A、脂质运载蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域或硫氧还蛋白的结构。制备非抗体蛋白支架的方法是本领域已知的；参见例如Binz和Pluckthun,CurrOpinBiotechnol16:459-469(2005)；Koide等，J MolBiol 415:393-405(2012)；以及Gilbreth和Koide,CurrOpinStructBiol 22:413-420(2012)。

在一些实施方式中，该亲和试剂是适体。本文中，“适体”指对抗原(如蛋白质或核酸)具有特异性结合亲和性的DNA或RNA分子。在一些实施方式中，适体选自基于其以基于与目标分子(如感兴趣的抗原)的非沃森克里克相互作用的高亲和特异性结合其他分子能力的随机池(参见例如，Cox和Ellington,Bioorg.Med.Chem.9:2525-2531(2001)；Lee等，Nuc.Acids Res.32:D95-D100(2004))。例如，可使用称为通过指数富集的配体系统性演化(SELEX)的选择过程选择适体。参见例如Gold等，US 5,270,163。可选择结合例如核酸、蛋白质、小有机化合物、维生素或无机化合物的适体。

磁珠

在一些实施方式中，基于是否存在连接亲和试剂的磁珠来分离样品中复合的抗原-亲和试剂-标记物与未复合组分(例如若存在于样品中的未复合亲和试剂和未复合抗原)。适用于连接本文所述亲和试剂的磁珠可包括任何顺磁性、超顺磁性或铁磁性材料，且可包括任何形状。例如，磁珠形状可为基本类似球形、方块形、四面体、八面体、十二面体、二十面体等。在一些实施方式中，两种或更多种形状磁珠的组合可用于连接亲和试剂。在一些实施方式中，所述磁珠的尺寸、形状和/或表面积基本一致。

磁珠可通过各种方式与亲和试剂连接，例如通过形成共价键、离子键、氢键或通过范德华力。在一些实施方式中，所述磁珠通过共价键连接亲和试剂。可通过各种反应例如转酰氨基作用形成共价键。在一些实施方式中，所述磁珠通过交联剂连接亲和试剂。在一些实施方式中，所述交联剂是选自异源双功能交联剂和同源双功能交联剂的成员。在一些实施方式中，所述交联剂是同源双功能交联剂。在一些实施方式中，所述交联剂是二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸盐(BS3),乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯](EGS)、乙二醇双[磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯](磺基-EGS)、双[2-(琥珀酰亚氨基氧基羰基氧)乙基]砜(BSOCOES)、二硫代双(琥珀酰亚胺基)丙酸酯(DSP)、3,3'-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)、N-琥珀酰亚胺基己二酸甲酯(MSA)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、1,5-二氟-2,4-二硝基苯(DFDNB)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐(EDC或EDAC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、羟胺和硫代-LC-SPDP(N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯)、或磺基琥珀酰亚胺基6-(3'-[2-吡啶二硫]-丙酰胺基)己酸乙酯(磺基-LC-SPDP)。磁珠和用于偶联磁珠至亲和试剂的技术本领域已知。磁珠市售可得，例如Dynabeads^TM磁珠(纽约州格兰德岛的生命技术公司(Life Technologies))；PureProteome^TM磁珠(马萨诸塞州比尔里卡的EMD密理博公司(EMDMillipore))；和抗体偶联试剂盒(得克萨斯州奥斯汀的路明克斯公司(LuminexCorporation))。

在一些实施方式中，所述磁珠连接亲和试剂(其形成抗原-亲和试剂-标记物复合物的部分)，并且使用吸引所述磁珠(连接复合物中的亲和试剂)的磁体分离所述抗原-亲和试剂-标记物复合物和未复合组分(即抗原-亲和试剂-标记物复合物中未结合的组分)。在一些实施方式中，所述磁性分离使用包含磁体的磁性分离设备进行。例如，在一些实施方式中，所述磁性分离设备是磁性架。磁性架市售可得，例如购自英杰公司(Invitrogen)。

在一些实施方式中，样品中的复合抗原-亲和试剂-标记物通过浮力或过滤与未复合组分(如若存在于样品中的未复合亲和试剂和未复合抗原)分离。例如，在一些实施方式中，磁珠连接亲和试剂(其形成抗原-亲和试剂-标记物复合物的部分)，并且基于抗原-亲和试剂-标记物复合物中磁珠的浮力相比未复合组分有所减小或通过过滤磁珠来使所述抗原-亲和试剂-标记物复合物与未复合组分分离。

在一些实施方式中，所述方法在分离抗原-亲和试剂-标记物复合物和未复合组分的步骤之后并在划分分离的样品的步骤之前还包括在溶液中重悬至少所述标记物(抗原-亲和试剂-标记物复合物中的标记物或从抗原-亲和试剂-标记物复合物上切下的标记物)的步骤。本领域技术人员可确定重悬抗原-亲和试剂-标记物复合物的合适溶液。在一些实施方式中，所述溶液是水溶液，例如水性缓冲液或PCR主混物例如液滴PCR超混物(Bio-Rad实验室公司(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯))。

在一些实施方式中，所述方法在分离抗原-亲和试剂-标记物复合物和未复合组分的步骤之后并在划分分离的样品的步骤之前还包括从未复合组分洗涤至少所述标记物(抗原-亲和试剂-标记物复合物中的标记物或从抗原-亲和试剂-标记物复合物上切下的标记物)的步骤。在一些实施方式中，所述洗涤步骤包括从游离亲和试剂和游离抗原(若存在)上至少洗去所述标记物。适当清洗条件、清洗缓冲液等的选择将基于诸如抗原、亲和试剂等的条件变化且可由本领域技术人员确定。需要时，可重复清洗过程以进行额外的清洗。在一些实施方式中，分离样品中抗原-亲和试剂-标记物复合物和未复合组分之后并在从所述分离样品划分至少标记物之前不进行插入的洗涤步骤。

可检测标记物

在一些实施方式中，本文所述亲和试剂连接可检测标记物。该标记物可直接连接至亲和试剂(例如通过共价键)或可以间接连接(例如使用螯合剂或接头分子)。术语“标记物”和“可检测标记物”在本文中的含义相同。

可检测标记物的示例包括但不限于：生物素/链霉亲和素标记物、核酸(例如寡核苷酸)标记物、化学反应性标记物、荧光标记物、酶标记物、放射性标记物、量子点、聚合物点、质量标记物及其组合。在一些实施方式中，该标记物可包括光学试剂，如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。多种试剂(如染料、探针或指示剂)是本领域已知的并可用于本发明。(参见例如英杰公司(Invitrogen)，The Handbook—A Guide to Fluorescent Probes andLabeling Technologies(《手册——荧光探针和标记技术指导》)，第10版(2005))。荧光剂可包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于：花青、酞菁、卟啉、吲哚菁、若丹明、吩噁嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素(例如FITC、5-羧基荧光素和6-羧基荧光素)、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、若丹明(例如TAMRA、TMR和若丹明红)、吖啶、蒽醌、硫族吡喃鎓(chalcogenopyrylium)类似物、氯、萘菁、次甲基染料、方菁染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷型染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青、BODIPY^TM和BODIPY^TM衍生物，及其类似物。在一些实施方式中，荧光剂是Alexa Fluor染料。在一些实施方式中，荧光剂是聚合物点或量子点。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自英杰/分子探针公司(Invitrogen/Molecular Probes)(俄勒冈州尤金市)和皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Inc.)(伊利诺斯州洛克福德)。在一些实施方式中，该光学试剂是插入染料。插入染料包括但不限于SYBR绿和Pico绿(来自分子探针公司(MolecularProbes)(俄勒冈州尤金市))、化乙啶、碘化丙啶、色霉素、吖啶橙、Hoechst 33258,TOTO-I、YOYO-1和DAPI(4',6-二眯基-2-苯基吲哚盐酸盐)。

在一些实施方式中，该标记物是放射性同位素。放射性同位素包括放射性核素，其发射γ射线、正电子、β和α粒子和X射线。合适的放射性核素包括但不限于：²²⁵Ac、⁷²As、²¹¹At、¹¹B、¹²⁸Ba、²¹²Bi、⁷⁵Br、⁷⁷Br、¹⁴C、¹⁰⁹Cd、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、¹⁸F、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、³H、¹⁶⁶Ho、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³⁰I、¹³¹I、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹³N、¹⁵O、³²P、³³P、²¹²Pb、¹⁰³Pd、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁴⁷Sc、¹⁵³Sm、⁸⁹Sr、^99mTc、⁸⁸Y和⁹⁰Y。

在一些实施方式中，该标记物是亲和标签。合适的亲和标签的示例包括但不限于：生物素、肽标签(如FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Strep标签)和蛋白质标签(如GST标签、MBP标签、GFP标签)。

在一些实施方式中，该标记物是“点击”化学部分。点击化学使用简单稳健的反应(如铜催化的炔和叠氮化物的环加成)来建立分子间连接。对于点击化学的综述，参见Kolb等，Agnew Chem 40:2004-2021(2001)。在一些实施方式中，点击化学部分(如叠氮化物或炔部分)可使用另一种可检测标记物(例如荧光标记、生物素化或放射性标记的炔或叠氮化物部分)来检测。

核酸标记物

在一些实施方式中，该标记物是核酸标记物。合适的核酸标记物的示例包括但不限于：寡核苷酸序列、单链DNA、双链DNA、RNA(如mRNA或miRNA)或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，该核酸标记物的长度是约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸标记物包含可检测标签(例如“带标签的核酸”)。在一些实施方式中，所述可检测标签是本文所述光学试剂(如荧光团或插入染料)。在一些实施方式中，所述可检测标签是与可检测探针互补或基本互补的序列，例如探针(纽约州格兰德岛的生命技术公司)，其具有与核酸区域退火的荧光团和淬灭剂，从而可检测核酸标记物。在一些实施方式中，所述核酸标记物针对特定亲和试剂进行特异性“条形码化”(即对特定亲和试剂具有特定识别特征)。参见图3。

作为非限制性实施例，在一些实施方式中，所述标记物是核酸标记物。在一些实施方式中，所述核酸标记物在化学上合适的位置共价结合亲和试剂(如抗体)。

酶标记物

在一些实施方式中，所述标记物是酶，并通过检测所述酶生成的产物来检测所述标记物(如抗原-亲和试剂-标记物复合物)的存在。合适的酶的示例包括但不限于：聚合酶(如DNA聚合酶)、脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。例如，辣根过氧化物酶检测系统可与发光底物四甲基联苯胺(TMB)联用，其在过氧化氢存在下产生在450nm处可检测的可溶产物。碱性磷酸酶检测系统可与发光底物对硝基苯基磷酸盐联用，其产生405nm处可容易地检测的可溶性产物。β-半乳糖苷酶检测系统可与生色底物邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)联用，产生在410nm可测的可溶性产物。脲酶检测系统可与底物如脲溴甲酚紫(西格玛免疫化学品公司(Sigma Immunochemicals)，密苏里州圣路易斯)联用。

作为非限制性示例，在一些实施方式中，所述酶是DNA聚合酶，并且所述检测包括检测所述DNA聚合酶生成的核酸扩增产物。见图2A-B。在一些实施方式中，DNA聚合酶是热稳定的DNA聚合酶例如Taq聚合酶。在一些实施方式中，DNA聚合酶是化学介导或抗体介导的热启动Taq聚合酶。Taq聚合酶和热启动Taq聚合酶市售易得(例如，罗氏应用科学公司(RocheApplied Science)的FastStart Taq DNA聚合酶，或伯乐实验室公司的iTaq^TM DNA聚合酶)。本领域技术人员应理解可使用其他DNA聚合酶，例如Taq的其他株系和/或突变体，来检测核酸扩增产物。

连接可检测标记物与亲和试剂的技术是熟知的。例如，常见蛋白标记技术的综述可参见Biochemical Techniques:Theory and Practice(《生物化学技术：理论和实践》)，John F.Robyt和Bernard J.White，维弗兰德出版公司(Waveland Press,Inc.)(1987)。其他标记技术综述于，例如，R.Haugland,Excited States of Biopolymers(《生物聚合物的兴奋状态》)，Steiner编，普莱南出版社(Plenum Press)(1983)；Fluorogenic ProbeDesign and Synthesis:A Technical Guide(《荧光探针设计与合成：技术指南》)，PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems)(1996)；以及G.T.Herman,BioconjugateTechniques(《生物偶联技术》)，学术出版社(Academic Press)(1996)。所述技术还可作为市售可得试剂盒(例如英国剑桥的银诺瓦生物科学有限公司(Innova Biosciences Ltd.)的Thunder-和Lightning-)的部分获得。在一些实施方式中，可检测标记物通过共价键、离子键、氢键或范德华相互作用与亲和试剂接合。

检测

可使用多种检测装置中的任一种来检测可检测标记物(例如本文所述标记物)。检测方法的示例包括放射性检测、吸光度检测(如荧光或化学发光)或质谱检测。作为非限制性示例，可使用配备生成激发光的模块(所述激发光可被荧光团吸收)以及检测由荧光团发射的光的模块的检测装置来检测荧光标记物。

在一些实施方式中，可整体检测经划分的样品中的可检测标记物。例如，可将经划分的样品(如液滴)分配至板(如96孔或384孔板)的一个或多个孔中，并可使用酶标仪检测信号(如荧光信号)。

在一些实施方式中，所述检测器还包括对经划分的样品(如液滴)的操作能力，通过单独划分的样品进入检测器，进行检测，然后退出检测器。在一些实施方式中，经划分的样品(如液滴)可在所述经划分的样品流动时连续检测。在一些实施方式中，经划分的样品(如液滴)排列在表面，而检测器相对所述表面运动，在含信号分区的各位置检测信号。检测器的示例如WO 2010/036352所示，其内容通过引用纳入本文。在一些实施方式中，经划分样品中的可检测标记可连续检测而无需使经划分的样品流动(如使用载玻片)。

获取荧光检测数据后，可使用通用目的计算机系统(本文中称作“主机”)来储存和处理数据。可使用计算机可执行逻辑进行诸如扣减背景信号、对目标和/或参考序列赋值和定性和/或定量数据的功能。主机可用于显示、储存、检索或计算来自分子谱分析的结果；储存、检索或计算来自表达分析的原始数据；或者显示、储存、检索或计算用于本发明的方法中的任何样品或患者信息。

主机可配置许多不同的硬件组件并可以许多尺寸和形式制造(例如台式PC、笔记本、平板PC、手持式计算机、服务器、工作站、大型机)。可包含标准组件，例如监视器、键盘、磁盘驱动器、CD和/或DVD驱动器等。当主机与网络相连时，可通过任何合适的传输介质(如有线、光和/或无线介质)和任何合适的通信协议(如TCP/IP)来提供连接；主机可包括合适的网络硬件(例如调制解调器、以太网卡、WiFi卡)。主机可使用多种操作系统中的任一种，包括UNIX、Linux、Microsoft Windows、MacOS或任何其他操作系统。

可以多种语言书写用于实施本发明的各方面的计算机代码，包括PERL、C、C++、Java、JavaScript、VBScript、AWK或任何其他的可在主机上执行或可经编译在主机上执行的脚本或编程语言。代码也可以低级语言书写或分配，例如汇编语言或机器语言。

主机系统通过用户控制操作的工具有利地提供界面。在本文所述的实施例中，软件工具以脚本方式实施(例如使用PERL)，其执行可由用户从操作系统(如Linux或UNIX)的标准控制线界面起始。本领域技术人员应理解，需要时，可使命令适用于操作系统。在其他实施方式中，可提供图形化用户界面，使用户使用点击设备控制操作。因此，本发明不限于任何特定的用户界面。

可在用于储存和/或传输的多种计算机可读取介质上编码整合本发明的多种特征的脚本或程序。合适的介质的示例包括：磁盘或磁带、光学储存介质(如光盘(CD)或DVD(数字多功能光盘))、闪速存储器以及经由遵循多种协议的有线、光纤和/或无线网络(包括因特网)的适用于传输的载波信号。

划分用于检测的样品

至少含有标记物(例如在抗原-亲和试剂-标记物复合物中或从所述抗原-亲和试剂-标记物复合物上切下)的分离样品划分为多个分区。分区可包括多种类型的分区中的任一种，包括固体分区(如孔或管)和流体分区(如油相内的水性液滴)。在一些实施方式中，这些分区是液滴。在一些实施方式中，这些分区是微通道。分配样品的方法和组合物描述于，例如，公开的专利申请WO 2010/036352、US 2010/0173394、US 2011/0092373和US 2011/0092376，其全部内容各自通过引用纳入本文。

在一些实施方式中，将样品划分成多个液滴。在一些实施方式中，液滴包含乳液组合物，即不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在一些实施方式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的运载体流体(如水性溶液)包围。在一些实施方式中，本文所述液滴是相对稳定的并在两种或更多种液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中，由样品生成的液滴中至少0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他液滴聚结。这些乳液还可具有有限的絮凝，一种分散相从薄片中悬浮液产生的过程。

在一些实施方式中，使油相流过包含待检测标记物的水性溶液，从而形成液滴。在一些实施方式中，包含待检测标记物的水性样品包括缓冲溶液和检测标记物的试剂。用于油相的油可经合成或天然存在。在一些实施方式中，所述油包括碳和/或硅。在一些实施方式中，所述油包括氢和/或氟。示例性油包括但不限于硅油、矿物油、氟碳油、植物油或其组合。

该油相可包含氟化基础油，其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中，该基础油包括以下一种或多种：HFE 7500、FC-40、FC-43、FC-70或另一种常见氟化油。在一些实施方式中，该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中，该阴离子含氟表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AS)、Krytox FSH的铵盐或Krytox FSH的吗啉基衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.62％。KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉基衍生物的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉基衍生物的浓度是约1.62％。

在一些实施方式中，该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘性或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸醇。在一些实施方式中，1H,1H,2H,2H-全氟癸醇以约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度添加。在一些实施方式中，1H,1H,2H,2H-全氟癸醇以约0.18％(w/w)的浓度添加。

在一些实施方式中，该乳液配制为生成具有类液界面膜的高度单分散液滴，其可通过加热转化为具有类固界面膜的微胶囊；这类微胶囊可作为生物反应器以通过一段时间的孵育保持其含量。转化为微胶囊可在一经加热后即发生。例如，这类转化可发生于大于约40°、50°、60°、70°、80°、90°或95℃的温度下。加热过程期间，流体或矿物油覆盖物可用于阻止蒸发。可在加热前除去或不除去过量的连续相油。这些生物相容性胶囊可在大范围的热和机械处理下抗聚结和/或絮凝。

转化后，这些微胶囊可储存于约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃下。在一些实施方式中，这些胶囊可用于生物医学应用，例如稳定、数字化的大分子包封，特别是包含目标分子(如核酸、蛋白质或上述两者)的混合物的水性生物液体；药物和疫苗递送；生物分子文库；临床成像应用；等。

这些微胶囊分区可含有本文所述的一种或多种亲和试剂并可抗聚结，特别是在高温下。因此，这些胶囊可在非常高的密度(例如每单位体积的分区数)下孵育。在一些实施方式中，可每毫升孵育超过100,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、2,500,000、5,000,000或10,000,000个分区。在一些实施方式中，样品-探针孵育发生在单个孔中，例如微量滴定板的孔，此时各分区之间不具有内部混合。这些微胶囊还可含有孵育所需的其他组分。

在一些实施方式中，将样品分配成至少500个分区(如液滴)、至少1000个分区、至少2000个分区、至少3000个分区、至少4000个分区、至少5000个分区、至少6000个分区、至少7000个分区、至少8000个分区、至少10,000个分区、至少15,000个分区、至少20,000个分区、至少30,000个分区、至少40,000个分区、至少50,000个分区、至少60,000个分区、至少70,000个分区、至少80,000个分区、至少90,000个分区、至少100,000个分区、至少200,000个分区、至少300,000个分区、至少400,000个分区、至少500,000个分区、至少600,000个分区、至少700,000个分区、至少800,000个分区、至少900,000个分区、至少1,000,000个分区、至少2,000,000个分区、至少3,000,000个分区、至少4,000,000个分区、至少5,000,000个分区、至少10,000,000个分区、至少20,000,000个分区、至少30,000,000个分区、至少40,000,000个分区、至少50,000,000个分区、至少60,000,000个分区、至少70,000,000个分区、至少80,000,000个分区、至少90,000,000个分区、至少100,000,000个分区、至少150,000,000个分区或至少200,000,000个分区。

在一些实施方式中，所述样品划分为足量分区，使得至少大部分分区含有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、或500个拷贝的标记物。在一些实施方式中，大部分分区含有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、或500个拷贝的一种或多种待测标记物。在一些实施方式中，各分区存在平均不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、或500个拷贝的一种或多种标记物。

在一些实施方式中，所述样品划分为足量分区，从而平均至少一个分区缺少所述标记物的拷贝。在一些实施方式中，所述样品划分为足量分区，从而平均至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个分区缺少所述标记物的拷贝。在一些实施方式中，所述样品划分为足量分区，使得平均至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个分区缺少所述标记物的拷贝并且使得平均至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个分区具有所述标记物的至少一个拷贝。

在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如，在一些实施方式中，这些液滴在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米，或小于约25微米。在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。

在一些实施方式中，生成的液滴在体积上基本均匀。例如，在一些实施方式中，生成的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL。

数字分析

可以使用数字读取试验(例如数字分析)通过从所述分离样品划分至少所述标记物(例如抗原-亲和试剂-标记物复合物中的标记物或从抗原-亲和试剂-标记物复合物上切下的标记物)并鉴定含所述标记物的分区来检测并定量样品中的一种或多种抗原。通常，数字分析的过程涉及：针对待检测标记物的存在，确定样品的各分区是阳性还是阴性。若所述抗原-亲和试剂-标记物复合物以未知比例包含抗原和标记物，则标记物的存在对应于抗原的阳性检测。若所述抗原-亲和试剂-标记物复合物以已知比例(即1:1比例)包含抗原和标记物，则针对样品检测的标记物的含量可与样品中存在的抗原含量关联起来。对于定量样品中抗原的含量(例如定量样品中抗原的浓度或拷贝数)，检验分区中各分区是否存在可检测信号。若在分区中检测到信号，则该分区对抗原存在为“阳性”。在一些实施方式中，分区中所检测信号通过连接抗原-亲和试剂-标记物复合物中的亲和试剂的标记物(如连接亲和试剂的荧光、化学发光、辐射、或酶标记)生成。若在分区中未检测到信号，则该分区对抗原存在为“阴性”。

在一些实施方式中，能够检测单个信号或多个信号的检测器被用于分析各分区中是否存在抗原。例如，在一些实施方式中，使用双色读取器(荧光检测器)。阳性计数分区的分数可用于测定待测量抗原的绝对浓度。

一旦确定各样品分区的二态“是-否”结果，即可使用基于泊松统计的算法分析各分区的数据以定量样品中的抗原含量。定量抗原的浓度或含量的统计学方法描述于例如WO2010/036352，其通过引用全文纳入本文。

核酸扩增

在一些实施方式中，本文所述方法包括扩增步骤。在一些实施方式中，接合亲和试剂作为抗原-亲和试剂-标记物复合物的一部分的核酸标记物在从所述标记物检测可检测信号步骤之前进行扩增。例如，在一些实施方式中，所述核酸标记在存在引物和特异性结合所述核酸标记物的探针时进行扩增，并且所述核酸扩增时所述探针生成可检测(例如荧光)信号，从而表明存在抗原-亲和试剂-标记物复合物。

在一些实施方式中，例如接合亲和试剂的标记物是DNA聚合酶时，所述扩增步骤包括使含标记的亲和试剂的样品与核酸接触并检测所述标记物(如DNA聚合酶)生成的核酸扩增产物。在一些实施方式中，待扩增的核酸包含与探针互补或基本互补的序列，当所述核酸经扩增时所述探针生成可检测(例如荧光)信号，从而表明存在抗原-亲和试剂-标记物复合物。

作为非限制性示例，可使用系统，例如系统。该系统利用由两种不同荧光染料标记的短寡核苷酸探针(例如长度约20-25碱基)。在一些实施方式中，所述探针的5'末端接合报告染料，或“荧光剂”，而3'末端接合淬灭部分，或“淬灭剂”。在一些实施方式中，所述染料接合探针的其他位置。所述探针可设计为与待扩增核酸上的探针接合位点具有至少基本的序列互补性。与侧接探针接合位点的区域结合的上游和下游PCR引物用于扩增核酸。

当所述发荧光探针完整时，荧光剂和淬灭剂部分之间发生能量转移，淬灭荧光剂的发射。PCR延伸阶段中，探针被切割(例如通过核酸聚合酶例如Taq聚合酶的5'核酸酶活性，或通过切割结合探针的单独提供的核酸酶活性)，从而使荧光剂和淬灭剂部分分离。这导致报告发射强度的增加，可用合适的检测器测量。根据本领域已知方法，通过荧光信号向抗原数量的数学转化，确定抗原的检测和/或定量。有关检测PCR产物的荧光方法的其他细节参见例如Gelfand的美国专利5,210,015、Livak等的美国专利5,538,848、和Haaland的美国专利5,863,736，它们通过引用全文纳入本文，以及Heid,C.A.,等Genome Research,6:986-994(1996)；Gibson,U.E.M,等Genome Research 6:995-1001(1996)；Holland,P.M.,等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 4 88:7276-7280,(1991)；和Livak,K.J.,等“PCR方法和应用”(PCR Methods and Applications)357-362(1995)。

作为另一非限制性示例，可利用结构化探针(如“分子信标”)来检测核酸扩增产物。通过分子信标，探针与扩增产物的互补区域杂交时对探针构型的改变导致可检测信号的产生。除了靶标特异性部分以外，所述探针包括其他部分，通常一部分在5'端另一部分在3'端，它们彼此互补。一端部分通常接合报告染料，而另一端部分通常接合淬灭剂染料。溶液中两种端部分可彼此杂交以形成茎环结构。该构型中，报告染料和淬灭剂足够接近，以致报告染料的荧光被淬灭剂有效淬灭。相反，杂交的探针具有线性化构型，这降低了淬灭程度。因此，通过监控报告染料的发射变化可以间接监控扩增产物的形成。此类探针及其使用方法还参见例如Piatek,A.S.,等,Nat.Biotechnol.16:359-63(1998)；Tyagi,S.和Kramer,F.R.,Nature Biotechnology 14:303-308(1996)；和Tyagi,S.等Nat.Biotechnol.16:49-53(1998)。

在一些实施方式中，所述方法包括在适于扩增核酸的条件下用核酸孵育含标记的亲和试剂的样品。例如，所述样品可与扩增试剂孵育(dNTP、引物、探针、封闭剂、生物防腐剂等)。扩增所述核酸的合适条件取决于例如待扩增核酸和DNA酶的性质，且这些本领域技术人员容易确定。

在一些实施方式中，分离抗原-亲和试剂-标记物复合物后，来自所述分离样品的标记物(如抗原-亲和试剂-标记物复合物中的标记物或从抗原-亲和试剂-标记物复合物上切下的标记物)在含扩增试剂(如dNTP、引物、探针等)的溶液(如水性缓冲液)中重悬。在一些实施方式中，所述溶液在扩增步骤前划分为多个分区。在某些实施方式中，扩增在分区步骤之前进行。

核酸扩增方法本领域已知，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR、实时PCR、热启动PCR、单细胞PCR、巢式PCR、原位集落PCR、数字PCR、液滴数字^TM PCR(ddPCR)、乳液PCR、连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增体系(TAS)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、和高分支RCA(HRCA)。

在一些实施方式中，所述扩增使用液滴数字^TM PCR(ddPCR)进行。本领域已知进行ddPCR的设备。例如，ddPCR可用QX100^TM Droplet Digital^TM PCR系统(加利福尼亚州赫科勒斯的伯乐实验室公司)进行。进行ddPCR的方法和装置还参见例如WO 2010/036352和WO2012/129187，其各通过引用纳入本文。

III.检测抗体分析物的方法

在另一方面，提供检测样品中感兴趣的抗体分析物的方法，其中所述抗体分析物特异性结合具体抗原。在一些实施方式中，该方法包括：

至少将来自所述分离样品的标记物划分为多种分区；和

在一些实施方式中，经划分的标记物在分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物中。在一些实施方式中，在所述划分步骤前将所述标记物从所述分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物上切下。

本文所述的方法可用于检测任何类型样品(如生物样品)中的一种或多种抗体分析物。在一些实施方式中，两种、三种、四种、五种或更多种不同抗体分析物待检测。在一些实施方式中，两种或更多不同抗体分析物待测时，所述两种或更多不同抗体分析物特异性结合相同抗原。在一些实施方式中，两种或更多不同抗原待测时，所述两种或更多不同抗体分析物特异性结合不同抗原。

为了检测抗体分析物，进行所述方法的试剂(如亲和试剂、可检测标记物、和磁珠)和条件(如检测、划分、和数字分析)可为本文所述任何试剂和/或条件，如上述第II部分所述。

IV.分区库

在其他方面中，提供包括进行本发明方法的多个分区的分区库。在一些实施方式中，所述分区库包括多个分区用于检测样品中抗原的存在。在一些实施方式中，该分区库包含两个或更多个分区，该库的至少一些分区(例如库中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的分区)包含1、2、3、4、5或更多种不同的亲和试剂。在一些实施方式中，至少一些分区包含第一亲和试剂和第二亲和试剂；其中所述第一亲和试剂包含标记物；其中所述第二亲和试剂连接磁珠；并且其中若所述抗原存在则所述第一和第二亲和试剂各特异性结合所述抗原。在一些实施方式中，至少一些分区包含第一亲和试剂、第二亲和试剂和第三亲和试剂，其中若所述抗原存在则所述第一和第二亲和试剂各特异性结合所述抗原，其中所述第二亲和试剂连接磁珠，并且其中所述第三亲和试剂包含标记物并特异性结合所述第一亲和试剂。

在一些实施方式中，所述分区库包含用于检测样品中存在抗体分析物的多个分区，其中所述抗体分析物特异性结合特定抗原。在一些实施方式中，至少一些分区包含抗原、第一亲和试剂和第二亲和试剂；其中所述第一亲和试剂连接磁珠且特异性结合所述抗原；并且所述第二亲和试剂包含标记物并且若所述抗体分析物存在则所述第二亲和试剂特异性结合所述抗体分析物。

在一个实施方式中，该分区库包含至少500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、10,000,000、20,000,000、30,000,000、40,000,000、50,000,000、60,000,000、70,000,000、80,000,000、90,000,000、100,000,000、150,000,000或200,000,000个分区。

用于分区库的分区的亲和试剂可为本文所述任何亲和试剂。在一些实施方式中，该亲和试剂是抗体。在一些实施方式中，该亲和试剂是抗体片段。在一些实施方式中，该亲和试剂是非抗体蛋白支架。在一些实施方式中，该亲和试剂是抗体模拟物。在一些实施方式中，该亲和试剂是适体。在一些实施方式中，亲和试剂如本文所述进行标记，如用核酸标记物、酶标记物或荧光团标记物。

在一些实施方式中，该分区库的至少一些分区包含一种或多种标记物。在一些实施方式中，至少一些分区包含两种、三种、四种、五种或更多种不同的标记物。在一些实施方式中，所述样品划分为足量分区，从而平均至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个分区缺少所述标记物的拷贝。在一些实施方式中，所述样品划分为足量分区，使得平均至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个分区缺少所述标记物的拷贝并且使得平均至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个分区具有所述标记物的至少一个拷贝。

在一些实施方式中，该分区库包含多个分区，所述多个分区是固体分区(如孔或管)。在一些实施方式中，这些分区是微通道。在一些实施方式中，该分区库包含多个分区，所述多个分区是流体分区(如油相中的水性液滴)。在一些实施方式中，这些分区是液滴。在一些实施方式中，这些分区是微胶囊。上文描述了合适的分区和生成分区的方法的示例。

在一些实施方式中，该分区库包含在形状和/或尺寸方面基本均匀的分区。例如，在一些实施方式中，这些分区(如液滴)在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中，这些分区(如液滴)的平均直径是约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000微米。在一些实施方式中，这些分区(如液滴)的平均直径小于约1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50或25微米。在一些实施方式中，该分区库包含在形状和/或尺寸方面不均匀的分区(如液滴)。

在一些实施方式中，这些分区(如液滴)在体积上基本均匀。例如，在一些实施方式中，这些分区(如液滴)的平均体积为约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50nL。

在一些实施方式中，这些分区(如液滴)是稳定的且能够长期储存。在一些实施方式中，这些分区可在约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃下长时间储存(例如至少30天、至少60天、至少90天或更长)。

V.试剂盒

在另一方面，提供本文所述的检测抗原的试剂盒或检测特异性结合抗原的抗体分析物的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包含本文所述一种或多种亲和试剂，例如本文所述一种或多种抗体、抗体片段、非抗体蛋白支架、抗体模拟物和/或适体。在一些实施方式中，试剂盒还包括用于形成分区一种或多种的试剂、检测试剂、和/或核酸扩增的试剂(如缓冲液、酶、dNTP、引物、探针、封闭剂、生物防腐剂等)。在一些实施方式中，用于检测抗体分析物的试剂盒还包括所述抗体分析物特异性结合的抗原。在一些实施方式中，试剂盒还包括进行本文所述方法的说明。

VI实施例.

提供以下实施例用于说明而非限制本发明所要求的权利。

实施例1：检测抗原的方案1

本实施例证明用两种一级亲和试剂(如抗体)检测感兴趣的抗原，其中所述亲和试剂各特异性结合所述抗原。样品接触一抗A和一抗B。抗体B具有共价接合的磁珠。与抗体A和B孵育后，所述样品与标记有带标签核酸("TNA")的二抗C接触。通过磁性分离和洗涤，从游离一抗A和二抗C中纯化抗原-一抗-二抗-TNA复合物，然后重悬纯化的复合物并在液滴中捕获。进行液滴数字PCR以检测TNA标记物的存在和/或定量各液滴中TNA标记物的含量。然后通过标记物信号向抗原数量的数学转化来确定抗原的检测和/或定量。参见图1。

实施例2：检测抗原的方案2

本实施例证明用两种一级亲和试剂(如抗体)检测抗原，其中所述亲和试剂各特异性结合所述抗原。本方案中，添加酶联二抗，其将底物转化为可检测形式用于检测抗原的存在。样品接触一抗A和一抗B。抗体B具有共价接合的磁珠。与抗体A和B孵育后，所述样品与特异性结合抗体A的二抗C接触。二抗C与DNA聚合酶(例如Taq、Fast Start Taq)或一些其他聚合酶(如具有应用所需特征的突变或变体DNA聚合酶)或其他酶偶联(图2A)。通过磁性分离和洗涤，从游离一抗和二抗中纯化所述抗原-一抗-二抗-DNA聚合酶复合物，然后在主混物或合适缓冲液中重悬所述复合物，所述主混物或合适缓冲液适于形成数字液滴和PCR扩增或其他荧光或生色检测(例如包括适于扩增的核酸、合适的正向和反向引物、探针；或偶联二抗C的酶的合适底物、和荧光或生色检测的试剂)。在液滴中捕获重悬复合物，然后扩增所述核酸并检测和/或定量由探针生成的荧光信号，或检测和/或定量由酶生成的荧光或生色信号(图2B)。然后通过探针信号向抗原数量的数学转化来确定抗原的检测和/或定量。

实施例3：检测抗原的方案3

本实施例证明用两种一级亲和试剂(如抗体)检测感兴趣的抗原，其中所述亲和试剂各特异性结合所述抗原。样品接触一抗A和一抗B。抗体B具有共价接合的磁珠。与抗体A和B孵育后，所述样品与用荧光团标记的二抗C接触。通过磁性分离和洗涤，从游离一抗A和二抗C中纯化抗原-一抗-二抗-荧光团复合物，然后重悬纯化的复合物并在液滴中捕获。根据本发明所述任何方法检测荧光团标记物生成的荧光信号。然后通过标记物信号向抗原数量的数学转化来确定抗原的检测和/或定量。参见图4。

实施例4：检测抗体分析物的方案

本实施例证明对结合特定抗原的感兴趣的抗体分析物的检测。含感兴趣的抗体分析物的样品与抗原和亲和试剂(如一抗B)接触，所述抗体分析物特异性结合所述抗原，所述亲和试剂也特异性结合所述抗原。亲和试剂具有共价接合的磁珠。与抗原和亲和试剂(如一抗B)孵育后，所述样品与标记的亲和试剂(如二抗C)接触。所述标记物可为本文所述任何标记物，例如但不限于具有标签的核酸(TNA)、DNA聚合酶或能将底物转化为可检测信号的其他酶，或荧光标记物。通过磁性分离和洗涤，从游离抗原和亲和试剂中纯化分析物-抗原-抗体-标记物复合物，然后重悬纯化的复合物并在液滴中捕获。然后如本文所述检测所述标记物。例如，若所述标记物是TNA标记物，进行液滴数字PCR以检测TNA标记物的存在和/或定量各液滴中TNA标记物的含量。若所述标记物是荧光团，则检测所述荧光团生成的荧光信号。然后通过标记物信号向分析物数量的数学转化来确定抗体分析物的检测和/或定量。参见图5。

实施例5：检测抗原的双抗体方案

本实施例证明用两种一级亲和试剂(如抗体)检测感兴趣的抗原，其中所述亲和试剂各特异性结合所述抗原。样品接触一抗A和一抗B。抗体A用(例如)带标签的核酸或荧光标记物(如荧光团)进行标记。抗体B具有共价接合的磁珠。与抗体A和B孵育后，通过磁性分离和洗涤，从游离一抗A中纯化抗原-一抗-二抗-荧光团复合物，然后重悬纯化的复合物并在液滴中捕获。然后检测各液滴是否存在所述标记物(如荧光团标记物生成的荧光信号可根据本文所述任何检测方法进行检测，或进行液滴数字PCR以检测TNA标记物的存在和/或定量各液滴中的TNA标记物的含量)。然后通过标记物的含量/信号向抗原数量的数学转化来确定抗原的检测和/或定量。参见图6。

应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和范围以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

Claims

1.检测样品中抗原的方法，所述方法包括：

至少将来自所述分离样品的标记物划分为多个分区；和

检测至少一个分区中是否存在所述标记物；从而检测是否存在所述抗原。

2.检测样品中抗原的方法，所述方法包括：

至少将来自所述分离样品的标记物划分为多个分区；和

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述经划分的标记物在所述抗原-亲和试剂-标记物复合物中。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述划分步骤前将所述标记物从所述抗原-亲和试剂-标记物复合物上切下。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述分离步骤之后并在所述划分步骤之前，所述方法还包括在溶液中至少重悬来自所述分离样品的标记物。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述第一、第二和第三亲和试剂各选自：抗体、适体、和非抗体蛋白支架。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述第一、第二和第三亲和试剂各为抗体。

8.如权利要求2所述的方法，其中所述第一和第二亲和试剂各选自：抗体、适体、和非抗体蛋白支架。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述第一和第二亲和试剂各为抗体。

10.如权利要求1或2所述的方法，其中所述标记物是核酸标记物。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸标记物包含可检测标签。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸标记物在所述检测步骤之前扩增。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述核酸标记物在存在探针的情况下扩增，所述探针包含荧光团和淬灭剂，所述核酸标记物的扩增生成来自所述探针的荧光信号。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述分区包含用于核酸扩增的试剂。

15.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸标记物未在所述检测步骤之前扩增。

16.如权利要求11所述的方法，其中所述可检测标签是荧光团。

17.如权利要求11所述的方法，其中所述可检测标签是插入染料。

18.如权利要求1或2所述的方法，其中所述标记物是酶，并且所述检测包括检测所述酶生成的产物。

19.如权利要求18所述的方法，所述酶选自：辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、水解二乙酸荧光素的酯酶、和聚合酶。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述酶是DNA聚合酶，并且所述检测包括检测所述DNA聚合酶生成的核酸扩增产物。

21.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述标记物是荧光团。

22.如权利要求1所述的方法，其中与含所述第一和第二亲和试剂的样品接触的所述第三亲和试剂共价结合所述标记物。

23.如权利要求2所述的方法，其中当所述第一亲和试剂接触所述样品时，所述标记物共价结合所述第一亲和试剂。

24.如权利要求1或2所述的方法，其中使用吸引所述磁珠的磁体从含所述抗原-亲和试剂-标记物复合物的样品中分离所述抗原-亲和试剂-标记物复合物和未复合组分，所述磁珠连接所述抗原-亲和试剂-标记物复合物中的第二亲和试剂。

25.如权利要求1或2所述的方法，其中所述分区是液滴。

26.如权利要求25所述的方法，所述液滴被不互溶的运载体流体包围。

27.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一亲和试剂和所述第二亲和试剂以大致等同的亲和性特异性结合所述抗原。

28.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一亲和试剂和所述第二亲和试剂以不同亲和性特异性结合所述抗原。

29.如权利要求1或2所述的方法，其中所述抗原是蛋白质、多糖、毒素、细胞壁、细胞被囊、病毒被囊、病毒包衣、鞭毛、纤毛或菌毛、微生物、与蛋白质或多糖复合的核酸、或与蛋白质或多糖复合的脂质。

30.如权利要求1或2所述的方法，还包括定量含所述标记物的分区数量。

31.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括检测所述样品中的两种或更多不同抗原。

32.检测样品中特异性结合抗原的抗体分析物的方法，所述方法包括：

将所述样品与所述抗原和第一亲和试剂接触，其中所述第一亲和试剂连接磁珠并特异性结合所述抗原，从而形成分析物-抗原-亲和试剂复合物；

至少将来自所述分离样品的标记物划分为多个分区；和

检测至少一个分区中是否存在所述标记物；从而检测是否存在所述抗体分析物。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述经划分的标记物在所述分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物中。

34.如权利要求32所述的方法，其中在所述划分步骤前将所述标记物从所述分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物上切下。

35.如权利要求32所述的方法，其中在所述分离步骤之后并在所述划分步骤之前，所述方法还包括在溶液中至少重悬来自所述分离样品的标记物。·

36.如权利要求32所述的方法，其中所述第一和第二亲和试剂各选自：抗体、适体、和非抗体蛋白支架。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述第一和第二亲和试剂各为抗体。

38.如权利要求32所述的方法，其中所述标记物是核酸标记物。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述核酸标记物包含可检测标签。

40.如权利要求38或39所述的方法，其中所述核酸标记物在所述检测步骤之前扩增。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述核酸标记物在存在探针的情况下扩增，所述探针包含荧光团和淬灭剂，所述核酸标记物的扩增生成来自所述探针的荧光信号。

42.如权利要求40所述的方法，其中所述分区包含用于核酸扩增的试剂。

43.如权利要求38或39所述的方法，其中所述核酸标记物未在所述检测步骤之前扩增。

44.如权利要求39所述的方法，其中所述可检测标签是荧光团。

45.如权利要求39所述的方法，其中所述可检测标签是插入染料。

46.如权利要求32所述的方法，其中所述标记物是酶，并且所述检测包括检测所述酶生成的产物。

47.如权利要求46所述的方法，所述酶选自：辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、水解二乙酸荧光素的酯酶和聚合酶。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述酶是DNA聚合酶，并且所述检测包括检测所述DNA聚合酶生成的核酸扩增产物。

49.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述标记物是荧光团。

50.如权利要求32所述的方法，其中与含所述分析物-抗原-亲和试剂复合物的样品接触的第二亲和试剂共价结合所述标记物。

51.如权利要求32所述的方法，其中使用吸引所述磁珠的磁体从含所述分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物的样品中分离所述分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物和未复合组分，所述磁珠连接所述分析物-抗原-亲和试剂-标记物复合物中的第一亲和试剂。

52.如权利要求32所述的方法，其中所述分区是液滴。

53.如权利要求52所述的方法，所述液滴被不互溶的运载体流体包围。

54.如权利要求32所述的方法，其中所述抗原是蛋白质、多糖、毒素、细胞壁、细胞被囊、病毒被囊、病毒包衣、鞭毛、纤毛或菌毛、微生物、与蛋白质或多糖复合的核酸、或与蛋白质或多糖复合的脂质。

55.如权利要求32所述的方法，还包括定量含所述标记物的分区数量。

56.如权利要求32所述的方法，其中所述方法包括检测所述样品中的两种或更多不同抗体分析物。

57.一种根据权利要求1产生的用于检测是否存在抗原的分区库，其中所述分区库包含两个或更多分区，其中至少一些分区包含第一亲和试剂、第二亲和试剂和第三亲和试剂；其中若所述抗原存在则所述第一和第二亲和试剂各特异性结合所述抗原；其中所述第二亲和试剂连接磁珠；并且其中所述第三亲和试剂包含标记物并特异性结合所述第一亲和试剂。

58.一种根据权利要求2产生的用于检测是否存在抗原的分区库，其中所述分区库包含两个或更多分区，其中至少一些分区包含第一亲和试剂和第二亲和试剂；其中所述第一亲和试剂包含标记物；其中所述第二亲和试剂连接磁珠；并且其中若所述抗原存在则所述第一和第二亲和试剂各特异性结合所述抗原。

59.一种根据权利要求32产生的用于检测是否存在特异性结合抗原的抗体分析物的分区库，其中所述分区库包含两个或更多分区，其中至少一些分区包含所述抗原、第一亲和试剂和第二亲和试剂；其中所述第一亲和试剂连接磁珠并特异性结合所述抗原；并且其中所述第二亲和试剂包含标记物并且若所述抗体分析物存在则所述第二亲和试剂特异性结合所述抗体分析物。

60.如权利要求57-59中任一项所述的分区库，其中所述标记物是核酸标记物。

61.如权利要求60所述的分区库，其中所述核酸标记物包含可检测标签。

62.如权利要求57-59中任一项所述的分区库，其中所述标记物是酶。

63.如权利要求62所述的分区库，其中所述酶是辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、水解二乙酸荧光素的酯酶或聚合酶。

64.如权利要求57-59中任一项所述的分区库，其中所述标记物是荧光团。

65.如权利要求57-59中任一项所述的分区库，其包含至少500个分区。

66.如权利要求57-59中任一项所述的分区库，其中至少一个分区包含标记物。

67.如权利要求57-59中任一项所述的分区库，所述分区是液滴。

68.如权利要求67所述的分区库，所述液滴被不互溶的运载体流体包围。