CN107367616B - 一种前列腺特异性抗原检测试剂与试剂盒 - Google Patents
一种前列腺特异性抗原检测试剂与试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107367616B CN107367616B CN201710622264.4A CN201710622264A CN107367616B CN 107367616 B CN107367616 B CN 107367616B CN 201710622264 A CN201710622264 A CN 201710622264A CN 107367616 B CN107367616 B CN 107367616B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- psa
- antibody
- detection
- dna
- prostate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 title description 65
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims abstract description 40
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 14
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 claims abstract 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 18
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 16
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 10
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 9
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 abstract description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 6
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 4
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000011807 nanoball Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 description 1
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- -1 pH= 7.4) Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 208000017497 prostate disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000025396 ringed hair disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明涉及一种前列腺特异性抗原检测试剂与试剂盒。所述检测试剂,包括PSA第一抗体、PSA第二抗体和剪切酶共标记的纳米磁珠、和剪切酶所作用的信号扩增反应液。所述信号扩增反应液含有荧光素/淬灭剂标记发卡DNA链,当所述发卡DNA链被纳米磁珠上高度分布的剪切酶切断后,荧光素和淬灭剂分离,便能释放荧光信号,从而放大PSA的检测信号。本发明试剂及试剂盒操作简单、灵敏度高、特异性好,适用于人体精液、血清中PSA的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域,具体地,本发明涉及前列腺特异性抗原检测试剂和含有其的试剂盒。
背景技术
前列腺癌(Prostatic Cancer,PCa)是目前男性群体中多发的癌症,如果在早期就能够被及时诊断则可以有效地应对和治疗。前列腺特异性抗原(PSA)自从几十年前被开发以来一直作为前列腺症临床诊断的主要蛋白类生物标志物。PSA在血清中主要以游离PSA和结合态PSA存在,游离态称为fPSA,结合态称为(tPSA)PSA,水平在4ng mL-1或者更低的情况下被认为是正常值,而超过4ng mL-1被认为是危险值。
传统的检测前列腺特异性抗原的方法有酶联免疫法(ELISA),放射性免疫测定(RIA),荧光法,化学发光法,电泳法,方法中多使用纳米金标记技术来获得放大信号,其操作复杂,且稳定性和重现性差。纳米材料在多次合成时很难保持结构和性能的一致,不利于检测结果的重现性。而基于各种DNA工具酶的DNA分子机器信号放大策略已经成为近几年来生物传感领域的研究热点。继聚合酶链式反应之后,恒温循环放大反应由于条件温和引起了研究者的注意。然而,虽然基于等温扩增技术的DNA分子机器由于DNA的优良可设计性和明显的放大作用被用于肿瘤疾病的检测,但是目前检测对象仅限于核酸类的肿瘤标志物或肿瘤细胞本身。核酸类肿瘤标志物基本上仅存在于肿瘤细胞内部,这就意味着在疾病检测过程中需要进行组织活检提取细胞等操作,检测过程对病人创伤比较大,不利于肿瘤疾病的早期、广泛筛查。而目前创伤比较小的血清类肿瘤标志物的检测由于检测方法的局限性,灵敏度远低于核酸类肿瘤标志物,无法满足血清中低丰度蛋白的灵敏检测。
中国专利申请CN10544356A公开了一种检测血清或精液中PSA特异性抗原的新型前列腺特异性抗原检测试剂盒,其利用抗PSA抗体-待测抗原-剪切酶修饰的抗PSA第二抗体形成夹心结构,通过剪切酶引发DNA分子机器循环放大信号,实现了高灵敏度定量检测PSA特异性抗原。反应原理如图1所示,在上述检测试剂盒中,用于DNA分子机器循环的反应物包括两条发卡DNA链,其中一条含有茎环结构DNA1,另一条为具有发夹结构的荧光探针DNA2,此外还需要一条引物DNA,聚合酶Klenow和含有dNTP的缓冲液。在反应循环中,第一个等温扩增循环在剪切酶,聚合酶作用下,DNA1经剪切酶剪切后,DNA片段被新生成的DNA链取代,周而复始,释放出大量的DNA片段。该DNA片段与探针DNA 2的环区域互补可以打开它的发卡结构。然后,在短的引物DNA链和聚合酶作用下,引物从探针DNA 2打开的颈的部位引发聚合反应。在此过程中引物在聚合酶作用下延伸,发生取代反应生出上述DNA片段,发生了第二个等温扩增循环反应。反应一旦引发后,就会周而复始的发生聚合、剪切和取代反应,往复循环地产生大量的上述DNA片段去打开更多的发卡探针DNA 2。在同一时间,由于探针DNA 2被上述DNA片段打开,构象变化标记的荧光基团Cy5和猝灭剂BHQ分离,产生了一个明显的荧光信号,这样使信号放大有了明显的提高,实现了对待测样品中含有的PSA抗原的检测。
在上述方法中,为了增强荧光检测信号,通过多重DNA等温扩增循环反应实现,使用的反应体系复杂,成本高,不适于实际应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种前列腺特异性抗原PSA检测试剂。
本发明的另一个目的是提供检测前列腺特异性抗原的试剂盒。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种检测待测样本中前列腺特异性抗原的检测试剂,包括
固定于载体上的第一抗体,所述第一抗体为抗PSA抗体;
磁性纳米微球,所述磁性纳米微球的表面修饰有第二抗体和剪切酶,所述第二抗体为抗游离PSA抗体;以及
用于剪切酶与探针DNA反应的DNA反应液,所述DNA反应液包括:
探针DNA,所述探针DNA为发卡结构,其DNA链一端标记有荧光素,另一端标记有淬灭剂;和
反应缓冲液。
优选地,所述剪切酶为Nb.BtSI,所述探针DNA具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。优选地将所述第一抗体包被于固相载体上,所述固相载体可以是微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒,更优选为微孔板。
上述检测试剂还可以包括标准品溶液,所述标准品为前列腺特异性抗原(PSA)。
本发明主要的检测试剂为PSA第一抗体、PSA第二抗体和剪切酶共标记的纳米磁珠、和剪切酶所作用的信号扩增反应液。
所述PSA第一抗体、PSA第二抗体可与抗原PSA形成夹心物,而通过纳米磁珠和PSA第二抗体偶联的剪切酶可用于引发荧光信号扩增反应。荧光信号扩增反应液含有茎环状发卡DNA链,所述发卡DNA链的链两端分别连有荧光素和淬灭剂。当发卡DNA链被剪切酶切开后,淬灭剂与荧光素分离,释放荧光信号。
本发明的PSA第二抗体和剪切酶共标记的纳米磁珠上高密度地分布着剪切酶,这样使得低水平量的抗原PSA可通过结合共标记纳米磁珠、剪切酶与荧光素/淬灭剂标记的发卡DNA链反应级联放大信号。
本发明也提供含有上述检测试剂的试剂盒,所述试剂盒除含有上述检测试剂外,还可以包含通常检测所需要的洗涤液、样品稀释液,还可以包括试剂盒使用说明等资料。
更具体地,本发明的检测试剂盒包括,包被有PSA第一抗体的微孔板、含有PSA第二抗体和Nb.BtSI剪切酶共标记的纳米磁珠、含有荧光素/淬灭剂标记的发卡DNA链的NEBuffer缓冲液、PSA标准品溶液,浓缩洗涤液,样品稀释液,试剂盒说明书。
有益效果:本发明创新性地设计了一种基于二抗和剪切酶修饰的磁性纳米球引发的DNA分子机器循环放大的新型前列腺特异性抗原检测试剂盒,通过一抗/抗原/二抗的特异性夹心结构结合,使得磁性纳米球上的剪切梅引发了DNA的不断剪切实现对信号的放大,进而实现对前列腺特异性抗原高灵敏和高特异检测。
本发明提供的前列腺特异性抗原PSA检测试剂盒操作程序简单、灵敏度高、特异选择性好,适用于人体精液、血清中前列腺特异性抗原的快速、准确检测。
附图说明
图1:现有技术(CN10544356A)中检测PSA的原理示意图;
图2:本发明荧光检测PSA的原理示意图;
图3:荧光响应曲线;
图4:工作曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但不限制权利要求书范围。
本发明所用材料均为市售。
材料和设备:
前列腺特异性抗原(PSA)(上海领潮生物有限公司)
抗-PSA抗体(一抗,规格:L1C00401、批号:C130801)(上海领潮生物有限公司)
抗-游离PSA抗体(二抗,规格:L1C00402,批号:C130601)(上海领潮生物有限公司);
链霉亲和素修饰的磁性纳米材料(Invitrogen);
生物素-NHS、牛血清白蛋白(美国西格玛试剂公司);
剪切酶Nb.BtSI、NEBuffer缓冲液(纽英伦生物技术有限公司);
荧光素/淬灭剂标记的发卡DNA链(5’BHQ-gcagtgaga tttttttt tttttttttttttttt tctcactgc-3’FAM,大连TaKaRa公司);发卡DNA链序列:SEQ ID NO.1:5’gcagtgaga tttttttt tttttttt tttttttt tctcactgc-3’;
碳酸钠、碳酸氢钠等基础药品(国药集团化学试剂有限公司);
荧光分光光度计(F-4500型,日本,Hitachi公司)。
设计思路:
如图2所示,首先含有前列腺特异性抗原第一抗体(Ab1)的包被液,依次滴入96孔或48孔微孔板里,使酶标板底部修饰上一层Ab1。通过抗体Ab1、Ab2与靶抗原Antigen的夹心免疫反应将剪切酶Nb.BtSI修饰到微孔板的表面。然后,在微孔板中加入制备的反应缓冲液(发夹结构的荧光探针DNA(在其末端修饰荧光基团FAM和猝灭剂BHQ),)并在37℃条件下反应。此时,切酶Nb.BtSI剪切DNA相应的位点,由于探针DNA被切成两个片段导致荧光基团FAM和猝灭剂BHQ分离,产生了一个明显的荧光信号。因为一个磁珠上可以修饰大量的切酶,并且每个剪切酶能够切断大量的发夹结构的荧光探针DNA,这样使信号放大有了明显的提高。没有靶抗原,剪切酶Nb.BtSI不能修饰到微孔板上,剪切反应就不会发生。
我们发现,靶抗原(PSA)的量影响着荧光的最终信号,因为它反映剪切酶Nb.BtSI的量,剪切酶Nb.BtSI在实验中起着关键的作用。靶抗原的浓度的增加导致剪切酶Nb.BtSI的量的增加并产生一个明显的荧光增强信号。
借助ELISA免疫吸附,以固定化PSA第一抗体捕获样品PSA,再以PSA第二抗体和剪切酶共标记的纳米磁珠相孵育,形成夹心结构(PSA第一抗体/PSA/PSA第二抗体和剪切酶共标记的纳米磁珠);而剪切酶又可切开荧光素/淬灭剂标记的发卡DNA链,使得荧光素与淬灭剂分离,从而释放荧光信号,检测信号便可定量分析。
整体技术方案:
1、96孔或48孔微孔板的包被:制备含有前列腺特异性抗原第一抗体(anti-PSA)的包被液,依次滴入96孔或48孔微孔板里,使酶标板底部修饰上一层anti-PSA。然后用缓冲液洗涤微孔板,使用牛血清白蛋白封闭经洗涤的微孔板。
2、制备修饰有剪切酶和前列腺抗原第二抗体(anti-fPSA)的磁性纳米微球:首先将链霉亲和素标记的磁性纳米微球表面通过亲和素和生物素的亲和反应修饰上生物素-NHS,然后将第二抗体(anti-fPSA)和剪切酶Nb.BtSI按照一定的比例修饰到磁性纳米材料表面,最后通过磁性分离除去溶液中没有结合到磁性纳米材料表面的多余第二抗体(anti-fPSA)和剪切酶Nb.BtSI,从而制备成了修饰有anti-fPSA和剪切酶的磁性纳米微球。
3、前列腺特异性抗原的检测:把含有前列腺特异性抗原的待测液加入到微孔板的孔里,使固定于板上的前列腺抗原的第一抗体与待测抗原特异性结合;加入制备好的修饰有anti-fPSA和剪切酶Nb.BtSI的磁性纳米微球,构成抗体/抗原/抗体的夹心结构。加入剪切酶所作用的反应液(发卡探针DNA溶液),即含有1条标记荧光素和猝灭剂的发卡探针DNA链的NEBuffer缓冲液,引发DNA分子机器,切断发卡DNA,使修饰其两端的荧光素和猝灭剂互相远离,呈现荧光信号。
4、荧光强度测试:通过实验选择系列标准品浓度为0,0.2,0.8,1.6,3.2,8.6,11.0,20ng mL-1。
5、配制试剂盒其他组分:20倍浓缩洗涤液(含有0.05%吐温-20的0.02M磷酸盐缓冲液,pH=7.4)、样品稀释液(灭活的小牛血清)、剪切酶所作用的反应液为发卡探针DNA链的NEBuffer缓冲液。
6、鉴定该方法制成试剂盒的准确度、灵敏度、精密度和稳定性合格。
7、根据试剂盒的需要量将这些组分分装在小瓶中,组装为成品。
实施例1【检测试剂盒的配置与检测调试】
1.1试剂配置
PSA第一抗体、20倍浓缩洗涤液(含有0.05%吐温-20的0.02M磷酸盐缓冲液,pH=7.4)、样品稀释液(灭活的小牛血清)、含有荧光素/淬灭剂标记的发卡DNA链的NEBuffer缓冲液。
1.2检测调试操作步骤
配制PSA系列标准品,其浓度为0、0.2、0.8、1.6、3.2、8.6、11.0、20ng mL-1。
(1)微孔板的包被:用包被缓冲液(50mM碳酸钠、50mM碳酸氢钠、pH=9.6)溶解PSA第一抗体,使PSA第一抗体浓度为10μg/ml,以100μL/孔加入到微孔板中,4℃放置过夜。第二天弃去包被液后,用蒸馏水洗涤3次,每孔加入150μL 1%牛血清白蛋白,37℃封闭1h。
(2)制备修饰有前列腺抗原第二抗体和剪切酶的磁性微球:取200μL链霉亲和素修饰的磁珠,洗涤后加入100μL 0.5μg/ml PSA第二抗体和100μL剪切酶Nb.BtSI(1U/μL)反应90min,洗涤后备用。
(3)每孔加入100μL待测抗原溶液反应90min,洗涤后加入100μL修饰有PSA第二抗体和剪切酶共标记的磁性微球反应90min,洗涤后加入浓度为含有10-6M的发卡DNA的NEBuffer缓冲液,于微孔板中反应90min。
(4)荧光测试:上述反应完后,将反应液放入荧光分光光度计中进行荧光测试。
以PSA标准品溶液鉴定,该试剂盒的准确度、灵敏度、精密度和稳定性均合格。
如图3所示,随着PSA浓度的升高,荧光信号强度增加。将每条曲线在518nm处的峰值荧光对浓度的对数值作图,工作曲线见图4所示。当PSA浓度在0.2ng mL-1到100ng mL-1的范围内,荧光响应与其呈线性关系,回归方程为I(a.u.)=67.63+148.9log c(PSA,ng mL-1),该试剂盒对列腺抗原(PSA)的检测限为0.2ng mL-1。
根据试剂盒的需要量将这些组分分装在小瓶中,组装为成品试剂盒。
实施例2【检测试剂盒的使用方法】
1、自4℃冰箱中取出试剂盒,室温平衡20分钟,取一瓶浓缩洗液,加蒸馏水(1mL+19mL)备用。
2、将微孔板从密封袋中取出,将洗涤液注满各孔,静置10-20秒,甩掉洗涤液,重复洗板,最后在干净的吸水纸上拍干。
3、设系列标准品浓度各2孔,每个样品孔2孔,取标准品或样品溶液各50μL置于对应板孔中,微量振荡器充分振荡混匀,用不干胶片封盖反应板,然后置反应板37℃温育30分钟。
4、小心甩去反应液,然后洗涤五次同步骤2。
5、取PSA第二抗体和剪切酶共标记的磁珠溶液100μL置于对应板孔中,微量振荡器充分振荡混匀,用不干胶片封盖反应板,然后置反应板37℃温育30分钟。
6、小心甩去反应液,然后洗涤五次同步骤2。
7、于对应板孔中加入剪切酶所作用的信号扩增反应液(发卡DNA链的NEBuffer溶液)200μL,微量振荡器充分振荡混匀,用不干胶片封盖反应板,然后置反应板37℃温育60分钟后对溶液荧光强度进行测量。
8、用对数坐标以荧光强度值对PSA浓度对数作图,通过标准曲线对样品血清中PSA实现定量分析。
与CN105044356A的技术方案(方案1)相比,两个方案的灵敏度和检测限相似(方案1为:0.5ng mL-1,本发明(方案2)为:0.2ng mL-1),方案1主要是通过剪切酶、两条发卡DNA链、一条引物链、聚合酶Klenow、dNTP的NEBuffer缓冲液所形成的DNA多重等温循环放大策略来增强荧光信号,反应体系复杂,试剂成本高;而方案2是通过在磁珠表面增加剪切酶的量来增加剪切酶切断大量发夹结构的荧光探针DNA,从而增加荧光信号。反应体系简单,试剂成本大大降低。
SEQUENCE LISTING
<110> 临沂大学
<120> 一种前列腺特异性抗原检测试剂与试剂盒
<130> SD1326-17P121637
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 发卡DNA链序列
<400> 1
gcagtgagat tttttttttt tttttttttt ttttctcact gc 42
Claims (7)
1.一种检测待测样本中前列腺特异性抗原的检测试剂,包括
固定于载体上的第一抗体,所述第一抗体为抗PSA抗体;
磁性纳米微球,所述磁性纳米微球的表面修饰有第二抗体和剪切酶,所述第二抗体为抗游离PSA抗体;以及
用于剪切酶与探针DNA反应的DNA反应液,所述DNA反应液包括:
探针DNA,所述探针DNA为发卡结构,其DNA链一端标记有荧光素,另一端标记有淬灭剂;和
反应缓冲液;
其中所述剪切酶为Nb.BtSI,所述探针DNA具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于将所述第一抗体包被于固相载体上,所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
3.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于所述检测试剂进一步包括标准品溶液,所述标准品为前列腺特异性抗原。
4.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在所述反应缓冲液为NEBuffer。
5.一种检测试剂盒,用于检测待测样本中前列腺特异性抗原,包含权利要求1所述的检测试剂。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒,其特征在于进一步含有洗涤液和样品稀释液。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒,其特征在于所述洗涤液为20倍浓缩洗涤液,组成为含有0.05%吐温-20的0.02M磷酸盐缓冲液、pH=7.4;所述样品稀释液为灭活的小牛血清。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710622264.4A CN107367616B (zh) | 2017-07-27 | 2017-07-27 | 一种前列腺特异性抗原检测试剂与试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710622264.4A CN107367616B (zh) | 2017-07-27 | 2017-07-27 | 一种前列腺特异性抗原检测试剂与试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107367616A CN107367616A (zh) | 2017-11-21 |
CN107367616B true CN107367616B (zh) | 2019-01-15 |
Family
ID=60307701
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710622264.4A Expired - Fee Related CN107367616B (zh) | 2017-07-27 | 2017-07-27 | 一种前列腺特异性抗原检测试剂与试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107367616B (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108445213B (zh) * | 2018-03-23 | 2020-09-01 | 临沂大学 | 一种高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针、组合物及荧光定量试剂盒 |
CN110208538B (zh) * | 2019-06-27 | 2022-02-25 | 临沂大学 | 一种前列腺特异抗原的检测试剂盒、检测方法及应用 |
CN110596060B (zh) * | 2019-09-12 | 2020-08-21 | 江南大学 | 一种检测前列腺特异性抗原的光谱分析中荧光传感器的构建方法及其应用 |
CN112301095A (zh) * | 2020-08-25 | 2021-02-02 | 西北工业大学 | 一种超灵敏检测前列腺特异性抗原psa的方法 |
CN116087497B (zh) * | 2021-11-05 | 2024-08-16 | 湖南早晨纳米机器人有限公司 | 一种非线性杂交链式免疫检测试剂及方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030190602A1 (en) * | 2001-03-12 | 2003-10-09 | Monogen, Inc. | Cell-based detection and differentiation of disease states |
JP4692200B2 (ja) * | 2005-10-06 | 2011-06-01 | 横河電機株式会社 | 化学処理用カートリッジおよびその使用方法 |
CN105044356A (zh) * | 2015-07-01 | 2015-11-11 | 临沂大学 | 一种新型前列腺特异性抗原检测试剂盒 |
-
2017
- 2017-07-27 CN CN201710622264.4A patent/CN107367616B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107367616A (zh) | 2017-11-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107367616B (zh) | 一种前列腺特异性抗原检测试剂与试剂盒 | |
Virkler et al. | Analysis of body fluids for forensic purposes: from laboratory testing to non-destructive rapid confirmatory identification at a crime scene | |
KR101029343B1 (ko) | 면역분석 기반의 항원 검출용 키트 및 항원 검출 방법 | |
CN103033619B (zh) | 一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒及方法 | |
JP2008259496A (ja) | Dnaアプタマーを用いて標的タンパク質を検出する方法及びキット | |
RU2107730C1 (ru) | Молекулярный зонд | |
WO2017181339A1 (zh) | 蛋白配体和基因同时检测方法及试剂盒 | |
Zhang et al. | Recent progress on rapid lateral flow assay-based early diagnosis of COVID-19 | |
CN108290158A (zh) | 测定板及其用途 | |
CN109468384A (zh) | 一种同时检测45个y基因座的复合扩增检测试剂盒 | |
CN108192948A (zh) | 一种利用α-溶血素纳米孔检测DNA糖基化酶活性的方法 | |
Jia et al. | based point-of-care testing of SARS-CoV-2 | |
CN105525010A (zh) | 一种茎环结构组合探针及其应用 | |
US20090075298A1 (en) | Method of analyzing enzyme | |
KR20200144498A (ko) | 핵산 검출 방법 | |
US6255060B1 (en) | Method of detecting protein by immuno RNA | |
CN104726606B (zh) | 一种pcr酶联双杂交法检测病原微生物检测方法 | |
CN105567839A (zh) | 基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测dna的比色法 | |
CN108445213A (zh) | 一种高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针、组合物及荧光定量试剂盒 | |
CN108841828A (zh) | 一种特异性识别妥布霉素的单链dna适配体及其应用 | |
CN113624724A (zh) | 一种适配体分子信标对靶分子的多元检测分析方法 | |
CN115436335B (zh) | 一种基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法 | |
CN110468182A (zh) | 一种检测血小板衍生生长因子bb的均相生物分析方法及其应用 | |
EP2143806A1 (en) | Method of measuring dna methylation | |
CN105044356A (zh) | 一种新型前列腺特异性抗原检测试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190115 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |