CN108445213A - 一种高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针、组合物及荧光定量试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及荧光定量检测领域，提供了一种高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针，所述纳米复合探针包括负载待检测血清肿瘤标志物二抗和DNA酶链的金纳米粒子。本发明提供的纳米复合探针，以金纳米粒子为载体，负载了高催化特性的脱氧核酶，形成的复合物既保留了脱氧核酶的高催化特性和识别能力，又引入了纳米材料的信号转导功能，实现了识别与信号转导功能的一体化。结合肿瘤标志物高效的特异性识别功能、脱氧核酶的高识别和催化特性结合以及金纳米粒子的信号转导和荧光放大功能显著提高了荧光定量检测的灵敏度和特异性，检测灵敏度可达到0.01ng/mL。
Description
技术领域
本发明涉及荧光定量检测领域，具体涉及一种高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针、包括该纳米复合探针的组合物和荧光定量试剂盒。
背景技术
在癌症的研究和临床实践中，肿瘤标志物(tumormarker)在肿瘤普查、诊断、判断预后、评价治疗疗效和高危人群随访观察等方面都具有较大的实用价值。肿瘤标志物最早提出于1978年，当时是在美国国立癌症研究所召开的“人类免疫及肿瘤免疫诊断”会上由Herberman提出的。次年在英国第七届肿瘤发生生物学和医学会议上被与会者确认，并开始公开引用。
肿瘤标志物是指在恶性肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞异常分泌或脱落，或由机体因肿瘤反应而产生和/或升高的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶(同工酶)、多胺及癌基因产物等。肿瘤标志物存在于病人的血液、体液、细胞或组织中。如果这些肿瘤标志物在人体中的含量明显高于正常值，则可能预示着患有某种癌症，因此对这些肿瘤标志物的高灵敏高选择性测定在临床研究和诊断上意义非常重大。
由于癌症早期体内肿瘤标志物的含量一般非常低，常规的检测方法很难对其进行精确定量和特异性分析，且易导致假阳性和假阴性结果。例如，酶联免疫分析法在当前被广泛采用，但所针对的患者均是肿瘤发育到相当阶段后才能检出；放射免疫分析法也是肿瘤标志物检测的主要方法，但这种方法存在操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等诸多缺点。
发明内容
有鉴于此，本发明为了提高荧光定量检测血清肿瘤标志物方法的灵敏度，提供了一种纳米复合探针，以及包含该纳米复合探针的组合物和荧光定量试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针，所述纳米复合探针包括金纳米粒子以及负载在所述金纳米粒子表面的待检测血清肿瘤标志物二抗和DNA酶链，所述DNA酶链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述DNA酶链能与荧光素和荧光猝灭剂修饰的具有发卡结构的底物链结合，在Zn2+催化下切断底物链使荧光素与荧光猝灭剂分离，产生荧光信号。
优选的，所述底物链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述纳米复合探针的制备方法为：以金纳米粒子为载体，先将所述DNA酶链修饰在金纳米粒子表面，得到金纳米粒子-酶链；再将待检测血清肿瘤标志物二抗修饰在所述金纳米粒子-酶链上。
优选的，所述DNA酶链与金纳米粒子通过共价键连接。
优选的，所述DNA酶链、待检测血清肿瘤标志物二抗修饰的方法为不对称修饰。
本发明提供了一种提高血清肿瘤标志物荧光定量检测方法灵敏度的组合物，包括以下试剂，底物溶液和上述技术方案所述的纳米复合探针，所述底物溶液以PBS缓冲液为溶剂，包括荧光素和荧光猝灭剂修饰的发卡结构的底物链以及Zn2+，所述底物链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述底物溶液含有0.2×10-7～2.0×10-7M的所述底物链和 100～300μM的Zn2+。
本发明还提供了一种用于检测血清肿瘤标志物的荧光定量试剂盒，上述技术方案所述的组合物、包被有待测肿瘤标志物单克隆抗体的微孔板和待测肿瘤标志物的标准品。
优选的，所述待检测的血清肿瘤标志物包括CA242、PSA、CEA、AFP、 CA125、CA15-3、CA19-9、NSE、CA50、CA72-4、CYFRA21-1、TPA、SCCA、 HE4和Ft中的一种。
优选的，所述包被有待测肿瘤标志物单克隆抗体的微孔板中，待测肿瘤标志物单克隆抗体浓度为0.5～4μg/孔。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针所述纳米复合探针包括金纳米粒子以及负载在所述金纳米粒子表面的待检测血清肿瘤标志物二抗和DNA酶链，所述DNA酶链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述DNA酶链能与荧光素和荧光猝灭剂修饰的具有发卡结构的底物链结合，在Zn2+催化下切断底物链使荧光素与荧光猝灭剂分离，产生荧光信号。本发明提供的纳米复合探针，以具有生物相容性和稳定性的功能化纳米材料金纳米粒子作为载体，负载了高催化特性的脱氧核酶，形成的金纳米粒子-酶链复合物既保留了脱氧核酶的高催化特性和识别能力；又引入了功能化纳米材料的信号转导功能，实现了识别与信号转导功能的一体化。
同时，本发明还在金纳米粒子上负载了待检测的血清肿瘤标志物二抗，结合肿瘤标志物高效的特异性识别功能、脱氧核酶的高识别和催化特性结合以及金纳米粒子的信号转导和荧光放大功能显著提高了荧光定量检测的灵敏度和特异性，检测灵敏度可达到0.01ng/mL。
本发明设计了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA酶链，具有高催化活性和特异性，能够与带有RNA碱基的发卡结构底物链特异性结合，在二价锌离子的催化下切断底物链，由于底物链上修饰有荧光素和荧光猝灭剂，底物链被切断后荧光素与荧光猝灭剂远离进而产生荧光。本发明所述纳米复合探针上的每一条DNA酶链在底物链被切断后均会与另一条底物链结合并继续切断，如此反复循环反应，使得荧光信号增强，放大了特异性检测所得的反应信号，从而有效地提高了荧光定量检测的灵敏度，能够用于检测样品中含量极低的血清肿瘤标志物。
本发明所述的纳米复合探针适合多种肿瘤标志物的高灵敏检测分析，负载不同的肿瘤标志物二抗即可实现，为脱氧核酶在生物学及临床医学等领域的应用提供重要的参考和依据，也为癌症等重大疾病的早期准确诊断提供新方法、新技术。
在本发明的一些具体实施方式中，本发明利用表面不对称修饰技术制备了纳米复合探针，先在金纳米粒子表面负载所述DNA酶链，其后再负载待测血清肿瘤标志物二抗，使得纳米复合探针中含有的DNA酶链远远多于待测血清肿瘤标志物。含有较多DNA酶链的纳米复合探针催化效率更高，能够加快反应进程，快速有效的实现应该信号放大，提高荧光定量检测的灵敏度。
本发明还提供了一种提高血清肿瘤标志物荧光定量检测方法灵敏度的组合物，包括底物溶液和上述技术方案所述的纳米复合探针，所述底物溶液以 PBS缓冲液为溶剂，包括荧光素和荧光猝灭剂修饰的发卡结构的底物链和 Zn2+，所述底物链的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。本发明所述的纳米复合探针中负载的待测血清肿瘤标志物二抗能够与相关肿瘤标志物结合，添加底物溶液后，纳米复合探针上的DNA酶链与底物溶液中的底物链结合，在二价锌离子的催化下切断底物链，使底物链上修饰的荧光素和荧光猝灭剂远离产生荧光信号，本发明所述的DNA酶链与底物链的反应循环进行，可以不断产生荧光信号进而放大信号，使得荧光更容易被检出，通过检测一定反应时间后的荧光信号强度即可实现对血清肿瘤标志物的高灵敏度检测。
本发明提供了包括上述技术方案所述组合物的荧光定量试剂盒，用于检测血清肿瘤标志物，还包括包被有待测肿瘤标志物单克隆抗体的微孔板和待测肿瘤标志物的标准品。所述荧光定量试剂盒在检测时可与待测肿瘤标志物形成三明治夹心结构，实现了特异性对抗原的检测。在此基础上，本发明所述能够提高检测灵敏度的组合物能够有效放大特异性检测结果的荧光信号强度，从而实现对血清肿瘤标志物的高特异性、高灵敏度检测。
附图说明
图1为纳米复合探针的结构及合成示意图；
图2为含有纳米复合探针的荧光定量检测的原理示意图，
其中M2+表示二价锌离子；
图3为实施例4中PSA标准系列样品进行荧光定量检测得到的荧光响应曲线，曲线由低到高依次为0、0.01、0.08、0.1、0.5、1.0、5.0、10、20ng/mL 的PSA标准样品的荧光响应曲线；
图4为实施例4中PSA标准样品在518nm处的峰值荧光强度对PSA样品浓度的对数值-荧光强度的标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针，所述纳米复合探针包括负载待检测血清肿瘤标志物二抗和DNA酶链的金纳米粒子，所述DNA酶链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述DNA酶链能与荧光素和荧光猝灭剂修饰的发卡结构的底物链结合，在Zn2+催化下切断底物链使荧光素与荧光猝灭剂分离，产生荧光信号。
在本发明中，所述DNA酶链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为：
5'-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGGTAATCTACGTTTT TTATTAATT-3'。
本发明所述发卡结构的底物链由发卡部分和互补部分组成，其中互补部分为底物链的5’端和3’端部分碱基，发卡部分为底物链的中间部分碱基。在本发明中，所述发卡部分含有RNA碱基，本发明所述的DNA酶链在二价锌离子的催化下能够特异性的切断该RNA碱基，切断后的底物链互补部分在常温下不稳定而自动解链，使得底物链被切割为两段。
本发明将荧光素和荧光猝灭剂分别修饰在底物链的5’端和3’端，由于底物链的5’端和3’端互补配对使得荧光素与荧光猝灭剂接近，荧光素被荧光猝灭剂猝灭，不产生荧光信号。本发明对所述荧光素和荧光猝灭剂无特殊限定，采用本领域常用的荧光素和荧光猝灭剂即可，比如FAM和BHQ。
在本发明中，所述DNA酶链能够与荧光猝灭剂修饰的发卡结构底物链的发卡部分互补配对结合，当二价锌离子存在时，DNA酶链具有切断所述底物链发卡部分的RNA碱基功能，使底物链分为两部分，荧光素与荧光猝灭剂随之远离进而恢复荧光。切断为两部分的底物链与DNA酶链脱离，DNA酶链能够继续与其他未反应的底物链结合继续切割，如此循环往复，在高催化活性的DNA酶链不断反应下产生大量的荧光信号，具有显著的放大作用，从而获得极高的检测灵敏度，可用于血清样品中低含量的肿瘤标志物检测。
在本发明中，所述底物链的核苷酸优选的如SEQ ID NO.2所示，即5'-CCACCACATTGAAATTGACCCACTATrAGGAAGAGATGTTACGAGGCG GTGGTGG-3'。其中，“rA”为RNA碱基，本发明所述的DNA酶链能够特异性识别该位点并切割，使底物链断裂。所述底物链中，5’端的“CCACCAC”碱基与3’端的“GTGGTGG”碱基形成互补部分，中间的碱基部分“ATTGAAATTGACCCACTATrAGGAAGAGATGTTACGAGGCG”为发卡部分，发卡部分中“rA”为所述DNA酶链的酶切位点。
在本发明中，所述荧光素和荧光猝灭剂修饰的发卡结构的底物链优选为： 5'-(FAM)CCACCACATTGAAATTGACCCACTATrAGGAAGAGATGTTACGA GGCGGTGGTGG(BHQ)-3'。
在本发明中，所述纳米复合探针仅能够被二价锌离子催化产生酶切活性，其他二价金属离子无法催化本申请所述纳米复合探针产生酶切活性。
在本发明中，所述纳米复合探针以金纳米粒子为载体，先将所述DNA酶链修饰在金纳米粒子表面，得到金纳米粒子-酶链；再将待检测血清肿瘤标志物二抗修饰在所述金纳米粒子-酶链上。优选的，所述DNA酶链与金纳米粒子通过共价键连接；更优选的，所述DNA酶链通过金-巯基或金-氨基共价键连接。优选的，所述DNA酶链、待检测血清肿瘤标志物二抗修饰的方法为不对称修饰。
采用本发明所述的制备顺序能够获得含有大量DNA酶链和少量待检测的血清肿瘤标志物二抗的纳米复合探针，使得探针中富含大量的DNA酶链，缩短反应时间，快速放大荧光信号，从而实现高灵敏度的检测。
具体的，本发明所述的纳米复合探针按照如下步骤制备得到：
S1、以DNA酶链通过不对称修饰的方式修饰金纳米粒子，得到金纳米粒子-酶链；
S2、将待检测的血清肿瘤标志物二抗与S1步骤得到的金纳米粒子-酶链混合进行不对称修饰，得到纳米复合探针。
本发明通过不对称修饰的方式将DNA酶链修饰在金纳米粒子表面，得到金纳米粒子-酶链。优选的，所述DNA酶链与金纳米粒子的摩尔比为1:15～30；更优选为1:20。所述金纳米粒子的粒径优选为20～50nm，更优选为30nm。
在本发明中，所述DNA酶链通过金-氨基或金-巯基共价键组装在金纳米粒子表面；优选的，为了使DNA酶链能够以共价键方式修饰在金纳米粒子表面，在所述DNA酶链的5’端或3’端修饰巯基或氨基；更优选的，所述DNA 酶链修饰巯基后的序列为：5'-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTG GGGTAATCTACGTTTTTTATTAATT(SH)-3’。
本发明所述不对称修饰方式将DNA酶链修饰在金纳米粒子表面的方法具体为：本发明用鞣酸包覆金纳米粒子，将鞣酸包覆的金纳米粒子滴涂于带正电荷的载玻片上反应2～5h，洗涤，鞣酸包覆的金纳米粒子通过静电吸附作用吸附在带正电荷的载玻片上；将巯基或氨基修饰后的DNA酶链滴涂于洗涤后的载玻片上，进行不对称修饰形成金-氨基或金-巯基共价键，反应10～15h 后洗涤；超声3～10min使吸附在载玻片上的金纳米粒子-酶链脱离，离心，得到金纳米粒子-酶链。
得到所述金纳米粒子-酶链后，本发明将待检测的血清肿瘤标志物二抗与金纳米粒子-酶链进行不对称修饰，再加入含有1.5～5M氯化钠的PBS缓冲液，得到纳米复合探针。
在本发明中，待检测的血清肿瘤标志物二抗的浓度优选为0.1～1.0mg/mL，更优选为0.4～0.6mg/mL。所述待检测的血清肿瘤标志物二抗与金纳米粒子表面的酶链的体积比优选为1:8～20，更优选为1:10。
在本发明中，所述待检测血清肿瘤标志物二抗修饰金纳米粒子时的反应时间优选为10～18h，更优选为12～14h。本发明所述待检测的血清肿瘤标志物二抗填补金纳米粒子表面未被DNA酶链修饰的位点。
本发明对所述待检测的血清肿瘤标志物二抗无特殊限定，采用本领域常规二抗即可，比如鼠的单克隆抗血清标志物的抗体等。
本发明优选的在待检测血清肿瘤标志物二抗修饰金纳米粒子后，加入含有1.5～5M氯化钠的PBS缓冲液使反应得到的纳米复合探针稳定。所述PBS 缓冲液中优选的含有2～2.5M氯化钠。所述含有氯化钠的PBS缓冲溶液的加入量为0.1～0.2mL。
本发明提供了一种提高血清肿瘤标志物荧光定量检测方法灵敏度的组合物，包括底物溶液和上述技术方案所述的纳米复合探针；所述底物溶液以PBS 缓冲液为溶剂，包括荧光素和荧光猝灭剂修饰的发卡结构的底物链和Zn2+，所述底物链的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。将本发明所述组合物应用于血清肿瘤标志物的荧光定量检测方法中，能够有效地放大荧光信号强度，提高检测灵敏度。
在本发明中，所述底物溶液含有0.2×10-7～2.0×10-7M的荧光素和荧光猝灭剂修饰的发卡结构的底物链和100～300μM的Zn2+。优选的，所述底物溶液中含有0.5×10-7～1.2×10-7M的所述底物链；更优选为1.0×10-7M。优选的，所述底物溶液中含有120～200μM的Zn2 +；更优选为150μM。
在本发明中，所述Zn2+优选的以ZnCl2、Zn(NO3)2等形式提供。
在本发明中，所述组合物用于提高血清肿瘤标志物荧光定量检测方法灵敏度时，反应温度为20～25℃。当底物链被DNA酶链酶切后，底物链中的互补部分在该温度下不稳定而直接解离，进而使得荧光素和荧光猝灭剂远离，发出荧光信号。
本发明还提供了一种用于检测血清肿瘤标志物的荧光定量试剂盒，包括前述技术方案所述的组合物、包被有待测肿瘤标志物单克隆抗体的微孔板和待测肿瘤标志物的标准品。优选的，所述包被有待测肿瘤标志物单克隆抗体的微孔板中，待测肿瘤标志物单克隆抗体浓度为0.5～4μg/孔；更优选为 0.8～2μg/孔；最优选为1μg/孔。
具体的，本发明将含有待测肿瘤标志物单克隆抗体的包被液滴入孔板中， 4℃放置过夜，洗涤2～4次后加入牛血清白蛋白封闭0.5～1.5h，得到包被有待测肿瘤标志物单克隆抗体的微孔板。
在本发明中，所述待检测的血清肿瘤标志物包括CA242、PSA、CEA、 AFP、CA125、CA15-3、CA19-9、NSE、CA50、CA72-4、CYFRA21-1、TPA、 SCCA、HE4或Ft中的一种。
在本发明中，所述待测样品是指血清、组织样品等可能含有待测肿瘤标志物的生物样本。
本发明所述荧光定量检测试剂盒的检测原理如图2所示，微孔板上包被有待测肿瘤标志物单克隆抗体(一抗)，将待测样品加入微孔板中反应，此时一抗与抗原特异性结合；洗涤后加入纳米复合探针，纳米复合探针上的二抗能够与抗原特异性结合，从而在微孔板上形成一抗/抗原/纳米复合探针的三明治夹心结构；以水洗涤后加入含有荧光素和荧光猝灭剂修饰的底物链和二价锌离子，纳米复合探针上的DNA酶能够与底物链结合，在二价锌离子的催化下特异性切断底物链上的RNA碱基(rA)位点，20～25℃下反应0.5～1.5h 后用荧光分光光度计检测酶催化反应所产生的荧光(λex＝494nm、λem＝518nm)。利用待测肿瘤标志物的标准品绘制荧光强度与待测肿瘤标志物浓度的标准曲线，从而定量检测血清样品中的待测肿瘤标志物浓度。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1纳米复合探针的制备
将0.1mL鞣酸包覆的AuNP(30nm，50nM)滴涂于带有正电荷的洁净的载玻片上室温反应3小时，鞣酸包覆的AuNPs通过静电吸附作用吸附于带正电荷的载玻片上，载玻片呈现淡紫色，用大量的超纯水冲洗干净后，将100 μL DNA酶链(10-6M)滴涂于载玻片上，对吸附于载玻片上AuNPs进行不对称修饰。反应12h后用大量的超纯水冲洗，氮气吹干后，将载玻片置于1.0mL 的超纯水中超声5min，解除AuNPs与载玻片的吸附。超声所得溶液经离心分离得到沉淀物(8000r/min,10min)，用超纯水洗涤后，重新分散于0.1mL 的超纯水中得到不对称修饰的AuNPs-酶链。
所述DNA酶链为：5'-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTG GGGTAATCTACGTTTTTTATTAATT(SH)-3’。
将10μL二抗(0.5mg/mL)与0.1mLAuNPs-酶链混合后，在25℃下搅拌过夜，然后将0.1mL含有2M NaCl的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)逐滴加入到上述混合液中稳定纳米复合探针。将上述溶液离心并用PBS洗涤后，重新分散在0.1mL PBS中，得到二抗和酶链修饰的纳米复合探针，于4℃条件下保存。
实施例2纳米复合探针的制备
将0.1mL鞣酸包覆的AuNP(30nm，50nM)滴涂于带有正电荷的洁净的载玻片上室温反应2.5小时，鞣酸包覆的AuNPs通过静电吸附作用吸附于带正电荷的载玻片上，载玻片呈现淡紫色，用大量的超纯水冲洗干净后，将 100μL酶链(10-6M)滴涂于载玻片上，对吸附于载玻片上AuNPs进行不对称修饰。反应14h后用大量的超纯水冲洗，氮气吹干后，将载玻片置于1.0mL 的超纯水中超声8min，解除AuNPs与载玻片的吸附。超声所得溶液经离心分离得到沉淀物(9000r/min,8min)，用超纯水洗涤后，重新分散于0.1mL的超纯水中得到不对称修饰的AuNPs-酶链。
所述DNA酶链为：5'-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTG GGGTAATCTACGTTTTTTATTAATT(NH2)-3’。
将10μL、0.45mg/mL的二抗(鼠的单克隆抗人PSA抗体)与0.1mL Au NPs-酶链混合后，在25℃下搅拌过夜，然后将0.1mL含有3M NaCl的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)逐滴加入到上述混合液中稳定纳米复合探针。将上述溶液离心并用PBS洗涤后，重新分散在0.1mL PBS中，得到二抗和酶链修饰的纳米复合探针，于4℃条件下保存。
实施例3提高血清肿瘤标志物荧光定量检测方法灵敏度的组合物
所述组合物为：实施例1制备得到的纳米复合探针和底物溶液，底物溶液由1.0×10-7M的荧光素和荧光猝灭剂修饰的发卡结构的底物链、150μM的 Zn2+的PBS缓冲液组成。
所述荧光素和荧光猝灭剂修饰的发卡结构的底物链为： 5'-(FAM)CCACCACATTGAAATTGACCCACTATrAGGAAGAGATGTTACGA GGCGGTGGTGG(BHQ)-3'。
实施例4用于检测血清PSA含量的荧光定量试剂盒
微孔板包被：用包被缓冲液(50mM碳酸钠、50mM碳酸氢钠、pH＝9.6) 溶解PSA单克隆抗体，使PSA单克隆抗体浓度为10μg/mL，以100μL/孔加入到微孔板中，4℃放置过夜。第二天弃去包被液后，用蒸馏水洗涤3次，每孔加入150μL 1％牛血清白蛋白，37℃封闭1h，得到包被有PSA单克隆抗体的微孔板。
所述PSA荧光定量检测试剂盒的组成为：
包被有PSA单克隆抗体的96微孔板、实施例3得到的组合物和PSA标准品。
实施例5
本次试验利用实施例4所述的PSA荧光定量检测试剂盒对血清样品中的 PSA含量进行检测，以验证检测灵敏度。
(1)以PBS缓冲液(pH 7.4)配制PSA系列标准品，使其终浓度为0、 0.01、0.08、0.1、0.5、1.0、5.0、10、20ng/mL。
(2)向包被有PSA单克隆抗体的微孔板中，每孔加入100μL待测样品溶液反应60min，超纯水洗涤后加入100μL实施例1制备得到的纳米复合探针反应60min，超纯水洗涤后加入实施例3所述组合物中的底物溶液0.2 mL，25℃下反应60min。
(3)荧光测试：上述反应完后，将反应液放入荧光分光光度计中进行荧光测试(λex＝494nm、λem＝518nm)。
上述PSA标准系列检测所得的荧光信号响应曲线如图3所示，由下到上依次为PSA标准样品浓度为0、0.01、0.08、0.1、0.5、1.0、5.0、10、20ng/mL 时检测得到的荧光响应曲线。如图3所示，随着PSA浓度的升高，荧光信号强度增加。
取图3中每条曲线在518nm处的峰值荧光，绘制峰值荧光对浓度的对数值-荧光强度的标准曲线，曲线如图4所示，
如图3所示，随着PSA浓度的升高，荧光信号强度增加。将每条曲线在 518nm处的峰值荧光对浓度的对数值作图，工作曲线见图4所示。当PSA浓度在0.01ng/mL到20ng/mL的范围内，荧光响应与其呈线性关系，回归方程为I(a.u.)＝1119.9+485.6logc(PSA,ng/mL)，该方法对前列腺抗原(PSA)的检测限为0.01ng/mL。
可以看出，本发明提供的血清PSA荧光定量检测试剂盒的检测灵敏度高，操作简便，利用本发明提供的纳米复合探针进行荧光信号的放大，能够显著提高肿瘤标志物的检测限，对于早期肿瘤的检测有显著的益处。
实施例6
本次试验利用实施例4所述的PSA荧光定量检测试剂盒对实际样品进行检测，以验证检测的可行性。
1、向人血清中加入PSA抗原，配制成浓度为100.0ng/mL、50.0ng/mL、 10.0ng/mL,1.0ng/mL的加标样品，备用。
2、以实施例4制备得到的PSA荧光定量检测试剂盒对步骤1中制备得到的加标样品中PSA含量进行测定，每个样品重复测定6次，测定结果取平均值。试剂盒的具体使用方法参照实施例5进行。
测定结果如表1所示，采用本发明提供的PSA荧光定量检测试剂盒测定值的加标回收率在96.2％～112.4％，对每个测量浓度，我们平行检测了六次，这足以证明此法对人血清样本中PSA抗原浓度检测的良好准确性，同时说明该方法的精度良好。以上实验数据足以证明，本发明提供的PSA荧光定量检测试剂盒对人血清样品中PSA含量的测定，简单高效，准确性高，具有极好的临床应用前景。
表1该试剂盒在人实际血清样本中的回收率
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 临沂大学
<120> 一种高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针、组合物及荧光定量试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catctcttct ccgagccggt cgaaatagtg gggtaatcta cgttttttat taatt 55
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaccacatt gaaattgacc cactatragg aagagatgtt acgaggcggt ggtgg 55
Claims (10)
1.一种高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针，其特征在于，所述纳米复合探针包括金纳米粒子以及负载在所述金纳米粒子表面的待检测血清肿瘤标志物二抗和DNA酶链，所述DNA酶链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述DNA酶链能与荧光素和荧光猝灭剂修饰的具有发卡结构的底物链结合，在Zn2+催化下切断底物链使荧光素与荧光猝灭剂分离，产生荧光信号。
2.根据权利要求1所述高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针，其特征在于，所述底物链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针，其特征在于，所述纳米复合探针的制备方法为：以金纳米粒子为载体，先将所述DNA酶链修饰在金纳米粒子表面，得到金纳米粒子-酶链；再将待检测血清肿瘤标志物二抗修饰在所述金纳米粒子-酶链上。
4.根据权利要求3所述高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针，其特征在于，所述DNA酶链与金纳米粒子通过共价键连接。
5.根据权利要求4所述高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的纳米复合探针，其特征在于，所述DNA酶链、待检测血清肿瘤标志物二抗修饰的方法为不对称修饰。
6.一种提高血清肿瘤标志物荧光定量检测方法灵敏度的组合物，包括以下试剂，底物溶液和权利要求1～5任意一项所述的纳米复合探针，所述底物溶液以PBS缓冲液为溶剂，包括荧光素和荧光猝灭剂修饰的发卡结构的底物链以及Zn2+，所述底物链的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
7.根据权利要求6提高血清肿瘤标志物荧光定量检测方法灵敏度的组合物，其特征在于，所述底物溶液含有0.2×10-7～2.0×10-7M的所述底物链和100～300μM的Zn2+。
8.一种用于检测血清肿瘤标志物的荧光定量试剂盒，其特征在于，包括权利要求6或7所述的组合物、包被有待测肿瘤标志物单克隆抗体的微孔板和待测肿瘤标志物的标准品。
9.根据权利要求8所述用于检测血清肿瘤标志物的荧光定量试剂盒，其特征在于，所述待检测的血清肿瘤标志物包括CA242、PSA、CEA、AFP、CA125、CA15-3、CA19-9、NSE、CA50、CA72-4、CYFRA21-1、TPA、SCCA、HE4和Ft中的一种。
10.根据权利要求8或9所述用于检测血清肿瘤标志物的荧光定量试剂盒，其特征在于，所述包被有待测肿瘤标志物单克隆抗体的微孔板中，待测肿瘤标志物单克隆抗体浓度为0.5～4μg/孔。
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