CN109884029B - 银/石墨烯量子点纳米酶、sers检测试剂盒及应用 - Google Patents
银/石墨烯量子点纳米酶、sers检测试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109884029B CN109884029B CN201910154649.1A CN201910154649A CN109884029B CN 109884029 B CN109884029 B CN 109884029B CN 201910154649 A CN201910154649 A CN 201910154649A CN 109884029 B CN109884029 B CN 109884029B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- silver
- graphene quantum
- quantum dot
- nanoenzyme
- sers
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种银/石墨烯量子点纳米酶、SERS检测试剂盒及应用。所述银/石墨烯量子点纳米酶具有核壳结构,所述核壳结构中的核包含银,壳层包含石墨烯量子点,所述银/石墨烯量子点纳米酶的尺寸为7~15nm。本发明还公开了该银/石墨烯量子点纳米酶作为SERS基底具有良好的稳定性和SERS增强能力。本发明还公开了一种细胞内原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶催化试剂盒,用于检测癌细胞内过氧化氢。本发明还公开了一种原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶联免疫试剂盒,能够检测各种抗原、多肽或DNA等,尤其能够特异性识别检测肝癌标志物甲胎蛋白,在生物医学领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种核壳结构的银/石墨烯量子点纳米酶及其制备方法,以及相应的纳米酶催化和酶联免疫试剂盒,及其细胞内原位SERS检测纳米酶催化反应及纳米酶联免疫技术相关的检测应用,属于生物医学技术检测领域。
背景技术
现代科学的发展,使得人们对生命活动本质的研究正迅速深化,还达到了亚细胞和单分子层面。而细胞是一个复杂的系统,细胞内的各种物质难以原位检测,因此找到一种能够进入细胞并能够反映细胞内信息的生物相容性好的材料,是研究细胞的关键。近年来,在纳米材料基础上诞生的纳米酶推动了化学、材料学以及生物学等学科的发展。纳米酶作为纳米材料,可以将能够特异识别病原体的物质如抗体、多肽和核酸的适配体等组装到纳米酶上,实现靶向细胞内运输,进而特异性检测细胞内的各种抗原、多肽、或DNA等;也可以将药物或酶组装到纳米酶上。因而,纳米酶在细胞检测和生物医学上具有良好的发展前景,不仅可以实现对细胞内各种物质的检测,而且对生物传感、免疫分析、癌症诊断和治疗等领域产生了巨大的影响。
纳米酶是具有类酶活性的纳米材料,其形状、尺寸以及表面电荷等性能与天然酶有一定的相似性,但是与天然酶相比,纳米酶具有稳定性高,催化活性可调节,成本低,易于储存和使用等优点。因而,利用纳米材料的独特性能,合成在化学结构、催化效率、选择性和特异性上都和天然酶功能相似的纳米酶,对于有效克服天然酶的局限性,具有重要意义。2007年首次发现磁性四氧化三铁纳米粒子具有类过氧化物酶的催化活性后,各种具有过氧化物酶特性的纳米酶被研制出来。目前纳米酶主要分为:贵金属、氧化物和碳基纳米材料三大类。贵金属颗粒作为最普遍的过氧化物酶,催化活性较高,但是单独使用仍具有稳定性差、易于团聚使活性降低,且在生物系统中存在生物相容性差的缺点。而碳基纳米材料具有无毒、生物相容性好、优良的电荷传输特性,易于化学修饰和功能集成性等独特的物理化学性质,且发现有些碳纳米材料同样具有类过氧化物酶性质。因此,为解决上述贵金属纳米材料的局限,使催化活性以及生物相容性得到显著提高,是拓展纳米酶在生物领域应用的关键问题。
酶联免疫分析技术(ELISA)是一种准确、灵敏、可靠、快速、特异、稳定的检测方法,近年来已广泛应用于很多抗原的快速检测,这其中包括蛋白质、核酸、小分子抗原、病毒和细菌等。酶联免疫分析法,是以生物酶为标记物的标记免疫分析法,它将抗原-抗体反应的特异性与酶的高效催化放大作用相结合,既保持了酶催化反应的敏感性,又保持了抗原-抗体反应的特异性。但在实际应用中由于天然酶的局限性,人们也在尝试寻找新的替代方法,比如用纳米酶替代生物酶。利用纳米酶建立纳米酶联免疫检测方法,可以提升检测的速度和灵敏度,改善检测试剂的稳定性,对临床诊断方面具有巨大的应用前景。
拉曼光谱作为一种分析手段,除了能够从分子水平上提供物质的光谱指纹信息,还具有无损、免标记等特点。表面增强拉曼散射(SERS)光谱技术的发现更是大大的提高了检测的灵敏度,逐渐成为表征分子结构、探测痕量、甚至单分子特性的有效测试分析工具,在生命科学、生物医学等领域中有着广泛的应用前景。以贵金属纳米粒子为代表的SERS基底为快速检测奠定了基础,而且SERS光谱的特征峰较窄,能够提供丰富的分子信息,该光谱技术特别适用于细胞生物领域的相关研究。与传统的生物检测技术相比,它具有以下优势:(1)非侵入性,无需样品制备;(2)无损伤;(3)灵敏度高,可以对单细胞进行原位实时检测;(4)适合研究水溶液体系。SERS的这些特点使其有可能成为一种新的研究凋亡细胞中物质结构和含量改变的有效手段,以及为细胞癌变、组织康复等生命科学领域提供一种新的检测手段。而制备一种具有高灵敏度,SERS增强能力高,生物相容性好的SERS基底,是检测细胞中各种物质的关键。以贵金属纳米粒子为代表的SERS基底,尤其是Ag NPs具有很好的SERS增强能力,但是Ag NPs具有稳定性差、易聚沉、生物相容性差的缺点,因此寻找一种稳定、生物相容性好的SERS基底是扩宽SERS技术在生命科学领域应用的关键。
一些难以检测的内源性活性小分子,是影响细胞活动的最重要的物质之一。如内源性小分子过氧化氢,是生物体内活性氧的重要成员,也是细胞生长、增殖和分化的重要信号分子,在生理和病理系统中发挥着重要的作用。过氧化氢浓度异常会导致各种生理疾病,引发炎症,器官损坏甚至恶性肿瘤。目前,检测过氧化氢的方法主要有电子自旋共振法(ESR)、高效液相色谱法(HPLC)、化学发光法和荧光法等。另外近年来,肿瘤,尤其是恶性肿瘤(癌症)渐渐成为一类严重威胁人类健康的多发病和常见病。及早发现和预防是对癌症的有效防治方法。肿瘤标志物是指在肿瘤的发生和增殖过程中,由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的,反应肿瘤存在和生长的一类物质,包括蛋白质、激素、酶、多胺及癌基因等,如肝癌标志物甲胎蛋白。这些肿瘤标志物的检测对肿瘤早期筛查,疗效观察,追踪复发等都具有重要意义。因此,开发一种SERS高活性和生物相容性好的纳米酶材料,实现单细胞内纳米酶催化的原位SERS检测方法,并应用于生物、化学和医学领域,具有很好的前景和价值,随着对纳米酶催化体系研究的不断深入,从基础研究走向临床转化,将为疾病诊断和治疗提供新的方法和思路。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种银/石墨烯量子点(Ag/GQDs)纳米酶及其制备方法,以克服现有纳米酶的局限。
本发明的另一主要目的在于制备一种稳定的、生物相容性好的、具有高SERS增强能力的SERS基底的高催化活性纳米酶用于生物检测应用。
本发明的另一主要目的在于提供一种细胞内原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶催化试剂盒来检测细胞中过氧化氢。
本发明的另一目的还在于提供一种原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶联免疫试剂盒,来检测抗原、多肽、DNA,尤其优选能够特异性识别检测肝癌标志物甲胎蛋白。
为实现前述发明目的,本发明采用的技术方案包括:
本发明实施例提供了一种银/石墨烯量子点(以下可简称为Ag/GQDs)纳米酶,其具有核壳结构,所述核壳结构中的核包含银,壳层包含石墨烯量子点,所述银/石墨烯量子点纳米酶的尺寸为7~15nm,其中所述核的尺寸为6~14nm,壳层的厚度为1~3nm。
本发明实施例还提供了一种银/石墨烯量子点纳米酶的制备方法,其包括:使包含石墨烯量子点、银盐的均匀混合反应体系在碱性环境中于100~150℃加热反应0.5~1.5h,经离心洗涤,制得所述银/石墨烯量子点纳米酶。
本发明实施例还提供了具有高SERS增强能力以及良好稳定性的Ag/GQDs纳米酶SERS基底。将Ag/GQDs纳米酶当做SERS基底,加入到不同浓度的10-5~10-9对巯基苯胺(PATP)的乙醇溶液中,充分吸附1-2小时,离心,洗涤,去除多余的PATP,最后分散在相同体积的水中,进行SERS测试。为测试其稳定性,每次将储存的Ag/GQDs纳米酶与新制备的PATP分子进行SERS测试,存储的Ag/GQDs样品至十六个月仍有很好的SERS信号。
进一步地,所述银/石墨烯量子点纳米酶具有高效的催化活性。
本发明实施例还提供了一种细胞内原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶催化试剂盒,其包含前述的银/石墨烯量子点纳米酶。
本发明实施例还提供了前述的原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶催化试剂盒用于检测细胞内过氧化氢中的应用,检测过氧化氢最低浓度为1.0×10-8mol/L。
本发明实施例还提供了一种原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶催化试剂盒用于细胞内过氧化氢的方法,所述方法包括:以银/石墨烯量子点纳米酶为催化剂,在过氧化氢存在下,用SERS原位监测银/石墨烯量子点纳米酶催化氧化显色底物TMB,得到有色物质氧化TMB的信息;以及,通过SERS原位检测细胞中氧化TMB的信号,再与体外和细胞内的SERS谱图相对比,来检测体外和细胞中过氧化氢的浓度。
本发明实施例还提供了一种原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶联免疫试剂盒,其包含前述的银/石墨烯量子点纳米酶。
本发明实施例还提供了前述的原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶联免疫试剂盒于检测抗原、多肽或DNA中的应用,尤其能够特异性识别检测肝癌标志物甲胎蛋白。
本发明实施例还提供了一种原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶联免疫试剂盒检测抗原、多肽或DNA的方法,以检测甲胎蛋白为例,所述方法包括:
以甲胎蛋白抗体对银/石墨烯量子点纳米酶进行标记,得到银/石墨烯量子点纳米酶标记的甲胎蛋白抗体;
将银/石墨烯量子点纳米酶标记的甲胎蛋白抗体与TMB~H2O2体系相结合,进行SERS检测;以及,将银/石墨烯量子点纳米酶标记的甲胎蛋白抗体与甲胎蛋白抗原相结合,得到甲胎蛋白抗原-银/石墨烯量子点纳米酶标记的甲胎蛋白抗体复合物,再与TMB~H2O2体系相结合,进行SERS检测,对比两次SERS检测的结果,从而实现对甲胎蛋白的检测。
与现有技术相比,本发明的优点包括:
1)本发明提供的Ag/GQDs纳米酶将贵金属纳米粒子银与碳基纳米材料中的石墨烯量子点进行复合得到核壳结构,可使其SERS特性,催化活性以及生物相容性得到显著提高,并降低了细胞毒性,Ag/GQDs纳米酶催化试剂盒与SERS技术相结合有利于检测细胞内的过氧化氢;
2)本发明提供的Ag/GQDs纳米酶作为生物相容性好的纳米材料,可以将能够特异识别病原体的小分子如抗体、多肽和核酸的适配体等组装到纳米酶上,实现靶向细胞内运输,进而为特异性检测细胞内各种抗原、多肽、DNA提供了基础;在本发明中,将Ag/GQDs纳米酶联免疫试剂盒与SERS技术相结合有利于检测细胞内各种抗原、多肽、DNA等;
3)本发明在生物传感、免疫分析和检测等领域具有潜在的应用前景。
附图说明
图1是本发明一典型实施方案中一种银/石墨烯量子点纳米酶的微观结构图。
图2是以本发明实施例1所制备的Ag/GQDs为SERS基底与新制备的10-5M PATP混合测得的SERS光谱时间变化图。
图3是本发明实施例3所述的不同浓度的PMA刺激乳腺癌细胞产生不同浓度的过氧化氢,以Ag/GQDs纳米酶为催化剂和SERS基底,在细胞中催化氧化TMB的SERS光谱图。
图4是本发明实施例4所述的Ag/GQDs纳米酶标记甲胎蛋白抗体,在过氧化氢的存在下,催化氧化TMB的SERS图,以及Ag/GQDs纳米酶标记甲胎蛋白抗体与AFP抗原特异性结合,在过氧化氢存在下,催化氧化TMB的SERS图。
具体实施方式
为解决贵金属纳米材料的局限,将石墨烯量子点与贵金属纳米粒子进行复合,可使稳定性、SERS特性、催化活性以及生物相容性得到显著提高,并降低细胞毒性,有利于检测细胞内的过氧化氢。且Ag@GQDs作为生物相容性好的纳米材料,可以将能够特异识别病原体的小分子如抗体、多肽和核酸的适配体等组装到纳米酶上,实现靶向细胞内运输,进而特异性检测细胞内的各种抗原、多肽、DNA,为纳米酶应用于未来单细胞内的疾病检测提供了可能性和广阔前景。
且银/石墨烯量子点具有良好的稳定性和SERS增强能力,这可能是由于石墨烯量子点壳层作为封端剂可以防止银纳米粒子的氧化、聚集和沉降,进而提高了其稳定性,因此石墨烯量子点也被看做稳定剂。另外,由于石墨烯量子点壳层可能具有石墨烯的SERS增强性质,再加上石墨烯量子点的强电荷传输能力,使得Ag与GQDs之间的化学增强得到提高,经FDTD模拟,石墨烯量子点与Ag的协同作用也使其电磁场增强都得到提高,进而使得Ag/GQDs的SERS得到增强。Ag/GQDs纳米酶作为SERS基底的增强能力和稳定性也为该纳米酶扩宽SERS技术应用在生物领域提供了广泛的前景。
尤其将纳米酶催化反应或纳米酶联免疫检测方法与SERS技术相结合,特异性检测细胞内的内源性小分子,以及各种抗原、多肽、DNA,对生物传感、免疫分析等领域产生巨大的影响。比如一些难以检测的内源性活性小分子或抗原,如过氧化氢和甲胎蛋白。
鉴于现有技术的不足,本案发明人经长期研究和大量实践,得以提出本发明的技术方案,其主要是提供一种细胞内原位SERS检测Ag/GQDs纳米酶催化试剂盒的制备来检测细胞内的过氧化氢,以及提供一种原位SERS检测Ag/GQDs纳米酶催化试剂盒的制备和来实现对各种抗原、多肽、DNA的检测。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是,应当理解,在本发明范围内,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
本发明实施例的一个方面提供了一种银/石墨烯量子点(以下可简称为Ag/GQDs)纳米酶,其具有核壳结构,所述核壳结构中的核包含银,壳层包含石墨烯量子点,所述银/石墨烯量子点纳米酶的尺寸为7~15nm,其中所述核的尺寸为6~14nm,壳层的厚度为1~3nm。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种银/石墨烯量子点纳米酶的制备方法,其包括:使包含石墨烯量子点、银盐的均匀混合反应体系在碱性环境中于100~150℃加热反应0.5~1.5h,经离心洗涤,制得所述银/石墨烯量子点纳米酶。
进一步地,所述均匀混合反应体系中石墨烯量子点的浓度为0.5~1.0mg/ml,尺寸为2~8nm。
进一步地,所述均匀混合反应体系中银盐的浓度为0.1~0.4mol/L。其中进一步地,例如,所述银盐可以优选为硝酸银,但不限于此。
进一步地,所述均匀混合反应体系中碱性环境包括浓度为0.1~0.5mol/L的NaOH。
在更为具体的实施案例中,所述制备方法具体包括:将0.5~1.0mg/ml的石墨烯量子点与0.1~0.4mol/L的AgNO3,0.1~0.5mol/L的NaOH混合,随后上述混合物在100~150℃下搅拌加热反应0.5~1.5h。将上述溶液冷却至室温,以6000~10000r/min离心5~15min,洗涤2~4次,去除上清液,最后分散在5~10ml的水中。
在一些实施例中,本案发明人还对Ag/GQDs纳米酶作为SERS基底的的SERS特性和稳定性进行了进一步测试,具体包括如下步骤:
将Ag/GQDs当做SERS基底,加入到不同浓度的探针分子10-5~10-9对巯基苯胺(PATP)的乙醇溶液中,充分吸附1~2小时,离心,洗涤,去除多余的PATP,最后分散在相同体积的水中,进行SERS测试。为测试其稳定性,每次将储存的Ag/GQDs与新制备的PATP分子进行SERS测试,存储的Ag/GQDs样品至十六个月仍有很好的SERS信号。
通过检测PATP的SERS光谱的变化,表明Ag/GQDs具有良好的稳定性。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种细胞内原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶催化试剂盒,其包含前述的银/石墨烯量子点纳米酶,可以来检测细胞内过氧化氢。
进一步地讲,Ag/GQDs具有良好的SERS特性,稳定性和生物相容性以及催化特性。通过在体外和细胞内用SERS原位监控Ag/GQDs纳米酶SERS基底催化氧化TMB,得到氧化TMB分子的指纹变化信息,对比体外和细胞内的SERS谱图,来实现体外和细胞内过氧化氢的快速灵敏且可视化检测。
进一步地,检测过氧化氢的最低浓度为1.0×10-8mol/L。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种原位SERS检测纳米酶催化试剂盒检测细胞内过氧化氢的方法,其包括:
以银/石墨烯量子点纳米酶为催化剂,在过氧化氢存在下,用SERS原位监测银/石墨烯量子点纳米酶催化氧化显色底物TMB,得到有色物质氧化TMB的信息;以及,通过SERS原位检测细胞中氧化TMB的信号,再与体外和细胞内的SERS谱图相对比,来检测体外和细胞中过氧化氢的浓度。
在一些实施例中,利用此种试剂盒对细胞内过氧化氢实现原位SERS超灵敏监测,其是将此种纳米酶作为SERS基底加入不同浓度过氧化氢的TMB的溶液中,由无色TMB变为蓝色氧化TMB,通过拉曼光谱监测氧化TMB的变化信息,得到SERS谱图,通过SERS谱图的变化,来得到过氧化氢的快速检测。
在一些更为具体的实施例案例之中,所述的利用Ag/GQDs试剂盒对过氧化氢进行检测的方法具体包括:首先配制TMB的DMSO溶液,得到浓度为0.1-0.2mMol/L的TMB显色液,取10-50μl TMB溶液加入到3-8ml pH=4.0-4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中,分别与不同浓度的过氧化氢的水溶液(浓度为10-3-10-8mol/L)混合后分别加入到200-500μl Ag/GQDs纳米复合物SERS基底溶液中,30-40℃条件下分别浸泡30-60min后,由于复合物SERS基底具有类过氧化物酶的催化性质,可以生成一种蓝色氧化TMB显色物,通过原位SERS监测催化氧化TMB的反应过程,得到不同浓度的过氧化氢催化的氧化TMB产物SERS谱图,进而可以利用SERS原位检测过氧化氢的浓度。
在另一些实施例中,该方法还可将银/石墨烯量子点纳米酶与癌细胞共同培养,通过加入佛波醇酯(PMA)来刺激产生过氧化氢,催化氧化TMB来得到氧化TMB的SERS谱图,通过与体外SERS谱图比较,间接检测细胞中的过氧化氢。
在一些更为具体的实施例案例之中,用前述试剂盒原位SERS检测细胞内的过氧化氢的方法包括如下步骤:首先将乳腺癌细胞(MCF-7细胞)进行传代培养,然后将0.5-5mg/mlAg/GQDs的纳米探针与细胞共同培养5-8小时,使探针充分进入细胞中。然后加入不同浓度的佛波醇酯(PMA)与细胞中共同孵育1-3小时,充分刺激细胞产生过氧化氢。接着将细胞培养液倒掉,用PH=7-8的PBS缓冲溶液清洗三次,将多余的死细胞洗去,最后用0.5-2.0mlPBS来代替细胞培养液。然后为减少其毒性,配制TMB的DMSO与PBS的混合溶液,得到浓度为0.1-0.2mMol/L的TMB显色液。取20-50μl TMB溶液加入到3-8ml PH=7-8的PBS的细胞中反应0.5-1.5小时。制备好的样品都是在玻璃底小皿中用于原位SERS检测,通过检测细胞中氧化TMB的信号,再与体外的SERS谱图相对比,来检测细胞中过氧化氢的浓度。
进一步地,本发明实施例的另一个方面还提供了一种包含前述的细胞内原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶催化试剂盒的产品,所述产品应用于原位SERS检测过氧化氢的方法。
又例如,进一步地,本发明实施例的另一个方面还提供了一种包含前述的原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶联免疫试剂盒,其包含前述的银/石墨烯量子点纳米酶。
更进一步地,所述的细胞内原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶催化试剂盒可以将能够特异识别病原体的物质如抗体、多肽和核酸的适配体等组装到纳米酶上,实现靶向细胞内运输,进而特异性检测细胞内的各种抗原、多肽、DNA,如检测肝癌标志物甲胎蛋白。
本发明实施例的另一个方面还提供了检测抗原、多肽或DNA的方法,以检测甲胎蛋白为例,所述方法包括:
以甲胎蛋白抗体对银/石墨烯量子点纳米酶进行标记,得到银/石墨烯量子点纳米酶标记的甲胎蛋白抗体;
将银/石墨烯量子点纳米酶标记的甲胎蛋白抗体与TMB-H2O2体系相结合,进行SERS检测;以及,将银/石墨烯量子点纳米酶标记的甲胎蛋白抗体与甲胎蛋白抗原相结合,得到甲胎蛋白抗原-银/石墨烯量子点纳米酶标记的甲胎蛋白(AFP)抗体复合物,再与TMB-H2O2体系相结合,进行SERS检测,对比两次SERS检测的结果,从而实现对甲胎蛋白(AFP)的检测。
在一些更为具体的实施例案例之中,所述的方法具体包括如下步骤:
首先进行Ag/GQDs-AFP抗体标记:将100-500μl的5-15mg/ml的Ag/GQDs溶液与20-80μl的1000-5000ng/ml的AFP抗体混合,在37℃孵育1-3小时,用0.005-0.015mol的PH=7的PBS缓冲液洗涤三次,再加入300-800μl 0.5%的牛血清蛋白(BSA)封闭,37℃孵育1-3小时,然后再用PBS缓冲溶液洗涤三次,最后分散在PBS溶液中,得到200-500μl的标记Ag/GQDs的AFP抗体,置于4℃冰箱中储存备用。配制TMB-H2O2体系:称取1.0-4.5mg TMB固体,溶解在0.5-1.5ml DMSO溶液中,稀释5倍得到浓度为1*10-3M-5*10-3M的TMB溶液。取10-30μl TMB溶液于离心管中,加入5-15μl的10-4M的H2O2溶液,再取50-150μl的PH=4的HAC-NaAC缓冲溶液,最后混合均匀。向清洗干净的96孔板中加入TMB-H2O2体系然后加入50-150μl标记的Ag/GQDs的AFP抗体,37℃下反应1小时后进行SERS测试。基于96孔板的AFP标记:加入5-15μl的AFP的PBS溶液,在37℃孵育2小时,用PBS缓冲溶液洗涤三次,然后加入50-150μl BSA封闭,37℃孵育2小时,然后再用PBS缓冲溶液洗涤三次,最后分散在10-50μl的PBS溶液中。基于96孔板的AFP抗原-Ag/GQDs标记的AFP抗体复合物:向有AFP标记的孔中加入50-150μl标记Ag/GQDs的AFP抗体,在37℃孵育2小时,PBS缓冲液洗涤三次,最后分散在50-150μl PBS溶液中。向有AFP抗原-Ag/GQDs标记的AFP抗体复合物中加入TMB-H2O2体系,37℃反应1小时后进行SERS测试。通过对比SERS谱图的变化,检测AFP的浓度。
进一步地,本发明实施例的另一个方面还提供了一种包含前述的纳米酶联免疫试剂盒的产品,所述产品应用于甲胎蛋白的方法。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图和若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明,但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1-1:核壳结构的Ag/GQDs的制备
将分别为10ml的1.0mg/ml的石墨烯量子点(GQDs)与0.2mol/L的AgNO3,0.1mol/L的NaOH混合,随后上述混合物在120℃下搅拌加热反应1小时。将上述溶液冷却至室温,离心,洗涤,去除上清液,最后分散在5ml的水中。
本实施例所获核壳结构的Ag/GQDs的制备原理及微观结构图可参阅图1所示。由图1可知,石墨烯量子点包覆在银纳米粒子的表面,石墨烯量子点起到了还原剂和封端剂的作用,是银与石墨烯量子点共同自组装成核壳的小尺寸纳米粒子,其尺寸为10nm左右。
实施例1-2:核壳结构的Ag/GQDs的制备
将分别为10ml的0.5mg/ml的石墨烯量子点(GQDs)与0.1mol/L的AgNO3,0.2mol/L的NaOH混合,随后上述混合物在100℃下搅拌加热反应1.5小时。将上述溶液冷却至室温,离心,洗涤,去除上清液,最后分散在5ml的水中。
经测试,本实施例所获核壳结构的Ag/GQDs的结构与实施例1-1基本一致。
实施例1-3:核壳结构的Ag/GQDs的制备
将分别为10ml的0.8mg/ml的石墨烯量子点(GQDs)与0.4mol/L的AgNO3,0.5mol/L的NaOH混合,随后上述混合物在150℃下搅拌加热反应0.5小时。将上述溶液冷却至室温,离心,洗涤,去除上清液,最后分散在5ml的水中。
经测试,本实施例所获核壳结构的Ag/GQDs的结构与实施例1-1基本一致。
实施例2:Ag/GQDs的SERS特性和稳定性研究
将Ag/GQDs当做SERS基底,与不同浓度的对巯基苯胺(PATP)的乙醇溶液混合,使PATP的最终浓度为10-5-10-9Mol/L,充分吸附1小时,离心,洗涤,去除多余的PATP,最后分散在相同体积的水中,进行SERS测试。为测试其稳定性,每次将储存的Ag/GQDs与新制备的10- 5M PATP分子进行SERS测试得到其SERS变化图。
图2是以实施例1所述的Ag/GQDs为SERS基底与新制备的10-5mol/L PATP混合测得的SERS光谱时间变化图。从图2中可以看出,在16个月内该Ag/GQDs具有稳定的SERS光谱图,说明Ag/GQDs作为SERS基底具有良好的稳定性。
实施例3:Ag/GQDs纳米酶试剂盒对细胞内过氧化氢进行SERS原位检测
首先配制TMB的DMSO溶液,得到浓度为0.14mMol/L的TMB显色液,取30μl TMB溶液加入到3ml pH=4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中,分别与不同浓度的过氧化氢的水溶液(浓度为10-3-10-8mol/L)混合后分别加入到500μl Ag/GQDs纳米复合物SERS基底溶液中,37℃条件下分别浸泡30min后,由于复合物SERS基底具有类过氧化物酶的催化性质,可以生成一种蓝色氧化TMB显色物,得到不同浓度的过氧化氢催化的氧化TMB产物SERS谱图,又由于该基底具有较高的SERS增强能力,进而可以利用SERS原位检测过氧化氢的浓度。可发现氧化TMB的浓度与过氧化氢浓度呈良好的线性关系,最终检测到过氧化氢的最低浓度。
然后将乳腺癌细胞(hela细胞)进行传代培养,将1.5mg/ml Ag/GQDs的纳米探针与细胞共同培养6小时,使探针充分进入细胞中。然后加入不同浓度的佛波醇酯(PMA)与细胞中共同孵育2小时,充分刺激细胞产生过氧化氢。接着将细胞培养液倒掉,用PBS缓冲溶液(PH=7-8清洗三次),将多余的死细胞洗去,最后用1.0ml PBS来代替细胞培养液。然后配制TMB的DMSO与PBS的混合溶液,得到浓度为0.14mMol/L的TMB显色液。取30μl TMB溶液加入到1ml PH=7-8的PBS的细胞中反应1小时。制备好的样品都是在玻璃底小皿中用于原位SERS检测,通过检测细胞中氧化TMB的信号,再与体外的相对比,来检测细胞中过氧化氢的浓度。
图3是本实施例所述的不同浓度的PMA刺激乳腺癌细胞产生不同浓度的过氧化氢,以Ag/GQDs纳米酶为催化剂和SERS基底,在细胞中催化氧化TMB的SERS光谱图。从图3中可以看出,随PMA浓度的增加,氧化TMB的SERS逐渐增加,并且随PMA的增加,氧化TMB逐渐不再变化,在低浓度PMA下,氧化TMB的SERS谱图呈良好的线性关系。通过与体外氧化TMB的SERS谱图相对比,得到细胞内过氧化氢的浓度。
实施例4:基于此纳米酶制备甲胎蛋白(AFP)抗原的纳米酶联免疫试剂盒,用SERS技术来检测甲胎蛋白(AFP)
首先进行Ag/GQDs-AFP抗体标记:将300μl的10mg/ml的Ag/GQDs溶液与50μl的3000ng/ml的甲胎蛋白(AFP)抗体混合,在37℃孵育2小时,用0.01mol/L的PH=7的PBS缓冲液洗涤三次,再加入500μl 0.5%的牛血清蛋白(BSA)封闭,37℃孵育2小时,然后再用PBS缓冲溶液洗涤三次,最后分散在PBS溶液中,得到400μl的标记Ag/GQDs的AFP抗体,置于4℃冰箱中储存备用。
配制TMB-H2O2体系:称取3.6mg TMB固体,溶解在1ml DMSO溶液中,稀释5倍得到浓度为3×10-3mol/L的TMB溶液。取20μl TMB溶液于离心管中,加入10μl的10-4mol/L的H2O2溶液,再取100μl的PH=4的HAC-NaAC缓冲溶液,最后混合均匀。
向清洗干净的96孔板中加入TMB-H2O2体系然后加入100μl标记的Ag/GQDs的AFP抗体,37℃下反应1小时后进行SERS测试。
基于96孔板的AFP标记:加入10μl的AFP的PBS溶液,在37℃孵育2小时,用PBS缓冲溶液洗涤三次,然后加入100μl BSA封闭,37℃孵育2小时,然后再用PBS缓冲溶液洗涤三次,最后分散在30μl的PBS溶液中。
基于96孔板的AFP抗原-Ag/GQDs标记的AFP抗体复合物:向有AFP标记的孔中加入100μl标记Ag/GQDs的AFP抗体,在37℃孵育2小时,PBS缓冲液洗涤三次,最后分散在100μlPBS溶液中。
向有AFP抗原-Ag/GQDs标记的AFP抗体复合物中加入TMB-H2O2体系,37℃反应1小时后进行SERS测试。
图4是本实施例所述的Ag/GQDs纳米酶标记AFP抗体,在过氧化氢的存在下,催化氧化TMB的SERS图,以及Ag/GQDs纳米酶标记AFP抗体与AFP抗原特异性结合,在过氧化氢存在下,催化氧化TMB的SERS图。
综上所述,藉由上述技术方案,本发明的核壳结构的银/石墨烯量子点纳米酶,具有良好的稳定性和SERS特性,高效的催化活性以及良好的生物相容性。本发明制备了一种细胞内原位SERS监测Ag/GQDs纳米酶的催化试剂盒用于检测细胞中过氧化氢,可检测到细胞内的过氧化氢浓度为1.0×10-8mol/L。本发明利用纳米酶联免疫方法与SERS技术相结合,制备了一种原位SERS检测Ag/GQDs纳米酶联免疫试剂盒来实现对各种抗原、多肽、DNA的检测,实现了对肝癌标志物甲胎蛋白的特异性检测,扩宽了其在生物医学领域的应用。
应当理解,上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种检测甲胎蛋白的方法,其特征在于,它是以原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶联免疫试剂盒而实施,所述方法包括:
提供原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶联免疫试剂盒,所述原位SERS检测银/石墨烯量子点纳米酶联免疫试剂盒包括银/石墨烯量子点纳米酶,所述银/石墨烯量子点纳米酶具有核壳结构,所述核壳结构中的核包含银,壳层包含石墨烯量子点,所述银/石墨烯量子点纳米酶的尺寸为7~15 nm,其中所述核的尺寸为6~14 nm,壳层的厚度为1~3 nm;
以甲胎蛋白抗体对银/石墨烯量子点纳米酶进行标记,得到银/石墨烯量子点纳米酶标记的甲胎蛋白抗体;
将银/石墨烯量子点纳米酶标记的甲胎蛋白抗体与TMB-H2O2体系相结合,进行SERS检测;以及,将银/石墨烯量子点纳米酶标记的甲胎蛋白抗体与甲胎蛋白抗原相结合,得到甲胎蛋白抗原-银/石墨烯量子点纳米酶标记的甲胎蛋白抗体复合物,再与TMB-H2O2体系相结合,进行SERS检测,对比两次SERS检测的结果,从而实现对甲胎蛋白的检测。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述银/石墨烯量子点纳米酶具有良好的稳定性和SERS增强能力,以银/石墨烯量子点纳米酶为SERS基底,PATP为探针分子进行SERS测试时,16个月仍保持良好的SERS信号。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述银/石墨烯量子点纳米酶的制备方法包括:使包含石墨烯量子点、银盐的均匀混合反应体系在碱性环境中于100~150℃加热反应0.5~1.5 h,经离心洗涤,制得所述银/石墨烯量子点纳米酶。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述银/石墨烯量子点纳米酶的制备方法包括:所述均匀混合反应体系中石墨烯量子点的浓度为0.5~1.0 mg/mL,尺寸为2~8 nm。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述银盐的浓度为0.1~0.4 mol/L。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述银盐选自硝酸银。
7.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述碱性环境包括浓度为0.1~0.5 mol/L的NaOH。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910154649.1A CN109884029B (zh) | 2019-03-01 | 2019-03-01 | 银/石墨烯量子点纳米酶、sers检测试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910154649.1A CN109884029B (zh) | 2019-03-01 | 2019-03-01 | 银/石墨烯量子点纳米酶、sers检测试剂盒及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109884029A CN109884029A (zh) | 2019-06-14 |
CN109884029B true CN109884029B (zh) | 2020-04-14 |
Family
ID=66930219
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910154649.1A Active CN109884029B (zh) | 2019-03-01 | 2019-03-01 | 银/石墨烯量子点纳米酶、sers检测试剂盒及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109884029B (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112255215B (zh) * | 2020-09-16 | 2021-08-17 | 清华大学 | 检测分析活体细胞生命活动状态的修饰二聚体表面增强拉曼的方法 |
CN112439897B (zh) * | 2020-09-21 | 2022-06-17 | 山东大学 | 一种二硫化钨量子点包覆的银纳米球复合材料及其制备方法与应用 |
CN112904007B (zh) * | 2021-03-01 | 2022-07-26 | 河南工业大学 | 一种基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大免疫层析试纸条用于呕吐毒素的检测方法 |
CN113189078B (zh) * | 2021-03-04 | 2024-04-16 | 吉林大学 | 一种靶向药物的高通量筛选方法 |
CN117686711B (zh) * | 2024-01-31 | 2024-05-14 | 云南伦扬科技有限公司 | 一种纳米酶结合适配体检测食品中大肠杆菌的方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101358976A (zh) * | 2008-04-28 | 2009-02-04 | 北京华大吉比爱生物技术有限公司 | 检测六项肿瘤标志物的微阵列-酶联免疫检测试剂盒 |
CN103411948A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-11-27 | 吉林大学 | 基于探针标记免疫金-磁性复合材料检测甲胎蛋白的sers方法 |
EP3219665B1 (en) * | 2016-03-18 | 2020-11-25 | Te?ted Oy | Method for converting aqueous metal into colloidal metal using carboxylated allotropes of carbon |
EP3552006A4 (en) * | 2016-12-09 | 2020-08-19 | Digital Sensing Limited | ELECTROCHEMICAL SENSORS AND METHOD OF USING THEREOF |
CN109187468B (zh) * | 2018-09-10 | 2020-11-20 | 广西师范大学 | 一种用适配体介导掺氮碳点催化h2o2与tmb反应荧光光谱法测定水胺硫磷的方法 |
CN109187470B (zh) * | 2018-09-10 | 2020-12-29 | 广西师范大学 | 一种用适配体介导掺银碳点催化h2o2与tmb反应荧光光谱测定铅的方法 |
-
2019
- 2019-03-01 CN CN201910154649.1A patent/CN109884029B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109884029A (zh) | 2019-06-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109884029B (zh) | 银/石墨烯量子点纳米酶、sers检测试剂盒及应用 | |
Qin et al. | A novel carbon quantum dots signal amplification strategy coupled with sandwich electrochemiluminescence immunosensor for the detection of CA15-3 in human serum | |
Ranjan et al. | Rapid biosensing tools for cancer biomarkers | |
Ma et al. | Copper-mediated DNA-scaffolded silver nanocluster on–off switch for detection of pyrophosphate and alkaline phosphatase | |
Syedmoradi et al. | Point-of-care cancer diagnostic devices: From academic research to clinical translation | |
Ravalli et al. | Gold and magnetic nanoparticles-based electrochemical biosensors for cancer biomarker determination | |
CN108344783B (zh) | 一种电化学细胞传感器及其制备方法和应用 | |
Zhu et al. | Colorimetric detection of immunomagnetically captured rare number CTCs using mDNA-wrapped single-walled carbon nanotubes | |
Alizadeh et al. | Magnetoimmunosensor for simultaneous electrochemical detection of carcinoembryonic antigen and α-fetoprotein using multifunctionalized Au nanotags | |
Feng et al. | A magnetic SERS immunosensor for highly sensitive and selective detection of human carboxylesterase 1 in human serum samples | |
Peng et al. | Nonenzyme cascaded amplification biosensor based on effective aggregation luminescence caused by disintegration of silver nanoparticles | |
Zhong et al. | Expanding the scope of chemiluminescence in bioanalysis with functional nanomaterials | |
Miao et al. | An electrochemical approach capable of prostate specific antigen assay in human serum based on exonuclease-aided target recycling amplification | |
CN113136417B (zh) | 用于检测肺癌标志物的金纳米笼sers传感器及其制备方法 | |
Kavetskyy et al. | Magneto-immunoassay of cancer biomarkers: Recent progress and challenges in biomedical analysis | |
Ni et al. | Label-free electrochemical aptasensor based on magnetic α-Fe2O3/Fe3O4 heterogeneous hollow nanorods for the detection of cancer antigen 125 | |
Li et al. | Nanomaterial based analytical methods for breast cancer biomarker detection | |
Mao et al. | Ultra-sensitive and high efficiency detection of multiple non-small cell lung cancer-related miRNAs on a single test line in catalytic hairpin assembly-based SERS-LFA strip | |
Lin et al. | Aptamer-modified magnetic SERS substrate for label-based determination of cardiac troponin I | |
Li et al. | Clinically applicable homogeneous assay for serological diagnosis of alpha-fetoprotein by impact electrochemistry | |
Liu et al. | Detection of exosomes via an electrochemical biosensor based on C60-Au-Tb composite | |
Hou et al. | Chemiluminescence sensing of adenosine using DNA cross-linked hydrogel-capped magnetic mesoporous silica nanoparticles | |
Wang et al. | Fluorescent/electrochemical dual-signal response biosensing strategy mediated by DNAzyme-ferrocene-triggered click chemistry for simultaneous rapid screening and quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus | |
Guo et al. | Dual-recognition immune-co-chemical ECL-sensor based on Ti, Mg@ N-CDs-induced and novel signal-sensing units Poly (DVB-co-PBA)-reported for alpha-fetoprotein detection | |
Hallaj et al. | Induced ultrasensitive electrochemical biosensor for target MDA-MB-231 cell cytoplasmic protein detection based on RNA-cleavage DNAzyme catalytic reaction |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |