CN105675573B - 透明质酸酶的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种透明质酸酶的检测方法，包括：1)Fe3O4纳米球的制备；2)Fe3O4@SiO2纳米球的制备；3)Fe3O4@SiO2@NH2纳米球的制备；4)L‑半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点的制备；5)HA‑QDs的制备；6)将Fe3O4@SiO2@NH2纳米球加入至HA‑QDs中以得到HA‑QDs‑Fe3O4复合结构，接着向多组复合结构中分别加入同体积、不同浓度的HAase溶液进行荧光反应，然后检测荧光强度并绘制工作曲线；7)将纯化后的正常人体血清加入至复合结构中进行荧光反应，然后检测荧光强度并根据工作曲线计算血清中HAase的浓度。该方法对于透明质酸酶的检测具有优异的灵敏度同时能够避免背景的干扰。

Description

透明质酸酶的检测方法
技术领域
本发明涉及透明质酸酶的检测方法。
背景技术
透明质酸酶，英文名称为Hyaluronidase，是一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。在体内，当许多恶性肿瘤的产生往往伴随着透明质酸酶的含量升高，例如，膀胱癌、直肠癌等。因此灵敏地检测人体内的透明质酸酶的含量对于临床诊断以及初期肿瘤治疗有很重要的意义。
传统的透明质酸酶的检测方法包括浑浊度测定、粘度测量法、比色法等。然而，没有一种方法有高的选择性与灵敏度。浑浊度测定需要昂贵的抗体以及复杂的清洗步骤。粘度测量法只适用于定性检测，而不能灵敏地对透明质酸酶进行定量检测。荧光方法因为其高的灵敏度已经广泛地被应用于许多酶的检测。现在，越来越多的新的检测透明质酸酶的探针也被设计出来，例如，荧光团标记的透明质酸与金纳米粒子。荧光团的荧光被金纳米粒子猝灭，当透明质酸酶的加入，透明质酸链的剪断致使荧光团掉落，而使荧光回升。然而，这种金纳米粒子探针本身在生物高盐环境中会沉淀。因此，高灵敏度的高选择性的以及低背景的的荧光透明质酸酶探针的设计，对于检测透明质酸酶极为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种透明质酸酶的检测方法，该方法对于透明质酸酶的检测具有优异的灵敏度同时能够避免背景的干扰。
为了实现上述目的，本发明提供了一种透明质酸酶的检测方法，包括：
1)在保护气的存在下，将可溶性铁盐、乙二醇水溶液、聚乙烯吡咯烷酮和醋酸钠进行接触反应，然后进行水热反应、磁性分离以制得Fe3O4纳米球；
2)将Fe3O4纳米球分散于乙醇和水的混合体系中，接着加入氨水和正硅酸乙酯的乙醇溶液进行包硅、磁性分离以制得Fe3O4@SiO2纳米球(Fe3O4纳米球的表面包裹有SiO2)；
3)将Fe3O4@SiO2纳米球分散于乙醇中，接着加入氨水和3-氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基修饰、磁性分离以制得Fe3O4@SiO2@NH2纳米球(Fe3O4@SiO2纳米球的表面修饰有氨基)；
4)在保护气的存在下，将可溶性镉盐、氨基酸溶于水中，接着加入碱调节pH，然后依次加入碲氢化钠、硫代乙酰胺进行回流反应、离心纯化以制得L-半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点(L-半胱氨酸是一种带有氨基的氨基酸，即表示CdTe@CdS核壳结构的量子点的表面修饰有氨基)；
5)将HA(透明质酸)溶于PBS缓冲溶液中，接着加入EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)、NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和L-半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点进行接触反应，分离纯化以制得HA-QDs(L-半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点的表面枝接有HA)；
6)将Fe3O4@SiO2@NH2纳米球加入至HA-QDs中以得到HA-QDs-Fe3O4复合结构(表示HA的两端分别枝接有L-半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点以及Fe3O4@SiO2@NH2纳米球)，接着向多组复合结构中分别加入同体积、不同浓度的HAase(透明质酸酶)溶液进行荧光反应，然后检测荧光强度并绘制工作曲线；
7)将纯化后的人体血清溶液加入至复合结构中进行荧光反应，然后检测荧光强度并根据工作曲线计算所述人体血清中HAase溶液的浓度。
通过上述技术方案，如图11所示，本发明通过在偶联剂(EDC和NHS)的存在下，将HA的羧基进行活化，从而使得活化后的羧基与氨基进行结合形成HA-QDs，接着HA-QDs与Fe3O4@SiO2@NH2纳米球通过HA进行连接(HA相当于桥梁的作用)HA-QDs-Fe3O4复合体系，该复合体系由于磁性Fe3O4的存在，进而能够通过磁铁进行分离和富集。同时，本发明利用癌症标志物Hyaluronidase(HAase)(透明质酸酶)可对HA(透明质酸)进行剪切，进而使得HA-QDs-Fe3O4复合结构被切割成L-半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点和Fe3O4@SiO2@NH2，然后利用Fe3O4的磁性将Fe3O4@SiO2@NH2与未切割的HA-QDs-Fe3O4分离出去。最后，检测L-半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点的荧光强度，利用荧光仪器进行检测。检测的L-半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点的荧光强度与检测的癌症标志物透明质酸酶的浓度呈一定比例关系，所以可通过检测量子点的荧光强度来定量检测癌症标志物透明质酸酶。但是因为未剪切下来的HA-QDs-Fe3O4复合结构以及Fe3O4@SiO2@NH2都存在于此体系中，所以会对QDs的检测有背景干扰。因为此复合结构具有磁性，从而我们利用Fe3O4的磁性将体系中的干扰粒子分离出检测体系，因此无背景干扰，所以其检测的灵敏度也很高。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是检测例1中的荧光光谱图；
图2是依据检测例2中小浓度的的荧光光谱绘制出的工作线性；
图3是检测例3中Fe3O4的透射表征图；
图4是检测例4中Fe3O4@SiO2的透射表征图；
图5是检测例5中HA-QDs-Fe3O4的透射表征图；
图6是检测例6中HA-QDs的透射表征图；
图7是检测例7中HA-QDs-Fe3O4的红外光谱图；
图8是检测例8中Fe3O4、Fe3O4@SiO2以及Fe3O4@SiO2@NH2的X射线衍射谱图；
图9是检测例9中Fe3O4、Fe3O4@SiO2以及Fe3O4@SiO2@NH2的磁滞表征谱图；
图10是检测例9中Fe3O4的X射线光电子能谱；
图11是透明质酸酶的检测原理图；
图12是应用例1中的样品图；
图13是应用例1中的工作曲线图；
图14是应用例3中的结果统计图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种透明质酸酶的检测方法，包括：
1)在保护气的存在下，将可溶性铁盐、乙二醇水溶液、聚乙烯吡咯烷酮和醋酸钠进行接触反应，然后进行水热反应、磁性分离以制得Fe3O4纳米球；
2)将Fe3O4纳米球分散于乙醇和水的混合体系中，接着加入氨水和正硅酸乙酯的乙醇溶液进行包硅、磁性分离以制得Fe3O4@SiO2纳米球；
3)将Fe3O4@SiO2纳米球分散于乙醇中，接着加入氨水和3-氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基修饰、磁性分离以制得Fe3O4@SiO2@NH2纳米球；
4)在保护气的存在下，将可溶性镉盐、氨基酸溶于水中，接着加入碱调节pH，然后依次加入碲氢化钠、硫代乙酰胺进行回流反应、离心纯化以制得L-半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点；
5)将HA(透明质酸)溶于PBS缓冲溶液中，接着加入EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)、NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和CdTe@CdS核壳结构的量子点进行接触反应，分离纯化以制得HA-QDs；
6)将Fe3O4@SiO2@NH2纳米球加入至HA-QDs中以得到HA-QDs-Fe3O4复合结构，接着向多组复合结构中分别加入同体积、不同浓度的HAase(透明质酸酶)溶液进行荧光反应，然后检测荧光强度并绘制工作曲线；
7)将纯化后的人体血清溶液加入至复合结构中进行荧光反应，然后检测荧光强度并根据工作曲线计算人体血清中HAase溶液的浓度。
在本发明的步骤1)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高Fe3O4纳米球的产率，优选地，在步骤1)中，相对于0.5406g的可溶性铁盐，乙二醇的用量为15-25ml，聚乙烯吡咯烷酮的用量为1.5-2.5g，醋酸钠的用量为1-2g；接触反应至少满足以下条件：反应温度为110-130℃，反应时间为0.5-2.5h；水热反应至少满足以下条件：反应温度为180-220℃，反应时间为10-14h。
在本发明的步骤1)中，聚乙烯吡咯烷酮以及保护气的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了提高Fe3O4纳米球的产率，优选地，在步骤1)中，聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量为30000-50000，保护气为氮气、氢气和氩气中的一种或多种。
在本发明的步骤1)中，原料的添加顺序可以在宽的范围内选择，但是为了提高Fe3O4纳米球的产率，优选地，在步骤1)中，原料的添加顺序为：先将可溶性铁盐溶于乙二醇水溶液中，接着加入聚乙烯吡咯烷酮于110-130℃下反应0.5-1.5h，然后加入醋酸钠，停止加热并继续搅拌20-40min，最后将体系于180-220℃下进行水热反应10-14h。
在本发明的步骤1)中，可溶性铁盐的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了提高Fe3O4纳米球的产率，优选地，可溶性铁盐选自高氯化铁、氯化铁和氯化亚铁中的一种或多种。
在本发明的步骤2)中，原料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高Fe3O4@SiO2纳米球的产率，优选地，在步骤2)中，相对于0.155g的Fe3O4纳米球，乙醇的用量为15-25mL，水的用量为0.5-1.5mL，氨水的用量为0.5-1.5mL，正硅酸乙酯的乙醇溶液的用量为5-7ml并且体积浓度为2-5％。
在本发明的步骤2)中，包硅的具体条件在宽的范围内选择，但是为了提高Fe3O4@SiO2纳米球的产率，优选地，在步骤2)中，包硅至少满足以下条件：包硅的时间为0.5-1.5h，包硅的温度为20-30℃。
在本发明的步骤3)中，各物料的具体用量在宽的范围内选择，但是为了提高Fe3O4@SiO2@NH2纳米球的产率，优选地，在步骤3)中，相对于0.16g的Fe3O4@SiO2纳米球，乙醇的用量为15-25mL，氨水的用量为0.5-1.5mL，3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量为0.1-0.3mL。
在本发明的步骤3)中，氨基修饰的具体条件在宽的范围内选择，但是为了提高Fe3O4@SiO2@NH2纳米球的产率，优选地，氨基修饰至少满足以下条件：修饰的时间为1-2h，修饰的温度为20-30℃。
在本发明的步骤4)中，各物料的用量在宽的范围内选择，但是为了提高CdTe@CdS@NH2量子点的产率，优选地，在步骤4)中，相对于0.00125mol的可溶性镉盐，水的用量为90-110ml，氨基酸的用量为0.002-0.004mol，碲氢化钠的用量为0.0001-0.0002mol，硫代乙酰胺的用量为0.00007-0.0001mol；并且，加入碱后体系的pH为10-12。
在本发明的步骤4)中，回流反应的具体条件在宽的范围内选择，但是为了提高L-cys修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点的产率，优选地，回流反应至少满足以下条件：反应温度为100-110℃，反应时间为2.5-3.5h。
在本发明的步骤4)中，保护气、可溶性镉盐、氨基酸的具体种类在宽的范围内选择，但是为了提高L-cys修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点的产率，更优选地，保护气选自氮气、氢气和氩气中的一种或多种，可溶性镉盐选自CdCl2·2.5H2O、Cd(ClO4)2·6H2O和CdCl2中的一种或多种，氨基酸选自L-半胱氨酸、谷胱甘肽和赖氨酸中的一种或多种。
在本发明的步骤5)中，各物料的用量在宽的范围内选择，但是为了提高L-cys修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点的产率，优选地，在步骤5)中，相对于100mg的HA，EDC的用量为150-250mg，NHS的用量为25-35mg，L-cys修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点的用量为4-6mL，PBS缓冲溶液的用量为80-120mL并且PBS缓冲溶液的pH为6.5-6.9。
在本发明的步骤5)中，接触反应的具体条件在宽的范围内选择，但是为了提高HA-QDs量子点的产率，优选地，在步骤5)中，接触反应至少满足以下条件：反应温度为20-30℃，反应时间为5-7h。
在本发明的步骤6)中，为了提高工作曲线的线性，各物料的用量可以在宽的范围内选择，优选地，在步骤6)中，相对于0.01g的Fe3O4@SiO2@NH2纳米球，HA-QDs的用量为0.02-0.04g，HAase溶液的用量为0.5-1.5mL且HAase溶液的浓度为0.01ng/mL-0.1mg/mL，EDC的用量为30-50mg，NHS的用量为10-20mg。
在本发明的步骤6)中，为了提高工作曲线的线性，荧光反应的具体条件可以在宽的范围内选择，优选地，荧光反应至少满足以下条件：反应温度为20-30℃，反应时间为50-60min。
在上述实施方式的基础上，虽然可以利用工作曲线进行检测未知浓度的HAase溶液的浓度，但是为了提高结果的准确性，优选地，工作曲线对应的曲线方程为y＝2.77+686.99*x，其中，y为荧光强度，x为透明质酸酶的浓度。
在本发明中为了进一步提高透明质酸酶的检测的结果的准确性和灵敏度，优选地，在步骤7)之前，所述检测方法还包括：将人体血液离心，取上层以得到所述的纯化后的人体血清溶液，具体为：使用不含热源和内毒素的试管(操作过程中避免任何细胞刺激)收集血液后，以3000转/分钟的转速离心10分钟，将血清与红细胞迅速小心地分离，取上层得到纯化后的血清。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
1)磁性Fe3O4纳米球的制备：将0.5406g的FeCl3·6H2O(高氯化铁)溶于20mL的EG(乙二醇)中，磁力搅拌30min后，加入2.0g的PVP(聚乙烯吡咯烷酮，重均分子量40,000)。接着在氮气氛围中，油浴加热至120℃反应1h，再将1.5g的NaOAc(无水醋酸钠)加入其中，停止加热，继续搅拌30min。得到的反应混合物转入50mL的200℃的反应釜中反应12h。反应结束后，冷却至25℃，磁铁分离，分散于乙醇和水中，进行清洗，得到磁性Fe3O4纳米球。
2)磁性Fe3O4@SiO2纳米球的制备：将0.155g的磁性Fe3O4纳米球重新分散于20mL乙醇和1mL水的混合体系中，超声分散，再加入1mL氨水，超声15min，加入5.2ml的TEOS(正硅酸乙酯)的乙醇溶液(0.2mL的TEOS溶于5mL乙醇中)，于25℃下对磁性Fe3O4纳米球进行包硅1h，磁性分离，得到磁性Fe3O4@SiO2纳米球。
3)磁性Fe3O4@SiO2@NH2纳米球的制备：将0.16g的磁性Fe3O4@SiO2纳米球重新分散于20mL乙醇中，超声分散，再加入1mL氨水，超声15min，加入0.2mL的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，于25℃下进行Fe3O4@SiO2的表面氨基修饰1.5h，得到Fe3O4@SiO2@NH2。
4)L-cys修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点的制备：将0.00125mol的CdC12·2.5H2O(2.5水氯化镉)和0.003mol的L-cys(半胱氨酸)溶于100mL水中，用NaOH(氢氧化钠)调节PH至11，油浴，氮气氛围，30min后，快速注入0.025g的NaHTe(碲氢化钠，0.00017mol)，于105℃下加热回流3h，加入0.06g的TAA(硫代乙酰胺)作为硫源，于105℃下油浴回流3h、离心纯化得到L-cys修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点。进行离心纯化。
5)将100mg的HA(透明质酸)溶于100mL的PBS缓冲溶液(0.01M，pH为6.8)，溶解完成后，加入200mg的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)和30mg的NHS(N-羟基丁二酰亚胺)，30min后，加入5mL的CdTe@CdS(碲化镉@硫化镉)核壳结构的量子点，进行分离纯化得到HA-QDs。
6)在0.04g的EDC和0.015g的NHS的存在下，向0.03g的HA-QDs中加入0.01g的Fe3O4@SiO2@NH2，得到HA-QDs-Fe3O4复合结构。向此体系中，加入1ml的HAase溶液(浓度分别为0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.04ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、50000ng/mL、100000ng/mL、500000ng/mL、1000000ng/mL)，并于37℃下反应1h，之后进行荧光检测，并绘制工作曲线，结果见图1，其中，小浓度范围的工作曲线方程为y＝2.77+686.99*x，具体见图2。
实施例2
1)磁性Fe3O4纳米球的制备：将0.5406g的FeCl3·6H2O(高氯化铁)溶于15mL的EG(乙二醇)中，磁力搅拌20min后，加入1.5g的PVP(聚乙烯吡咯烷酮，重均分子量3000)。接着在氮气氛围中，油浴加热至110℃反应0.5h，再将1g的NaOAc(无水醋酸钠)加入其中，停止加热，继续搅拌0.5min。得到的反应混合物转入50mL的180℃的反应釜中反应10h。反应结束后，冷却至25℃，磁铁分离，分散于乙醇和水中，进行清洗，得到磁性Fe3O4纳米球。
2)磁性Fe3O4@SiO2纳米球的制备：将0.155g的磁性Fe3O4纳米球重新分散于15mL乙醇和0.5mL水的混合体系中，超声分散，再加入0.5mL氨水，超声15min，加入5ml的TEOS(正硅酸乙酯)的乙醇溶液(0.2mL的TEOS溶于5mL乙醇中)，于25℃下对磁性Fe3O4纳米球进行包硅1h，磁性分离，得到磁性Fe3O4@SiO2纳米球。
3)磁性Fe3O4@SiO2@NH2纳米球的制备：将0.16g的磁性Fe3O4@SiO2纳米球重新分散于15mL乙醇中，超声分散，再加入0.5mL氨水，超声15min，加入0.1mL的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，于25℃下进行Fe3O4@SiO2的表面氨基修饰1.5h，得到Fe3O4@SiO2@NH2。
4)L-cys修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点的制备：将0.00125mol的CdC12·2.5H2O(2.5水氯化镉)和0.002mol的L-cys(半胱氨酸)溶于90mL水中，用NaOH(氢氧化钠)调节PH至10，油浴，氮气氛围，30min后，快速注入0.025g的NaHTe(碲氢化钠)，于100℃下加热回流2.5h，加入0.05g的TAA(硫代乙酰胺)作为硫源，于100℃下油浴回流2.5h、离心纯化得到L-cys修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点。进行离心纯化。
5)将100mg的HA(透明质酸)溶于80mL的PBS缓冲溶液(0.01M，pH为6.5)，溶解完成后，加入150mg的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)和25mg的NHS(N-羟基丁二酰亚胺)，30min后，加入4mL的CdTe@CdS(碲化镉@硫化镉核壳结构)量子点，进行分离纯化得到HA-QDs量子点。
6)在0.04g的EDC和0.015g的NHS的存在下，向0.03g的HA-QDs中加入0.01g的Fe3O4@SiO2@NH2，得到HA-QDs-Fe3O4复合结构。向此体系中，加入1ml的HAase溶液(浓度分别为0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.04ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、50000ng/mL、100000ng/mL、500000ng/mL、1000000ng/mL)，并于37℃下反应1h，之后进行荧光检测，并绘制工作曲线，该工作曲线与实施例1的结果保持一致。
实施例3
1)磁性Fe3O4纳米球的制备：将0.5406g的FeCl3·6H2O(高氯化铁)溶于25mL的EG(乙二醇)中，磁力搅拌40min后，加入2.5g的PVP(聚乙烯吡咯烷酮，重均分子量5000)。接着在氮气氛围中，油浴加热至130℃反应1.5h，再将2g的NaOAc(无水醋酸钠)加入其中，停止加热，继续搅拌1.5min。得到的反应混合物转入50mL的220℃的反应釜中反应14h。反应结束后，冷却至25℃，磁铁分离，分散于乙醇和水中，进行清洗，得到磁性Fe3O4纳米球。
2)磁性Fe3O4@SiO2纳米球的制备：将0.155g的磁性Fe3O4纳米球重新分散于25mL乙醇和1.5mL水的混合体系中，超声分散，再加入1.5mL氨水，超声15min，加入7ml的TEOS(正硅酸乙酯)的乙醇溶液(0.2mL的TEOS溶于5mL乙醇中)，于30℃下对磁性Fe3O4纳米球进行包硅1h，磁性分离，得到磁性Fe3O4@SiO2纳米球。
3)磁性Fe3O4@SiO2@NH2纳米球的制备：将0.16g的磁性Fe3O4@SiO2纳米球重新分散于25mL乙醇中，超声分散，再加入1.5mL氨水，超声15min，加入0.3mL的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，于30℃下进行Fe3O4@SiO2的表面氨基修饰1.5h，得到Fe3O4@SiO2@NH2。
4)L-cys修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点的制备：将0.00125mol的CdC12·2.5H2O(2.5水氯化镉)和0.004mol的L-cys(半胱氨酸)溶于90-110mL水中，用NaOH(氢氧化钠)调节PH至12，油浴，氮气氛围，30min后，快速注入0.025g的NaHTe(碲氢化钠)，于110℃下加热回流3.5h，加入0.07g的TAA(硫代乙酰胺)作为硫源，于110℃下油浴回流3.5h、离心纯化得到L-cys修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点。进行离心纯化。
5)将100mg的HA(透明质酸)溶于120mL的PBS缓冲溶液(0.01M，pH为6.9)，溶解完成后，加入250mg的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)和35mg的NHS(N-羟基丁二酰亚胺)，30min后，加入6mL的CdTe@CdS(碲化镉@硫化镉)量子点，进行分离纯化得到CdTe@CdS@NH2@HA量子点。
6)在0.04g的EDC和0.015g的NHS的存在下，向0.03g的HA-QDs中加入0.01g的Fe3O4@SiO2@NH2，得到HA-QDs-Fe3O4复合结构。向此体系中，加入1ml的HAase溶液(浓度分别为0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.04ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、50000ng/mL、100000ng/mL、500000ng/mL、1000000ng/mL)，并于37℃下反应1h，之后进行荧光检测，并绘制工作曲线，该工作曲线与实施例1的结果保持一致。
检测例1
通过通过牌号为HitachiF-4600荧光分光光度计对实施例1中的酶的剪切进行荧光检测，具体结果见图1，由该图可知，随着酶的浓度的增加，其荧光强度逐渐增加。
检测例2
通过通过牌号为HitachiF-4600荧光分光光度计对实施例1中的酶的剪切进行荧光检测，并在小浓度范围内做线性。具体结果见图2，由该图可知，随着酶的浓度的增加，其荧光强度逐渐增加，并具有良好的线性。
检测例3
通过牌号为Tecnai G2 20ST(FEI)的透射电子显微镜对Fe3O4进行透射电镜检测，检测结果见图3，由图3可知，其尺寸约为300nm，分布均匀。
检测例4
通过牌号为Tecnai G2 20ST(FEI)的透射电子显微镜对Fe3O4@SiO2进行形貌检测，检测结果见图4，由图4可知，其尺寸约为330nm，分布均匀，同时也可以看到，其硅层的包覆与厚度。
检测例5
通过牌号为Tecnai G2 20ST(FEI)的透射电子显微镜对HA-QDs-Fe3O4进行形貌检测，检测结果见图5，由图5可知，其尺寸约为335nm，分布均匀，同时也可以看到，HA与Fe3O4@SiO2@NH2纳米球已经偶联上。
检测例6
通过牌号为Tecnai G2 20ST(FEI)的透射电子显微镜对HA-QDs进行形貌检测，检测结果见图6，由图6可知，其尺寸约为20nm，分布均匀，也可以看到半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点已经被包裹在HA中，形成HA-QDs复合物。
检测例7
通过牌号为PerkinElmer PE-983的红外光谱仪对HA-QDs-Fe3O4进行红外光谱检测，检测结果见图7，由图7可知，在1547cm-1处有一个明显的酰胺键的N-H峰。
检测例8
通过牌号为X'Pert Pro MPD的X射线衍射仪对Fe3O4、Fe3O4@SiO2以及Fe3O4@SiO2@NH2进行X射线衍射，检测结果见图8，由图8分析其衍射图谱，可以看出，其峰位置并没有改变。说明对Fe3O4进行包硅以及氨基化后，对其晶体结构没有明显的变化。
检测例9
通过牌号为UKCZX-1的动态磁滞回线测试仪对Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@NH2进行磁滞表征，检测结果见图9，由图9可知，三条磁滞回线均经过零点，可以看出，合成的Fe3O4为超顺磁性。
检测例10
通过牌号为ESCALAB 250Xi XPS的X射线光电子能谱分析对Fe3O4进行X射线光电子能谱检测。检测结果见图10，由图10可知，在711.8eV、724.8eV处为Fe 2p的特征峰。可以看出，我们已成功合成Fe3O4。
应用例1
ELISA(酶联免疫法)检测实际样：
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被血管紧张素II(Ang II)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB(3,3",5,5"-四甲基联苯胺)显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下转化为最终的黄色。颜色的深浅和样品的血管紧张素II(Ang II)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
S0、S1、S2、S3、S4、S5为HAase标准品，用酶标仪测得吸光度。横坐标为活度值，纵坐标为吸光度值得到工作曲线。R1、R2依次为血清样本1、血清样本2，同样得到吸光度值。根据工作曲线，得到血清样本的活度值。检测结果见图1和图2，图1为检测结果的样品图，图2为工作曲线图；其中，活度值与浓度之间关系为：300U＝1mg，可根据此换算关系，R1中的HAase的浓度为0.0099ng/mL、R2中的HAase的浓度为0.0048ng/mL。
应用例2
荧光法检测实际样：
在0.04g的EDC和0.015g的NHS的存在下，向0.03g的HA-QDs中加入0.01g的Fe3O4@SiO2@NH2，得到HA-QDs-Fe3O4复合结构。向此体系中，加入1ml的已纯化后的血清样本溶液(使用不含热源和内毒素的试管收集血液后，以3000转/分钟的转速离心10分钟，将血清与红细胞迅速小心地分离，取上层得到纯化后的血清。)，并于37℃下反应1h，之后进行荧光检测。根据实施例1中的工作曲线，计算样品浓度。然后进行回收率的检测。具体结果见表1，其中，加入表示通过标准加入法向体系中加入0.1ng/mL标准HAase酶样品；发现表示在标准加入后，测得的荧光值，根据工作曲线，得出的浓度值。
表1
应用例3
干扰检测：
在0.04g的EDC和0.015g的NHS的存在下，向0.03g的HA-QDs中加入0.01g的Fe3O4@SiO2@NH2，得到HA-QDs-Fe3O4复合结构。向此体系中，加入1ml的血清样本溶液中的干扰物(0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液、0.15mol/L氯化钠、0.1mmol/L氯化钾、1.5μM丙氨酸、0.5μM精氨酸、0.4μM天冬氨酸、0.6μM谷氨酸、2.3μM甘氨酸、1.4μM组氨酸、0.8μM亮氨酸、1.0μM赖氨酸、0.1μM蛋氨酸、0.4μM苯丙氨酸、1.3μM脯氨酸、0.7μM丝氨酸、0.8μM苏氨酸、0.3μM色氨酸、0.8μM缬氨酸、1.25μM半胱氨酸、5μM谷胱甘肽、15pM多巴胺、30μM葡萄糖、0.5μM抗坏血酸、0.15mg/mL胰蛋白酶、0.2mg/mL核糖核苷酸酶、0.1mg/mL凝血酶、1μg/mL溶菌酶、1mg/mL人血清蛋白、1mg/mL牛血清蛋白、0.15mol/L尿素、0.01mol/L尿酸、0.01mol/L肌酸酐以及各种干扰物的混合物)，并于37℃下反应1h，之后进行荧光检测。根据所得的荧光强度值，绘制柱状图，结果见图14。可以看出，各种干扰物对体系均无影响。最后一条柱状图为标准酶样品，可以看出荧光回升效果良好。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (16)

1.一种透明质酸酶的检测方法，其特征在于，包括：
1）在保护气的存在下，将可溶性铁盐、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和醋酸钠进行接触反应，然后进行水热反应、磁性分离以制得Fe3O4纳米球；
2）将所述Fe3O4纳米球分散于乙醇和水的混合体系中，接着加入氨水和正硅酸乙酯的乙醇溶液进行包硅、磁性分离以制得Fe3O4@SiO2纳米球；
3）将所述Fe3O4@SiO2纳米球分散于乙醇中，接着加入氨水和3-氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基修饰、磁性分离以制得Fe3O4@SiO2@NH2纳米球；
4）在保护气的存在下，将可溶性镉盐、L-半胱氨酸溶于水中，接着加入碱调节pH，然后依次加入碲氢化钠、硫代乙酰胺进行回流反应、离心纯化以制得L-半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点；
5）将透明质酸（HA）溶于PBS缓冲溶液中，接着加入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）和L-半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点进行接触反应，分离纯化以制得HA-QDs；
6）在EDC和NHS的存在下，将所述Fe3O4@SiO2@NH2纳米球加入至所述HA-QDs中以得到HA-QDs-Fe3O4复合结构，接着向多组所述复合结构中分别加入同体积、不同浓度的透明质酸酶（HAase）溶液进行荧光反应，然后检测荧光强度并绘制工作曲线；
7）将纯化后的人体血清溶液加入至所述复合结构中进行荧光反应，然后检测荧光强度并根据所述工作曲线计算所述人体血清中HAase的浓度；
其中，在步骤5）中，相对于100mg的所述HA，所述EDC的用量为150-250mg，所述NHS的用量为25-35mg，所述L-半胱氨酸修饰的CdTe@CdS核壳结构的量子点的用量为4-6mL，所述PBS缓冲溶液的用量为80-120mL并且所述PBS缓冲溶液的pH为6.5-6.9；在步骤6）中，相对于0.01g的所述Fe3O4@SiO2@NH2纳米球，所述HA-QDs的用量为0.02-0.04g，所述HAase溶液的用量为0.5-1.5mL且所述HAase溶液的浓度为0.01ng/mL-0.1mg/mL，所述EDC的用量为30-50mg，所述NHS的用量为10-20mg。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在步骤1）中，相对于0.5406g的可溶性铁盐，所述乙二醇的用量为15-25ml，所述聚乙烯吡咯烷酮的用量为1.5-2.5g，所述醋酸钠的用量为1-2g；所述接触反应至少满足以下条件：反应温度为110-130℃，反应时间为0.5-2.5h；所述水热反应至少满足以下条件：反应温度为180-220℃，反应时间为10-14h。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在步骤1）中，所述聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量为30000-50000，所述保护气为氮气、氢气和氩气中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在步骤1）中，原料的添加顺序为：先将可溶性铁盐溶于所述乙二醇中，接着加入聚乙烯吡咯烷酮于110-130℃下反应0.5-1.5h，然后加入醋酸钠，停止加热并继续搅拌20-40min，最后将体系于180-220℃下进行水热反应10-14h。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述可溶性铁盐选自高氯化铁、氯化铁和氯化亚铁中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在步骤2）中，相对于0.155 g的所述Fe3O4纳米球，所述乙醇的用量为15-25mL，所述水的用量为0.5-1.5mL，所述氨水的用量为0.5-1.5mL，所述正硅酸乙酯的乙醇溶液的用量为5-7ml并且体积浓度为2-5%。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在步骤2）中，所述包硅至少满足以下条件：包硅的时间为0.5-1.5h，包硅的温度为20-30℃。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在步骤3）中，相对于0.16g的所述Fe3O4@SiO2纳米球，所述乙醇的用量为15-25mL，所述氨水的用量为0.5-1.5mL，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量为0.1-0.3mL。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述氨基修饰至少满足以下条件：修饰的时间为1-2h，修饰的温度为20-30℃。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在步骤4）中，相对于0.00125mol的所述可溶性镉盐，所述水的用量为90-110ml，所述L-半胱氨酸的用量为0.002-0.004mol，所述碲氢化钠的用量为0.0001-0.0002mol，所述硫代乙酰胺的用量为0.00007-0.0001mol；并且，加入碱后体系的pH为10-12。
11.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述回流反应至少满足以下条件：反应温度为100-110℃，反应时间为2.5-3.5h。
12.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述保护气选自氮气、氢气和氩气中的一种或多种，所述可溶性镉盐选自CdCl2·2.5H2O、Cd（ClO4）2·6H2O和CdCl2中的一种或多种。
13.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在步骤5）中，所述接触反应至少满足以下条件：反应温度为20-30℃，反应时间为5-7h。
14.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述荧光反应至少满足以下条件：反应温度为20-30℃，反应时间为50-60min。
15.根据权利要求1-14中任意一项所述的检测方法，其中，所述工作曲线对应的曲线方程为y=2.77+686.99*x，其中，y为荧光强度，x为透明质酸酶的浓度。
16.根据权利要求1-14中任意一项所述的检测方法，其中，在步骤7）之前，所述检测方法还包括：将人体血液离心，取上层以得到所述的纯化后的人体血清溶液。
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