CN112094886A - 一种检测肿瘤患者尿液生物标志物的方法 - Google Patents
一种检测肿瘤患者尿液生物标志物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112094886A CN112094886A CN202010776867.1A CN202010776867A CN112094886A CN 112094886 A CN112094886 A CN 112094886A CN 202010776867 A CN202010776867 A CN 202010776867A CN 112094886 A CN112094886 A CN 112094886A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- haase
- detection
- detecting
- urine
- bladder cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 title claims abstract description 24
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 11
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title abstract description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 27
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 27
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 24
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 claims abstract description 20
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims abstract description 19
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- 238000005844 autocatalytic reaction Methods 0.000 claims description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 4
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 3
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 3
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical group [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 61
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 20
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 20
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 abstract description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 9
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 6
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 11
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 7
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000222336 Ganoderma Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000002574 cystoscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- -1 embryogenesis Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000196 viscometry Methods 0.000 description 1
- 238000007805 zymography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
- C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
- C08K2201/00—Specific properties of additives
- C08K2201/01—Magnetic additives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
- C08K2201/00—Specific properties of additives
- C08K2201/011—Nanostructured additives
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- G01N2333/926—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on alpha -1, 4-glucosidic bonds, e.g. hyaluronidase, invertase, amylase
- G01N2333/928—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on alpha -1, 4-glucosidic bonds, e.g. hyaluronidase, invertase, amylase acting on alpha -1, 4-glucosidic bonds, e.g. hyaluronidase, invertase, amylase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
- G01N2800/7028—Cancer
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
透明质酸酶HAase与许多恶性肿瘤密切相关。研究表明,HAase浓度在膀胱癌患者的尿液中显著增高,使其成为膀胱癌早期诊断与治疗的重要生物标志物之一。本发明提出了一种采用空心金纳米材料构建基于HAase‑HA生物识别作用的纳米复合材料进行自催化循环放大反应用于检测HAase的方法。该方法不但使检测体系得到优化和改进,而且,最大程度地提高了检测灵敏度、简化了检测过程、降低了检测成本、拓宽了应用领域,解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高、灵敏度不足等难题,尤为重要的是,本发明无需采用任何工具酶就能获得信号的循环放大效果,为体内外检测、活体及细胞成像等领域提供新的技术和方法。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤患者尿液生物标志物的检测,具体涉及一种检测肿瘤患者尿液生物标志物透明质酸酶HAase的方法,属于光电化学生物传感分析及生物医学临床诊断领域。
背景技术
膀胱癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均占泌尿生殖系统肿瘤的首位。由于传统的膀胱癌临床诊断方法多以膀胱镜检查为主,不但存在创伤和痛苦,对于临床早期诊断也明显不足。据报道,透明质酸酶HAase与许多恶性肿瘤密切相关,该酶是由Frost在1997年首先分离纯化得到。研究表明,HAase的表达水平在癌细胞中大大增加,而在正常细胞中的分布较少。特别是,HAase浓度在膀胱癌患者的尿液中显著增高,使其成为膀胱癌早期诊断与治疗的重要生物标志物之一。作为一种膀胱癌肿瘤标志物,HAase具备蛋白水解酶的特性,能够通过特异性地切割透明质酸HA结构内部β-N-乙酰基-D-葡萄糖胺键来降解HA。除此之外,HAase还与广泛的生理和病理过程有关,包括受精、胚胎发生、炎症和肿瘤生长,除膀胱癌之外,其过表达已被报道与许多恶性肿瘤相关,包括前列腺癌、脑癌、结肠癌等多种癌症,日益成为一种重要的肿瘤标志物而得到广泛关注和研究。因此,开发灵敏检测HAase的技术对于肿瘤的早期诊断和治疗具有重要意义。但是,传统的检测方法,例如粘度测定法,比浊法,比色法和酶谱法等通常缺乏灵敏度和选择性。而免疫测定法因其昂贵的抗体和繁琐的检测步骤限制了它的实际应用。与其他方法相比,荧光检测技术因其具有操作简便、灵敏度高、实时监测能力强、适合于高通量检测等优点得到广泛研究。因此,为了克服传统技术的缺点和不足,迫切需要开发出既无创伤、无痛苦、又简单、灵敏、特异及准确度高的荧光检测方法来满足生物医疗领域对膀胱癌等多种相关癌症的早期诊断及早期治疗的需求。
本发明根据HAase能够特异性地切割并降解HA的这一特性,利用HA作为生物识别分子,采用细胞毒性低、生物相容性好的金纳米材料载带信号分子,通过表面组装方法将生物识别分子与载有信号分子的纳米载体组装为一体,构建形成具有生物识别作用的荧光纳米金复合材料。为了获得比传统技术更高的灵敏度和特异性,本发明采用具有特殊结构的多孔金纳米材料用于荧光信号分子的载带,即将信号分子负载于空心金纳米材料中,为了抑制信号分子的泄露而产生假阳性信号,通过简单有效的表面修饰技术将生物识别分子组装到纳米材料表面,使得纳米金表面被生物识别分子包被,起到分子锁的作用,有效抑制了信号分子的泄露,从而构建获得了基于HAase-HA生物识别作用的荧光纳米复合材料。利用构建获得的荧光纳米复合材料,可实现对HAase的高灵敏检测。
基于该检测机理,不但实现了生物识别分子对于靶标的特异性识别和响应,释放出大量的信号分子从而获得显著增强的荧光信号,而且由于HAase的特性,靶标可以被循环利用,因此,即便很微量的HAase,也能够通过不断地剪切-循环-再剪切的循环方式打开更多的分子锁,不断释放出更多的信号分子,使荧光信号呈指数型增强,最终实现靶标的超灵敏检测。在该体系中,荧光信号的循环放大无需外加生物酶进行催化,而靶标分子HAase通过与HA构建的分子锁发生生物识别作用的同时就可以依靠自身启动催化循环反应,使更多的分子锁被打开,不断释放出大量的信号分子,因此,该体系的检测策略是基于生物识别的自催化反应,使HAase得到循环利用,最终使检测信号得到循环放大,为HAase的高灵敏检测提供了特异、高效的自催化循环放大检测技术。迄今为止,利用空心金纳米材料构建基于HAase-HA生物识别作用的纳米复合材料进行自催化循环放大反应用于HAase检测的文献还未见报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足,针对基于HAase-HA生物识别作用、利用空心金纳米材料负载信号分子进行靶循环-自催化循环放大反应用于检测HAase的技术未见报道,因此,本发明的第一目的:提出并构建一种新型的基于HAase-HA生物识别作用、利用空心金纳米材料载带信号分子进行靶循环-自催化循环放大反应、用于HAase检测的纳米复合材料,具体是利用空心金纳米材料负载信号分子,通过表面修饰技术将生物识别分子组装到多孔的空心金纳米材料表面,形成生物分子锁。该分子锁一方面能够封锁孔口,起到防止纳米材料内部负载的信号分子的泄漏作用,另一方面能够在靶标存在时,与靶标发生特异性地识别反应而被剪切,使封闭信号分子的分子锁被打开,导致大量的信号分子被释放出来,通过对增强的荧光信号的检测实现对靶标HAase的活性检测。在本发明中,由于HAase的特性,靶标可以被循环利用,因此,即便很微量的HAase,也能够通过不断地剪切-循环-再剪切的循环往复的方式打开更多的分子锁,结果释放出更多的信号分子,使荧光信号呈指数型增强,最终实现对靶标的超灵敏检测。正是由于靶标的自催化循环放大作用,使检测体系得到优化和改进,避免了传统方法依赖各种外加工具酶产生催化循环放大作用提高检测灵敏度,这对活体、细胞检测及应用具有重要意义。本发明带来的优点是,最大程度地提高了检测灵敏度、简化了检测过程、降低了检测成本、拓宽了应用领域,解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高、灵敏度不足等难题,在体内外检测、活体及细胞成像等领域具有潜在的应用价值;本发明的第二目的:提供一种基于HAase-HA生物识别作用、利用空心金纳米材料负载信号分子进行靶循环-自催化循环放大反应的纳米复合材料的制备方法;本发明的第三目的:提供一种利用空心的金纳米材料构建基于HAase-HA生物识别作用的纳米复合材料进行自催化循环放大反应用于检测HAase的方法。
本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。本发明提出的基于HAase-HA生物识别作用、利用空心金纳米材料负载信号分子进行靶循环-自催化循环放大反应的纳米复合材料,不但能够显著提高检测灵敏度,还可以实现细胞成像等活体研究。具体是利用空心金纳米载体的特殊结构,在其内部载带大量信号分子;为了防止信号分子的泄露,通过表面修饰技术将HAase的生物识别分子HA组装到多孔的空心金纳米材料表面,构建形成生物分子锁。该分子锁一方面能够封锁孔口,起到防止纳米材料内部载带的信号分子的泄漏作用,另一方面能够在靶标物质HAase存在时,与靶标发生特异性地识别反应而被剪切和降解,降解后的HA从载体表面脱落,使封闭信号分子的分子锁被打开,导致大量的信号分子被释放出来,产生增强的荧光信号,通过检测增强的荧光信号实现对靶标HAase的活性检测。在本发明中,由于HA构建的分子锁可被HAase特异性地识别而被剪切、降解,因此,每个靶标分子可以被循环利用,即便很微量的HAase,也能够通过不断地剪切-循环-再剪切的循环往复的方式打开更多的分子锁,使荧光信号呈指数型增强,最终实现对靶标的超灵敏检测。正是由于靶标的自催化循环放大作用,使检测体系得到优化和改进,无需任何外部条件如温度、激光照射等刺激,避免了传统方法依赖各种外加工具酶而产生催化循环放大作用,这对活体、细胞检测及应用尤其具有重要意义,特别是可以省略工具酶的使用而获得信号的循环放大效果。本发明的优点是,最大程度地提高了检测灵敏度、简化了检测过程、降低了检测成本、拓宽了应用领域,解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高、灵敏度不足等难题,在体内外检测、活体及细胞成像等领域具有潜在的应用价值。
为了降低空白信号,达到最佳的包被效果,通过实验探索,本发明最终通过两端分别带有氨基和巯基的聚乙二醇NH2-PEG-SH的共价连接作用在载体表面进行分子锁的构建,不但简化了组装过程,而且获得了最佳的封堵效果。组装的分子锁仅对靶标分子HAase具有生物识别作用,产生特异性的响应,使HA的结构被HAase破环后从载体表面降解脱落,导致分子锁被打开,产生增强的荧光信号。除此之外,分子锁对其它物质如NaCl、KCl、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖或牛血清白蛋白均没有响应,具有优良的选择性和特异性。当加入不同浓度的HAase时,荧光信号的增强与加入HAase的浓度存在强的相关性。因此,根据测得的荧光信号强度就可以实现对HAase的活性检测。本发明通过实验选择荧光染料罗丹明B作为信号分子,使检测性能表现出荧光强、Stokes位移大、溶解性好、光学性质稳定、信噪比高、无光漂白、生物相容性好、受环境影响小等优良性能。结果表明,该检测体系能够获得远高于传统技术的灵敏度,最重要的是,本发明提出的检测体系不但可以进行特异性的生物识别,而且由于体系的自催化循环放大特性,无需任何外加工具酶、无需任何外部条件刺激就可以产生信号的循环放大,为活体及细胞成像等应用提供了新的方法和技术。
一种制备本发明提出的新型的用于HAase检测的、基于HAase-HA生物识别作用、利用空心金纳米材料载带信号分子进行靶循环-自催化循环放大反应的纳米复合材料的制备方法,包括如下步骤:
(1)巯基磁珠20μL用pH=7.4的PBS缓冲溶液清洗后,加入空心的金纳米载体溶液200μL,37℃摇床反应12.0h;
(2)磁分离、清洗后加入终浓度为1.0×10-5mol/L的RhB的PBS溶液100μL,37℃摇床反应12.0h;
(3)磁分离、清洗后制得纳米载体复合物,保存备用;
(4)在0.5mL100mg/mLHA水溶液中加入200μL13mg/mL羰基二咪唑的DMF溶液,室温反应2.0h后,加入100μL含有25mgNH2-PEG-SH的水溶液和10μL三甲胺溶液,搅拌过夜;
(5)纯化,冷冻干燥,制得复合物HA-PEG-SH;
(6)将0.5mL2.4mg/mLHA-PEG-SH的水溶液加入到步骤(3)制得的纳米载体复合物中,常温搅拌2.0h;
(7)磁分离、清洗,最终制得本发明用于检测HAase的纳米复合材料。
本发明的有益效果:本发明提出的纳米复合材料,为HAase的高灵敏检测提供了特异、高效的自催化循环放大检测技术,可以对靶标物质HAase进行高灵敏和高特异性的检测。与传统技术相比,无需任何外部条件如温度、激光照射等刺激,避免了传统方法依赖各种外加工具酶而产生催化循环放大作用,这对活体、细胞检测及应用尤为重要。本发明的优点在于:不但使检测体系得到优化和改进,而且,最大程度地提高了检测灵敏度、简化了检测过程、降低了检测成本、拓宽了应用领域,解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高、灵敏度不足等难题,尤为重要的是,本发明无需采用任何工具酶就能获得信号的循环放大效果,在体内外检测、活体及细胞成像等领域发挥潜在的应用价值,同时,也为活体及细胞成像等应用提供新的方法和技术。
本发明提出的用于检测HAase的纳米复合材料具有高效、灵敏、结构简单、易制备、性能优异、稳定、细胞毒性低、生物相容性好、适用范围广等优点,并且不会受到其它物质如NaCl、KCl、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖或牛血清白蛋白的影响,表现出高的特异性和选择性。实验结果表明,采用本发明提出的纳米复合材料检测HAase,不但显示了远高于文献值的灵敏度和优异的选择性,而且,还获得了更宽的线性检测范围;其中,在低浓度检测区间0.005-1.00U/mL,HAase的浓度与荧光强度比值F/F0的线性方程为F/F0=1.00+6.70×CHAase(U/mL),线性相关系数为0.9984,检测限为0.0042U/mL(S/N=3);在高浓度检测区间20.00-100.00U/mL,HAase的浓度与荧光强度比值F/F0的线性方程为F/F0=8.80+0.04×CHAase(U/mL),线性相关系数为0.9906;F为荧光强度,F0为荧光空白值。
与文献值相比,不但灵敏度得到显著提高,而且,还获得了包括低浓度区和高浓度区在内的、更宽的线性检测范围,能够很好地满足对常量及微量样品的高灵敏检测。可以预见,本发明提出的纳米复合材料及其制备方法和检测技术在体内外检测、活体及细胞成像等领域具有广阔的应用前景,为重大疾病的早期诊断与治疗发挥重要作用。
附图说明
图1.不同浓度的HAase的荧光强度曲线图。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例,对本发明的技术方案做进一步描述,但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
下面通过实施例具体说明本发明,但本发明不受下述实施例的限定。
实验仪器:THZ-82A气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂);F-4600荧光分光光度计(日立,日本);磁性分离架(天津倍思乐色谱技术开发中心);TDL-40B4000转/分离心机(上海安亭科学仪器厂);TGL-16B10000转/分离心机(上海安亭科学仪器厂);SCIEWTZ-10N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司)。
实验试剂:罗丹明B(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);3-4μm巯基磁珠(天津市倍思乐色谱技术开发中心);乙烯吡咯烷酮K-30(PVP,中国国药化学公司);PBS缓冲溶液(pH=7.4);透明质酸(HA,青岛云山生物科技有限公司);羰基二咪唑(CDI,青岛云山生物科技有限公司);NH2-PEG-SH(华腾制药有限公司);三甲胺(青岛云山生物科技有限公司);透明质酸酶(HAase,青岛云山生物科技有限公司);4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone,青岛云山生物科技有限公司);HumanHyaluronidase-1ELISAKit(探索平台);健康人、膀胱癌病人尿液(高密市人民医院);Hela细胞(青岛大学);二次水等,所用试剂均为分析纯。
实施例1:
一种制备本发明提出的新型的用于检测HAase的、基于HAase-HA生物识别作用、利用空心金纳米材料载带信号分子进行靶循环-自催化循环放大反应的纳米复合材料的制备方法,包括如下步骤:
(1)用pH=7.4的PBS缓冲溶液清洗20μL巯基磁珠后,加入空心金纳米载体溶液200μL,37℃摇床反应12.0h;
(2)磁分离、清洗后加入终浓度为1.0×10-5mol/L的RhB的PBS溶液100μL,37℃摇床反应12.0h;
(3)磁分离、清洗后制得纳米载体复合物,保存备用;
(4)在0.5mL100mg/mLHA水溶液中加入200μL13mg/mL羰基二咪唑的DMF溶液,室温反应2.0h后,加入100μL含有25mgNH2-PEG-SH的水溶液和10μL三甲胺溶液,搅拌过夜;
(5)经透析膜纯化,冷冻干燥,制得复合物HA-PEG-SH;
(6)将0.5mL2.4mg/mLHA-PEG-SH的水溶液加入到步骤(3)制得的纳米载体复合物中,常温搅拌2.0h;
(7)磁分离、清洗,最终制得本发明用于检测HAase的纳米复合材料;
所述的空心金纳米载体按文献方法获得(Sun,Y.;Xia,Y.Science2002,298,2176.)。
实施例2:
一种采用本发明提出的利用空心金纳米载体构建基于HAase-HA生物识别作用的纳米复合材料进行自催化循环放大反应用于检测膀胱癌病人尿液中HAase的方法,包括如下步骤:
(1)取从医院获得的健康人尿液、膀胱癌病人尿液各20μL,另取健康人尿液、膀胱癌病人尿液通过标准加入法制备成比原尿液浓度增加10U/mLHAase的尿液各20μL,分别加入到上述所制备的纳米复合材料中,37℃摇床反应4.0h;
(2)磁分离,取上清液用pH=7.4的PBS缓冲溶液稀释至200μL,并用0.1mol/L的盐酸溶液调pH为5.0进行荧光检测,激发波长553nm,狭缝宽度5.0nm。
实验结果表明,两组健康人尿液中HAase的浓度检测结果分别为19.04和23.33U/mL,向各样品中加标浓度10U/mL后检测结果为27.26和32.38U/mL,回收率分别为93.9%和97.1%。两组膀胱癌病人尿液中HAase的浓度检测结果分别为66.79和74.42U/mL,向各样品中加标浓度10U/mL后检测结果为77.39和86.17U/mL,回收率分别为100.8%和102.1%。同时,为了对照,采用1:200倍稀释样品进行检测,所获结果均与原液数据相吻合。因此,本文提出的纳米复合材料除了用于低浓度范围0.005-1.000U/mLHAase的检测,还能够用于高浓度范围20.00-100.00U/mLHAase的检测,利用本实验方法,即可用于样品原液的检测,也可用于高倍稀释液的检测,说明该方法同时具备高灵敏度、检测线性范围宽等优点,可适用于常量及微量样品的高灵敏检测。
本发明提出的纳米复合材料,为HAase的高灵敏、高特异性检测提供了简单、经济、高效的自催化循环放大检测技术。本发明的优点在于:不但使检测体系得到优化和改进,而且,最大程度地提高了检测灵敏度、简化了检测过程、降低了检测成本、拓宽了应用领域,解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高、灵敏度不足等难题,尤为重要的是,本发明无需采用任何工具酶就能获得信号的循环放大效果,在体内外检测、活体及细胞成像等领域发挥潜在的应用价值,同时,也为活体及细胞成像等应用提供新的方法和技术。
Claims (6)
1.一种检测透明质酸酶HAase的方法,其特征在于:该方法采用的纳米复合材料是基于HAase-HA生物识别作用及自催化循环放大策略,所述的纳米复合材料采用细胞毒性低、生物相容性好的空心金纳米材料载带信号分子,利用透明质酸HA作为生物识别分子构建分子锁。
2.一种如权利要求1所述的检测透明质酸酶HAase的方法,其特征在于:该方法用于检测膀胱癌患者尿液中的HAase。
3.一种如权利要求1所述的检测透明质酸酶HAase的方法,其特征在于:所述的分子锁是通过复合物HA-PEG-SH与空心金纳米材料的反应构建而成。
4.一种如权利要求1所述的检测透明质酸酶HAase的方法,其特征在于:所述的分子锁是通过HA与带有氨基和巯基的聚乙二醇反应制得复合物HA-PEG-SH,然后再与空心金纳米材料反应构建而成。
5.一种如权利要求1所述的检测透明质酸酶HAase的方法,其特征在于:所述的信号分子是罗丹明B。
6.一种如权利要求1所述的检测透明质酸酶HAase的方法,其特征在于:该方法检测膀胱癌病人尿液中的HAase包括以下步骤:
(1)取健康人尿液、膀胱癌病人尿液各20μL,分别加入到本发明提出并制备的纳米复合材料中,37℃摇床反应4.0h;
(2)磁分离,取上清液用PBS缓冲溶液稀释至200μL,并用0.1mol/L的盐酸溶液调pH为5.0进行荧光检测。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010776867.1A CN112094886A (zh) | 2020-08-05 | 2020-08-05 | 一种检测肿瘤患者尿液生物标志物的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010776867.1A CN112094886A (zh) | 2020-08-05 | 2020-08-05 | 一种检测肿瘤患者尿液生物标志物的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112094886A true CN112094886A (zh) | 2020-12-18 |
Family
ID=73750369
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010776867.1A Pending CN112094886A (zh) | 2020-08-05 | 2020-08-05 | 一种检测肿瘤患者尿液生物标志物的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112094886A (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20150017258A1 (en) * | 2012-01-31 | 2015-01-15 | American University Of Cairo (Auc) | Direct detection of disease biomarkers in clinical specimens using cationic nanoparticle-based assays & versatile and green methods for synthesis of anisotropic silver nanostructures |
CN105675573A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-06-15 | 安徽师范大学 | 透明质酸酶的检测方法 |
CN105784666A (zh) * | 2016-05-23 | 2016-07-20 | 青岛科技大学 | 一种纳米荧光生物传感器及其制备方法和应用 |
CN106802294A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-06-06 | 青岛科技大学 | 一种基于可控释放技术的谷胱甘肽荧光传感器及其制备方法 |
CN106908429A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-06-30 | 青岛科技大学 | 一种检测谷胱甘肽的方法 |
CN110819695A (zh) * | 2018-08-13 | 2020-02-21 | 青岛科技大学 | 一种检测银离子的方法 |
-
2020
- 2020-08-05 CN CN202010776867.1A patent/CN112094886A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20150017258A1 (en) * | 2012-01-31 | 2015-01-15 | American University Of Cairo (Auc) | Direct detection of disease biomarkers in clinical specimens using cationic nanoparticle-based assays & versatile and green methods for synthesis of anisotropic silver nanostructures |
CN105675573A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-06-15 | 安徽师范大学 | 透明质酸酶的检测方法 |
CN105784666A (zh) * | 2016-05-23 | 2016-07-20 | 青岛科技大学 | 一种纳米荧光生物传感器及其制备方法和应用 |
CN106802294A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-06-06 | 青岛科技大学 | 一种基于可控释放技术的谷胱甘肽荧光传感器及其制备方法 |
CN106908429A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-06-30 | 青岛科技大学 | 一种检测谷胱甘肽的方法 |
CN110819695A (zh) * | 2018-08-13 | 2020-02-21 | 青岛科技大学 | 一种检测银离子的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
OYUNTUYA GOTOV等: "Hyaluronic acid-coated cisplatin conjugated gold nanoparticles for combined cancer treatment", 《JOURNAL OF INDUSTRIAL AND ENGINEERING CHEMISTRY》, vol. 65, pages 236 - 243 * |
李欣: "基于金纳米笼可控释放的荧光分析方法研究", 《万方 学位》 * |
程丹: "基于功能化金纳米探针检测透明质酸酶和金黄色葡萄球菌", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技 I辑》, no. 12, pages 020 - 152 * |
程丹: "基于功能化金纳米探针检测透明质酸酶和金黄色葡萄球菌", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》, no. 12, pages 020 - 152 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110220888B (zh) | 一种三联吡啶钌功能化mof的电化学发光传感器的制备方法 | |
Su et al. | Recent advances in chemiluminescence for reactive oxygen species sensing and imaging analysis | |
CN111303102B (zh) | 一种硝基还原酶响应的乏氧探针化合物及其制备与应用 | |
CN109266332B (zh) | 一种用于定量检测血液中AChE和BChE的比率型荧光探针的制备方法 | |
Xing et al. | Surface modifications technology of quantum dots based biosensors and their medical applications | |
CN110982513B (zh) | 一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用 | |
Kagalwala et al. | Chemiluminescent spiroadamantane-1, 2-dioxetanes: Recent advances in molecular imaging and biomarker detection | |
CN112111552A (zh) | 一种肿瘤细胞的荧光成像方法 | |
Nie et al. | Novel preparation and electrochemiluminescence application of luminol functional-Au nanoclusters for ALP determination | |
CN107056618B (zh) | 一种检测硝基还原酶的荧光探针 | |
CN109884029A (zh) | 银/石墨烯量子点纳米酶、sers检测试剂盒及应用 | |
CN101012207B (zh) | 检测超氧阴离子自由基的荧光探针及合成方法和用途 | |
CN106749153A (zh) | 硝基还原酶的特异性荧光探针及其制备和用于肿瘤靶向荧光成像和监测肿瘤缺氧程度的应用 | |
CN114478473B (zh) | 一种亮氨酸氨基肽酶化学发光检测试剂的合成及应用 | |
CN110133252A (zh) | 用于检测癌胚抗原的试剂盒和检测方法及其应用 | |
CN110243794A (zh) | 一种基于石墨烯量子点的检测二氧化硫的荧光探针及其应用 | |
Tan et al. | AIEgens-based fluorescent covalent organic framework in construction of chemiluminescence resonance energy transfer system for serum uric acid detection | |
CN112111553A (zh) | 一种检测肿瘤患者尿液生物标志物的纳米复合材料及其制备方法 | |
Sha et al. | One step functional assembly of guanosine monophosphate and terbium ion on metal organic frameworks for determination of alkaline phosphatase activity | |
Cao et al. | Chiral MoSe2 nanoparticles for ultrasensitive monitoring of reactive oxygen species in vivo | |
CN112094886A (zh) | 一种检测肿瘤患者尿液生物标志物的方法 | |
CN111394095B (zh) | 基于铁卟啉金属-有机框架材料/葡萄糖氧化酶的长时间化学发光体系 | |
Li et al. | Direct bilirubin detection using surface-enhanced Raman spectroscopy | |
KR101692052B1 (ko) | 표면 증강 라만 산란 방법(sers)을 이용하여 순환 종양세포 및 순환 종양 줄기유사세포를 검출하는 방법 및 이를 이용한 시스템 | |
CN113502154B (zh) | 一种检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器、制备方法及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |