CN101012207B

CN101012207B - 检测超氧阴离子自由基的荧光探针及合成方法和用途

Info

Publication number: CN101012207B
Application number: CN2007100130058A
Authority: CN
Inventors: 唐波; 高静静; 毛震; 徐克花
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2007-01-04
Filing date: 2007-01-04
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2027-01-04
Also published as: CN101012207A

Abstract

本发明提供一系列用于选择性检测细胞内超氧阴离子自由基的新型荧光探针及合成方法和用途。按照缩合剂：芳香族邻氨基硫酚或芳香族邻氨基硫酚衍生物＝1∶2-3.5重量份配比将缩合剂、芳香族邻氨基硫酚或芳香族邻氨基硫酚衍生物溶解于正丁醇：苯＝1∶0.3-0.6体积份配比的混合溶液中，得混合液；再将该混合液加热回流3-5小时，减压除去溶剂，得到荧光探针粗品；然后将该粗品用乙醇重结晶，真空干燥得荧光探针纯品。该荧光探针用于化学体系，生物体系中超氧阴离子自由基的检测，生物活细胞和活组织内的超氧阴离子自由基的荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中超氧阴离子自由基的检测。

Description

检测超氧阴离子自由基的荧光探针及合成方法和用途

技术领域：

本发明涉及生物检测技术及临床医学检测领域，尤其涉及一系列用于高选择性检测细胞内超氧阴离子自由基的荧光探针；同时涉及该荧光探针的合成方法；另外，还涉及该荧光探针的用途。

背景技术：

生物新陈代谢过程中产生众多的活性氧自由基，包括超氧阴离子自由基(O₂ ^-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基(HO·)、一氧化氮(NO)、过氧亚硝基(ONOO^-)等，这些自由基与癌症和炎症的发病、组织过氧化、蛋白质交联变性、核酸损伤和信号传导(Wiseman，H.；Halliwell，B.Biochem.J.1996，313，17-29；McCord，J.M.；Science.1974，185，529-531；Dobashi，K.；Ghosh，B.；Orak，J.K.；Singh，I.Biochem.2000，205，1-11；Nishida，M.；Maruyama，Y.；Tanaka，R.；Kontani，K.；Nagao，T.；Hoshi，T.Nature.2000，408，492-495.)等有直接的关系。但由于自由基寿命短、含量低、种类多，对其检测仍是生命科学与化学分析领域最困难的问题之一。尤其是高选择性、高灵敏度、实用性强的检测方法仍未见有报道。作为产生其它活性自由基的前体，超氧阴离子自由基的识别和检测尤其重要.目前已有HatsuOMaeda课题组设计合成了双2，4-二硝基磺酸酯基荧光素作为荧光探针检测超氧阴离子(H.Maeda，K.Yamamoto，Y.Nomura，I.Kohno，L.Hafsi，N.Ueda，S.Yoshida，M.Fukuda，Y.Fukuyasu，Y.Yamauchi，N.Itoh，J.Am.Chem.Soc.2005，127，68-69.)。我们基于超氧阴离子的氧化性原理设计合成的新型噻唑啉类荧光探针，通过超氧与探针的特异性反应，利用共聚焦扫描显微镜实现了细胞内原位超氧阴离子自由基的直接有效检测。此研究结果为研究超氧介导的生化反应、自由基损伤生物大分子的作用机理、损伤与疾病的关系及临床治疗提供了一定的理论基础与实验方法。

发明内容：

本发明的目的之一是提供一种快速响应、高选择性、高灵敏度检测超氧阴离子自由基的荧光探针，为生物样品中低含量的超氧阴离子自由基检测，探讨人类疾病及老化的机制以及某些重大疾病的早期诊断与预防，提供良好的辅助手段；目的之二是提供一种工艺简单，性能稳定的合成方法；目的之三是提供该荧光探针的用途。

本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现：

该荧光探针具有下列结构通式：

式中：R＝H，—CH₃，—CH₂CH₃；X＝F，Cl；

或者：

式中：X＝F，Cl 。

本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现：

该合成方法按照缩合剂：芳香族邻氨基硫酚或芳香族邻氨基硫酚衍生物＝1∶2-3.5重量份配比将缩合剂、芳香族邻氨基硫酚或芳香族邻氨基硫酚衍生物溶解于正丁醇：苯＝1∶0.3-0.6体积份配比的混合溶液中，得混合液；再将该混合液加热回流3-5小时，减压除去溶剂，得到荧光探针粗品；然后将该粗品用乙醇重结晶，真空干燥得荧光探针纯品。

本发明的目的之二还可通过如下技术措施来实现：

所述的缩合剂选自氟代二醛基环己烯或氯代二醛基环己烯；所述的芳香族邻氨基硫酚选自邻氨基苯硫酚、取代邻氨基苯硫酚或邻氨基萘硫酚；所述的芳香族邻氨基硫酚衍生物选自甲基邻氨基苯硫酚或乙基邻氨基苯硫酚。

本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现：

将本发明所述的荧光探针用于化学体系、生物体系中超氧阴离子自由基的检测，生物活细胞和活组织内的超氧阴离子自由基的荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中超氧阴离子自由基的检测。

1.本发明荧光探针分子的设计基于探针分子捕获超氧阴离子自由基后，被氧化去氢，共轭结构增大，荧光增强的原理。荧光探针分子表现出良好的选择性，其它活性氧自由基不能使其荧光增强。

2.本发明荧光探针分子对超氧阴离子自由基的检测范围为5.03×10^-9-3.33×10^-6M.可以检测细胞内微摩尔浓度的超氧阴离子自由基。探针分子细胞渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，适于细胞内超氧阴离子自由基浓度变化的检测。

本发明的噻唑啉类荧光探针的具体特征如下：

探针由缩合剂和芳香族邻氨基硫酚化合生成，通过捕获体系内黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶在pH＝7.4的条件下定量生成的超氧阴离子自由基生成荧光产物，具有较高的灵敏度。体内存在的其它种类的活性氧(ROS)和还原性酶不对检测造成干扰，说明该探针选择性较好。该荧光探针分子捕获超氧阴离子自由基速率快，5分钟内反应基本完成，说明其实用性较好。激光共聚焦显微镜成像实验证明探针能够穿透细胞膜进入细胞内部捕获超氧阴离子自由基，并且能够对细胞内微摩尔级的超氧阴离子自由基含量的变化产生响应，对细胞本身没有毒副作用，并且能够对细胞内微摩尔级的超氧阴离子自由基含量变化进行检测。

本发明涉及的荧光探针分子具有极其重要的应用价值。特别是该探针对O₂ ^-·响应迅速，测定灵敏度高，选择性好，对细胞的渗透性好，毒副作用小，使得这类探针作为测定生物体内超氧阴离子自由基的试剂有很好的实际应用价值。另外该系列探针分子结构简单，合成工艺一步即可完成且效率高，而且性能稳定，使得极易规模化生产。

探针分子能够高选择性捕获化学和生物体系内的超氧阴离子自由基，而超氧阴离子自由基是由体系内的黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶在pH＝7.4的条件下定量产生的，因此，反应等同于探针分子定量、专一性捕获超氧阴离子自由基。

本发明适用于生物体内超氧阴离子自由基检测成像的新型探针分子，为生物样品中低含量的超氧阴离子自由基检测，探讨人类疾病及老化的机制以及某些重大疾病的早期诊断与预防，提供良好的辅助手段。

附图说明：

图1是本发明的探针分子与超氧阴离子自由基结合后产物的荧光发射谱图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度；

图2是本发明的荧光探针分子与自由基结合后产物的荧光强度与pH变化关系，横坐标为pH，纵坐标为相对荧光强度；

图3是本发明的荧光探针分子与自由基结合后产物的荧光强度与反应时间的关系，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度；

图4是本发明的荧光探针分子与自由基结合后产物的荧光强度与探针浓度的关系，横坐标为探针浓度，纵坐标为相对荧光强度；

图5是本发明的荧光探针分子对超氧阴离子自由基具有良好的选择性。

图6是本发明的荧光探针分子研究小鼠腹腔巨噬细胞内超氧阴离子自由基的激光共聚焦显微成像。

探针对超氧阴离子自由基选择性

对比了探针对O₂ ^-·以及其它自由基和生物体内物质的反应。将探针在pH7.4的HEPES缓冲中(10mM)配制成10μM的10％的二甲亚砜溶液，探针激发波长为485nm，发射波长为559nm，测试结果显示于图5中。从图5可以看出，探针与超氧阴离子自由基结合后荧光显著增强，而其它种类的活性氧荧光背景干扰极低。

探针在活细胞中的适用性

本发明的探针分子用于检测细胞提取液中的超氧阴离子自由基的量。从表1中可以看出，该探针应用于检测细胞提取液中的超氧阴离子自由基的回收率和准确度是令人满意的。

细胞培养

将收集的小鼠腹腔巨噬细胞用含10％小牛血清蛋白的培养液调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。在37℃，CO₂浓度为5％的条件下使细胞贴壁孵育12小时，取出用培养液冲洗未贴壁细胞，用探针溶液孵育20min，将细胞分成两部分，一部分用佛波醇豆蔻酸盐(PMA)(2ng/ml)刺激，另一部分未刺激的细胞作为空白，用激光共聚焦成像拍摄荧光显微照片。

激光共聚焦成像

从图6可以看出，未经佛波醇豆蔻酸盐(PMA)刺激的巨噬细胞内部含有的O₂ ^-·的量微乎其微，难以进行荧光显像(Fig.6A)，用探针孵育的巨噬细胞经过佛波醇豆蔻酸盐(PMA)刺激后发出强烈的荧光(Fig.6B)，表明细胞内刺激生成的O₂ ^-·被成功捕获，Fig.6C为亮场下的细胞图像。加入了O₂ ^-·清除剂后的用探针孵育的巨噬细胞荧光被完全抑制(Fig.6D)，进一步证明了该探针对超氧阴离子自由基的检测具有高的选择性。

表1：

表1是本发明的荧光探针分子用于检测细胞提取液中的超氧阴离子自由基的量。

细胞内超氧阴离子自由基检测的一般方法是将用探针孵育好的细胞分成两部分，将一部分用佛波醇豆蔻酸盐(PMA)刺激，使细胞内产生大量的O₂ ^-·，用缓冲液冲洗后，进行激光共聚焦显微成像；未刺激的细胞用激光共聚焦显微镜成像得到阴性对照图像。

具体实施方式：

实施例1：

探针的合成

探针DBZTC

取17克的氯代二醛基环己烯和35克的邻氨基苯硫酚溶解于500毫升正丁醇和300毫升的苯的混合溶液中，得混合液；将混合液加热回流3小时，减压蒸除(0.02个大气压，55℃)溶剂，得到紫红色荧光探针粗品；然后将该粗品用重量浓度为99％的乙醇40ml重结晶，真空干燥(0.01个大气压)得棕紫色荧光探针纯品(产率54％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆，25℃，TMS)：CR8.10-7.90(m，2H)，7.75(d，2H)，7.47-7.39(m，2H)，7，24(d，2H)，4.10(m，2H)，3.12(m，2H)，2.3(m，3H)，1.15(m，4H).IR(KBr压片)：v(cm^-1)3245(N-H)，3110(C-H)，1592(C＝C).元素分析结果(理论值)：C₂₀H₁₉N₂S₂Cl:C 62.10(62.02)，H 4.92(4.84)，N 7.24(7.36).

实施例2：

探针的合成

取17克的氯代二醛基环己烯和59克的甲基邻氨基苯硫酚溶解于500毫升正丁醇和150毫升的苯的混合溶液中，得混合液；将混合液加热回流3小时，减压蒸除溶剂(0.01个大气压，45℃)，得到紫红色荧光探针粗品；然后将该粗品用重量浓度为99％的乙醇50ml重结晶，真空干燥(0.01个大气压)得棕紫色荧光探针纯品(产率54.8％)。

实施例3：

探针的合成

取17克的氯代二醛基环己烯和48克的乙基邻氨基苯硫酚溶解于500毫升正丁醇和220毫升的苯的混合溶液中，得混合液；将混合液加热回流4小时，减压蒸除溶剂(0.01个大气压，50℃)，得到紫红色荧光探针粗品；然后将该粗品用重量浓度为99％的乙醇60ml重结晶，真空干燥(0.01个大气压)得棕紫色荧光探针纯品(产率54.2％)。

实施例4：

分别同实施例1～3，不同的是用取代邻氨基苯硫酚替代邻氨基苯硫酚。

实施例5：

分别同实施例1～3，不同的是用取代邻氨基萘硫酚替代邻氨基苯硫酚。

实施例6：

分别同实施例1～3，不同的是用甲基邻氨基苯硫酚替代邻氨基苯硫酚。

实施例7：

分别同实施例1～3，不同的是用乙基邻氨基苯硫酚替代邻氨基苯硫酚。

实施例8：

分别同实施例1～7，不同的是用氟代二醛基环己烯替代氯代二醛基环己烯。

Claims

1.检测超氧阴离子自由基的荧光探针，其特征在于该荧光探针具有下列结构通式：

式中：R＝H或-CH₃或-CH₂CH₃；X＝F或Cl；

或者：

式中：X＝F或Cl。

2.权利要求1的检测超氧阴离子自由基的荧光探针的合成方法，其特征在于按照缩合剂∶芳香族邻氨基硫酚或芳香族邻氨基硫酚衍生物＝1∶2-3.5重量份配比将缩合剂、芳香族邻氨基硫酚或芳香族邻氨基硫酚衍生物溶解于正丁醇∶苯＝1∶0.3-0.6体积份配比的混合溶液中，得混合液；再将该混合液加热回流3-5小时，减压除去溶剂，得到荧光探针粗品；然后将该粗品用乙醇重结晶，真空干燥得荧光探针纯品；所述的缩合剂选自氟代二醛基环己烯或氯代二醛基环己烯；所述的芳香族邻氨基硫酚选自邻氨基苯硫酚或邻氨基萘硫酚；所述的芳香族邻氨基硫酚衍生物选自甲基邻氨基苯硫酚或乙基邻氨基苯硫酚。