CN107652968B - 一种过氧化亚硝酰荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种过氧化亚硝酰荧光探针及其制备方法和应用，其具有如下结构式通式：式中，R选自烷基、取代烷基。本发明提供的荧光探针用于过氧化亚硝酰的检测，该识别反应基于激发态电子转移机制，具有良好的选择性和灵敏度；对于不同浓度的过氧化亚硝酰进行检测时，呈现出良好的线性关系，检测灵敏度高，可达37nM；且其它活性氧物种、活性氮物种、生物硫醇和金属离子对于测定结果干扰很小，检测方法可靠稳定；该探针良好的生物相容性，低毒性，实现了活细胞中过氧亚硝酰的成像等生物方面的潜在应用。

Description

一种过氧化亚硝酰荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光探针领域，更具体的，涉及一种过氧化亚硝酸检测的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
过氧化亚硝酰是生物体内非常重要的一种活性氧物质，它是由一氧化氮和超氧自由基快速反应而生成，且在一些生理和病理过程中具有很高的活性。一方面，过量的过氧化亚硝酰会氧化或硝化细胞内的一些生物分子，如含有酪氨酸残基或硫醇的蛋白质、DNA、含不饱和脂肪酸的脂滴等，使得这些生物分子遭到伤害，从而导致一系列疾病，包括癌症、糖尿病、阿兹海默症、帕金森氏症、亨丁顿舞蹈症和炎性疾病等。另一方面，已有研究表明，过氧化亚硝酰还参与了细胞的信号传导和细胞凋亡过程。因此，对细胞内过氧化亚硝酰的监测引起了人们的广泛关注，阐明过氧化亚硝酰的细胞生理功能和病理机制，对其引起的相关疾病的诊断有着重要的意义。
目前用于检测过氧化亚硝酰的方法中，小分子荧光探针由于具有操作简单、高选择性、非入侵性和实时荧光成像等优点，受到了人们的广泛关注。现已有大量用于检测过氧化亚硝酰的荧光探针，这些探针主要基于光致电子转移(PET)、分子内电荷转移(ICT)和荧光共振能量转移(FRET)等发光机理。近些年来，激发态电子转移机理(ESIPT)吸引了人们的注意，这主要是由于基于激发态电子转移机理的荧光探针通常具有很低的背景(低的量子产率)和长的激发波长(大的斯托克斯位移)，但应用该机理的过氧化亚硝酰荧光探针屈指可数，因此本发明提供了一种基于激发态电子转移机制的，具有高选择性和高灵敏度的，用于检测过氧化亚硝酰的荧光探针及其制备方法和应用。
发明内容
1.本发明的一个目的在于提供一种过氧化亚硝酰荧光探针及其制备方法。
为达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种过氧化亚硝酰荧光探针，其特征在于，所述过氧化亚硝酰荧光探针具有如下结构式通式：
式中，R选自烷基、取代烷基。
优选的，所述过氧化亚硝酰荧光探针的R基为-(CH2)3CH3。
具有上述结构式的过氧化亚硝酰荧光探针通过下述方法制备得到，步骤如下：
将3-甲酰基-4-羟基-N-正丁基-1,8-萘二甲酰亚胺和苯并噻唑-2-乙腈溶于乙醇中，再加入少量催化剂，混合物在惰性气体的保护下，反应得到目标探针。
制备步骤中，所述反应生成目标探针时其反应条件为70℃-90℃下回流反应2小时或以上。
制备步骤中，所述反应得到目标探针其反应结束后将反应物进行抽滤处理，用乙醇洗并干燥，所得产物即为目标探针。
制备步骤中，所述的3-甲酰基-4-羟基-N-正丁基-1,8-萘二甲酰亚胺和苯并噻唑-2-乙腈的用量摩尔比为1：(1～1.5)。
制备步骤中，所述碱性催化剂为三乙胺或其他碱性催化剂。
制备步骤中，所述三乙胺或其他碱性催化剂的用量为0.05～0.3mL。
制备步骤中，所述惰性气体氛围为氮气和氩气中的一种。
2.本发明的另一个目的在于提供一种过氧化亚硝酰荧光探针在检测细胞内内源性过氧化亚硝酰的应用。
有益效果
本发明提供的过氧化亚硝酰荧光探针具有以下显著的特征：
1)在水溶液中几乎没有荧光，降低了检测过程中背景的干扰；
2)灵敏度高，且荧光强度与过氧化亚硝酰的浓度具有良好的线性关系；
3)选择性好，对其他的活性氧物种、活性氮物种、生物硫醇和常见金属离子几乎无响应；
4)在pH为6.0-10.0范围内，探针本身的荧光强度不受pH值变化的干扰，在pH为7.0-10.0范围内，探针对过氧化亚硝酰的检测结果不受pH值变化的干扰；
5)能够检测细胞内内源性的过氧化亚硝酰；
6)合成方法简便，产品易得。
附图说明
图1为制备的荧光探针对不同浓度的过氧化亚硝酰的荧光强度响应图。探针的浓度为5μM,过氧化亚硝酰的浓度为0-50μM，检测体系为乙醇和磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)的混合溶液，体积比为1:1，激发波长为405nm。
图2为制备的荧光探针与过氧化亚硝酰反应前后，分子结构、荧光强度以及发光机理的改变。
图3为制备的荧光探针对不同的活性氧、活性氮、生物硫醇和常见金属离子的荧光强度响应图。探针的浓度为5μM，谷胱甘肽和过氧化氢的浓度为1mM,半胱氨酸、高半胱氨酸和金属离子的浓度均为500μM，其他物质的浓度为50μM。
图4为荧光探针在不同pH值下对过氧化亚硝酰的荧光强度响应图。探针的浓度为5μM，过氧化亚硝酰的浓度为50μM，体系pH值为6、7、8、9、10。
图5为荧光探针检测巨噬细胞内内源性过氧化亚硝酰的荧光成像。a为用5μM探针孵育30min的细胞成像，b为先将细胞用1μg/mL脂多糖(LPS)，50ng/mL干扰素-γ(IFN-γ)和10nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激后，再加入5μM探针孵育30min的细胞成像，c为细胞的荧光强度统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但不限于此。
实施例1
荧光探针的合成
将3-甲酰基-4-羟基-N-正丁基-1,8-萘二甲酰亚胺(297mg,1mmol)加入到15mL乙醇中，使其完全溶解，再向上述溶液中加入苯并噻唑-2-乙腈(174mg,1mmol)和三乙胺(0.1mL)，搅拌，使其完全溶解。混合物在氮气保护下，加热搅拌，回流过夜，反应完成后，待体系冷却，减压抽滤，所得固体用乙醇洗两次，真空干燥，得到目标探针(75％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.32(s,1H),8.81(s,1H),8.47(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),8.31(dd,J＝7.5,1.3Hz,1H),8.08(d,J＝7.9Hz,1H),7.96(d,J＝8.1Hz,1H),7.50(dt,J＝9.5,7.1Hz,2H),7.40(t,J＝7.6Hz,1H),4.02(t,J＝7.4Hz,2H),1.59(h,J＝6.5,5.8Hz,2H),1.35(q,J＝7.4Hz,2H),0.94(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ177.58,166.96,164.33,154.01,144.62,134.28,133.97,133.13,132.29,131.55,129.39,127.08,125.24,124.16,122.47,122.41,122.00,119.01,116.20,102.82,92.45,49.07,39.79,30.41,20.39,14.27.HR ESI-MS calcd for C26H20N3O3S+[M+H+]:454.1220,found 454.1253.
实施例2
探针对过氧化亚硝酰的荧光滴定实验
将5μM的探针加入到乙醇和磷酸盐缓冲液(v/v＝1:1，pH＝7.4)的混合体系中，再加入过氧化亚硝酰，使得其浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45和50μM，记录各个浓度下体系的荧光强度，结果如图1所示。随着过氧化亚硝酰浓度的增加，体系在518nm处的荧光强度随之增强，当浓度达到50μM时，体系的荧光强度达到一个平台。经计算得出检出限为37nM。
实施例3
荧光探针对过氧化亚硝酰的选择性实验
将5μM的荧光探针分别加入到含有50μM的过氧化亚硝酰和含其他物质(谷胱甘肽和过氧化氢的浓度为1mM,半胱氨酸、高半胱氨酸和金属离子的浓度均为500μM，其余物质的浓度为50μM)的体系中，检测体系为乙醇和磷酸盐缓冲液(v/v＝1:1，pH＝7.4)混合体系，记录不同反应体系的荧光强度，结果如图3所示。由图可知，探针仅对过氧化亚硝酰有响应，且荧光强度增强了34倍，而其他反应体系的荧光强度没有明显变化，这说明该荧光探针对过氧化亚硝酰具有高度选择性。
实施例4
探针及探针对过氧化亚硝酰检测的pH干扰实验
将5μM探针加入到pH分别为6、7、8、9、10的检测体系中，测定并记录体系的荧光强度，再向体系中加入50μM过氧化亚硝酰，再次测定并记录体系的荧光强度，结果如图4所示。在pH为7-10的范围内，pH值的变化对探针本身和加入50μM过氧化亚硝酰后的测定结果没有干扰，这说明该探针可用于此pH范围内过氧化亚硝酰的检测。
实施例5
探针检测巨噬细胞内内源性过氧化亚硝酰的研究
巨噬细胞在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和100μg/ml青霉素-链霉素培养基中培养，培养条件为37℃，5％CO2。向培养基中加入5μM探针，孵育30min后，用磷酸盐缓冲液洗三遍，然后进行荧光共聚焦成像。同样，将巨噬细胞用1μg/mL脂多糖(LPS)和50ng/mL干扰素-γ(IFN-γ)孵育12h，然后加入10nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)孵育30min，最后加入5μM的探针培养30min，用磷酸盐缓冲液洗三遍后，进行荧光共聚焦成像。结果如图4所示。由图5a可知，细胞未受脂多糖(LPS)、干扰素-γ(IFN-γ)和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激时，巨噬细胞的发光很微弱，当细胞受到脂多糖(LPS)、干扰素-γ(IFN-γ)和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激后(图5b)，巨噬细胞的荧光强度明显增强。这表明该探针可用于细胞内内源性过氧化亚硝酰的检测。

Claims (10)

1.一种过氧化亚硝酰荧光探针，其特征在于，所述过氧化亚硝酰荧光探针具有如下结构式通式：
式中，R选自烷基或取代烷基。
2.根据权利要求1所述的过氧化亚硝酰荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的化学结构通式中：R＝-(CH2)3CH3。
3.一种根据权利要求2所述的过氧化亚硝酰荧光探针的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
将3-甲酰基-4-羟基-N-正丁基-1,8-萘二甲酰亚胺和苯并噻唑-2-乙腈溶于乙醇中，再加入少量催化剂，混合物在惰性气体的保护下，反应得到目标探针。
4.根据权利要求3所述的过氧化亚硝酰荧光探针的制备方法，其特征在于，反应条件为70℃-90℃下回流反应2小时或以上。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，反应结束后将反应物进行抽滤处理，用乙醇洗并干燥，所得产物即为目标探针。
6.根据权利要求3所述的过氧化亚硝酰荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的3-甲酰基-4-羟基-N-正丁基-1,8-萘二甲酰亚胺和苯并噻唑-2-乙腈的用量摩尔比为1：(1～1.5)。
7.根据权利要求3所述的过氧化亚硝酰荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的催化剂为三乙胺或其他碱性催化剂。
8.根据权利要求7所述的过氧化亚硝酰荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的三乙胺或其他碱性催化剂的用量为0.05～0.3mL。
9.根据权利要求3所述的过氧化亚硝酰荧光探针的制备方法，其特征在于，所述惰性气体氛围为氮气和氩气中的一种。
10.根据权利要求1或2所述的过氧化亚硝酰荧光探针在检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于，所述的过氧化亚硝酰荧光探针用于活细胞中过氧化亚硝酰的检测。
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