CN100486966C - 检测羟基自由基的近红外荧光探针及其合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供检测羟基自由基的近红外荧光探针及其合成方法和用途，该合成方法按如下步骤进行：a.按照2，2，6，6-四甲基哌啶醇∶强碱＝1∶0.5～2.5的摩尔比分别加入无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后将两溶解液混匀，在惰性气体保护和冰水浴条件下反应25～40分钟；b.将与2，2，6，6-四甲基哌啶醇等摩尔比的花菁7加入无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，得花菁7溶液；然后将a工序所得混合液在惰性气体保护下于10～20分钟缓慢加入花菁7溶液中，在干的碎冰中反应25～35分钟；c.将b工序所得产物减压蒸发，蒸除N，N-二甲基甲酰胺，然后用乙醚洗涤，真空干燥得到粗品；d.用硅胶柱层析分离得蓝紫色固体纯品。

Description

检测羟基自由基的近红外荧光探针及其合成方法

技术领域：

本发明涉及生物检测技术及临床医学检测领域，尤其涉及用于羟基自由基检测的近红外荧光分子探针；本发明还涉及该荧光分子探针的合成方法。

背景技术：

生物新陈代谢过程中产生众多的活性氧自由基，包括超氧阴离子自由基(O₂ ^-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基(HO·)、一氧化氮(NO)、过氧亚硝基(ONOO^-)等，这些自由基与癌症和炎症的发病、组织过氧化、蛋白质交联变性、核酸损伤和信号传导(Wiseman，H.；Halliwell，B.Biochem.J.1996，313，17-29；McCord，J.M.；Science.1974，185，529-531；Dobashi，K.；Ghosh，B.；Orak，J.K.；Singh，I.Biochem.2000，205，1-11；Nishida，M.；Maruyama，Y.；Tanaka，R.；Kontani，K.；Nagao，T.；Hoshi，T.Nature.2000，408，492-495.)等有直接的关系，被统一称为对机体的氧化胁迫。然而，这些活性氧在体内的产生和作用，以及过量时的致病机制尚有待于进一步探究；生物体内活性氧的寿命非常短，导致通常情况下稳态浓度极低，意味着活性氧的测定非常困难。·OH作为一种生命活动过程中产生的目前已知氧化性最强的自由基，其检测尤为重要。荧光法由于灵敏度高于其它方法而显示出较强的优越性，并且结合了共聚焦显微成像技术和微区光谱检测技术，是唯一使活体细胞和组织内的活性氧“实时、可见、定量”的检测方法。在600-1000nm的近红外光区，生物基体光吸收或荧光强度很小，且致密介质(如组织)的光散射大大降低，激发光的穿透性更大，因而自发荧光的背景干扰大大降低，且能量较低减少光照对细胞的损伤，所以近红外荧光探针拥有良好的发展前景。目前已有用于细胞内NO和H₂O₂检测并成像的近红外荧光探针(Sasaki，E.；Kojima，H.；Nishimatsu，H.；Urano，Y.；Kikuchi，K.；Hirata，Y.；Nagano，T.J.Am.Chem.Soc.2005，127，3684-3685；Xu，K H.；Tang，B.；Huang，H.；Yang，G.W.；Chen，Z.Z.；Li，P.；An，L.G.；Chem.Commun.2005，48，5974-5976)，而用于针对细胞内HO·检测成像的近红外荧光探针尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的之一是提供性能优良、适用于生物体内羟基自由基检测成像的检测羟基自由基的近红外荧光探针，为生物样品中低含量的羟基自由基检测、探讨人类疾病及老化的机制以及某些重大疾病的早期诊断与预防，提供良好的辅助手段；目的之二是提供工艺简单、成本低、操作方便的该荧光探针的合成方法。

本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现：

该荧光探针具有如下结构通式：

R＝CH₂CH₂CH₃，CH₂CH₃，CH₂CH₂SO₃Na，CH₂CH₂SO₃ ^-，CH₂CH₂CH₂SO₃Na，CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-；

X＝I。

本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现：

该合成方法按如下步骤进行：

a.按照2，2，6，6—四甲基哌啶醇：强碱＝1：0.5～2.5的摩尔比分别加入无水N，N-二甲基甲酰胺至完全溶解，然后将两溶解液混合均匀，在惰性气体保护和冰水浴条件下反应25～40分钟，后恢复至室温；

b.将与2，2，6，6—四甲基哌啶醇等摩尔比的花菁7(Cy.7.Cl)染料加入无水N，N-二甲基甲酰胺至完全溶解，得花菁7溶液；然后将a步骤所得混合液在惰性气体保护下于10～20分钟缓慢加入花菁7溶液中，在干的碎冰中反应25～35分钟；

c.将b步骤所得产物减压蒸干，蒸除N，N-二甲基甲酰胺，然后用乙醚洗涤，真空干燥得到粗品；

d.用硅胶柱层析分离得蓝紫色固体纯品。

本发明的目的之二还可通过如下技术措施来实现：

b工序中所述的缓慢加入时间一般控制为10～20分钟；

c工序中所述的减压蒸干是采用油泵减压，35～45℃旋转蒸发的方式来实现；

d工序中所述的硅胶柱层析分离是采用甲醇—三氯甲烷(3：7～5：5v/v)为洗脱剂，35～45℃旋转蒸发去除溶剂后真空干燥的方式来实现。

本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现：

将本发明的检测羟基自由基的近红外荧光探针用于化学体系、化学模拟生物体系中羟基自由基的检测，生物活细胞和活组织内的羟基自由基的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中羟基自由基的检测。

本发明具有如下积极效果：

探针分子能够专一性捕获化学和生物体系内的甲基自由基，而甲基自由基是由体系内的羟基自由基和加入的二甲亚砜快速定量生成的，因此，反应等同于探针分子定量、专一性捕获羟基自由基。为了简便起见，本专利以下叙述均描述为测定羟基自由基的探针分子。

1.本发明荧光探针分子激发和发射光谱在近红外光区，属于近红外荧光探针，激发位于780nm，发射位于802nm，可以有效避免细胞自发荧光的干扰，提高检测方法的选择性和灵敏度，减少对生命体的损伤，有利于活体检测。

2.本发明荧光探针分子的设计基于哌啶氮氧自由基自旋标记使荧光基团荧光猝灭，探针分子捕获由羟基自由基和二甲亚砜定量快速生成的甲基自由基后荧光恢复的原理。荧光探针分子表现出良好的选择性，其它活性氧自由基不能使其荧光增强。另外荧光探针分子对pH不敏感，在pH6.80到8.00范围内，pH变化对荧光发射没有影响。

3.本发明荧光探针分子对羟基自由基的检测范围为3.0×10^-9～5.0×10^-6M，可以检测纳摩尔浓度的细胞内羟基自由基。探针分子细胞渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，适于细胞内羟基自由基浓度变化的检测。

本发明的花菁染料荧光探针水溶性很好，通常，可以将探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或二甲亚砜中，然后加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试，避免了体系中大量有机溶剂的使用。

本发明的荧光探针的具体特征如下：

探针由近红外荧光基团花菁7和哌啶氮氧自由基通过共价键结合构成，激发发射波长在近红外波段，能够提高方法的灵敏度，降低方法的检测限。在pH值范围为6.80到8.00的范围内，探针使用不受环境酸碱度影响，适用于生物体内使用。体内存在的其它种类的活性氧和还原性酶不对检测造成干扰。激光共聚焦显微镜成像实验证明探针分子的细胞渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，并且能够对细胞内微摩尔级的HO·含量变化进行检测。

细胞内羟基自由基检测的一般方法是将培养好的细胞分成两部分，将一部分用佛波醇豆蔻酸盐(PMA)刺激，使细胞内产生大量的O₂ ^-·，之后的自由基链式反应能够生成HO·，用培养液冲洗后，进行激光共聚焦显微成像。未刺激的细胞用激光共聚焦显微镜成像得到空白对比图像。

本发明涉及的探针分子具有极其重要的应用价值。特别是该探针分子其激发波长位于近红外区，对pH变化极不敏感，响应时间短，测定灵敏度极高，对细胞的渗透性好，毒副作用小，使得这类探针作为测定生物体内羟基自由基的试剂有很好的实际利用价值。另外该系列探针分子结构简单，合成方法更简单，设备投入和生产运行成本均很低、操作方便且生产效率高，适于大规模工业化生产。

附图说明：

图1是本发明的荧光探针分子与自由基结合后产物的激发发射谱图，以及实验体系组分两两加入时的激发发射谱图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。

图2是本发明的荧光探针分子与自由基结合后产物的荧光强度与pH变化关系。横坐标为pH，纵坐标为相对荧光强度。

图3是本发明的荧光探针分子与自由基结合后产物的荧光强度与反应时间的关系。横坐标为时间，纵坐标为相对荧光强度。

图4是本发明的荧光探针分子与自由基结合后产物的荧光强度与探针浓度的关系。横坐标为探针浓度，纵坐标为相对荧光强度。

图5是本发明的荧光探针分子研究小鼠腹腔巨噬细胞内HO·的激光共聚焦显微成像。

具体实施方式：

参照附图1～5和表1做进一步说明：

探针对羟基自由基选择性

对比了探针对HO·以及其它自由基和生物体内物质的反应。将探针在pH7.4的HEPES缓冲中(0.1mM)配制成10μM的10％的二甲亚砜溶液，探针激发波长为780nm，发射波长为802nm，测试结果显示于表1中。从表中可以看出，探针与自由基结合后产生很大的荧光强度，而其它种类的活性氧荧光背景干扰极低。

通过表1显示本发明的荧光探针分子对羟基自由基具有良好的选择性。

表1：

探针在生理pH下的适用性

评价探针在生理pH下的适用性。从图3中可以看出在pH6.80到8.00范围内，pH变化对荧光强度基本没有影响。因此探针可用于生理条件下锌离子的检测。

细胞培养

将收集的小鼠腹腔巨噬细胞用含10％小牛血清蛋白的培养液调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。在37℃，CO₂浓度为5％的条件下使细胞贴壁孵育12小时，取出用培养液冲洗未贴壁细胞，用探针溶液孵育20min，将细胞分成两部分，一部分用佛波醇豆蔻酸盐(PMA)(2ng/ml)刺激。将未刺激的细胞作为空白，用激光共聚焦成像拍摄荧光显微照片。

激光共聚焦成像

从图5可以看出，未经佛波醇豆蔻酸盐(PMA)刺激的巨噬细胞内部含有的HO·的量微乎其微，难以进行荧光显像(Fig.5a)，用探针孵育的巨噬细胞经过佛波醇豆蔻酸盐(PMA)刺激后发出强烈的荧光(Fig.5b)，表明细胞内刺激生成的HO·转变成·CH₃后被成功捕获。Fig.5c为亮场下的细胞图像。

实施例1：

探针的合成

    花菁7(Cy.7.Cl)              探针(Cy.7.TEMPO)

氮气保护下将382.7mg(2.15mmol)2，2，6，6—四甲基哌啶醇加入到100ml三口烧瓶，冰水浴冷却下10ml无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解。浆状的氢氧化钠65mg(2.15mol，80％，保存于煤油中，用正己烷清洗)溶于5ml无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌下加入烧瓶中，反应于30分钟后恢复至室温。花菁7(Cy.7.Cl)378mg(2.15mmol)溶于50ml无水N，N-二甲基甲酰胺DMF中，将上述所得溶液在室温氮气保护下逐滴加入到花菁7(Cy.7.Cl)的无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，15分钟完成加料，30分钟后反应在干的碎冰中结束。油泵减压，40℃旋转蒸发将N，N-二甲基甲酰胺(DMF)蒸干，将所得物用乙醚洗涤，真空干燥，用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇—三氯甲烷(3：7v/v)，40℃旋转蒸发去除溶剂，真空干燥，得蓝紫色固体(C₄₅H₅₉O₈S₂N₃)，1.486g，产率83％。元素分析结果(理论值)：C，64.6(64.8)；H，6.9(7.1)；N，5.1(5.0)；。¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ 8.00(d，2H)，7.52(d，2H)，7.42(d，2H)，7.37(t，2H)，7.21(t，2H)，6.27(d，2H)，4.17(t，4H)，3.80(m，1H)，1.96(m，2H)，1.76(m，8H)，1.62(m，2H)，1.32(s，12H)，1.08(t，12H)，0.86(d，4H)。

Claims (3)

1、检测羟基自由基的近红外荧光探针，其特征在于该荧光探针具有如下结构通式：

R＝CH₂CH₂CH₃，CH₂CH₃，CH₂CH₂SO₃Na，CH₂CH₂SO₃ ^-，CH₂CH₂CH₂SO₃Na，CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-；

X＝I。

2、权利要求1所述的检测羟基自由基的近红外荧光探针的合成方法，其特征在于该合成方法按如下步骤进行：

a.按照2，2，6，6—四甲基哌啶醇：强碱＝1:0.5～2.5的摩尔比分别加入无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后将两溶解液混匀，在惰性气体保护和冰水浴条件下反应25～40分钟；

b.将与2，2，6，6—四甲基哌啶醇等摩尔比的花菁7加入无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，得花菁7溶液；然后将a步骤所得混合液在惰性气体保护下缓慢加入花菁7溶液中并在干碎冰中反应25～35分钟；

c.将b步骤所得产物减压蒸干，蒸除N，N-二甲基甲酰胺，然后用乙醚洗涤，真空干燥得到粗品；

d.用硅胶柱层析分离得蓝紫色固体纯品。

3、根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：

b步骤中所述的缓慢加入时间控制为10～20分钟；c步骤中所述的减压蒸干是指油泵减压，35～45℃旋转蒸发；d步骤中所述的硅胶柱层析分离是指以甲醇—三氯甲烷为洗脱剂，35～45℃旋转蒸发去除溶剂后真空干燥。

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