CN1412553A - 一种羟基自由基的测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种羟基自由基的测定方法，将捕获剂异丙醇加入待测体系，使得其中含有异丙醇的浓度为体系中羟基自由基产生物浓度的10～100倍；在pH值为1～7，异丙醇与待测体系中的羟基自由基反应生成丙酮，采用气相色谱/氢火焰离子化检测器法测定生成的丙酮浓度，然后将测得的丙酮浓度换算成羟基自由基的浓度。本发明利用异丙醇捕获羟基自由基生成丙酮的反应，然后采用气相色谱/氢火焰离子化检测器法间接测定羟基自由基。该方法可检测浓度范围为0～580μmol/L的羟基自由基，检测限可达0.5μmol/L(进样量10μL)；实现了羟基自由基准确、简单、快速、高效、低成本的测定。
Description
技术领域 本发明涉及一种羟基自由基的测定方法，具体的说就是利用异丙醇捕获羟基自由基(·OH)生成丙酮的反应，然后采用气相色谱/氢火焰离子化检测器(GC/FID)法间接测定羟基自由基。
背景技术 虽然国内外已建立了多种测定自由基的方法，但除少数几种(如电子自旋共振能谱法、激光荧光光谱法和长光程吸收光谱法)可直接测定自由基外，大多数方法都属于间接测定法。由于自由基的高度活泼性、浓度低和存在的寿命短，即使属于直接测定方法，其干扰因素也不少，无论是定性还是定量，都有待于进一步提高其可靠性(徐向荣等，《生物化学与生物物理进展》，1999，26，67)。测定羟基自由基的间接法又称清除剂法或捕获剂法，即以各种简单有机物作为PtOH自由基的捕获剂与PtOH自由基发生反应，测定反应的产物，根据生成产物的量、速率推算PtOH自由基生成的量、速率。目前尚没有统一的捕获剂，一般研究所选择的清除剂为苯、异丙醇、叔丁醇、苯甲酸等，生成的产物分别是苯酚、丙酮、叔丁基二醇和羟基苯甲酸，对这些产物的测定方法一般为发光光度法和液相色谱法；若用甲酸和二甲亚砜作清除剂，则产物为二氧化碳和甲烷气，采用气相色谱法测定。
在国外，自由基的测定主要是采用电子自旋共振法和液相色谱法；而国内受仪器条件和经费的限制，有相当一部分工作是用分光光度法来测定自由基。这种间接测定自由基的方法干扰大，影响准确度的因素非常多而复杂，有的方法所测得的物质是否是自由基反应的产物都还有待于确证。大气化学中，常使用激光荧光光谱和长光程吸收光谱方法；在生命科学领域，电子自旋共振法仍属于相对可靠的方法。但不普及而且价格昂贵。在化学、生物、环境科学等领域的自由基研究中，需要准确、简单、价廉、易得的实用检测方法。
发明内容 本发明所要解决的问题是提供一种羟基自由基的测定方法，这种方法准确、简单、价廉、易得。
本发明提供的技术方案是：一种羟基自由基的测定方法，将捕获剂异丙醇加入待测体系，使得其中含有异丙醇的浓度为体系中羟基自由基产生物浓度的10～100倍；在pH值为1～7，异丙醇与待测体系中的羟基自由基反应生成丙酮，采用气相色谱/氢火焰离子化检测器法测定生成的丙酮浓度，然后将测得的丙酮浓度换算成羟基自由基的浓度。
上述异丙醇与待测体系中的羟基自由基的反应温度不超过80℃下。
上述气相色谱以3～5％(聚乙二醇与载体的重量百分比)的聚乙二醇(PEG)为色谱固定液，聚乙二醇的分子量为6000～20000。
上述色谱固定液以硅藻土(Chromsob)为载体。
本发明利用捕获剂和捕获反应对活性自由基间接测定来研究自由基。异丙醇捕获·OH生成丙酮的反应如下：
根据自由基反应研究结果：捕获反应的效率为86.7％，因此
因此通过测定丙酮可以间接测定·OH的浓度。
本发明可检测浓度范围为0～580μmol/L的羟基自由基，检测限可达0.5μmol/L(进样量10μL)。结果与国外报道用液相色谱法测定的结果相一致(Hislop，K.A.and Bolton，T.R.，Environ.Sci.Technol.，1999，33，3119)，但分析时间大大缩短，仅需2min。
本发明首次利用这一捕获反应，采用聚乙二醇为色谱固定液，GC/FID法，无需衍生化就能够很好实现产物丙酮与捕获剂异丙醇良好分离，快速测定生成的丙酮，实现羟基自由基的准确、简单、价廉、快速的定量测定。
附图说明 图1为本发明的典型色谱分离效果图；图2和图3为丙酮色谱分析的标准曲线图；图4为本发明测定的不同pH下Fe3+/草酸盐配合物体系中羟基自由基的浓度关系图；图5为本发明测定的Fe3+/草酸盐配比在9/30～90/600范围的Fe3+/草酸盐配合物体系中羟基自由基的浓度关系图。
具体实施方式 本发明测定羟基自由基的主要步骤如下：1)将捕获剂异丙醇加入待测体系，使得其中含有异丙醇的浓度为体系中羟基自由基产生物(来源)浓度的10～100倍；2)体系产生羟基自由基的方法可以多种多样，如化学的、物理的和生物的，具体条件因具体体系而改变，但捕获反应应控制体系pH值为1～7，温度不超过80℃。3)清除反应完成后，用气相色谱仪/氢火焰离子化检测器法测定生成的丙酮浓度。气相色谱条件如表1所列。
表1丙酮分析的气相色谱条件参数 设置色谱柱 2m不锈钢填充柱3～5％PEG/ChromsobW(PEG分子量6000～20000)柱温 80℃进样口温度 150℃载气 N2 42ml/min检测器 FID(氢火焰离子化检测器)检测器温度 150℃进样体积 10μL
丙酮和异丙醇的保留时间分别为0.94min和1.42min。典型的色谱分离图如图1所示。样品定量分析采用外标法(即标准曲线法)。丙酮浓度范围在0～20μmol/L时，A＝65+65.8×C；20～500μmol/L时，A＝900+95.9×C；其中A表示色谱峰面积，C表示丙酮浓度(μmol/L)。标准曲线如图2和图3所示。同一样品进样分析3次，峰面积误差小于4.9％。
实施例：对紫外光照射下含三价铁离子(Fe3+)水溶液中·OH的生成进行测定。配制Fe3+/草酸盐(Ox)配比为11.1/120.5μmol/L的水溶液，加入异丙醇使得其浓度为1mmol/L，调节溶液pH为3.0，将该溶液分装入8支10ml比色管，放入光反应支架，进行光照。每隔10min取一支比色管，用GC/FID测定溶液中生成的丙酮。在表1所示的气相色谱条件下(聚乙二醇分子量为20000)，利用图2和图3获得的标准曲线对样品中的丙酮进行定量分析。结果为：光照80min后，·OH生成浓度为68.2μmol/L，绝对量为0.682μmol；若上述溶液中不加入草酸盐，则·OH生成浓度仅为8.1μmol/L，绝对量为0.081μmol；而在不加光照或不加Fe3+条件下进行上述实验，没有检测到·OH。
本发明实施可随具体反应体系变化而改变，如上述实施例中体系为Fe3+/草酸盐配合物体系，可在pH值为2～6，Fe3+/草酸盐配比在9/30～90/600很宽范围的条件下测定·OH，结果以·OH生成速率表示，如图4和图5所示。图4是在pH值为2～6条件下测定Fe3+/草酸盐配合物体系中的羟基自由基，当pH＝3.5时，体系中的羟基自由基产生速率最高，而较高的pH值不利于羟基自由基的生成；图5是Fe3+/草酸盐配比在9/30～90/600很宽范围的条件下测定羟基自由基，从图中可以看出Fe3+/草酸盐配比高有利于体系中的羟基自由基产生速率提高，而过高的Fe3+/草酸盐配比对于羟基自由基生成量的增加并不明显。
Claims (4)
1.一种羟基自由基的测定方法，将捕获剂异丙醇加入待测体系，使得其中含有异丙醇的浓度为体系中羟基自由基产生物浓度的10～100倍；在pH值为1～7，异丙醇与待测体系中的羟基自由基反应生成丙酮，采用气相色谱/氢火焰离子化检测器法测定生成的丙酮浓度，然后将测得的丙酮浓度换算成羟基自由基的浓度。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征是：异丙醇与待测体系中的羟基自由基的反应温度不超过80℃下。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征是：气相色谱以重量百分比3～5％的聚乙二醇为色谱固定液，聚乙二醇的分子量为6000～20000。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征是：色谱固定液以硅藻土为载体。
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