CN111548790A - 一种近红外比率型荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种近红外比率型荧光探针及其合成方法与应用，属于小分子荧光探针技术领域。通过将谷胱甘肽(GSH)修饰于七甲川花菁上作为γ‑谷氨酰转肽酶(GGT)的酶切位点，研制出一例用于GGT活性检测的近红外比率型荧光探针(Cy‑GGT)。且Cy‑GGT具有良好的水溶性，向其水溶液中加入GGT，可使其荧光发射波长由808nm蓝移至616nm(发射位移192nm)。该比率型荧光探针既对GGT活性检测表现出较高的灵敏度(检出限为0.02mU/mL)和选择性，又可成功地用于活细胞内和动物体中GGT活性检测与荧光成像，并且能有效地区分肿瘤细胞和正常细胞，有望对相关癌症的早期诊断与治疗发挥积极作用。
Description
技术领域
本发明属于小分子荧光探针领域，涉及一种用于γ-谷氨酰转肽酶(GGT)活性检测与成像的近红外比率型荧光探针，更具体地，涉及一种近红外比率型荧光探针及其合成方法和它在检测γ-谷氨酰转肽酶中的应用。
背景技术
γ-谷氨酰转肽酶(GGT)是一种广泛存在于哺乳动物细胞表面的酶，可催化谷胱甘肽(GSH)或其他γ-谷氨酰化合物中谷氨酰胺键的水解，其活性与许多重要的生理过程密切相关。研究发现GGT活性在许多疾病中显著升高，如肝癌、卵巢癌、结直肠癌等。因此，GGT的高表达与肿瘤的发生密切相关，被认为是一种潜在的癌症生物标志物。准确检测肿瘤细胞/组织内GGT活性对疾病的早期诊断和预测治疗效果具有非常重要的意义。
目前，GGT活性的检测方法有放射性同位素标记法、比色法、高效液相色谱法(HPLC)和荧光法，每种方法各具特色。然而，放射性同位素标记法产生的残留物会对人体造成一定的损害，比色分析法和高效液相色谱法对仪器设备要求较高，且不适合用于生物样品的实时成像。相较而言，荧光分析法具有检测灵敏度高、样品前处理简单、无创性好和实时成像监测等优势，可以准确、特异地检测活细胞和病理组织中GGT活性，有助于癌症的早期诊断。并且GGT特异性荧光探针在手术过程中能够指示肿瘤与正常组织之间的边界，其对外科手术有一定的帮助。
近红外荧光探针采用近红外光谱分析，在生物体内分子的诊断识别中起着关键的作用。因为近红外波段(600～800nm)的光波避开了体内水、有氧及无氧血红蛋白等主要吸收组织的最佳吸收波长，从而具有良好的生物组织穿透能力，能降低对生物组织的损伤。并且该类染料的类型比较多，摩尔消光系数高，具有良好的水溶性，分子量比较小(一般小于1000)，可以避免对被标记分子的连接与功能产生空间位阻效应。
另外，目前报道的比率型GGT荧光探针大多基于分子内电荷转移(ICT)和荧光共振能量转移(FRET)的光物理机制设计，该类探针的荧光发射峰位移小(通常在100nm以内)，容易受到两个发射信号的串扰，不利于肿瘤细胞/组织的精准成像。并将其与紫外-可见光相比，近红外光对生物样品的光损伤小、组织的穿透性好、受复杂生命系统的自身荧光干扰弱，更利于生物成像。
因此，如何开发一种能够用于GGT活性精准检测且具有较大发射峰位移的近红外比率型荧光探针是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种具有较大发射峰位移并用于GGT活性精准检测的近红外比率型荧光探针(Cy-GGT)。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种近红外比率型荧光探针，所述比率型荧光探针具有花菁荧光基团，其结构式为：
所述近红外比率型荧光探针利用花菁骨架共轭重组形成具有红色荧光的Cy-O,对应的荧光发射波长由808nm蓝移至616nm。较大的发射位移(约192nm)可以使荧光探针避免光谱串扰,更加有利于生物样品中GGT活性的检测与成像。因此，探针Cy-GGT不仅在溶液中表现出对GGT活性检测的优越光谱性能,还能成功地用于活细胞和动物体内GGT活性的荧光成像。
本发明的另一目的是提供一种近红外比率型荧光探针的合成方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种近红外比率型荧光探针的合成方法，具体包括如下步骤：
(1)吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇在正丁醇/苯混合溶剂中分水回流得到化合物1，其中反应体系温度为130℃～150℃，反应时间为10～12h，
(2)在N2气氛下将上述化合物1与乙酸钠在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中反应5～7h，反应温度为85℃～95℃，纯化得到化合物2，
(3)将化合物2和三乙胺溶于无水二氯甲烷中，冰浴下滴加丙烯酰氯的无水二氯甲烷溶液，升至室温搅拌过夜，纯化得到化合物3，
(4)将谷胱甘肽和碳酸氢钠溶于去离子水中，在N2保护下逐滴滴加化合物3的甲醇溶液，室温下搅拌反应24h，待反应结束后，将反应液倾入去离子水中，并用二氯甲烷萃取、硅胶柱层析纯化得到本发明公开的近红外比率型荧光探针。
通过采用上述技术方案，本发明的作用机理如下：
本发明近红外荧光探针以花菁为荧光基团，在PBS缓冲溶液中可通过与GGT作用催化谷氨酰胺键水解，进而引发分子内消去过程发生，分别通过探针及其反应产物的两个不同波长处荧光强度的比值(F616nm/F808nm)变化可检测GGT的存在与否。
在没有加入GGT时，所述探针的最大吸收和荧光发射波长均处在近红外区，分别为766nm和808nm；而加入GGT后，766nm处的吸收减弱，510nm处出现新的吸收峰,溶液颜色由绿色变为红色。Cy-GGT于808nm的发射峰降低,在616nm出现新的荧光发射峰。
并且，该合成方法不仅操作简单，而且产率高，提纯方便快捷。
优选的，所述步骤(1)中，吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇的摩尔比为(1～3):1，所用溶剂正丁醇/苯的体积比为(6～8):(2～4)；优选吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇的摩尔比为2:1，所用溶剂正丁醇/苯的体积比为7:3。
具体的，溶剂(正丁醇/苯)与反应物(吲哚季铵盐、(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇)之间的配比关系如下所示：
溶剂(正丁醇/苯)为50mL，吲哚季铵盐2mmol，2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇为1mmol。
优选的，所述步骤(2)中，化合物1与乙酸钠的摩尔比为1:(2～4)，所用溶剂N,N-二甲基甲酰胺的体积为5～7mL；优选化合物1与乙酸钠的摩尔比为1:3，所用溶剂N,N-二甲基甲酰胺为6mL。
具体的，溶剂(N,N-二甲基甲酰胺)与反应物(化合物1、乙酸钠)之间的配比关系如下所示：
溶剂(N,N-二甲基甲酰胺)20mL，化合物1为1mmol，乙酸钠为1.5mmol。
优选的，所述步骤(3)中，化合物2、三乙胺和丙烯酸氯的摩尔比为1:(5～6):(2～3)，所述无水二氯甲烷的体积为20～30mL。
具体的，溶剂(无水二氯甲烷)与反应物(化合物2、三乙胺和丙烯酰氯)之间的配比关系如下所示：
化合物2为0.1mmol，丙烯酰氯为0.2mmol，三乙胺为0.6mmol，无水二氯甲烷的体积约为20mL。
优选的，所述步骤(4)中，化合物3、谷胱甘肽和碳酸氢钠的摩尔比为1:(3～5):(5～6)，所用去离子水的体积为5～10mL，甲醇的体积为5～10mL。
需要说明的是，原料配比不会影响产物对γ-谷氨酰转肽酶的检测性能，优化原料配比仅为提高反应产率。如加入5倍量的谷胱甘肽以使化合物3充分反应生成所需产物，若谷胱甘肽加入较少则化合物2会有剩余，则给后续纯化过程带来一定难处。
另外，发明人分别通过核磁共振氢谱、高分辨质谱等手段进行表征，以表明所述近红外比率型荧光探针合成成功。
本发明还有一个目的，就是提供近红外比率型荧光探针在检测γ-谷氨酰转肽酶中的具体应用。
优选的，所述γ-谷氨酰转肽酶在以肝癌细胞为主癌细胞中过度表达，且合成的荧光探针可进入活细胞并用于细胞内和动物体内GGT活性的荧光成像。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种近红外比率型荧光探针及其合成方法与应用，具体公开一种近红外比率型荧光探针的合成方法及其检测细胞内γ-谷氨酰转肽酶的应用，具有如下优异的技术效果：
本发明公开的近红外比率型荧光探针的合成方法不仅操作简便，生物毒性低，而且在PBS缓冲溶液中能够高效选择性识别GGT；同时通过对细胞初步标记研究表明，该探针具有很好的肿瘤靶向性，能够对GGT具有较高的灵敏度，少量的探针即可对细胞内GGT作出快速响应。因此本发明公开的用于检测GGT的方法策略具有市场应用与推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明近红外比率型荧光探针在氘代甲醇中的核磁共振氢谱。
图2附图为本发明近红外比率型荧光探针在甲醇中的高分辨质谱。
图3附图为本发明近红外比率型荧光探针在PBS缓冲溶液中与GGT相互作用时的吸收光谱和荧光光谱图。
图4附图为在PBS缓冲溶液中Cy-GGT与不同浓度的GGT在37℃下孵育60min后的荧光光谱以及616nm和808nm的荧光强度随GGT浓度变化的散点图和I616nm/I808nm随GGT浓度变化的线性关系。
图5附图为本发明近红外比率型荧光探针随DON浓度变化的抑制效率图。
图6附图为近红外比率型荧光探针在细胞内成像的共聚焦时间跟踪图。
图7附图为近红外比率型荧光探针分别在癌细胞和正常细胞内的共聚焦成像图。
图8附图为皮下肿瘤小鼠模型的荧光成像图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种高灵敏度、高选择性，能够用于GGT活性精准检测且具有较大发射峰位移的近红外比率型荧光探针及其合成方法与应用。
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
本发明公开了一种近红外比率型荧光探针，所述比率型荧光探针具有花菁荧光基团，其结构式为：
下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行进一步的说明。
实施例1
近红外比率型荧光探针的合成方法，具体包括如下步骤：
(1)化合物1的合成：
吲哚季铵盐(3.00×10-3mol)和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)(1.50×10-3mol)甲醇通过分水分流法得到化合物1；
其中反应的溶剂为体积比7:3的正丁醇/苯的混合溶剂，反应体系温度为140℃，反应时间为11h；
(2)化合物2的合成：
在N2气氛下将上述化合物1(5.00×10-4mol)与乙酸钠(1.50×10-3mol)在N,N-二甲基甲酰胺(6mL)溶剂中反应6h，反应温度为90℃，获得化合物2；
(3)化合物3合成：
将化合物2(1.00×10-4mol)和三乙胺(6.00×10-4mol)溶于干燥的二氯甲烷(10mL)中，冰浴下滴加丙烯酰氯(2.00×10-4mol)的二氯甲烷(5mL)溶液，升至室温搅拌过夜，获得化合物3；
(4)近红外比率型荧光探针的合成：
将谷胱甘肽(2.00×10-4mol)和NaHCO3(6.00×10-4mol)溶于去离子水(10mL)中，在N2保护下逐滴滴加化合物3(1.00×10-4mol)的甲醇(5mL)溶液，室温下搅拌反应24h，得到本发明公开的近红外比率型荧光探针。
1、测试分析：
图1为探针在氘代甲醇中的1H NMR谱，具体谱峰值为：1H NMR(500MHz,MeOD-d4)δ(ppm)7.78(d,J＝14.1Hz,2H),7.54(d,J＝7.4Hz,2H),7.41(t,J＝7.6Hz,2H),7.28(dd,J＝14.8,7.6Hz,4H),6.20(d,J＝14.1Hz,2H),4.65(dd,J＝8.9,4.9Hz,2H),4.19(q,J＝7.1Hz,4H),3.79(d,J＝3.7Hz,2H),3.63(t,J＝6.2Hz,1H),3.22(d,J＝6.9Hz,2H),3.01(dd,J＝13.7,7.8Hz,2H),2.90(dd,J＝14.0,9.0Hz,1H),2.70(s,4H),2.60-2.52(m,2H),2.16-2.11(m,2H),1.97(s,2H),1.67(d,J＝2.5Hz,12H),1.39(t,J＝7.2Hz,6H)。其与探针基团相对应，可证明探针合成成功。
图2为在氘代甲醇中的高分辨质谱，具体谱峰值为：ESI-MS m/z:[M]+Calcd forC47H60N5O8S+854.4157,Found 854.4164；[M++H]2+/2Calcd for C47H61N5O8S2+427.7117,Found427.7110。
综上从1H NMR和质谱证明了该荧光探针的化学结构，从而证明通过本发明公开的合成方法能够成功制备出本发明预想保护的比率型近红外荧光探针。
为了进一步验证本发明公开保护技术方案所产生的技术效果，发明人还进行了如下测定实验：
实验1：近红外荧光探针在PBS缓冲溶液中与GGT反应能力测试
将探针Cy-GGT溶于光谱纯的甲醇中，配制成5mM的母液。在吸收光谱和荧光光谱的测试时，取适量的母液用PBS缓冲液(10mM,pH 7.0)稀释至所需浓度，随后加入适量的GGT或其他分析物在37℃下孵育相应时间后转入1cm的石英比色皿进行测试，且所有光谱测试均在25℃下进行。
图3为荧光探针与GGT反应前后的吸收光谱和荧光光谱。其中，蓝色线为不含GGT的光谱，红色线为探针与100mU/mL的GGT孵育60分钟后的光谱。从图3a的吸收光谱中可见，加入GGT后，766nm的吸光度显著降低，510nm处出现新的吸收峰，溶液颜色由绿色变为红色，且在对应的如图3b和图3c所示的荧光光谱中，Cy-GGT于808nm的发射峰降低，在616nm出现新的荧光发射峰。
由上述实验结果表明探针Cy-GGT可用于GGT的检测。
实验2：近红外荧光探针对γ-谷氨酰转肽酶最低检测限的测定
图4为在PBS缓冲溶液中Cy-GGT与不同浓度的GGT在37℃下孵育60min后的荧光光谱(图4a与图4b)以及616nm和808nm的荧光强度随GGT浓度变化的散点图(图4c)和I616nm/I808nm随GGT浓度变化的线性关系(图4d)。在37℃时，根据对γ-谷氨酰转肽酶近红外荧光探针的滴定实验，依据LOD＝3.3σ/k计算得到探针Cy-GGT对GGT的最低检测限为0.02mU/mL，取616nm和808nm处荧光强度的比值，I616nm/I808nm与GGT浓度在0～140mU/mL范围内呈良好的线性关系(y＝0.014x+0.02,线性相关系数R2为0.998)，较以往报道的GGT探针更为灵敏。这种高灵敏度主要归功于比率型检测模式，同时测量两个波长荧光信号，取其比值从而将一些干扰因素最小化并将输出信号放大。
上述实验结果证实通过本发明合成的近红外比率型荧光探针对γ-谷氨酰转肽酶的检测灵敏度高，以表明该探针在水溶液中对γ-谷氨酰转肽酶高效检测方面有潜在的应用价值。
实验3：近红外荧光探针随DON浓度变化的抑制效率
将不同浓度的DON与100mU/mL的GGT在37℃下孵育30分钟，随后加入6μM Cy-GGT继续孵育60分钟，并测其荧光光谱。
图5为本发明近红外比率型荧光探针随DON浓度变化的抑制效率。随着抑制剂浓度的增加，616nm的发射峰逐渐降低(图5a)，808nm的荧光逐渐增强(图5b)，其比值(I616nm/I808nm)也依次降低，说明加入DON可以察到明显的抑制作用(图5c)。此外，随着抑制剂浓度的增加，抑制效率逐渐增强，DON浓度超过2mM时趋于缓慢增加(图5d)。根据DON浓度与抑制效率的关系图，可以得出当GGT浓度为100μM/mL时，其半数抑制浓度IC50为0.48mM。
实验4：近红外荧光探针对Hep G2细胞内GGT的时间响应
将本发明用于Hep G2细胞中GGT快速成像。具体步骤如下：将荧光探针(3μmol·L-1)加入到育有Hep G2细胞的培养液中，利用共聚焦显微镜观察荧光成像情况。
图6为近红外荧光探针在细胞内成像的共聚焦时间跟踪。从图中可以看出10min内即可出现明显的红色荧光，表明探针Cy-GGT扩散进入Hep G2细胞后，细胞内GGT能快速地催化探针水解释放红色荧光物质Cy-O。随着孵育时间延长，红色通道荧光逐渐增强，近红外通道荧光减弱，两个通道荧光强度的比值逐渐变大。当Cy-GGT与Hep G2孵育40分钟后，红色通道荧光增强15倍，近红外通道荧光强度降低为原来的1/4。由此可知，本发明公开合成的近红外比率型荧光探针Cy-GGT可实现细胞内GGT活性的可视化实时检测。
实验5：荧光探针对于癌细胞内GGT检测的普适性及其对正常细胞的区分
将本发明拓展应用于其他癌细胞内GGT检测。具体步骤如下：选取GGT高表达的HepG2细胞和两种肿瘤细胞系(HeLa和MCF-7)为研究对象，以正常细胞HUVEC为对照。将上述四种细胞与3μM的Cy-GGT在37℃孵育40分钟后观察其于红色通道和近红外通道的荧光强度。
图7附图为近红外荧光探针分别在癌细胞和正常细胞内的共聚焦成像。由图可以看出肿瘤细胞中的红色荧光显著强于正常细胞，红色通道与近红外通道荧光强度的比值也可看出HUVEC细胞明显低于其他三种肿瘤细胞，由此可以证实GGT在肿瘤细胞中的活性远远高于正常细胞，该实验表明探针Cy-GGT可用于区分正常细胞和肿瘤细胞。
实验6：荧光探针对皮下肿瘤小鼠内GGT的响应
将本发明拓展应用于其他癌细胞内GGT检测。具体步骤如下：2只裸鼠大腿后侧接种Hep G2肿瘤，待肿瘤长至直径8-10mm时进行实验。将探针Cy-GGT(10μL，3mM溶液)注入荷瘤小鼠体内，而另一只小鼠用抑制剂DON(20μL,100mM水溶液)预处理30min，然后注射相同剂量的Cy-GGT，并向1只健康小鼠相同部位注射等剂量的Cy-GGT作为对照实验，随后记录小鼠荧光强度随时间的变化。
图8附图为皮下肿瘤小鼠模型的荧光成像。在荷瘤小鼠体内观察到红色通道荧光显著增强，近红外通道发射随之减弱(图8b)。而对用DON抑制肿瘤中GGT活性的荷瘤小鼠和健康小鼠而言，红色通道的荧光增强相对较弱的，而近红外通道的荧光反而较强，其两个通道的荧光比(Ired/INIR)远小于未经抑制剂预处理的荧光比(图8e)。结果表明，通过本发明合成的近红外比率型荧光探针Cy-GGT可用于监测活体动物内源性GGT活性。
综上所述，本发明合成了一种近红外比率型荧光探针，该探针对γ-谷氨酰转肽酶有较高的反应活性。重要的是，该探针在细胞内和小鼠体内的相关研究中用量较少，响应较快，对高GGT含量的癌细胞具有普适性，而在正常细胞内转化率很低。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种近红外比率型荧光探针，其特征在于，所述比率型荧光探针具有近红外花菁荧光基团，其结构式为：
2.一种近红外比率型荧光探针的合成方法，具体包括如下步骤：
(1)吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇在正丁醇/苯混合溶剂中分水回流得到化合物1，其中反应体系温度为130℃～150℃，反应时间为10～12h，
(2)在N2气氛下将上述化合物1与乙酸钠在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中反应5～7h，反应温度为85℃～95℃，纯化得到化合物2，
(3)将化合物2和三乙胺溶于无水二氯甲烷中，冰浴下滴加溶有丙烯酰氯的无水二氯甲烷溶液，升至室温搅拌过夜，纯化得到化合物3，
(4)将谷胱甘肽和碳酸氢钠溶于去离子水中，在N2保护下逐滴滴加溶有化合物3的甲醇溶液，室温下搅拌反应24h，待反应结束后，将反应液倾入去离子水中，并用二氯甲烷萃取、硅胶柱层析纯化得到本发明公开的近红外比率型荧光探针。
3.根据权利要求2所述的一种近红外比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中，吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇的摩尔比为(1～3):1，所用溶剂正丁醇/苯的体积比为(6～8):(2～4)。
4.根据权利要求2所述的一种近红外比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，所述步骤(2)中，化合物1与乙酸钠的摩尔比为1:(2～4)，所用溶剂N,N-二甲基甲酰胺的体积为5～7mL。
5.根据权利要求2所述的一种近红外比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，所述步骤(3)中，化合物2、三乙胺和丙烯酰氯的摩尔比为1:(5～6):(2～3)，所述无水二氯甲烷的体积为20～30mL。
6.根据权利要求2所述的一种近红外比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，所述步骤(4)中，化合物3、谷胱甘肽和碳酸氢钠的摩尔比为1:(3～5):(5～6)，所用去离子水的体积为5～10mL，甲醇的体积为5～10mL。
7.一种如权利要求1所述的近红外比率型荧光探针或如权利要求2～权利要求6任一所述方法合成的近红外比率型荧光探针在检测γ-谷氨酰转肽酶中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述γ-谷氨酰转肽酶在以肝癌细胞为主癌细胞中过度表达。
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