CN109053802B - 一种比率型近红外荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种比率型近红外荧光探针及其合成方法与应用，本发明公开的比率型近红外荧光探针利用单磷酸酯(也是ALP识别基团)保护NIR荧光团的羟基，当向体系中加入碱性磷酸酶时，碱性磷酸酶可通过酶促反应诱导单磷酸酯基团断裂释放，该反应导致溶液颜色发生显著变化，发光由近红外区转变为红色发光。通过紫外‑可见吸收光谱法和荧光光谱法等研究了其对多种酶的识别效果，结果表明这种比率荧光探针在Tris‑HCl缓冲溶液中能够高效选择性识别碱性磷酸酶，且对碱性磷酸酶具有很高的响应灵敏度。

Description

一种比率型近红外荧光探针及其合成方法与应用

技术领域

本发明属于小分子荧光探针领域，涉及一种用于检测细胞内源性碱性磷酸酶的方法策略。更具体地，涉及一种比率型近红外荧光探针及其合成方法和它在检测碱性磷酸酶中的应用。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP)是一种重要的水解酶，可催化核酸、蛋白质和一些小分子的脱磷酸过程，由于血清中ALP含量的异常与前列腺癌、骨病、肝功能障碍和糖尿病等几种疾病密切相关，其活性通常被认为是医学诊断中的重要生物标志物。因此，对ALP高效便捷的检测可为疾病的诊断提供可靠、有效的数值依据。现今对ALP的检测主要依赖比色法、色谱法、电化学发光法和荧光测定法等手段，这些方法大多对仪器设备的要求较高，且无法快速提供实时检测结果。对比之下，具有高灵敏度、高选择性的荧光测定法可用于裸眼定位目标待测物，在生命科学和环境检测等领域更具发展潜力。

近红外荧光探针采用近红外光谱分析，在生物体内分子的诊断识别中起着关键的作用。因为近红外波段(600～800nm)的光波避开了体内水、有氧及无氧血红蛋白等主要吸收组织的最佳吸收波长，从而具有良好的生物组织穿透能力，能降低对生物组织的损伤。并且该类染料的类型比较多，摩尔消光系数高，具有良好的水溶性，分子量比较小(一般小于1000)，可以避免对被标记分子的连接与功能产生空间位阻效应。

另外，现今对碱性磷酸酶的检测主要依赖色谱法、电化学发光法、电化学法、表面增强共振拉曼散射方法、比色法和荧光法等手段，上述方法大多需要复杂的仪器，限制了其实际应用。在诸多方法中，光谱分析手段具有较高的灵敏度和选择性，对仪器设备的门槛要求较低，并有较为广阔的商用价值，是目前具有应用价值的碱性磷酸酶分析方法。

因此，如何提供一种高灵敏度、高选择性的近红外荧光探针是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种比率型近红外荧光探针及其合成方法与应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种比率型近红外荧光探针，所述近红外荧光探针具有花菁荧光基团，其结构式为：

所述比率型近红外荧光探针利用单磷酸酯(也是ALP识别基团)保护NIR荧光团的羟基，当向体系中加入碱性磷酸酶时，碱性磷酸酶可通过酶促反应诱导单磷酸酯基团断裂释放，该反应导致溶液颜色发生显著变化，发光由近红外区转变为红色发光。本发明可以通过肉眼对目标物碱性磷酸酶进行可视化鉴别，也可进入活细胞中对细胞内源性碱性磷酸酶进行测定。

本发明的另一目的是提供一种比率型近红外荧光探针的合成方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种比率型近红外荧光探针的合成方法，具体包括如下步骤：

(1)吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇通过分水分流法得到化合物1，其中反应体系温度为130℃～150°С，反应时间为10～12h，

(2)在N₂气氛下将上述化合物1与乙酸钠在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中反应5～7h，反应温度为85°С～95℃，纯化得到化合物2，

(3)将上述化合物2溶于干燥的二氯甲烷中，滴入三氯氧磷，室温反应2.5～3.5h，冰水水解，用二氯甲烷萃取得到本发明的比率型近红外荧光探针，

通过采用上述技术方案，本发明的作用原理如下：

本发明近红外荧光探针以花菁为荧光基团，在Tris-HCl缓冲溶液中可通过与ALP的酶促反应诱导其单磷酸酯基团的断裂及离去，分别通过探针及其反应产物的两个不同波长处吸收强度的比值(A_516nm/A_736nm)和荧光强度的比值(F_616nm/F_766nm)变化可检测ALP的存在与否。

在没有加入ALP时，所述探针的最大吸收和荧光发射波长均处在近红外区，分别为736nm和766nm；加入ALP后，736nm处的吸收减弱，766nm处的荧光减弱，最大吸收波长和荧光发射波长分别蓝移至516nm和616nm。

并且，该合成方法不仅操作简单，而且产率高，提纯方便快捷。

优选的，所述步骤(1)中，吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇的摩尔比为(1～3):1，所用溶剂正丁醇/苯的体积比为(6～8):(2～4)；优选吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇的摩尔比为2:1，所用溶剂正丁醇/苯的体积比为7:3。

优选的，所述步骤(2)中，化合物1与乙酸钠的摩尔比为1:(2～4)，所用溶剂N,N-二甲基甲酰胺的体积为5～7mL；优选化合物1与乙酸钠的摩尔比为1:3，所用溶剂N,N-二甲基甲酰胺为6mL。

优选的，所述步骤(3)中，化合物2和三氯氧磷的摩尔比为1:(8～10)，所用无水二氯甲烷的体积为5～7mL；优选化合物2和三氯氧磷的摩尔比为1:10，无水二氯甲烷为5mL。

原料配比不会影响产物对碱性磷酸酶的检测性能，优化原料配比仅为提高反应产率。如加入10倍量的三氯氧磷以使化合物2充分反应生成所需产物，若三氯氧磷加入较少则化合物2会有剩余，则给后续纯化过程带来一定难处。

另外，发明人分别通过核磁共振氢谱、碳谱、磷谱、紫外光谱等手段进行表征，表明所述比率型近红外荧光探针合成成功。

本发明还有一个目的，就是提供比率型近红外荧光探针在检测碱性磷酸酶中的具体应用。

优选的，所述碱性磷酸酶在癌细胞中过渡表达，合成的荧光探针可进入活细胞对细胞内源性碱性磷酸酶进行检测。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种比率型近红外荧光探针的合成方法及其检测细胞内源性碱性磷酸酶的应用。本发明近红外荧光探针合成方法不仅操作简便，生物毒性低，而且在Tris-HCl缓冲溶液中能够高效选择性识别ALP；同时通过对细胞初步标记研究表明，该探针具有很好的线粒体共定位效果，能够对ALP具有较高的灵敏度，少量的探针即可对细胞内ALP作出快速响应。本发明所公开的用于检测ALP的方法策略具有市场应用与推广价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明比率型近红外荧光探针在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱。

图2附图为本发明比率型近红外荧光探针在二甲基亚砜中的核磁共振碳谱。

图3附图为本发明比率型近红外荧光探针在二甲基亚砜中的核磁共振磷谱。

图4附图为本发明比率型近红外荧光探针在Tris-HCl缓冲溶液中与ALP相互作用时的紫外可见光谱图。

图5附图为相对吸光度值A_516nm/A_736nm与ALP活性的线性响应曲线。

图6附图为荧光比率F_616nm/F_766nm与ALP活性的线性响应曲线。

图7附图为近红外荧光探针与Mito Tracker Green(购买的线粒体示踪剂)细胞内共定位共聚焦图像。

图8附图为近红外荧光探针在细胞内成像的共聚焦时间跟踪。

图9附图为近红外荧光探针分别在癌细胞和正常细胞内的共聚焦成像。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种高灵敏度的测定碱性磷酸酶的比率型近红外荧光探针及其合成方法与应用。

为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

本发明公开了一种比率型近红外荧光探针，所述近红外荧光探针具有花菁荧光基团，其结构式为：

下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行进一步的说明。

实施例1

近红外荧光探针的合成

(1)化合物1的合成：

吲哚季铵盐(3.00×10^-3mol)和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)(1.50×10^-3mol)甲醇通过分水分流法得到化合物1；

其中反应的溶剂为体积比7:3的正丁醇/苯的混合溶剂，反应体系温度为140°С，反应时间为11h。

(2)化合物2的合成：

在N₂气氛下将上述化合物1(5.00×10^-4mol)与乙酸钠(1.50×10^-3mol)在N,N-二甲基甲酰胺(6mL)溶剂中反应6h，反应温度为90°С，获得化合物2。

(3)比率型近红外荧光探针的合成：

将上述化合物2(1.00×10^-4mol)溶于干燥的二氯甲烷(5mL)中，滴入三氯氧磷(93mL)，室温反应3h，冰水水解，用二氯甲烷萃取得到本发明的比率型近红外荧光探针。

1、测试分析：

图1为探针的¹HNMR图谱，具体谱峰值为：¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆)δ(ppm)8.36(d,J＝14.0Hz,1H),8.25(d,J＝14.1Hz,1H),7.56(t,J＝6.6Hz,2H),7.43–7.29(m,4H),7.20(dt,J＝14.2,7.2Hz,2H),6.09(dd,J＝24.4,14.2Hz,2H),4.21–4.11(m,4H),2.58(s,4H),1.79(d,J＝5.7Hz,2H),1.66(d,J＝6.2Hz,12H),1.27(t,J＝7.0Hz,6H).其与探针基团相对应，可证明探针合成成功。

图2为探针的¹³C NMR图谱，具体谱峰值为：¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)171.62(s),161.26(s),145.62–143.91(m),143.32(d,J＝112.2Hz),142.17(s),141.44(d,J＝93.7Hz),128.84(s),124.94(s),122.85(s),122.11(s),111.13(s),100.01(s),49.20(s),27.24(s),24.62(s),12.39(s).碳的数目及出峰位置与探针一一对应，进一步证实通过本发明合成的荧光探针结构正确。

图3为探针的³¹P NMR图谱，只有一个位于5.49的磷信号峰，说明化合物仅含一个磷酸酯结构。

综上从¹HNMR、¹³CNMR和³¹P NMR证明了该荧光探针的化学结构。

实施例2

近红外荧光探针在缓冲溶液中与ALP反应能力测试

将荧光探针溶于二甲基亚砜中配成2.50mmol/L的溶液，从中取4μL于2mL Tris-HCl缓冲溶液(10mmol/L，pH＝8)中，检测其紫外吸收光谱(图4A)；再加入4μL ALP(0.2U/μL)，与探针孵育60分钟后，检测其紫外吸收光谱(图4B)。

图4为荧光探针与碱性磷酸酶反应前后的紫外可见吸收光谱。其中，A表示荧光探针(5μmol·L^-1)，B表示荧光探针(5μmol·L^-1)和碱性磷酸酶(0.2U/μL)的混合液。从中可见，加入ALP后，736nm处的吸收峰减弱，并在516nm处出现新的吸收峰，说明ALP与探针反应得到新的化合物。

由此说明碱性磷酸酶可与近红外荧光探针反应，经过去磷酸化过程形成红色的化合物。

实施例3

近红外荧光探针对碱性磷酸酶最低检测限的测定

在37℃时，根据碱性磷酸酶对近红外荧光探针的滴定实验，通过紫外吸收光谱的比率变化，经由3s_B/S计算，得到近红外荧光探针对碱性磷酸酶的最低检测限达0.37mU·mL^-1(图5)，并且其吸光度比率A_516nm/A_736nm与ALP的浓度在0～10mU·mL^-1范围内线性相关(r²＝0.98302)，同样的计算方法，通过荧光比率变化F_616nm/F_766nm可以获得最低检测限达0.16mU·mL^-1(图6)，其线性范围为0～13mU·mL^-1(r²＝0.99277)。该结果证实合成的近红外荧光探针对碱性磷酸酶的检测灵敏度高，表明该探针在水溶液中对碱性磷酸酶高效检测方面有潜在的应用价值。

实施例4

近红外荧光探针对于人宫颈癌细胞内线粒体的定位功能

将本发明用于HeLa细胞中线粒体示踪应用，具体步骤如下：将购买的线粒体示踪剂(Mito Tracker Green，200nmol·L^-1)加入到育有HeLa细胞的培养液中，在二氧化碳培养箱中培养30分钟后移除培养液，继续与荧光探针(3μmol·L^-1)孵育30分钟，培养结束后用共聚焦显微镜观察荧光成像情况。

图7为近红外荧光探针与Mito Tracker Green的共定位荧光成像结果。其中，图7a是Mito Tracker Green在细胞内的成像，图7b是近红外探针在细胞内的定位成像，图7c是二者的叠加图。图7e是2种染料的强度相关图，图7f是所选部分(ROIs)2种荧光染料的强度变化图。

由图7可以看出，2种染料的叠加效果较好，根据共聚焦软件分析，Pearson’s系数为0.93，2种染料的重叠系数为0.94，足以证明合成的近红外探针具有较好的线粒体靶向性。

实施例5

近红外荧光探针对于人宫颈癌细胞内ALP响应时间跟踪细胞成像

将本发明用于HeLa细胞中ALP快速成像。具体步骤如下：将荧光探针(3μmol·L^-1)加入到育有HeLa细胞的培养液中，利用共聚焦显微镜观察荧光成像情况。

图8为近红外荧光探针对HeLa细胞中ALP响应时间跟踪结果，其中图8b-h分别是孵育5，10，15，25，30，40和60分钟的成像结果，图8i是上述成像相对荧光强度的量化值。

由图8可以看出，合成的近红外荧光染料的响应效果较好，仅3μmol·L^-1的用量，5分钟即可获得明显的细胞成像结果，且孵育30分钟细胞内荧光强度便达到最大值。

实施例6

荧光探针对于癌细胞内ALP检测的普适性及其对正常细胞的区分

将本发明拓展应用于其他癌细胞内ALP检测。具体步骤如下：将荧光探针(3μmol·L^-1)加入到育有癌细胞(宫颈癌细胞HeLa，肝癌细胞Hep G2，乳腺癌细胞MCF-7，肺癌细胞A549)的培养液中，利用共聚焦显微镜观察荧光成像情况。为作对比，正常细胞(HUVEC)亦采用同样的处理方法。

由图9可以看出，尽管用量较少，合成的近红外荧光染料对癌细胞内ALP的响应具有普适性，且可以较好的区分癌细胞和正常细胞。相比之下，HUVEC细胞内近红外荧光明显更强，而红色通道内信号较弱，说明合成的近红外探针在正常细胞内的反应率较低。癌细胞内的近红外荧光几乎完全消失，红色通道信号较强，说明近红外探针的转化率较高，该现象与癌细胞内较高的ALP浓度密切相关。

综上所述，本发明合成了一种比率型近红外荧光探针，该探针对碱性磷酸酶有较高的反应活性。重要的是，该探针在细胞内的相关研究中用量较少，响应较快，对高ALP含量的癌细胞具有普适性，而在正常细胞内转化率很低。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种比率型近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光探针具有花菁荧光基团，其结构式为：

2.一种如权利要求1所述的比率型近红外荧光探针的合成方法，具体包括如下步骤：

(1)吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇通过分水分流法得到化合物1，其中反应体系温度为130℃～150℃，反应时间为10～12h，

(2)在N₂气氛下将上述化合物1与乙酸钠在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中反应5～7h，反应温度为85℃～95℃，纯化得到化合物2，

(3)将上述化合物2溶于无水二氯甲烷中，滴入三氯氧磷，室温反应2.5～3.5h，冰水水解，并用二氯甲烷萃取得到所述的比率型近红外荧光探针。

3.根据权利要求2所述的一种比率型近红外荧光探针的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中，吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇的摩尔比为(1～3):1，所用溶剂正丁醇/苯的体积比为(6～8):(2～4)。

4.根据权利要求2所述的一种比率型近红外荧光探针的合成方法，其特征在于，所述步骤(2)中，化合物1与乙酸钠的摩尔比为1:(2～4)，所用溶剂N,N-二甲基甲酰胺的体积为5～7mL。

5.根据权利要求2所述的一种比率型近红外荧光探针的合成方法，其特征在于，所述步骤(3)中，化合物2和三氯氧磷的摩尔比为1:(8～10)，所述无水二氯甲烷的体积为5～7mL。

6.一种如权利要求1所述的比率型近红外荧光探针或如权利要求2～5任一所述方法合成的比率型近红外荧光探针在检测碱性磷酸酶中非诊断目的的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述碱性磷酸酶在癌细胞中过度表达。

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